SK182016U1 - Súprava chemikálií na detekciu patogénnych baktérií v potravinách - Google Patents

Abstract

Opísaná je je súprava chemikálií na detekciu patogénnych baktérií v potravinách, ktorá obsahuje 5 oddelene zabalených roztokov: tlmivý roztok s obsahom horečnatej soli, roztok deoxyribonukleotidov, roztok termostabilnej DNA polymerázy, roztok oligonukleotidov pre real-time PCR špecifickú pre patogén a demineralizovaná voda molekulárno-biologickej čistoty.

Description

Názov technického riešenia

Súprava chemikálií na detekciu patogénnych baktérií v potravinách

Oblasť techniky

Technické riešenie sa týka molekulárno-biologickej detekcie patogénnych baktérií v potravinách.

Doterajší stav techniky

V súčasnosti je opísaných alebo vyrábaných viacero súprav chemikálií na detekciu patogénnych baktérií v potravinách založených na polymerázovej reťazovej reakcii (PCR). Tieto sa od navrhovaného technického riešenia líšia chemickým zložením roztokov a usporiadaním komponentov:

- Súprava A sa skladá z 3 roztokov (1. roztok nešpecifikovaného zloženia, ktorý obsahuje zmes oligonukleotidov vrátane oligonukleotidov označených fluorescenčnými farbivami, 2. reakčná zmes nešpecifikovaného zloženia, 3. negatívna kontrolná vzorka nešpecifikovaného zloženia).

- Súprava B sa skladá zo 4 roztokov (1. reakčná zmes nešpecifikovaného zloženia, 2. roztok DNA polymerázy, 3. pozitívna kontrolná vzorka, 4. voda molekulárno-biologickej čistoty).

- Súprava C sa skladá z 5 roztokov (1. roztok nešpecifikovaného zloženia, ktorý obsahuje zmes oligonukleotidov vrátane oligonukleotidov označených fluorescenčnými farbivami, 2. roztok nešpecifikovaného zloženia obsahujúci DNA polymerázu, 3. interná amplifikačná kontrolná vzorka, 4. pozitívna kontrolná vzorka, 5. voda molekulárno-biologickej čistoty), pričom súprava neobsahuje negatívnu kontrolnú vzorku.

- Súprava D sa skladá zo 6 roztokov (1. roztok na detekciu nešpecifikovaného zloženia, 2. interná amplifikačná kontrolná vzorka, 3. pozitívna kontrolná vzorka, 4. reakčná zmes nešpecifikovaného zloženia, 5. riediaci tlmivý roztok na nukleové kyseliny nešpecifikovaného zloženia, 6. roztok fluorescenčného farbiva ROX).

Existujúce súpravy obsahujú kumulované zmesi nešpecifikovaných komponentov, ktoré neumožňujú korektnú validáciu súpravy v podmienkach rutinného použitia v laboratóriách analýzy potravín.

Podstata technického riešenia

Súprava chemikálií na detekciu patogénnych baktérií v potravinách sa používa na prípravu reakčnej zmesi pre polymerázovú reťazovú reakciu s priebežným monitorovaním fluorescencie (real-time PCR), ktorou sa vykonáva detekcia patogénnych baktérií v potravinách. Špecifické zameranie pre konkrétny patogén sa určuje zložením roztoku oligonukleotidov. Súprava chemikálií obsahuje 5 oddelene zabalených roztokov: 1. tlmivý roztok s obsahom horečnatej soli, 2. roztok deoxyribonukleotidov, 3. roztok termostabilnej DNA polymerázy, 4. roztok oligonukleotidov pre real-time PCR špecifickú pre patogén, 5. demineralizovaná voda molekulárno-biologickej čistoty. Obsah jednotlivých skúmaviek sa zmieša v pomere určenom priloženým pracovným postupom a k zmesi sa pridá vzorka DNA získanej z potraviny. Vykoná sa real-time PCR a výsledok sa vyhodnotí podľa priložených písomných pokynov. Výhodami technického riešenia sú vysoká selektivita a citlivosť detekcie, pri dlhodobej skladovateľnosti súpravy bez použitia chemických stabilizátorov. Technické riešenie sa od existujúcich súprav líši v počte a zložení komponentov, a v dosiahnutí dlhodobej skladovateľnosti bez použitia chemických stabilizátorov.

Príklady uskutočnenia

Príklad 1 - Súprava chemikálií na detekciu Listería monocytogenes v potravinách

Súprava na analýzu 96 vzoriek na prítomnosť Listería monocytogenes v potravinách pozostáva z 5 mikroskúmaviek s roztokmi biochemikálií. Mikroskúmavky sú s objemom 1,5 ml alebo 2,0 ml, vyrobené z plastu, so skrutkovacím uzáverom a tesnením zo silikónovej gumy, molekulárno-biologickej čistoty. Všetky roztoky sú pripravené v demineralizovanej vode molekulárno-biologickej čistoty. Mikroskúmavka obsahujúca roztok D je nepriepustná pre svetlo. Pre zjednodušenie používania pri analýze v rutinnej praxi sú jednotlivé mikroskúmavky farebne odlíšené.

Obsah súpravy:

1. Roztok A - tlmivý roztok s obsahom horečnatej soli (700 μΙ): 0,5 mol/l Tris-HCI (pH 9,0),

16,1 mmol/l MgCI₂

2. Roztok B - roztok deoxyribonukleotidov (50 μΙ): 10 mmol/l dATP, 10 mmol/l dGTP, 10 mmol/l dCTP, 10 mmol/l dTTP

3. Roztok C - roztok termostabilnej DNA polymerázy (30 μΙ): 5 U/μΙ Taq DNA polymeráza s teplotnou aktiváciou

4. Roztok D - zmes primérov a sondy na detekciu L. monocytogenes (80 μΙ): 10 μιηοΙ/Ι oligonukleotid LMrt3F (caa agc gag aat gtg get ata aat ga), 10 μιτιοΙ/Ι oligonukleotid LMrt3Rbis • » • »· • I • c (taa ttt ccg ctg cgc tat ccg), 7 pmol/l oligonukleotid listP (FAM-cct gga tga ega ege tcc act tgBHQ1)

5. Roztok E - demineralizovaná voda molekulárno-biologickej čistoty: 5 ml (5 x 1 ml)

Príklad 2 - Súprava chemikálií na detekciu Salmonella enteríca v potravinách

Súprava na analýzu 96 vzoriek na prítomnosť Salmonella enteríca v potravinách pozostáva z 5 mikroskúmaviek s roztokmi biochemikálií. Mikroskúmavky sú s objemom 1,5 ml alebo 2,0 ml, vyrobené z plastu, so skrutkovacím uzáverom a tesnením zo silikónovej gumy, molekulárnobiologickej čistoty. Všetky roztoky sú pripravené v demineralizovanej vode molekulárnobiologickej čistoty. Mikroskúmavka obsahujúca roztok D je nepriepustná pre svetlo. Pre zjednodušenie používania pri analýze v rutinnej praxi sú jednotlivé mikroskúmavky farebne odlíšené.

Obsah súpravy:

1. Roztok A - tlmivý roztok s obsahom horečnatej soli (700 pl): 0,5 mol/l Tris-HCI (pH 9,0),

16,1 mmol/l MgCI₂

2. Roztok B - roztok deoxyribonukleotidov (50 μΙ): 10 mmol/l dATP, 10 mmol/l dGTP, 10 mmol/l dCTP, 10 mmol/l dTTP

3. Roztok C - roztok termostabilnej DNA polymerázy (30 μΙ): 5 U/μΙ Taq DNA polymeráza s teplotnou aktiváciou

4. Roztok D - zmes primérov a sondy na detekciu S. enteríca (80 μΙ): 10 μιτιοΙ/Ι oligonukleotid Srt2F (ata aat ccg gcg gcc tga tg), 10 μιτιοΙ/Ι oligonukleotid Srt2R (tgg tat ega cgc ctt tat ctg aga), 7 μιτιοΙ/Ι oligonukleotid Srt2P (FAM-tta cac cgg agt gga tta aac ggc tgg g-BHQ1)

5. Roztok E - demineralizovaná voda molekulárno-biologickej čistoty: 5 ml (5 x 1 ml)

Claims (1)

1. hXV ΊΒ-Χοι£

   Súprava chemikálií na detekciu patogénnych baktérií v potravinách vyznačujúca sa tým, že obsahuje 5 oddelene zabalených roztokov: 1. tlmivý roztok s obsahom horečnatej soli, 2. roztok deoxyribonukleotidov, 3. roztok termostabilnej DNA polymerázy, 4. roztok oligonukleotidov pre real-time PCR špecifickú pre patogén, 5. demineralizovaná voda molekulárno-biologickej čistoty.