SK27499A3 - 25-methylene and 24,25-epoxy marcfortines and paraherquamides - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka 25-metylén a 24,25-epoxy markfortínov a paraherquamidov, ktoré sú užitočnými antiparazitikami.

Doterajší stav techniky

Markfortíny sú známe zlúčeniny, pozri Joumal of the Chemical Society Chemical Communications, 601-602 (1980) pre Markfortín A a Tetrahedron Letters, 22, 1977-1980 (1981) pre Markfortíny B a C. Tieto zlúčeniny sú hubové metabolity Penicillium roqueforti. Markfortíny sú štruktúrne podobné paraherquamidom, ktoré sú tiež známe zlúčeniny.

Paraherquamidy sú uvedené v Tetrahedron Letters, 22, 135-136 (1981), a v Joumal of Antibiotics, 44, 492-497 (1991). USA patenty 4 866 060 a 4 923 867 uvádzajú použitie markfortínov A, B a C a určitých ich derivátov na liečenie a prevenciu parazitických nemocí zvierat.

WO 92/22555 (publikované 23. decembra 1992) genericky opisuje derivát markfortínu alebo paraherquamidu (napríklad čiastočný vzorec (ΠΙ) substituovaný v polohe 14 metylom alebo metyl a hydroxy skupinou, avšak neuvádza žiadny opis prípravy takých 14-metyl-14hydroxymarkfortínových zlúčenín.

Joumal of Antibiotics, 43, 1380-1386 (1990) uvádza Paraherquamid A, ktorý má nasledujúcu štruktúru

Markfortín A má nasledujúcu štruktúru:

O

-2Markfortín B má nasledujúcu štruktúru:

Markfortín C má nasledujúcu štruktúru:

Markfortín D má nasledujúcu štruktúru:

WO 91/09961 (publikované 11. júla 1991) uvádza rôzne deriváty markfortínu a paraherquamidu a ich 12a-N-oxidov, rovnako ako výrobu VM 29919 (paraherquamid) a VM 55596 (12a-N-oxid paraherquamidu) inter alia z Penicillium Sp. IMI332995.

USA patent 4 873 247 uvádza deriváty paraherquamidu a kmeň Penicillium charlessi MF 5123 (ATCC 20841) na výrobu paraherquamidu. USA patent 4 978 656 (rovnako ako EP 390532-A, EP-301742-A) uvádza rôzne syntetické deriváty paraherquamidu, rovnako ako výrobu paraherquamidu z Penicillium charlessi MF 5123 (ATCC 20841).

Intemational Publication WO 92/22555 (publikované 23. decembra 1992) genericky uvádza zlúčeniny 14a-hydroxymarkfortínu a postup, ktorý používa zlúčeniny 14-hydroxy-14

-3metylmarkfbrtínu na výrobu antiparazitických liečiv. Avšak neuvádza žiadny opis možného spôsobu prípravy zlúčenín 14a-hydroxymarkfortínu alebo 14a-hydroxy-14p-markfortínu.

Intemational Publication WO94/29319 uvádza rôzne 14-substituované markfortíny a ich deriváty.

Sú známe 15-alkyl-l4-hydroxy zlúčeniny (ΠΙ), kde n] je 0, pozri Intemational Publication WO 94/29319.

Podstata vynálezu

Sú uvedené 25-metylén zlúčeniny všeobecného vzorce (VII), kde pre:

(I) markfortín A, (a) n je 1, (b) R14 j^eR14a^;R14pAdeRi4_a je-H a R]4β je-H, (c) ^R15J^{e R}15a^:R153>^{kde R}15a je-H a R]5β je-H, (II) paraherquamid A, (a) n je 0, (b) Rj4 je R14a^:R143> ^{kde R}14a J^e ’^{0H a} R14 J^{e CH}3>

(c) Ri5 je R]5_a:R^, kde Ri5_a je-H a R]5β je-H, (III) 14-hydroxy-14-alkylmarkfortín A, (a) n je 1, (b) Rj4 je R14_α:R14β, kde R]4_(x je-OH a R^ je C1-C4 alkyl, (c) R15 je Λΐ5_α:Λΐ5β, kde Rj5_a je -H a R^ je -H, (IV) 14-hydroxy-15-metylmarkfortin A, (a) n je 1, (b) R]4 je Ri4a^:R14p> ^{kde R}14a J^e -OH a R^ je -H, (c) R]5 je Λΐ5_α:Λΐ5β, kde Ri5_a je C4-C4 alkyl a R^ je -H a ich farmaceutický prijateľné soli.

Také sú uvedené 25-epoxy zlúčeniny všeobecného vzorce (VIII), kde pre:

(I) markfortín A (a) njel, (b) Rj4 je Ri4_a:R143>^{kde R}14a J^e ’^{0H a R}14β í^e K (c) ^R15 J^eR15a^:R15p> ^kdeR15a je-Ha R] sp je-H, (II) paraherquamid A (a) njeO, (b) R}4 je Ri4_a:Ri4p, kde Rj4_a je -OH a R^p je -CH3, (c) R₁₅ jeRi5_a:Ri5p, kdeR^ je-HaRisp je-H, (ΠΙ) 14-hydroxy-14-aIky Imarkfortín Á (a) njel, (b) R14 je Ri4_a:Ri4p, kde R^ je -OH a Ri4p je C4-C4 alkyl, (c) ^R15J^eR15a^:R15p> ^kdeRi5_a je -H a R}sp je-H, (IV) 14-hydroxy-15-alkylmarkfortín A (a) njel, (b) Rj4 je Ri4_a:Ri4p, kde Rj4_a je -OH a R^p je -H, (c) R]5 jeR]5_a:Risp, kdeR]5_ajeC]-C4 alkyl aR]5p je-H a ich farmaceutický prijateľné soli.

Je opísaný N-(18a)-demetyl-2-deoxoparaherquamid A a jeho farmaceutický prijateľné soli.

V tomto vynáleze sú 25-metylén (VII) a 24,25-epoxy (VIII) markfortíny a paraherquamidy. Tieto zlúčeniny sú pripravené dvoma rôznymi reakciami zo známych zlúčenín.

25-metylén a 24,25-epoxy markfortíny a paraherquamidy (VII) sa pripravia zo známych cyklických olefínov (I). Keď (a) n je 1, (b) R14 je Ri4a^:R14P> ^{kde R}14a í^e H ^{a R}14P J^e (c) Rj5 je Ri5a’Ri5p, kde Ris_a je -H a Rjsp je H, východiskový cyklický olefín (I) je markfortín A. Keď (a) n je 0, (b) R14 je &14α^:Κ14β> kde R14« je -OH a R^p je CH3, (c) R] 5 je Κΐ5α^:®·15β» kde Ri5a je -H a R)5p je H, východiskový cyklický olefin (I) je paraherquamid A. Keď (a) n je 1, (b) R]4 je Ri4_a:Ri4p, kde R]4_a je -OH a R^p je CH₃, (c) R15 j^e R15a^;R153’ kde Ri5_a je -H a Rjsp je -H, východiskový cyklický olefin (I) je 14hydroxy-14-metylmarkfortín A. Keď (a) n je 1, (b) R14 je Ri4_a:Ri4p, kde R]4a je -OH a R14P je -H, (c) R15 je Ri5«:Ri5p, kde Ri5_a je -CH₃ a R^p je -H, východiskový cyklický olefin (I) je 14-hydroxy-15-metylmarkfortín A.

Markfortín A a paraherquamid A sú dobre známe zlúčeniny. Zlúčeniny 14-hydroxy-14metylmarkfortín A a 14-hydroxy-15-metylmarkfortín A sa pripravia postupmi ukázanými v schémach C-H a príkladoch 1 až 31. Schémy a príklady ukazujú metyl ako alkylový substituent, avšak etyl, propyl a butyl (včítane ich izomérov, pokiaľ existujú) sa pripravia analogickým spôsobom, ako je známe odborníkom.

25-metylén zlúčeniny (VII) sa pripravia z odpovedajúceho cyklického olefinu (I) najskôr štiepením sedemčlenného cyklického éteru obsahujúceho olefin použitím reakčnej zlúčeniny ako kyselina mravčia, čím sa získa diol (Π). Diol (Π) sa potom alkyluje alkylačným činidlom, za získania odpovedajúceho olefinu (III). Olefin (III) musí mať dvojitú väzbu v špecifikovanej polohe, aby sa dostal žiadaný produkt, ktorý po cyklizácii a oxidácii bude mať hydroxy skupinu na C25. Takéto činidlá zahrnujú zlúčeniny vzorca Xi-CH2-CH=C(CH3)2, kde X] je odstupujúca skupina, napríklad -Br alebo -Cl, dáva sa prednosť tomu, aby X] bol -Br, najlepšie aby činidlom bol 4-bróm-2-metyl-2-butén. Tato reakcia sa uskutočňuje v prítomnosti jodidu draselného a slabej bázy, akou je hydrogenuhličitan alebo uhličitan (s výhodou uhličitan draselný) vo vodno-organickej zmesi rozpúšťadiel, s výhodou acetón/voda. Olefin (ΠΙ) sa potom oxiduje na odpovedajúci epoxy-fenol (IV) za použitia perkyseliny, s výhodou kyseliny mchlórperbenzoovej s nasledujúcim spracovaním hydrogensiričitanom sodným. Epoxy-fenol (IV) sa potom cyklizuje na odpovedajúci cyklický alkohol (V) použitím chloridu ciničitého. Cyklický alkohol (V) sa oxiduje za Swemových podmienok (oxalyl chlorid, DMSO, potom TEA), čím sa získa odpovedajúci ketón (VI). Ketón (VI) sa potom transformuje na požadovanú 25-metylén zlúčeninu (VII) Wittigovou reakciou použitím metyltrifenylfosfónium bromidu a silnej bázy, napríklad n-butyllítia. Rozumie sa, že 25-metylén zlúčenina (VII) je 24,25-dihydro zlúčenina.

24,25-epoxy zlúčeniny (VIII) sa pripravia zodpovedajúceho cyklického olefinu (I) oxidáciou perkyselinou za normálnych podmienok pre oxidáciu perkyselinou na epoxidy s nasledujúcim spracovaním vodným hydrogensiričitanom sodným. S výhodou je perkyselina kyselina m- chlórperbenzoová.

N-(18a)-demetyl-2-deoxoparaherquamid A je tiež známy ako (r,5‘a,8‘a,9‘a)-(-)2,2‘,3,3‘,8a‘,9‘-hexahydro-r-hydroxy-r4,4,8‘8‘-pentametyl-spiro[4H,8H,-(l,4)dioxepino(2,3g)indol-8,7‘(8‘H)-[5H,6H-a,9a(iminometano)(lH)cyklopent(f)indolizin)-9-ón). N-(18a)demetyl-2-deoxoparaherquamid A sa môže pripraviť dvoma rôznymi spôsobmi, pozri príklady 14 a 15.

25-metylén zlúčeniny (VII), 24,25-epoxy zlúčeniny (VIII) a N-(18a)-demetyl-2deoxoparaherquamid A sú amíny a ako také, tvoria pridaním kyselín soli, v prípade, že reagujú s dostatočne silnými kyselinami. Farmaceutický prijateľné soli zahrnujú soli tak anorganických, ako aj organických kyselín. S výhodou sú to farmaceutický prijateľné soli z odpovedajúcich volných amínov, pretože tvoria zlúčeniny, ktoré sú rozpustnejšie vo vode a kryštalickejšie. Výhodné farmaceutický prijateľné soli zahrnujú soli nasledujúcich kyselín: metánsulfónovej, chlorovodíkovej, bromovodíkovej, sírovej, fosforečnej, dusičnej, benzoovej, citrónovej, vínnej, fúmarovej, maleinovej, CH3-(CHa)n-C00H, kde n je 0 až 4, H00C-(CH2)n-C00H, kde n je rovnaké ako je vyššie definované.

25-metylén zlúčeniny (VII), 24,25-epoxy zlúčeniny (VIII) a N-(18a)-demetyl-2deoxoparaherquamid A sú neočakávane silnými antiparazitickými činidlami proti endoparazitom a ektoparazitom, najmä helmintom a článkovcom, ktoré zapríčiňujú mnohé parazitické nemoci ľudí, zvierat a rastlín.

Parazitické nemoci môžu byť zapríčinené buď endoparazitmi, alebo ektoparazitmi. Endoparazity sú parazity žijúce vo vnútri tela hostiteľa, buď v niektorom orgáne (ako je žalúdok, pľúca, srdce, črevo, atď.), alebo jednoducho pod kožou. Ektoparazity sú parazity žijúce na vonkajšom povrchu hostiteľa, ale napriek tomu získavajú živiny z hostiteľa.

Endoparazitické nemoci sú všeobecne označované ako helmintiáza, kvôli infekcii hostiteľa parazitickými červami známymi ako helminty. Helmintiáza resp. helmintóza je rozšírený a vážny celosvetový hospodársky problém, kvôli infekcii domestikovaných zvierat ako sú prasatá, ovce, kone, hovädzí dobytok, kozy, psy, mačky a hydina. Mnohé z týchto nemocí sú zapríčinené skupinou červov, opisovaných ako hlísty, ktoré zapríčiňujú nemoci rôznych druhov zvierat na celom svete. Tieto nemoci sú často vážne a môžu skončiť smrťou infikovaného zvieraťa. Najbežnejšie rody hlíst infikujúcich vyššie uvedené zvieratá sú Haemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Nematodirus, Cooperia, Ascaris, Bunostomum, Oesophagostomum, Chabertia, Trichuris, Strongylus, Trichonema, Dictyocaulus, Capillaria, Heterakis, Toxocara, Ascaridia,

-7Oxyuris, Ancylostoma, Uncinaria, Toxascaris a Parascaris. Mnohé parazity sú druhovo špecifické (infikujú len jedného hostiteľa) a väčšina tiež má výhodné miesto infekcie u zvierat. A tak, Haemonchus a Ostertagia primáme infikujú žalúdok, zatiaľ čo Nematodirus a Cooperia prevažne atakujú črevá. Ďalšie parazity sa prednostne usídlia v srdci, očiach, pľúcach, krvných cievach a podobne, zatiaľ čo iné sú podkožné parazity. Helmintiáza môže viesť k slabosti, strate hmotnosti, málokrvnosti, poškodeniu čriev, podvýžive a poškodeniu ďalších orgánov. Pokiaľ tieto nemoci nie sú liečené, môžu viesť k smrti zvieraťa.

Vážnym problémom sú tiež infekcie spôsobené ektoparazitickými článkovcami ako sú kliešte, roztoče, vši, bodavky malé, muchy mäsiarky, blchy a podobne. Infekcie spôsobené týmito parazitmi končia stratou krvi, poškodením kože a môžu byť prekážkou normálnym stravovacím návykom, a teda zapríčiniť stratu hmotnosti. Tieto infekcie tiež môžu vyústiť do prenosu vážnych onemocnení ako je encefalitída, anaplazmóza, ovčie kiahne a podobne, ktoré môžu byť smrteľné.

Zvieratá môžu byť v rovnakej dobe infikované niekoľkými druhmi parazitov, pretože infekcia spôsobená jedným parazitom môže zviera oslabiť a urobiť ho náchylným na infekciu spôsobenú druhým druhom parazita. Teda látka so širokým spektrom aktivity je najmä výhodná na liečenie týchto nemocí.

25-metylén zlúčeniny (VII), 24,25-epoxy zlúčeniny (VIII) a N-(18a)-demetyl-2deoxoparaherquamid A majú neočakávane vysokú aktivitu proti týmto parazitom, a navyše sú rovnako aktívne proti Dirofilarie u psov, Nematospiroides a Syphacia u hlodavcov, bodavému hmyzu a migrujúcim dvojkrídlym larvám, napríklad Hypoderma sp. u hovädzieho dobytka a Gastrophilus u koní.

25-metylén zlúčeniny (VII), 24,25-epoxy zlúčeniny (VIII) a N-(18a)-demetyl-2deoxoparaherquamid A sú tiež užitočné proti endo a ektoparazitom, ktoré spôsobujú parazitické nemoci ľudí. Príklady takýchto endoparazitov, ktoré infikujú človeka zahrnujú gastrointestinálne parazity rodu Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius a podobne. Ďalšie endoparazity, ktoré infikujú človeka sa nachádzajú v krvi alebo v iných orgánoch. Príkladmi takýchto parazitov sú vlasovcové červy Wucheria, Brugia, Onchocerca a podobne, rovnako ako mimočrevné štádia črevných červov Strongylides a Trichinella. Ektoparaziti, ktorí infikujú človeka, včítane článkovcov ako sú kliešte, blchy, roztoče, vši a podobne, chovajú sa rovnako ako u domácich zvierat, infekcie spôsobené týmito parazitmi môžu viesť k prenosu vážnych a dokonca smrteľných nemocí. 25metylén zlúčeniny (VII), 24,25-epoxy zlúčeniny (VIII) a N-(18a)-demetyl-2

-8deoxoparaherquamid A sú aktívne proti týmto endo a ektoparazitom a navyše sú rovnako aktívne proti bodavému hmyzu a ďalším dvojkrídlym škodcom, ktorí otravujú človeka. Pokiaľ sú 25metylén zlúčeniny (VII), 24,25-epoxy zlúčeniny (VIII) a N-(18a)-demetyl-2deoxoparaherquamid A podávané orálne alebo parenterálne, potom sú podávané v dávkach od 0,05 do 20 mg/kg telesnej hmotnosti zvieraťa.

25-metylén zlúčeniny (VII), 24,25-epoxy zlúčeniny (Vín) a N-(18a)-demetyl-2deoxoparaherquamid A sú tiež užitočné proti bežným škodcom v domácnosti ako sú Blatella sp. (šváb), Tineola sp. (šatová moľa), Attagenus sp. (kobercový chrobák), Musca domestica (mucha domáca) a proti Solenopsis Invicta (dovezený červený mravec).

25-metylén zlúčeniny (VII), 24,25-epoxy zlúčeniny (VIII) a N-(18a)-demetyl-2deoxoparaherquamid A sú ďalej užitočné proti škodcom v poľnohospodárstve ako sú vošky (Acyrtiosiphon sp.), koníky a nosáčik bavlníkový, rovnako ako proti škodcom z radov hmyzu, ktoré napadajú uskladnené obilie ako je Tribolium sp., a proti nevyvinutým štádiám hmyzu, ktorý žije na rastlinných tkanivách. 25-metylén zlúčeniny (VII), 24,25-epoxy zlúčeniny (VIII) a N-(18a)-demetyl-2-deoxoparaherquamid A sú tiež užitočné ako nematocídy na reguláciu pôdnych hlíst, čo môže byť dôležité z hľadiska poľnohospodárstva.

Na použitie ako antiparazitické prostriedky pre zvieratá môžu byť 25-metylén zlúčeniny (VII), 24,25-epoxy zlúčeniny (VIII) a N-(18a)-demetyl-2-deoxoparaherquamid A podávané vnútorne buď orálne, alebo injekciou, alebo zvonka ako kvapalina alebo ako šampón.

Na orálnu aplikáciu môžu byť 25-metylén zlúčeniny (VII), 24,25-epoxy zlúčeniny (VIII) a N-(18a)-demetyl-2-deoxoparaherquamid A podávané v podobe kapsulí, tabliet alebo bolusu, ktorý sa vkladá zvieraťu do huby alebo alternatívne môžu byť primiešané do zvieracej potravy. Kapsule, tablety a bolusy sú zmesou aktívnej zložky v kombinácii s vhodným nosným vehikulom ako je škrob, talkum, stearan horečnatý alebo hydrogenfosforečnan vápenatý. Tieto jednotkové dávkové formy sa pripravujú dokonalým zmiešaním aktívnej zložky s vhodnými jemne rozpráškovanými inertnými zložkami zahrnujúcimi riedidlá, plnivá, dezintegračné prostriedky, suspenzaČné prostriedky a/alebo spojivá tak, že sa získa homogénny zmesný roztok alebo suspenzia. Inertná zložka je taká, ktorá nereaguje s 25-metylén zlúčeninami (VII), 24,25epoxy zlúčeninami (VIII) a N-(18a)-demetyl-2-deoxoparaherquamidom A a ktorá nie je toxická pre ošetrené zviera. Vhodné inertné zložky zahrnujú škrob, laktózu, mastenec, stearan horečnatý, rastlinné živice a oleje a podobne. Tieto formulácie môžu obsahovať veľmi premenlivé množstvo aktívnych a neaktívnych zložiek, v závislosti na množstve faktorov, ako sú veľkosť a druh zvieraťa, ktoré má byť liečené a druh a závažnosť infekcie. Aktívna zložka môže byť

-9rovnako podávaná ako prísada do krmiva jednoduchým zmiešaním 25-metylén zlúčenín (VII),

24,25-epoxy zlúčenín (VIII) a N-(18a)-demetyl-2-deoxoparaherquamidu A s kŕmnou látkou alebo aplikáciou zlúčeniny na povrch potravy. Alternatívne môže byť aktívna zložka zmiešaná s inertným nosičom a výsledná zmes potom môže byť zmiešaná s potravou alebo skrmovaná priamo zvieraťom. Vhodné inertné nosiče zahrnujú kukuričnú múčku, citrusovou múčku, kvasné zvyšky, sójovú drť, sušené zrno a podobne. Aktívne zložky sú dokonale premiešané s týmito inertnými nosičmi rozomletím, miešaním, mletím alebo prevracaním tak, že konečná kompozícia obsahuje od 0,001 do 5,0 % hmotnostných aktívnej zložky.

25-metylén zlúčeniny (VII), 24,25-epoxy zlúčeniny (VIII) a N-(18a)-demetyl-2deoxoparaherquamid A môžu byť alternatívne podávané parenterálne injekciou formulácie skladajúcou sa z aktívnej zložky rozpustenej v inertnom kvapalnom nosiči. Injekcie môžu byť buď intramuskuláme, intraruminálne, intratracheálne alebo podkožné. Injikovateľná formulácia sa skladá z aktívnej zložky zmiešanej s vhodným inertným kvapalným nosičom. Prijateľné kvapalné nosiče zahrnujú rastlinné oleje, napríklad arašidový olej, bavlníkový olej, sezamový olej a podobne, rovnako ako organické rozpúšťadlá, napríklad solketal, glycerol formal a podobne. Rovnako môžu byť použité alternatívne vodné parenterálne formulácie. Rastlinné oleje sú výhodnými kvapalnými nosičmi. Formulácie sa pripravujú rozpustením a suspendovaním aktívnej zložky v kvapalnom nosiči tak, že konečná formulácia obsahuje od 0,005 do 20 hmotnostných % aktívnej zložky.

Vonkajšia aplikácia 25-metylén zlúčeniny (VII), 24,25-epoxy zlúčeniny (VIII) a N-(18a)demetyl-2-deoxoparaherquamidu A je možná použitím kvapalnej dávky lieku alebo šampónu obsahujúcich 25-metylén zlúčeniny (VII), 24,25-epoxy zlúčeniny (VIII) a N-(18a)-demetyl-2deoxoparaherquamidu A v podobe vodného roztoku alebo suspenzie. Tieto formulácie všeobecne obsahujú suspenzačný prostriedok, napríklad bentonit, a normálne budú tiež obsahovať odpeňovací prostriedok. Sú prijateľné formulácie obsahujúce od 0,005 do 20 hmotnostných % aktívnej zložky. Výhodné formulácie sú tie, ktoré obsahujú od 0,5 do 5 hmotnostných % 25-metylén zlúčeniny (VII), 24,25-epoxy zlúčeniny (VIII) a N-(18a)-demetyl2-deoxoparaherquamidu A.

25-metylén zlúčeniny (VII), 24,25-epoxy zlúčeniny (VIII) a N-(18a)-demetyl-2deoxoparaherquamidu A sú primáme užitočné ako antiparazitické prostriedky na liečenie a/alebo prevenciu helmintiázy u domestikovaných zvierat, ako je hovädzí dobytok, ovce, kone, psi, mačky, kozy, prasatá a hydina. Sú tiež užitočné pri prevencii a liečení parazitických infekcií týchto zvierat spôsobených ektoparazitmi, ako sú kliešte, roztoče, vši, blchy a podobne. Sú tiež

-10účinné pri liečení parazitických infekcií ľudí. Pri liečení takýchto infekcií môžu byť 25-metylén zlúčeniny (VII), 24,25-epoxy zlúčeniny (VIII) a N-(18a)-demetyl-2-deoxoparaherquamid A použité samostatne alebo vo vzájomnej kombinácii alebo v kombinácii s inými, s nimi nesúvisiacimi antiparazitickými prostriedkami. Dávkovanie 25-metylén zlúčenín (VII), 24,25 epoxy zlúčenín (VIII) a N-(18a)-demetyl-2-deoxoparaherquamidu A požadované na dosiahnutie najlepších výsledkov závisí od radu faktorov, ako je druh a veľkosť zvieraťa, typ a závažnosť infekcie, spôsob aplikácie a použité špecifické 25-metylén zlúčeniny (VII), 24,25-epoxy zlúčeniny (VM) a N-(18a)-demetyl-2-deoxoparaherquamidu A. Orálna aplikácia 25-metylén zlúčenín (VII), 24,25-epoxy zlúčenín (VIII) a N-(18a)-demetyl-2-deoxoparaherquamidu A pri dávkovaní od 0,005 do 50 mg na kg telesnej hmotnosti zvieraťa buď v jednotlivej dávke alebo v niekoľkých dávkach v odstupe niekoľko dní obecne poskytuje dobré výsledky. Jednotlivá dávka jednej z 25-metylén zlúčenín (VII), 24,25-epoxy zlúčenín (VIII) a N-(18a)-demetyl-2deoxoparaherquamidu A normálne dáva výbornú kontrolu, avšak opakované dávky sa môžu opakovať v prípade opakovanej infekcie alebo parazitných druhov, ktoré sú obzvlášť odolné. Techniky podávania 25-metylén zlúčenín (VII), 24,25-epoxy zlúčenín (VIII) a N-(l8a)-demetyl2-deoxoparaherquamidu A sú odborníkom veterinárom známe.

25-metylén zlúčeniny (VII), 24,25-epoxy zlúčeniny (VIII) a N-(18a)-demetyl-2deoxoparaherquamid A môžu byť tiež použité v boji so škodcami v poľnohospodárstve, ktoré napadajú úrodu buď na poliach, alebo pri uskladnení. Pre tento spôsob použitia sú 25-metylén zlúčeniny (VII), 24,25-epoxy zlúčeniny (VIH) a N-(18a)-demetyl-2-deoxoparaherquamid A aplikované ako spreje, prášok, emulzie a podobne, buď na rastúce rastliny, alebo na úrodu po zbere. Techniky aplikácie 25-metylén zlúčeniny (VII), 24,25-epoxy zlúčeniny (VIH) a N-(18a)demetyl-2-deoxoparaherquamid A týmto spôsobom sú odborníkom v poľnohospodárstve známe.

Presné dávkovanie a frekvencia podávania závisí na použití špecifických 25-metylén zlúčenín (VII), 24,25-epoxy zlúčenín (VM) a N-(18a)-demetyl-2-deoxoparaherquamidu A, konkrétnom stave a jeho závažnosti, veku, hmotnosti, všeobecnej fyzickej kondícii konkrétneho pacienta. Ďalšie liečenie jednotlivca môže sa uskutočniť známym postupom a môže byť presnejšie stanovené meraním hladiny v krvi alebo koncentrácie 25-metylén zlúčenín (VII),

24,25-epoxy zlúčenín (VIH) a N-(18a)-demetyl-2-deoxoparaherquamidu A v pacientovej krvi a/alebo pacientovej odozvy na konkrétne liečebné podmienky.

Definície a konvencie

Definície a vysvetlenia ďalej uvedené platia pre termíny použité v celom dokumente, tak v opise, ako i v nárokoch.

Chemické vzorce predstavujúce rôzne zlúčeniny alebo fragmenty molekúl v opise a nárokoch môžu obsahovať navyše okrem presne definovaných štruktúrnych znakov rôzne substituenty. Tieto premenné substituenty sú označené písmenom alebo písmenom nasledovaným dolným indexom, napríklad, Zf alebo Rj,kde i je celé číslo. Tieto rôzne substituenty sú buď jednomocné, alebo dvoj mocné, to znamená, že predstavujú skupinu naviazanú na vzorec jednou alebo dvoma chemickými väzbami. Napríklad, skupina Zj by predstavovala dvojmocnú premennú, pokiaľ by bola naviazaná na vzorec CH3-C(=Zi)H. Skupiny Rj a Rj by predstavovali jednomocné premenné substituenty, pokiaľ by boli naviazané na vzorec CH3-CH2-C(Rj)(Rj)-H. Pokiaľ sú chemické vzorce napísané v lineárnej podobe tak, ako tie vyššie uvedené, sú premenné substituenty obsiahnuté v zátvorkách naviazané na atóm bezprostredne naľavo od premenného substituenta uzavretého v zátvorke. Pokiaľ sú dva alebo viac po sebe idúce rôzne substituenty uzatvorené v zátvorkách, potom každý z týchto po sebe idúcich rôznych substituentov je naviazaný bezprostredne na predchádzajúci ľavý atóm, ktorý nie je uzatvorený v zátvorkách. Vo vyššie uvedenom vzorci sú teda obidve skupiny Rj a Rj naviazané na predchádzajúci uhlíkový atóm. Tiež u akejkoľvek molekuly s určeným systémom značenia uhlíkových atómov, napríklad steroidov, sú tieto uhlíkové atómy označené ako Q, kde i je celé číslo odpovedajúce číslu uhlíkového atómu. Napríklad, C5 predstavuje 6. polohu alebo číslo uhlíkového atómu v steroidnom jadre, tak ako je to tradične zvykom označovať v steroidnej chémii. Podobne označenie Ró predstavuje premenný substituent (buď jednomocný, alebo dvojmocný) v polohe Cg.

Chemické vzorce alebo ich časti napísané v lineárnej podobe predstavujú atómy v lineárnom reťazci. Symbol všeobecne označuje väzbu medzi dvoma atómmi v reťazci. CH3-O-CH2-CH(Rj)-CH3_? teda predstavuje zlúčeninu 2-substituovaný-l-metoxypropán. Podobným spôsobom predstavuje symbol = dvojitú väzbu, napríklad CH2=C(Ri)-O-CH3, a symbol trojitú väzbu, napríklad HCsC-CH(Rj)-CH2-CH3. Karbonylové skupiny sú označované buď jedným, alebo druhým spôsobom: -CO- alebo -C(=O)-, pričom prvý spôsob je výhodný pre svoju jednoduchosť.

Chemické vzorce cyklických (kruhových) zlúčenín alebo molekulových fragmentov môžu byť zobrazené v lineárnej podobe. Teda, zlúčenina 4-chlór-2-metylpyridín môže byť zobrazená

-12v lineárnej podobe N*=C(CH3)-CH=CC1-CH=C*H za predpokladu, že atómy označené hviezdičkou (*) sú vzájomne naviazané, za tvorby kruhu. Podobne môže byť cyklický molekulový fragment 4-(etyl)-l-piperazinyl zobrazený ako -N*-(CH2)2-N(C2H5)-CH2-C*H2·

Rigídna cyklická (kruhová) štruktúra ktorejkoľvek tu uvedenej zlúčeniny definuje orientáciu substituentov naviazaných na každý uhlíkový atóm tejto rigídnej cyklickej zlúčeniny vzhľadom na rovinu kruhu. U nasýtených zlúčenín, ktoré majú dva substituenty naviazané na uhlíkový atóm, ktorý je súčasťou kruhového systému, -C(Xi)(X2)-, môžu byť tieto dva substituenty buď v axiálnej, alebo ekvatoriálnej polohe vzhľadom na kruh a môžu sa meniť -- medzi týmito axiálne/ ekvatoriálne. Avšak, poloha týchto dvoch substituentov vzhľadom na kruh a k sebe navzájom zostáva nemenná. Zatiaľ čo každý substituent môže niekedy ležať v rovine

kruhu (ekvatoriálne) skôr než nad alebo pod jeho rovinou (axiálne), je jeden substituent vždy nad tým druhým. V chemických štruktúrnych vzorcoch, znázorňujúcich takéto zlúčeniny, bude substituent (Xj), ktorý je pod ďalším substituentom (X2) označovaný tak, že sa nachádza v alfa (a) konfigurácii a je označovaný prerušovanou čiarkovanou alebo bodkovanou čiarou, ktorá vedie k uhlíkovému atómu, to znamená, symbolom — alebo Odpovedajúci substituent naviazaný nad (X]) druhým substituentom (X2) je označovaný tak, že sa nachádza v beta (β) konfigurácii a je označovaný neprerušovanou čiarou vedúcou k uhlíkovému atómu.

Pokiaľ je premenný substituent dvojmocný, môžu byť tieto valencie považované za spoločné alebo oddelené alebo obe definované ako premenné. Napríklad premenná Rj naviazaná na uhlíkový atóm ako -C(=Ri)- môže byť dvojmocná a byť definovaná ako oxo alebo keto (a tak tvoriť karbonylovú skupinu (-CO-)) alebo ako dva oddelene naviazané jednomocné premenné substituenty α-Rj.j a β-Ri-k Pokiaľ je dvojmocná premenná Rj definovaná tak, že sa skladá z dvoch jednomocných premenných substituentov, potom je konvencia použitá k definícii dvojmocnej premennej vo forme a-Rj-j.p-Rj-k alebo v niektorom jeho variante. V takomto prípade sú tak a-Rj_j, ako β-Ri-k naviazané na uhlíkový atóm za vzniku -C(-Rj_j)(-Rj_ic)-. Napríklad, ak je dvojmocná premenná R^, -C(=Rô)- definovaná tak, že sa skladá z dvoch jednomocných premenných substituentov, potom tieto dva jednomocné premenné substituenty sú α-Κ$_):β-^2» 0--^-9^-^0-10. a tak ďalej, poskytujúce -C(a-R6_i)$-R6_2)-, ....-C(aRó-9)(P-Rô-10)·» ^a tak ďalej. Podobne, pre dvojmocnú premennú R]], -C(=R]])-, sú dva jednomocné premenné substituenty o--Rii-bP-Rii-2· Vyššie uvedená konvencia sa používa u kruhového substituenta, u ktorého neexistuje oddelená orientácia a a β (napríklad z dôvodu

-13prítomnosti dvojitej väzby uhlík-uhlík v kruhu) a u substituenta naviazaného na uhlíkový atóm, ktorý nie je súčasťou kruhu, s tým, že značenie a a β sú vynechané.

Tak ako dvojmocná premenná môže byť definovaná ako dva oddelené jednomocné premenné substituenty, tak môžu byť dva oddelené jednomocné premenné substituenty definované tak, že spoločne tvoria dvojmocnú premennú. Napríklad, vo vzorci -Ci(Rj)HC2(Rj)H- (C] a C2 označuje ľubovolný prvý a druhý uhlíkový atóm) Rj a Rj môžu byť definované tak, že spolu tvoria (1) druhú väzbu medzi Cj a C2, alebo (2) dvojmocnú skupinu, napríklad oxa (-O-), a tým označujú epoxid. Pokiaľ sú R; a Rj vzaté dohromady za tvorby komplexnejšej entity, ako je skupina -X-Y-, potom orientácia tejto entity je taká, že Cj vo vyššie uvedenom vzorci je naviazané na X a C2 je naviazané na Y. Teda, podľa konvencie formulácie ... Rj a Rj sú vzaté dohromady za tvorby -CH2-CH2-O-CO- ... znamená laktón, v ktorom karbonyl je naviazaný na C2. Avšak, keď Rj a Rj sú spojené spolu za tvorby -CO-O-CH2-CH2, potom podľa konvencie znamená laktón, v ktorom je karbonyl naviazaný na C).

Počet uhlíkových atómov v rôznych substituentoch sa označuje jedným z dvoch spôsobov. Prvá metóda používa prefix pred úplným názvom premennej ako je C1-C4, kde 1 a 4 sú celé čísla predstavujúce minimálny a maximálny počet uhlíkových atómov v premennej. Prefix je oddelený od premennej medzerou. Napríklad, C1-C4 alkyl predstavuje alkyl obsahujúci od 1 do 4 uhlíkových atómov (včítane jeho izomérnych foriem, pokiaľ nie je výslovne označené inak). Kdekoľvek je tento jednoduchý prefix uvedený, potom označuje celkový počet uhlíkových atómov premennej, ktorá je definovaná. Teda C2-C4 alkoxykarbonyl označuje skupinu CH3(CH2)_n-0-C0-, kde n je nula, jedna alebo dve. Podľa druhé metódy sa označuje oddelene počet uhlíkových atómov len každej časti tejto definície uzatvorením označenia Cj-Cj do zátvoriek a jeho umiestnením bezprostredne (bez medzery) pred časť označenia, ktoré je definované. Podľa tejto voliteľnej konvencie má označenie (C|-C3)alkoxykarbonyl rovnaký význam ako označenie C2-C4alkoxykarbonyl, pretože C1-C3 označuje len počet uhlíkových atómov alkoxyskupiny. Podobne ako C2-C6 alkoxyalkyl tak (Ci-C3)alkoxy(Ci-C3)alkyl definujú alkoxyalkylové skupiny obsahujúce od 2 do 6 uhlíkových atómov. Tieto dve definície sa líšia tým, že prvá definícia umožňuje, aby buď samotná časť alkoxy, alebo samotná časť alkyl obsahovala 4 alebo 5 uhlíkových atómov, zatiaľ čo druhá definícia limituje každú z týchto skupín na 3 uhlíkové atómy.

-14Pokiaľ nároky obsahujú doslova komplexný (cyklický) substituent, potom bude na konci frázového pomenovania/označenia tohto jednotlivého substituenta záznam (v zátvorkách), ktorý bude odpovedať tomu menu/označeniu v jednej zo schém. To tiež bude ďalej obsahovať chemický štruktúrny vzorec tohto jednotlivého substituenta.

Π. Definície

Všetky teploty sú v stupňoch Celzia.

THF označuje tetrahydrofurán.

DMSO označuje dimetylsulfoxid.

LDA označuje lítium diizopropylamid.

TEA označuje trietylamín.

DMF označuje dimetylformamid.

Soľný roztok označuje vodný nasýtený roztok chloridu sodného.

Chromatografia (kolónová a blesková (flesh) chromatografia) označuje čistenie/separáciu zlúčenín vyjádrenú ako (nosič, eluent). Tým sa rozumie, že vhodné frakcie sú spájané a skoncentrované za vzniku požadovaných zlúčenín.

NMR označuje nukleárnu (protónovú) magnetickú rezonančnú spektroskopiu, chemické posuny sú označené v ppm (δ) v smere klesajúceho poľa od tetrametylsilánu.

-φ označuje fenyl (CeHs).

MS označuje hmotnostnú spektroskopiu, vyjadrenú ako m/e, m/z alebo hmotnosť/dávkovacia jednotka. [M+H]⁺ označuje kladný ión východiskového plus vodíkového atómu. EI označuje elektrónový náraz. CI označuje chemickou ionizáciu. FAB označuje bombardovanie rýchlymi atómmi.

HRMS označuje hmotnostnú spektroskopiu s veľkým rozlíšením.

Éter označuje dietyléter.

Pojem farmaceutický prijateľné označuje tie vlastnosti a/alebo látky, ktoré sú prijateľné pre pacienta z farmakologického/toxikologického hľadiska a vyrábajúcim farmaceutickým chemikom z fyzikálneho/chemického hľadiska posudzujúceho zloženie, formulácie, stability, prijatie pacientom a bioužitočnosť.

- 15Pokiaľ sa použili dvojice rozpúšťadiel, potom sú uvedené pomery použitých rozpúšťadiel ako objem/objem (v/v).

Pokiaľ sa používa rozpustnosť tuhej látky v rozpúšťadle, potom je pomer tuhej látky k rozpúšťadlu uvedený ako hmotnosť/objem (wt/v).

_ ukazuje, že existujú dve možné orientácie pre pripojenú skupinu, (1) a alebo β, keď je pripojená k steroidnému kruhu a (2) cis alebo trans, keď je pripojená k uhlíkovému atómu s dvojitou väzbou.

UC#### odkazuje na číslo abcd Upjohn kultúry.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Bez ďalšieho upresnenia sa predpokladá, že odborník v danej oblasti môže, za použitia predchádzajúceho opisu, realizovať vynález v plné šírke. Nasledujúce podrobné príklady opisujú, ako sa pripravia rôzne zlúčeniny a/alebo uskutočňujú rôzne postupy podľa vynálezu. Mali by byť chápané len ako ilustrujúce a nie ako limitujúce k predchádzajúcemu opisu vynálezu. Odborníci v danej oblasti ihneď rozlíšia vhodné zmeny v postupoch, vzhľadom na použité reagujúce zlúčeniny, reakčné podmienky a techniky.

Príprava 1

16-Jod-17-kyanomarkfortín A ako zmes diastereoizomérov (vzorec 5)

Tuhý dikyán jodid (11,7 g, 76,5 mmol) sa pridá k roztoku markfortínu A (10,5 g, 22 mmol) v chloroforme (150 ml) a reakčná zmes sa zahrieva pod spätným chladičom, dokiaľ sa všetok markfortín A nespotrebuje (asi 5 hodín). Výsledná zmes sa ochladí na 20-25 °C, zriedi sa dichlórmetánom (100 ml), premyje sa nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného a potom roztokom siričitanu sodného. Organická fáze sa oddelí, vysuší nad síranom horečnatým a skoncentruje sa do sucha. Výsledná surová tuhá látka sa podrobí chromatografii (silikagél, etylacetát/hexán, 3:2) za vzniku titulnej zlúčeniny.

Príprava 2

16,17-Dehydro-17-kyanomarkfortín A (vzorec 6)

16-Jód-17-kyanomarkfortín A (príprava 1, 9,5 g, 15 mmol) sa rozpustí v metanole (150 ml) Q a pridá sa vodný roztok hydroxidu draselného (45%, 3 ml). Reakčná zmes sa mieša pri 20-25 C 2 hodiny. Pridá sa voda a výsledná biela zrazenina sa odfiltruje, premyje sa vodou a suší sa cez noc za zníženého tlaku, čím sa získa titulná zlúčenina.

-16Príprava 3

17-Ketomarkfortín A (vzorec 7)

Oxid seleničitý (2,9 g, 26 mmol) sa pridá k roztoku 16,17-dehydro-17-kyanomarkfortínu A (príprava 2, 6,0 g, 10 mmol) v 95% etanole (100 ml) a reakčná zmes sa mieša pri 20-25 °C 2 hodiny. Reakcia sa zastaví pridaním nasýteného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (100 ml). Výsledná zmes sa extrahuje dichlórmetánom (2 x 200 ml). Extrakty sa zmiešajú, vysušia (síran horečnatý) a skoncentrujú na surový materiál. Ten sa čistí preparatívnou chromatografiou na tenkej vrstve (silikagél, etylacetát), za vzniku titulnej zlúčeniny. HRMS (FAB) M/Z [M+H] vypočítaná pro C28H33N3O5+H: 492,2498; nameraná: 492,2478.

Alternatívne a výhodnejšie je možné nárokovanú zlúčeninu syntetizovať za použitia ptoluénsulfónovej kyseliny. Tak sa monohydrát p-toluénsulfónovej kyseliny (1 g) pridá do roztoku 16,17-dehydro-17-kyanomarkfortínu A (10 g) v 95% metanole (50 ml) a reakčná zmes sa mieša pri 20-25 °C 1 hodinu. K zmesi sa pridá trietylamín (2 ml) a rozpúšťadlo sa odparí. Zvyšok sa rozotrie s 10% vodným roztokom uhličitanu sodného (100 ml) a tuhá látka sa odfiltruje a suší sa, za vzniku titulnej zlúčeniny ako tuhej látky (90% výťažok).

Príprava 4

15,16-Dehydro-17-ketomarkfortín A (vzorec 8)

Roztok diizopropylamidu Iítneho sa pripraví z roztoku n-butyllítia (1,6 M, 9,9 ml, 15,4 mmol) vhexáne a diizopropylamíne (2,2 ml, 15,7 mmol). Tento roztok sa zriedi bezvodým tetrahydrofuránom (THF, 20 ml) a ochladí na -78 °C. Po kvapkách sa pridá roztok 17ketomarkfortínu A (príprava 3, 2,0 g, 4,1 mmol) vbezvodom THF (20 ml) a reakčná zmes sa nechá zahrievať na -40 °C počas 1 hodiny. Zmes sa znovu ochladí na -78 °C a po kvapkách sa pridá roztok fenyl seléniumchloridu (19 mg, 5,2 mmol) v THF (10 ml). Po 5 minútach sa reakcia zastaví pridaním nasýteného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, extrahuje sa dichlórmetánom, suší sa (síran horečnatý) a skoncentruje sa, za vzniku tuhej látky, ktorá sa použije bez ďalšieho čistenia. Tento materiál sa rozpustí v THF (150 ml) a reaguje s peroxidem vodíku (30%, 1,5 ml) pri 0 °C. Chladiaci kúpeľ sa odstráni a reakčná zmes sa mieša po dobu 30 minút pri 20-25 °C. Reakcia sa zastaví pridaním hydroxidu sodného (IN, 100 ml). Zmes sa extrahuje dichlórmetánom (2 X 200 ml). Extrakty sa zmiešajú, vysušia (síran horečnatý) a zkoncentrujú sa za vzniku surového produktu. Tento materiál sa čistí chromatografiou (silikagél, etylacetát), za

-17vzniku titulnej zlúčeniny. HRMS (FAB) M/Z [M+H] vypočítaná pro C28H31N3O5+H: 490,2342; nameraná: 490,2345.

Príprava 5

14a-Hydroxy-15,16-dehydro-17-ketomarkfortín A (vzorec 9a)

Použitie oxaziridínovej chémie:

Roztok bis(trímetylsilyl)amidu draselného v toluéne (0,5 M, 1 ml, 0,5 mmol) sa pridá po kvapkách do roztoku 15,16-dehydro-17-ketomarkfortínu A (príprava 4, 66 mg, 0,14 mmol) v THF (2 ml) pri -78 °C. Výsledná zmes sa nechá zahriať na -40 °C počas 1 hodiny. Reakčná zmes sa ochladí na -78 °C, mieša sa 15 minút, a potom sa po kvapkách pridá roztok 2fenylsulfonyl-3-fenyloxaziridínu (42 mg, 0,16 mmol) v THF (2 ml). Zmes sa mieša 5 minút a potom sa reakcia zastaví pridaním hydrogenuhličitanu sodného. Zmes sa extrahuje dichlórmetánom (2 x 25 ml). Extrakty sa zmiešajú, vysušia (síran horečnatý) a skoncentrujú za vzniku surového produktu. Tento produkt sa prečistí preparatívnou tenkovrstvou chromatografiou (silikagél, etylacetát), za vzniku titulnej zlúčeniny. HRMS (FAB), M/Z [M+H] vypočítaná pre C28H31N3O6+H: 506,2291; nameraná: 506,2280. Získa sa tiež 14,15-dehydro16-hydroxy-17-ketomarkfortín A (14 mg, 20%).

Príprava 6

14a-Hydroxy-15,16-dehydro-17-ketomarkfortín A (vzorec 9a), 15,16-dehydro-14,17diketomarkfortín A (vzorec 11) a 14,15-dehydro-16,17-diketomarkfortín A (vzorec 24), použitie oxidu seleničitého.

15.16- Dehydro-17-ketomarkfortín A (príprava 4,1,29 g, 2,6 mmol) sa rozpustí v p-dioxáne (30 ml) a pôsobí sa oxidom seleničitým (390 mg). Zmes sa refluxuje 1 hodinu a rozpúšťadlo sa odparí za zníženého tlaku. Zvyšok sa rozotrie s dichlórmetánom (30 ml) a sfíltruje sa. Filtrát sa koncentruje a zvyšok sa podrobí chromatografii (silikagél, metanol/etylacetát 1:20) za vzniku 14a-hydroxy-15,16-dehydro-17-ketomarkfbrtínu A (430 mg, 32 %) ako tuhá látka. Z chromatografíe sa tiež získa 15,16-dehydro-14,17-diketomarkfortín A (vzorec 11, 212 mg, 16 %) atiež 14,15-dehydro-16,17-diketomarkfortín A (vzorec 24, 106 mg, 8 %).

Príprava 7

15.16- Dehydro-14,17-diketomarkfortín A (vzorec 11)

14a-Hydroxy-15,16-dehydro-17-ketomarkfortín A (príprava 6, 60 mg, vzorec 9a) sa rozpustí v dichlórmetáne (10 ml) a reaguje s oxidem manganičitým (60 mg). Zmes sa mieša pri 20-25 °C 1 hodinu a skoncentruje sa. Preparatívna tenkovrstvá chromatografia zvyšku (silikagél, dichlórmetán/etylacetát, 50/50) dá titulnú zlúčeninu.

Príprava 8

14a-Hydroxymarkfortín A (vzorec 10)

14a-Hydroxy-15,16-dehydro-17-ketomarkfortín A (príprava 6, 20 mg, 0,040 mmol) sa rozpustí vTHF (5 ml) a reaguje s roztokom tetrahydridohlinitanu lítneho (IM, 0,11 ml, 0,11 mmol) vTHF pri 0 °C. Zmes sa mieša 0,5 hodiny pri 0 °C a potom sa pridá roztok hydrogenuhličitanu sodného (10%). Zmes sa extrahuje dichlórmetánom (2 x 10 ml). Extrakty sa zmiešajú, vysušia (síran horečnatý) a rozpúšťadlo sa odstráni za zníženého tlaku. Preparatívnou tenkovrstvou chromatografiou zvyšku (silikagél, ιηβίβηοΐ/βίγ^οβΐέζ 10/90) sa získa titulná zlúčenina, HRMS (FAB), M/Z [M+H] vypočítaná pre C28H35N3O5+H = 494,2655; nameraná = 494,2653.

Príprava 9

14a-Hydroxy-17-ketomarkfortín A (vzorec 12a)

14<x-Hydroxy-15,16-dehydro-17-ketomarkfortín A (vzorec 9a, príprava 6, 50 mg, 0,1 mmol) sa rozpustí v THF (5 ml) a reaguje s roztokom trietylhydroboritanu lítneho v THF (IM, 0,7 ml) pri -78 °C. Zmes sa mieša 0,5 hodiny pri -78 °C. Reakcia sa zastaví pridaním metanolu (1 ml) a zmes sa skoncentruje. Výsledná tuhá látka sa podrobí chromatografii (silikagél, metanol/dichlórmetán 1/20), za vzniku titulnej zlúčeniny. HRMS (FAB) M/Z [M+H] vypočítaná pre C28H33N3O6+H. 508,2447; nameraná: 508,2437.

Príprava 10

Príprava 14a-Hydroxy-17-ketomarkfortínu A (vzorec 12a) a 14P-hydroxy-17ketomarkfortínu A z 15,16-dehydro-14,17-diketomarkfortínu A (vzorec 11)

15,16-Dehydro-14,17-diketomarkfortín A (vzorec 11, príprava 6, 470 mg, 0,93 mmol) sa rozpustí v THF a pôsobí sa roztokom tetrahydroboritanu lítneho v THF (IM, 2 ml) pri 20-25 °C. Zmes sa mieša 2 hodiny a potom sa pridá roztok hydrogenuhličitanu sodného (10%). Zmes sa extrahuje dichlórmetánom (2 x 20 ml). Extrakty sa zmiešajú, vysušia sa (síran horečnatý) a rozpúšťadlo sa odparí. Zvyšok obsahuje zmes dvoch epimérov, ktoré sa dajú ľahko oddeliť chromatografiou (silikagél, metanol/etylacetát 1/20) 14a-hydroxy-17-ketomarkfortín A (90 mg, 19 %) a 143-hydroxy-17-ketomarkfortín A (94 mg, 20 %).

Príprava 11

Príprava 14a-hydroxymarkfortínu A (vzorec 10) z 14a-hydroxy-17-ketomarkfortínu A (vzorec 12a)

14<x-hydroxy-17-ketomarkfortín A (vzorec 12a, príprava 10, 413 mg, 0,81 mmol) sa rozpustí v THF (20 ml) a reaguje s roztokom bóran-THF komplexu v THF (IM, 2,43 ml) pri 0 °C. Zmes sa mieša 2,25 hodiny. Zmes sa mieša 0,5 hodiny a potom sa pridá metanol (3 ml). Po odparení rozpúšťadla sa zvyšok podrobí chromatografii (silikagél, 1:16 metanol: etylacetát), za vzniku titulnej zlúčeniny.

Príprava 12

14,17-Diketomarkfortín A (vzorec 13)

Roztok oxalylchloridu (0,040 μΐ) v bezvodom dichlórmetáne (5 μΐ) reaguje s dimetylsulfoxidom (0,045 μΐ) pri -78 °C. Zmes sa mieša 1 hodinu pri -78 °C. Po kvapkách sa pridá roztok 14a-hydroxy-17-ketomarkfortínu A ((príprava 11, 27 mg) v dichlórmetáne (2 ml). Reakčná zmes sa mieša 20 minút pri -78 °C. Pridá sa trietylamin (0,3 ml) a reakčná zmes sa nechá zahriať na 20-25 °C počas 20 minút. Zmes sa rozdelí medzi 10% uhličitan sodný (10 ml) a dichlórmetán (10 ml). Organická vrstva sa oddelí, suší sa (síran horečnatý) a skoncentruje sa. Zvyšok sa podrobí chromatografii (silikagél, 1:20 metanol.dichlórmetán), za vzniku titulnej zlúčeniny. HRMS (FAB) M/Z [M+H] vypočítaná pre C28H31N3O6+H: 506,2291; nameraná: 506,2280.

Príprava 13

17-ketomarkfortín A (vzorec 14a)

Roztok 14,17-diketomarkfbrtínu A (príprava 12, 16 mg, 0,032 mmol) v dichlórmetáne (5 ml) pri -78 °C reaguje s roztokom metylmagnézium bromidu (3M, 0,16 ml, 0,48 mmol) v éteri pri -78 °C. Výsledná zmes sa mieša 0,5 hodiny pri -78 °C. Reakcia sa zastaví pridaním 10% uhličitanu sodného (niekoľko kvapiek). Zmes sa zriedi dichlórmetánom (10 ml), suší (síran horečnatý) a koncentruje sa. Zvyšok sa podrobí chromatografii (silikagél, 1:20 metanol: dichlórmetán), za vzniku 14a-hydroxy-14P-metyl-17-ketomarkfortínu A (8 mg, 50 %, Rf =

-200,25). HRMS (FAB) M/Z [M+H] vypočítaná pre C29H35N3O6+H: 522,2604; nameraná: 522,2620. Z vrstvy sa tiež získa 14P-hydroxy-14a-metyl-17-ketomarkfortín A (1,2 mg, 7 %, Rf = 0,4). HRMS (FAB) M/Z [M+H] vypočítaná pre C29H35N3O6+H: 522,2604; nameraná: 522,2630. Takto získaný pomer produktov 6:1 sa zvýši na viac ako 50:1 a výťažok vzrastie na 80%, pokiaľ sa použije ako reakčné rozpúšťadlo THF namiesto dichlórmetánu.

Príprava 14

14a-hydroxy-14P-metylmarkfortín A (vzorec 15)

Roztok 14a-hydroxy-14P-metyl-17-ketomarkfortínu A (príprava 13, 5 mg, 0,01 mmol) v THF (5 ml) reaguje s roztokom tetrahydridohlinitanu lítneho (IM, 0,03 ml, 0,03 mmol) v THF pri 0 °C. Zmes sa mieša 0,5 hodiny pri 0 °C a potom sa pridá roztok hydrogenuhličitanu sodného (10%). Zmes sa extrahuje dichlórmetánom (2x5 ml). Extrakty sa zmiešajú, vysušia (síran horečnatý) a rozpúšťadlo sa odparí. Preparatívnou tenkovrstvou chromatografiou zvyšku (silikagél, 1:20 metanol:dichlórmetán) sa získa titulná zlúčenina. HRMS (FAB), M/Z [M+H] vypočítaná pre C29H37N3O5+H: 508,2811; nameraná: 508,2816.

Príprava 15

14-Ketomarkfortín A (vzorec 16)

Roztok oxalylchloridu (0,150 μΐ) vbezvodom dichlórmetáne (20 ml) reaguje s DMSO (0,170 ml) pri -78 °C. Zmes sa mieša 1 hodinu pri -78 °C. Po kvapkách sa pridá roztok 14a-hydroxymarkfortínu A (príprava 11,110 mg) v dichlórmetánu (5 ml). Reakčná zmes sa mieša 20 minút pri -78 °C. Pridá sa trietylamín (1 ml) a reakčná zmes sa nechá zahriať na 20-25 °C počas 20 minút. Zmes sa rozdelí medzi 10% uhličitan sodný (20 ml) a dichlórmetán (20 ml). Organická vrstva sa oddelí, vysuší sa (síran horečnatý) a skoncentruje sa. Zvyšok sa podrobí chromatografii (silikagél, 1:25 metanokdichlórmetán), za vzniku titulnej zlúčeniny. HRMS (FAB) M/Z [M+H] vypočítaná pre C28H33N3O5+H: 492,2498; nameraná: 492,2510.

Príprava 16

14β-Hydroxymarkfortín A (vzorec 17)

Roztok 14-ketomarkfortínu A (príprava 15, 10 mg) vmetanole (2 ml) reaguje s tetrahydroboritanom sodným (5 mg) pri 0 °C. Zmes sa mieša 0,5 hodiny pri 0 °C a potom sa pridá roztok hydrogenuhličitanu sodného (10%). Zmes sa extrahuje dichlórmetánom (2x10 ml).

-21Extrakty sa zmiešajú, vysušia (síran horečnatý) a rozpúšťadlo sa odparí. Preparatívnou tenkovrstvou chromatografiou (silikagél, 1:16 metanol:etylacetát) sa získa titulná zlúčenina. HRMS (FAB), M/Z [M+H] vypočítaná pre C28H35N3O5+H: 494,2655; nameraná: 494,2653.

Príprava 17

N-Oxid 14a-hydroxymarkfortínu A (vzorec 18)

Na roztok 14a-hydroxymarkfortínu A (príprava 11, 15 mg) v dichlórmetáne (3 ml) sa pôsobí m-chlórperoxybenzoovou kyselinou (15 mg) pri 0 °C. Zmes sa mieša 0,5 hodiny pri 0 °C, a potom reaguje s trietylamínom (0,03 ml) a skoncentruje sa. Preparatívnou tenkovrstvou chromatografiou (silikagél, 1:8 metanol.dichlórmetán) sa získa titulná zlúčenina. HRMS (FAB), M/Z [M+H] vypočítaná pre C28H35N3O6+H: 510,2604; nameraná: 510,2615.

Príprava 18

14a-Hydroxy-143-etylmarkfortín A (vzorec 19)

Na roztok 14-ketomarkfortínu A (príprava 15, 25 mg, 0,05 mmol) v THF (5 ml) pri -78 °C sa pôsobí roztokom etylmagnéziumbromidu (3 M, 0,15 ml, 0,45 mmol) v éteri pri -78 °C. Výsledná zmes sa mieša 0,5 hodiny pri -78 °C. Reakčná zmes sa nechá zahriať na 20-25 °C počas 20 minút. Reakcia sa zastaví pridaním 10% uhličitanu sodného (niekoľko kvapiek). Zmes sa zriedi dichlórmetánom (10 ml), vysuší sa (síran horečnatý) a skoncentruje sa. Zvyšok sa podrobí chromatografii (silikagél, 1:20 metanol:dichlórmetán), za vzniku titulnej zlúčeniny. HRMS (FAB), M/Z [M+H] vypočítaná pre C3QH39N3O5+H: 522,2968; nameraná: 522,2983.

Príprava 19

Príprava 14P-metylmarkfortínu A z 14a-hydroxy-14p-metylmarkfortínu A

Roztok bis(trimetylsilyl)amidu draselného v toluéne (0,5 M, 1 ml, 0,5 mmol) sa pridá po kvapkách do roztoku 14a-hydroxy-14P-metylmarkfortínu A (vzorec 15, príprava 14, 66 mg, 0,14 mmol) v THF (2 ml) pri -78 °C. Výsledná zmes sa nechá zahriať na -40 °C počas 1 hodiny. Reakčná zmes sa ochladí na -78 °C, mieša sa 15 minút a potom sa po kvapkách pridá roztok fenylchlórtionomravčanu (0,094 ml, 0,7 mmol) v THF (2 ml). Po 10 minútach sa odstráni kúpeľ suchého ľadu. Po ďalšom priebehu reakcie, trvajúcom 3 hodiny, sa reakcia zastaví pridaním hydrogenuhličitanu sodného. Zmes sa extrahuje dichlórmetánom (2 x 25 ml). Extrakty sa zmiešajú, vysušia (síran horečnatý) a skoncentrujú sa za vzniku surového materiálu. Ten sa čistí

-22preparatívnou tenkovrstvou chromatografiou (silikagél, etylacetát) za vzniku 14a-Ofenoxytiokarbonyl-143-metylmarkfortínu A.

K roztoku 14a-0-fenoxytiokarbonyl-143-metylmarkfortínu A (64 mg, 0,1 mmol) v toluéne (5 ml) sa pridá ABBN (2,2'-azabisizobutyromtril, 3,3 mg), a potom tributylcín hydrid (0,054 ml, 0,2 mmol). Zmes sa refluxuje 3 hodiny. Po odparení rozpúšťadla sa zvyšok čisti preparatívnou tenkovrstvou chromatografiou (silikagél, etylacetát) za vzniku 14βmetylmarkfortínu A.

Príprava 20

Alternatívna syntéza 17-ketomarkfortínu A (vzorec 7)

K markfortínu A (65 g, 0,136 mol) a hydrogenuhličitanu sodnému (137 g, 1,63 mol) v tetrahydrofuráne (THF, 2 1) a vody (1,25 1) sa po kvapkách pri reflexe pridá roztok jódu (206 g, 0,81 mol) v THF (1,25 1) v priebehu jednej hodiny. (Alternatívne sa môže zmes miešať 16 hodín

Q pri 20-25 C). Potom, ako sa reakčná zmes nechá pomaly ochladiť na laboratórnu teplotu (2,5 hodiny), sa reakcia zastaví pridaním nasýteného roztoku tiosíranu sodného (1,5 1) a extrahuje sa etylacetátom (2 X 1 1). Zmiešané organické fázy sa premyjú nasýteným roztokom tiosíranu sodného (11), vysušia (síran horečnatý), sfiltrujú, odparí a suší cez noc vo vákuovej sušiarni (65 °C) za vzniku 62 g surového 17-ketomarkfortínu A (vzorec 7). NMR (300 MHz, CDCI3): 7,68,

0,90 6.

Alternatívne, je možné použiť namiesto jódu chlorid jódny (JC1).

Príprava 21

16-Ditiofenyl-17-ketomarkfortín A (vzorec 20)

Surový 17-ketomarkfortín A (príprava 20, 5 g, 10,2 mmol) sa pridá cez kanylu ponorenú do THF (150 ml) pri -78 °C do roztoku LDA, ktorý sa pripraví pridaním n-butyllítia (1,6 M, 24,8 ml, 0,04 mol) po kvapkách do roztoku diizopropylamínu (5,7 ml, 0,041 mol) v THF (100 ml) pri 0 °C. Reakčná zmes sa nechá v priebehu jednej hodiny pomaly ohriať na -50 °C. Na výslednú zmes sa potom pôsobí fenyldisulfidom (4,4 g, 0,02 mol). Reakcia sa okamžite zastaví pridaním nasýteného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (100 ml) a extrahuje sa dichlórmetánom (300 ml). Organická fáze sa vysuší (síran horečnatý), skoncentruje (8 g) a chromatografuje (silikagél, 120 g, etylacetát/hexán 60/40), za vzniku titulnej zlúčeniny. MS (FAB) = 708 (M+ H); NMR

-23(300 MHz, CDC1₃) 7,74, 7,71, 7,64, 7,45-7,30, 6,81, 6,72, 6,32, 4,91, 3,70, 3,16, 3,01, 2,75, 2,53,2,35,2,15-1,50, 1,47, 1,45, 1,06 a 0,82 δ.

Príprava 22

16-Tiofenyl-16-sulfoxyfenyl-17-ketomarkfortín A (vzorec 21)

K 16-ditiofenyl-17-ketomarkfortínu A (príprava 21, 10 g, 14 mmol) v dichlórmetáne (250 ml) pri -78 °C sa v dusíkovej atmosfére po kvapkách pridá roztok m-chlórperoxybenzoovej kyseliny (64%, 4,2 g, 15,5 mmol) v dichlórmetáne (200 ml) počas 15 minút. Reakcia sa okamžite zastaví pridaním nasýteného roztoku tiosíranu sodného (200 ml), zriedi nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného (200 ml) a extrahuje sa do dichlórmetánu (200 ml). Sušenie (síran horečnatý) nasledované koncentráciou za zníženého tlaku dá titulnú zlúčeninu. NMR (300 MHz, CDC1₃) 8,0-7,29, 6,80,6,70, 6,31,4,90, 3,68,3,41, 3,14, 3,07, 2,82,2,80-2,65, 2,16,2,05-1,1,1,47,1,43,0,96 a 0,83 δ.

Príprava 23

16-Tiofenyl-15,16-dehydro-17-ketomarkfortín A (vzorec 22)

Surový 16-tiofenyl-16-sulfoxyfenyl-17-ketomarkfortín A (vzorec 21, príprava 22, 11 g) sa refluxuje v toluéne (250 ml) po dobu 45 minút, potom sa ochladí na 20-25 °C, zriedi nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného (300 ml) a extrahuje sa etylacetátom (300 ml). Organická vrstva sa vysuší (síran horečnatý) a skoncentruje sa, za vzniku titulnej zlúčeniny. MS (FAB) = 598 (M + H); HRMS M/Z (M⁺ +H, C₃4H₃₅N₃O₅S +H0, vypočítaná 598,2376, nameraná 598,2387. NMR (300 MHz, CDC1₃) 8,18, 7,55-7,45, 7,29-7,45, 6,83, 6,70, 6,34, 5,92, 4,91, 3,87,3,30, 3,21,3,08, 2,80,2,35,2,10,2,03, 1,78, 1,46, 1,44, 1,11 a 0,88 δ.

Príprava 24

16-Sulfoxyfenyl-15,16-dehydro-17-ketomarkfortín A (vzorec 23)

K surovému 16-tiofenyl-15,16-dehydro-17-ketomarkfortínu A (vzorec 22, príprava 23,

10,6 g) v dichlórmetáne (300 ml) pri -78 °C sa po kvapkách pridá roztok mchlórperoxybenzoovej kyseliny (64%, 2,8 g) v dichlórmetáne (125 ml). Reakcia sa zastaví pridaním nasýteného roztoku tiosíranu sodného (300 ml) a nasýteného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (300 ml), a potom sa extrahuje dichlórmetánom (300 ml). Organická vrstva sa vysuší (síran horečnatý), sfiltruje a skoncentruje sa, za vzniku titulnej zlúčeniny. NMR (300 MHz, CDCI3) 7,75-7,3, 6,81, 6,75-6,6, 6,31, 4,90, 3,78-3,58, 3,22, 2,98, 2,88-2,45,2,12-1,55, 1,46, 1,44, 1,12 a 0,88 Ô.

Príprava 25

14a-Hydroxy-15,16-dehydro-17-ketomarkfortín A (vzorec 9a)

K surovému 16-sulfoxyfenyl-15,16-dehydro-17-ketomarkfortínu A (vzorec 23, príprava

24,13 g) vo vodnom roztoku metanolu (10/1,300 ml) sa pridá dietylamin (15 ml). Potom, ako sa reakčná zmes refluxuje 0,5 hodiny, sa táto zmes ochladí na 20-25 °C, zriedi vodou (450 ml) a extrahuje sa do dichlórmetánu (500 ml). Sušenie (síran horečnatý), po ktorom nesleduje skoncentrovanie a chromatografia (silikagél, 130 g, acetón/dichlórmetán 30/70) dá titulnú zlúčeninu.

Príprava 26

14a-Hydroxy-14P-vinylmarkfortín A (vzorec 30)

Roztok 14-ketomarkfortínu A (vzorec 16, príprava 15, 200 mg, 0,4 mmol) vTHF (5 ml) 0 o pri -78 C reaguje s roztokom vinylmagnéziumbromidu (1 M, 4,0 ml, 4 mmol) v THF pri -78 C. Výsledná zmes sa mieša 2 hodiny pri -78 °C a potom sa zahreje na 20-25 °C. Pri 20-25 °C sa mieša 2 hodiny. Reakcia sa zastaví pridaním 10% uhličitanu sodného (3 ml). Zmes sa zriedi dichlórmetánom (30 ml), premyje sa nasýteným roztokom chloridu amónneho, vysuší (síran horečnatý) a skoncentruje sa. Zvyšok sa podrobí chromatografii (silikagél, 6:4 hexán:acetón), za vzniku titulnej zlúčeniny. NMR (300 MHz, CDCI3) 7,86, 6,78 & 6,67, 6,32, 6,58, 5,43, 5,18, 4,89, 3,7, 3,11,2,95, 2,8-1,5, 1,44, 1,08 a 0,82 δ. MS (FAB) M/Z [M + H] = 520.

' Príprava 27 • N-Oxid 14a-hydroxy-14P-metylmarkfortínu A (vzorec 32)

Na roztok 14a-hydroxymarkfortínu A (príprava 11, 30 mg) v dichlórmetáne (3 ml) sa pôsobí m-chlórperoxybenzoovou kyselinou (20 mg) pri 0 °C. Zmes sa mieša 0,5 hodiny, potom sa rozdelí medzi 5% vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (10 ml) a dichlórmetán (20 ml). Vrstvy sa oddelia, a vodná vrstva sa extrahuje dichlórmetánom (10 ml). Zmiešané extrakty sa vysušia síranom horečnatým, sfiltrujú a odparia vo vákuu pri 0 °C, nechajú sa zreagovať s trietylamínom (0,030 ml) a skoncentrujú sa, za vzniku titulnej zlúčeniny. NMR (300 MHz,

-25CD₃OD) 6,91 & 6,70, 6,36, 4,91, 4,08 & 3,76, 3,5-3,1, 3,12, 2,8-1,6, 1,46 & 1,44, 1,50 a 0,93 (s, 3Η)δ.

Príprava 28

14a-Hydroxy-15a-metylmarkfortín A (vzorec 35)

14a-Hydroxy-15a-metyl-17-ketomarkfortín A (príprava 32, 90 mg, 0,18 mmol) rozpustený v THF (10 ml) reaguje s bóran-dimetylsulfídovým komplexom (12 M, 0,18 ml) pri 0 °C. Zmes sa mieša 2 hodiny pri 0 °C, potom sa pridá metanol (0,4 ml) a mieša sa ďalšiu hodinu. Po odparení rozpúšťadla sa zvyšok podrobí chromatografii (silikagél, 30:70 acetón:dichlórmetán), za vzniku titulnej zlúčeniny. NMR (300 MHz, CDCI3) 8,39, 6,79 & 6,70, 6,36,4,91, 3,81, 3,67, 3,03, 3,11, 2,68 & 1,86, 2,7-1,2, 1,44, 1,02, 1,11 a 0,85 δ. HRMS (FAB), M/Z [M + H] vypočítaná pre C29H37N3O5 + H: 508,2811; nameraná: 508,2840.

Príprava 29

14,17-Diketo-15a-metylmarkfortín A (vzorec 36)

Roztok oxalylchloridu (0,040 ml) vbezvodom dichlórmetáne (5 ml) reaguje sDMSO (0,045 ml) pri -78 °C. Zmes sa mieša po dobu 1 hodiny pri -78 °C. Po kvapkách sa pridá roztok 14a-hydroxy-15a-metyl-17-ketomarkfortínu A (príprava 33, 27 mg) v dichlórmetáne (2 ml). Reakčná zmes sa mieša 20 minút pri -78 °C. Pridá sa tríetylamín (0,3 ml) a reakčná zmes sa nechá ohriať na 20-25 °C počas 20 minút. Zmes sa rozdelí medzi 10% uhličitan sodný (10 ml) a dichlórmetán (10 ml). Organická vrstva sa vysuší (síran horečnatý) a skoncentruje. Zvyšok sa podrobí chromatografii (silikagél, 1:20 metanokdichlórmetán), za vzniku titulnej zlúčeniny. HRMS (FAB, M/Z, [M+H]) vypočítaná pre C28H31N3O6 + H: 506,2291; nameraná: 506,2280.

Príprava 30

14a-Hydroxy-14p-metyl-15a-metyl-17-ketomarkfortín A (vzorec 37)

Na roztok 14,17-diketo-15a-metylmarkfortínu A (príprava 29, 25 mg, 0,05 mmol) v dichlórmetáne (5 ml) sa pri -78 °C pôsobí roztokom metylmagnéziumbromidu (3 M, 0,2 ml, 0,6 mmol) v éteri pri -78 °C. Výsledná zmes sa mieša 0,5 hodiny pri -78 °C. Reakcia sa zastaví pridaním 10% uhličitanu sodného (niekoľko kvapiek). Zmes sa zriedi dichlórmetánom (10 ml), vysuší sa (síran horečnatý) a skoncentruje sa. Zvyšok sa podrobí chromatografii (silikagél, metanol/dichlórmetán, 4/96), čím sa získa titulná zlúčenina. NMR (300 MHz, CDCI3) 8,13,

Príprava31

14a-Hydroxy-14P-mety]-15a-rnetylmarkfortín A (vzorec 38)

Na 14a-hydroxy-14P-metyl-15a-metyl-17-ketomarkfortín A (príprava 30, 15 mg, 0,028 mmol) rozpustený v THF (10 ml) sa pôsobí bóran-dimetylsulfidovým komplexom (10 M, 0,02 ml) pri 0 °C. Zmes sa mieša 2 hodiny pri 0 °C, potom sa pridá metanol (0,4 ml) a mieša sa ďalšiu 1 hodinu. Po odparení rozpúšťadla sa zvyšok podrobí chromatografii (silikagél, 30:70 acetón: dichlórmetán), za vzniku titulnej zlúčeniny. NMR (300 MHz, CDCI3) 7,82, 6,79, 6,67,

Príprava 32

14a-Hydroxy-15a-metyl-17-ketomarkfortín A (vzorec 34)

Zmes 14a-hydroxy-15,16-dehydro-17-ketomarkfortínu A (vzorec 9a, 300 mg) v THF (12 ml) reaguje s roztokom metylmagnéziumbromidu (3 M, 1,0 ml, 5 ekvivalentov) pri 20-25 °C. Výsledná zmes sa refluxuje 1,5 hodiny, potom sa ochladí na 20-25 °C. Reakcia sa zastaví pridaním nasýteného roztoku chloridu amónneho (30 ml), premyje sa nasýteným roztokom chloridu amónneho, suší sa nad síranom horečnatým a skoncentruje sa. Koncentrát sa podrobí chromatografii (silikagél, metanol/ dichlórmetán, 1/20), za vzniku titulnej zlúčeniny. NMR (300 MHz, CDCI3) 7,90, 6,80 & 6,70, 6,32, 4,89, 4,36 3,74, 3,20 3,06, 2,78 & 2,10, 2,5-1,8, 1,46 & 1,44, 1,13, 1,12 a 0,88 Ô.

H

Alternatívne sa titulná zlúčenina môže pripraviť s použitím dimetylmeďnatanu litneho. K jodidu mednému (0,4 g, 0,002 mmol) v THF pri 0 °C sa pridá po kvapkách metyllítium (1,4M, 9 ml, 0,002 mol). Vzniklá zmes sa mieša 15 minút, potom sa pridá po kvapkách pri 0 °C 14ahydroxy-15,16-dehydro-17-ketomarkfortín A (vzorec 9a, 0,5 g, 0,001 mol)) v THF (12 ml) pri 0 °C. Po 15 minútach miešania sa reakcia zastaví nasýteným roztokom chloridu amónneho (25 ml) a extrahuje sa do etylacetátu (30 ml). Organický extrakt sa suší nad síranom horečnatým, sfiltruje sa a skoncentruje sa, čim sa získa surový materiál, ktorý sa čistí chromatotrónom (4mm doska, metanol/ dichlórmetán, 4/96), za vzniku titulnej zlúčeniny.

-27Príprava 33

14,17-Diketo-15a-metylmarkfortín A (vzorec 36)

Zmes oxalylchloridu (0,040 ml) vbezvodom dichlórmetáne (5 ml) reaguje sDMSO (0,045 ml) pri -78 °C. Zmes sa mieša 1 hodinu pri -78 °C. Po kvapkách sa pridá roztok 14ahydroxy-15a-metyl-17-ketomarkfortínu A (príprava 32, 27 mg) v dichlórmetáne (2 ml). Reakčná zmes sa mieša 20 minút pri -78 °C. Pridá sa trietylamín (0,3 ml) a reakčná zmes sa nechá zahriať na 20-25 °C počas 20 minút. Zmes sa rozdelí medzi 10% uhličitan sodný (10 ml) a dichlórmetán (10 ml). Fázy sa oddelia a organická vrstva sa suší nad síranom horečnatým a skoncentruje sa. Koncentrát sa podrobí chromatografíi (silikagél, 1:20 metanokdichlórmetán), za vzniku titulnej zlúčeniny. HRMS (FAB, M/Z, [M+H]) vypočítaná pre C28H31N3O6+H: 50,2291; nameraná: 506,2280.

Príklad 1

24,25,26,27,28-Pentanormarkfortín A (Π)

Markfortín A (I, 8,5 g, 0,018 mol) sa rozpustí v kyseline mravčej (95% čistota, 100 ml). Zmes sa mieša pri 20-25 °C 16 hodín. Prchavé zložky sa odstránia a zvyšok sa znovu rozpustí v metanole (100 ml). Zmes sa koncentruje a zvyšok sa čistí chromatograficky (silikagél; metanol/dichlórmetán 10/90), za vzniku titulnej zlúčeniny, NMR (300 MHz, CDCI3+CD3OD) 0,80 1,09,1,4-2,0,2,2-2,8, 3,10,3,87, 6,52 a 6,61 8; MS (FAB, m/z [M + H]⁺ = 412.

Príklad 2

7-O-Prenyl-24,25,26,27,28-pentanormarkfortín A (ΠΙ)

K 4-bróm-2-metyl-2-buténu (1,0 ml g, 8,7 mmol) a jodidu draselnému (1,44 g, 8,7 mmol), ktoré sa miešali v acetóne (40 ml) 5 minút, sa pridá uhličitan draselný (1,6 g, 11,7 mmol) a potom po kvapkách 24,25,26,27,28-pentanormarkfortín A (Π, príklad 1, 1,2 g, 0,0029 mmol) v acetóne/vode (10 ml/ 6 ml). Reakčná zmes sa mieša 0,25 hodiny, potom sa reakcia ukončí nasýteným roztokpm siričitanu sodného (100 ml) a extrahuje sa do etylacetátu (100 ml). Organická vrstva sa vysuší síranom horečnatým, sfiltruje sa a skoncentruje sa za zníženého tlaku, za vzniku titulnej zlúčeniny. NMR (400 MHz, CDCI3) 7,90, 6,79, 6,57, 5,50, 4,49, 3,70, 3,10,

2,99,2,66, 1,83,2,55-2,5,2,39,2,14,1,95-1,30, 1,76,1,61, 1,10 a 0,81 δ.

Príklad 3

7-O-(2',3'-Epoxy-3'-metyl)butyl-24,25,26,27,28- pentanormarkfortín A (IV)

K 7-O-prenyl-24,25,26,27,28-pentanormarkfortínu A (ΙΠ, príklad 3, 1,4 g, 2,9 mmol) v dichlórmetáne (30 ml) sa pri 20-25 °C sa pridá v jednej dávke kyselina 3chlórperoxybenzoová. Po 0,5 hodine miešania sa pridá siričitan sodný (6 g v 50 ml vody) a miešanie pokračuje 0,5 hodiny. Reakcia sa zastaví hydrogenuhličitanom sodným (nasýtený, 100 ml) a extrahuje sa do etylacetátu (100 ml). Organický extrakt sa oddelí a vysuší sa síranom horečnatým, sfiltruje sa a skoncentruje sa a chromatografuje sa (silikagél; acetón/dichlórmetán, 40/60), za vzniku titulnej zlúčeniny ako zmesi diastereoizomérov, ktorá sa použije bez ďalšieho čistenia. NMR (400 MHz, CDCI3) 8,52, 8,44, 6,82, 6,59, 4,56-4,47, 3,92-3,84, 3,69, 3,26-3,14, 3,11,3,01, 2,70-2,55,2,39,2,30,2,15, 1,98-1,50, 1,41, 1,40-1,20, 1,10,0,82 a 0,81 δ.

Príklad 4

25-hydroxy-24,25-dihydromarkfortín A (V)

K 7-O-(2',3'-epoxy-3'-metyl)butyl-24,25,26,27,28- pentanormarkfortínu A (IV, 1,2 g, 2,4 mmol) v THF (30 ml) sa pri 20-25 °C v dusíkovej atmosfére pridá po kvapkách chlorid ciničitý (0,2 ml). Po 0,25 hodine miešania sa reakcia zastaví fluoridom draselným (10% vodný roztok, 50 ml) a extrahuje sa do etylacetátu (100 ml). Organický extrakt sa oddelí a vysuší sa nad síranom horečnatým, sfiltruje sa a skoncentruje sa, za vzniku titulnej zlúčeniny ako zmesi diastereoizomérov, ktorá sa použije bez ďalšieho čistenia. Vybrané NMR (400 MHz, CDCI3) 8,17, 7,87, 6,80-6,45, 6,59, 4,40, 4,25,4,05-3,90 a 3,15 δ.

Príklad 5

24,25-Dihydro-25-oxomarkfortín A (VI)

K oxalylchloridu (0,045 ml) v dichlórmetáne (5 ml) sa pri -78 °C pridá pomaly po kvapkách DMSO (0,06 ml) v dichlórmetáne (1 ml). Po 0,25 hodine miešania pri -78 °C sa pridá po kvapkách 25-hydroxy-24,25-dihydromarkfortín A (V, príklad 4, 60 mg, 0,12 mmol) v dichlórmetáne (1 ml). Reakčná zmes sa mieša 0,25 hodiny, potom sa reakcia ukončí ΊΈΑ (0,25 ml) a mieša sa 0,25 hodiny pri 20-25 °C. Reakčná zmes sa rozdelí medzi hydrogenuhličitan sodný (nasýtený, 25 ml) a etylacetát. Organický extrakt sa oddelí a suší sa nad síranom horečnatým, sfiltruje sa, skoncentruje sa a chromatografuje sa (silikagél; metanol/dichlórmetán (5/95)), za vzniku titulnej zlúčeniny. NMR (400 MHz, CDCI3) 7,45, 6,77, 6,64,4,89, 3,70, 3,11,

-293,02, 2,70, 1,85, 2,65, 2,40, 2,31, 2,15, 1,95 - 1,85, 1,80 -1,0, 1,53, 1,51, 1,13 a 0,85 δ; HRMS (FAB, MZZ) [M + H] vypočítaná pre C28H35N3O5 + H = 494,2655, nameraná = 494,2662.

Príklad 6

24,25-Dihydro-25-metylénmarkfortín A (VII)

K metyltrifenylfosfónium bromidu (70 mg, 0,2 mmol) v éteri (5 ml) pri 20-25 °C sa pridá po kvapkách n-butyllítium (1,6 M v hexáne, 0,2 mmol, 0,13 mi). Vzniklá zmes sa mieša 5 minút pri 20-25 °C v dusíkovej atmosfére a potom sa pridá po kvapkách 24,25-dihydro-25oxomarkfortín A (VI, príklad 5, 25 mg, 0,05 mmol) v THF (5 ml). Reakčná zmes sa mieša 0,25 hodiny, reakcia sa ukončí vodou (25 ml) a extrahuje sa etylacetátom (25 ml). Organický extrakt sa oddelí a suší sa nad síranom horečnatým, sfíltruje sa, skoncentruje sa a chromatografuje sa (silikagél; acetón/hexán, 40/60), za vzniku titulnej zlúčeniny. NMR (400 MHz, CDCI3) 7,67,

1,20,1,44 & 1,42 a 1,10 & 0,80 δ; HRMS (FAB, M/Z) [M + H] vypočítaná pre C29H37N3O4 +

H = 492,2862, nameraná = 492,2858.

Príklad 7

24.25- Epoxymarkfortín A (VIII)

Zmes markfortínu A (I, 0,25 g, 0,5 mmol) a m-chlórperoxybenzoovej kyseliny (čistota 60 %, 0,4 g, 1,4 mmol) sa mieša 16 hodín v dichlórmetáne (25 ml). Reakčná zmes reaguje sa siričitanom sodným (1,1 g v 15 ml vody) a v miešaní sa pokračuje 0,5 hodiny. Reakcia sa zastaví hydrogenuhličitanom sodným (nasýtený, 100 ml) a extrahuje sa do dichlórmetánu (25 ml). Organický extrakt sa vysuší nad síranom horečnatým, sfíltruje sa, skoncentruje sa a chromatografuje sa (silikagél; acetón/dichlórmetán, 40/60), za vzniku titulnej zlúčeniny, ako nerozdeliteľnej zmesi diastereoizomérov. Vybrané NMR (400 MHz, CDCI3) 8,01 & 7,86, 6,80 & 6,58, 5,36-5,30 & 3,00-2,97, 3,70,3,12, 2,69 & 1,85 a 2,40 δ.

Príklad 8

24.25- Dihydro-25-metylénparaherquamid A (VII)

Podľa všeobecného postupu príkladov 1-6 a s nekritickými obmenami, ale vychádzajúc z ppp A sa pripraví titulná zlúčenina.

Príklad 9

14a-Hydroxy-14P-metyl-24,25-dihydro-25-metylénparaherquamid A (VII)

-30Podľa všeobecného postupu príkladov 1-6 a s nekritickými obmenami, ale vychádzajúc z 14a-hydroxy-14P-metylmarkfortínu A sa pripraví titulná zlúčenina.

Príklad 10

14a-Hydroxy-15a-metyl-24,25-dihydro-25-metylénmarkfortín A (VII)

Podľa všeobecného postupu príkladov 1-6 a s nekritickými obmenami, ale vychádzajúc z 14a-hydroxy-15a-metylmarkfortínu A sa pripraví titulná zlúčenina.

Príklad 11

24,25-Epoxyparaherquamid A (VIII)

Podľa všeobecného postupu príkladu 7 a s nekritickými obmenami, ale vychádzajúc z paraherquamidu A sa pripraví titulná zlúčenina.

Príklad 12

14a-Hydroxy-14P-metyl-24,25-epoxymarkfortín A (VIII)

Podľa všeobecného postupu príkladu 7 a s nekritickými obmenami, ale vychádzajúc z 14ahydroxy-14p-metylmarkfortínu A sa pripraví titulná zlúčenina.

Príklad 13

14a-Hydroxy-15a-metyl-24,25-epoxymetylén markfortín A (VII)

Podľa všeobecného postupu príkladu 7 a s nekritickými obmenami, ale vychádzajúc z 14ahydroxy-15a-metylmarkfbrtínu A sa pripraví titulná zlúčenina.

Príklad 14

N-(18a)-Demetyl-2-deoxoparaherquamid A (spôsob 1)

Podľa všeobecného postupu opísaného v Intemational Publication WO 92/00300 sa (18a)demetylparaherquamid A (50 mg, 0,1 mmol) sa rozpustí v etylénglykoldimetyl éteri (glyme, 5 ml) a vody (0,5 ml). Tato zmes potom reaguje s tetrahydroboritanom lítnym(0,15 g, 6,9 mmol) a zahrieva sa na teplotu refluxu 5 hodín. Reakcia sa zastaví soľankou (25 mi) a extrahuje sa do etylacetátu. Organická vrstva sa oddelí a vysuší sa nad síranom horečnatým, sfiltruje sa a skoncentruje sa. Koncentrát sa čistí chromatograficky na silikagéli, za vzniku N-(18a)-demetyl2-deoxoparaherquamidu A.

-31Príklad 15

N-(18a)-Demetyl-2-deoxoparaherquamid A (spôsob 2)

N-(18a)-Demetyl-2-deoxoparaherquamid A sa dá pripraviť vychádzajúc z paraherquamidu A jeho premenou na 2-deoxoparaherquamid A postupom popísaným vWO 97/03988 sa 2deoxoparaherquamid A (10 mg) sa pridá do rýchle rastúcich kultúr (100 ml) Cunninghamella enichulata subsp. elegans (UUC7602) alebo C. enichulata (UUC7330) v 500 ml bankách so širokým hrdlom. Inkubuje sa pri 28 °C a trepanie pokračuje 1-3 dni podľa kultúry. Tým vznikne N-(18a)-demetyl-2-deoxoparaherquamid A. Izolácia sa dosiahne extrakciou dichlórmetánom, odstredením a odstránením rozpúšťadiel za zníženého tlaku. Zvyšný materiál sa analyzuje TLC a také HPLC. Čistenie sa dosiahne rôznymi chromatografíckýmí technikami a potvrdenie štruktúry sa dosiahne NMR a MS.

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. 25-metylén zlúčeniny všeobecného vzorca (VII) (VII) (I) markfortín A (a) n je 1, (b) R14 je Ri4_a:R143> ^{kde R}14ot Í^{e H a R}14pÍ^e (c) ^Ri5 je Ri5_a:Ri5p, kde Ri5_a je -H a Risp je -H, (II) paraherquamid A (a) n je 0, (b) R14 je Ri4a^R14p>^{kde R}14a J^e -°^{H a} *14β í^e -^CH3>

   (c) R15 je Ri5_a:Ri5p, kde ^R15aÍ^{e _H a R}15β J^e (III) 14-hydroxy-14-alkylmarkfortín A (a) n je 1, (b) R]4 je Ri4_a:^Ri4p, kde ^Ri4_a je -OH a Ri4p je C4-C4 alkyl, (c) ^r15 je^R15a^:R15p»^kdeRi5_aje-HaRi5p je-H, (IV) 14-hydroxy-15-alkylmarkfortín A (a) n je 1, (b) Rj4 je Ri4_a:^Ri4p, kde ^Ri4_a je -OH a R^p je -H, (c) K15 je Κ·ΐ5α^;Κ·15β» kde R]5_a je C4-C4 alkyl a Rjsp je -H a ich farmaceutický prijateľné soli.
2. 2. 25-metylén zlúčeniny všeobecného vzorca (VII) podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že farmaceutický prijateľné soli sú soli vybrané zo skupiny tvorenej kyselinami metánsulfónovou, chlorovodíkovou, bromovodíkovou, sírovou, fosforečnou, dusičnou, benzoovou, citrónovou, vinnou, filmárovou, maleínovou, CH3-(CH2)n-COOH, kde n je 0 až 4, H00C-(CH2)n-C00H, kde n je rovnaké ako je predtým definované.
3. 3. 25-metylén zlúčeniny všeobecného vzorca (VH) podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že nj je 0.
4. 4. 25-metylén zlúčeniny všeobecného vzorca (VII) podľa nároku 3, vyznačujúce sa tým, že ide o 24,25-dihydro-25-metylénparaherquamid A.
5. 5. 25-metylén zlúčeniny všeobecného vzorca (VII) podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že n] je 1.
6. 6. 25-metylén zlúčeniny všeobecného vzorca (VR) podľa nároku 5, vyznačujúce sa tým, že sú vybrané za skupiny pozostávajúcej z

   24,25-dihydro-25-metylénmarkfortínu A

   14a-hydroxy-14P-metyl-24,25-dihydro-25-metylénmarkfortínu A a

   14a-hydroxy-l 5a-metyl-24,25-dihydro-25-metylénmarkfortínu A
7. 7. 25-metylén zlúčenina všeobecného vzorca (VR) podľa nároku 6, vyznačujúca sa tým, že ide o 24,25-dihydro-25-metylénmarkfortín A.
8. 8. 24,25-epoxy zlúčeniny všeobecného vzorca (VRI) (VIII)

   -38kde:

   (I) markfortín A (a) n je 1, (b) R14 je Ri4_a:Ri4^ kde Ri4_a je -H a R^ je H, (c) R15 j^eRI5a^R15P> kdeRj5_a je-HaRisp je-H, (Π) paraherquamid A »· (a)njeO, ,, (b) R]4 je Ri4_a:Ri4p, kde R^ je -OH a Ri4p je -CH3, (c) R]5 jeRi5_a:Ri5^kdeR_15a je-HaRisp je H, (III) 14-hydroxy-14-alkylmarkfortín A (a) njel, (b) R14 je Ri4_a:Ri4p, kde R]_4a je -OH a Ri4p je C]-C₄ alkyl, (c) R] 5 jeRi5_a:Ri5p, kdeRi5_aje-HaRi5p je-H, (IV) 14-hydroxy-15-alkylmarkfortín A (a) njel, (b) R₁₄ je Ri4a^;R14p. kde R_14a je -OH a Ri4p je -H, • (c) R] 5 je R15a^:R15p. kde R]5_a je C4-C4 alkyl a Rjsp je -H a ich farmaceutický *

   , prijateľné soli.
9. 9. 24,25-Epoxy zlúčeniny všeobecného vzorca (VlH) podľa nároku 8, vyznačujúce sa tým, že farmaceutický prijateľné soli sú soli vybrané za skupiny tvorenej kyselinami metánsulfónovou, chlorovodíkovou, bromovodíkovou, sírovou, fosforečnou, dusičnou, benzoovou, citrónovou, vinnou, fúmarovou, maleínovou, CH3-(CH2)n-COOH, kde n je 0 až 4, HOOC-(CH2)n-COOH, kde n je rovnaké ako je definované vyššie.
10. 10. 24,25-Epoxy zlúčeniny všeobecného vzorca (VIII) podľa nároku 8, kde n] je 0.
11. 11. 24,25-Epoxy zlúčenina všeobecného vzorca (VIII) podľa nároku 10, vyznačujúca sa tým, že ide o 24,25-epoxyoparaherquamid A.
12. 12. 24,25-Epoxy zlúčeniny všeobecného vzorca (Vili) podľa nároku 8, vyznačujúce sa tým, že nj je 1.
13. 13. 24,25-Epoxy zlúčeniny všeobecného vzorce (VIII) podľa nároku 12, vyznačujúce sa tým, že sú vybrané zo skupiny pozostávajúcej z 24,25-epoxymarkfortínu A,
14. 14a-hydroxy-14P-metyl-4,25-epoxymarkfortínu A,

    14a-hydroxy-14a-metyl-24,25-epoxymarkfortínu A,

    14. 24,25-Epoxy zlúčenina všeobecného vzorca (VIII) podľa nároku 13, vyznačujúca sa tým, že to je 24,25-epoxymarkfortín A.
15. 15. N-(18a)-Demetyl-2-deoxoparaherquamid A a jeho farmaceutický prijateľné soli.