SK17422000A3 - Kompozöcie ¬astöc - Google Patents

Kompozöcie ¬astöc Download PDF

Info

Publication number
SK17422000A3
SK17422000A3 SK1742-2000A SK17422000A SK17422000A3 SK 17422000 A3 SK17422000 A3 SK 17422000A3 SK 17422000 A SK17422000 A SK 17422000A SK 17422000 A3 SK17422000 A3 SK 17422000A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
particle according
particle
mol
paclitaxel
hydrophobic
Prior art date
Application number
SK1742-2000A
Other languages
English (en)
Inventor
Walter Perkins
Xingong Li
Donald Hirsch
Eric Mayhew
Imran Ahmad
Shaukat Ali
Andrew Janoff
Original Assignee
The Liposome Company, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Liposome Company, Inc. filed Critical The Liposome Company, Inc.
Publication of SK17422000A3 publication Critical patent/SK17422000A3/sk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Vynález sa týka častíc obsahujúcich vysoké koncentrácie zlúčenín na terapeutické, diagnostické a iné použitie.
Doterajší stav techniky
Účinné použitie zlúčenín s liečivými účinkami si vyžaduje vytvoriť kompozície obsahujúce dostatočné množstvo zlúčenín bez väčších vedľajších účinkov. Vyskytujú sa nosiče, v ktorých je možné v dostatočných koncentráciách solubilizovať ako hydrofilné, tak i lipofilné zlúčeniny, a tieto potom podávať ako účinný liek. Avšak doteraz bol nedostatok farmaceutických nosičov, v ktorých by bolo možné účinne použiť slabo hydrofilných a súčasne slabo lipofilných zlúčenín, ako sú rôzne taxány, alkaloidy vinea, cefalosporíny a steroidy.
Jednou takou zlúčeninou je taxán paclitaxel. Jeho slabo hydrofilná/slabo lipofilná molekula je nedostatočne rozpustná v bežných farmaceutických nosičoch, ak sa z nej pripraví terapeuticky použiteľná kompozícia. Paclitaxel (TaxolR) je často bežne dostupný v „kremofor/etanolovom nosiči „CremophorREL. Avšak táto kompozícia má určité nežiadúce vedľajšie účinky v koncentráciách, zaisťujúcich účinnú terapeutickú hladinu paclitaxelu. Týmito účinkami sú napr. akútne toxicity niektorých pacientov, ktorým táto kompozícia bola podaná (viď napr. Straubinger aj., USP 5 415 869).
Straubinger aj. (viď USP 5 415 869) napríklad formuluje paclitaxel v lipozómoch, a to v limitovanom pomere paclitaxelu k lipozomálnemu lipidu. Okrem toho Straubingerova nisximálna koncentrácia paclitaxelu (viď anotácia) je značne pod hladinou koncentrácie tejto drogy akumulovanej v časticiach podľa tohto vynálezu A ďalej, Desai aj. (USP 5 439 686), Wheeler (USP 5 478 860) a AlkanOnyuksal a iní (čas. Pharmaceutical Research, strany 206 - 212) - títo všetci tiež aplikujú tieto zlúčeniny v príslušných nosičoch pri nízkych pomeroch zlúčeniny k nosiču, a pri koncentráciách menších, ako sú koncentrácie, pri ktorých je možné akumulovať tieto zlúčeniny v nosičoch podľa tohto vynálezu.
·· • · · • · · • · · · • · · ·· ·· · ·· ···· ···· ·· • · · • · · · · • · · · · · • · « · · · ·· ·· ··
Tento prihlásený vynález poskytuje takýto nosič na solubilizáciu slabo hydrofilných/slabo lipofilných zlúčenín, ako je napr. paclitaxel, že výsledné kompozície sú bezpečne použiteľné na podávanie vysokých dávok uvedených zlúčenín, a to bez neúnosných vedľajších účinkov Častice podľa vynálezu, ktorá obsahuje túto zlúčeninu vo vysokom pomere zlúčeniny k ostatným komponentom nosiča, nie je ani lipozóm, ani emulzné častice, a doteraz nebola opísaná
Podstata vynálezu
Vynález opisuje časticu zloženú z jadra, obklopeného hydrofilným/hydrofóbnym konjugátom. Jadro pozostáva zo slabo hydrofilných/slabo lipofilných zlúčenín, ako sú napr. taxány, alkaloidy vinea, bryostatíny, cyklické polypeptidy ako sú cefalosporíny, steroidálnie zlúčeniny, rifamycíny, mitomycíny, bleomyciny, benzo-naftopyranón, bis-interkalačné antibiotiká, nukleozidové antibiotiká, pyrol[1,4]benzodiazepíny, makrolidy vrátane makrolidových antibiotík ako je hamycín, bisindol-alkaloidy, kamptotecíny, etopozidy, tenipozidy, interkalátory DNA, antiestrogény, bis(benzimidazoly) a nukleozidy ako je adenín-arabinozid. Tieto zlúčeniny majú biokompatibilnú hydrofóbnu zónu, ako napr. niektorý acylový reťazec, hydrofóbny peptid alebo hydrofóbny polymérny reťazec, ktoré sú v nich buď prirodzeného pôvodu, alebo boli pripojené syntetickými prostriedkami. Alternatívne môže jadro tvoriť hydrofilná zlúčenina, na ktorej je konjugovaná (pripojená) hydrofóbna zóna, a výsledkom je, že zloženie jadra je slabo hydrofilné.
Konjugát obklopujúci jadro pozostáva z biokompatibilnej hydrofóbnej zóny a pripojenej biokompatibilnej hydrofilnej zóny. Konjugátom je buď prírodná alebo syntetická molekula, ktorá má hydrofóbnu a hydrofilnú zónu, alebo je to konjugát hydrofilnej a hydrofóbnej zóny. Vhodnými hydrofóbnymi zónami kerijugátu sú napr. oblasti acylových reťazcov v amfipatických (obojakých) lipidoch, ako aj hydrofóbne polyméry, ako silikónové polyméry a hydrofóbne peptidy. Vhodnými hydrofilnými zónami sú napr. polyetylénglykoly, celulózy, hydrofilné peptidy, polysacharidy, polyetylénoxidy, polyakrylové kyseliny, polyakrylamidy, polyvinylpyrolidóny a polymetakryláty. Vhodnými hydrofilnými zónami sú tiež polárne koncové skupiny amfipatických (obojakých) lipidov; tieto majú obyčajne kladný alebo záporný náboj, a patria medzi nich fosfatidyl-seríny, fosfatidyl-glyceroly a fosfatidické kyseliny, ako aj ···· ·· ·· ···· t · · • · · · • · · · ·· · · • · · • · : t ·· · iné lipidy, ako napr. fosfatidyl-etanolamíny, ku ktorým sú pripojené organické dikarboxylové kyseliny, ako je napr. kyselina glutarová.
Je výhodné, ak je zlúčeninou jadra taxán s pripojeným priamym nasýteným acylovým reťazcom s dĺžkou 10 až 24 atómov uhlíka, ďalej ak je konjugátom hydrofóbnej zóny fosfatidyl-etanolamin a hydrofilnej zóny hydrofilný polymér, ako je polyetylénglykol s molekulovou hmotnosťoui 50 až 5 000.
Najvýhodnejšou zlúčeninou jadra je paclitaxel s pripojeným priamym nasýteným acylovým reťazcom s dĺžkou 12, 14 alebo 16 uhlíkov a brómovaným na uhlíku alfa. Najvýhodnejším konjugátom hydrofóbnej zóny je distearoyl-fosfatidyletanolamín („DSPE“), a najvýhodnejším konjugátom hydrofilnej zóny je polyetylénglykol s molekulovou hmotnosťou 2000 („PEG2000“)·
Vynález sa tiež vzťahuje na kompozície obsahujúce tieto častice suspendované vo farmaceutický prijatelných nosičoch. Tieto kompozície sa použijú na vysoko účinné podávanie zlúčenín živočíchom, t.j. na podávanie zlúčenín vo vysokom pomere konštantným komponentom častíc. Pri takomto spôsobe podávania liekov sa dosahuje nižšia toxicita, ako pri normálnych formuláciách podobných zlúčenín. Uvedené vysokoúčinné a nízkotoxické formulácie sú použiteľné na podávanie pôsobiacich látok živočíchom, ako sú ľudia, a to na terapeutické, diagnostické a iné účely, ako napr. na ošetrenie rôznych druhov rakoviny.
Ostatné rysy, predmety a výhody vynálezu sa stanú zrejmými z podrobného opisu, ktorý nasleduje.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1. Sacharózová gradientová frakcionácia preparátu obsahujúceho DOPC,
DOPE-PEG2000 a BrC16-paclitaxel (mólový pomer 30:50:20). Os x : frakcia #; os y : A :% z celkového obsahu paclitaxelu vo vzorke:
B: koncentrácia fosfolipidu (mM).
Obr 2. Turbidita (zakalenosť) preparátu obsahujúceho DOPC:DOPE-PEG2ooo : BrC16-paclitaxel (10:10:80) a zriedeného v roztokoch s rôznym osmotickým tlakom. Os x: čas (sec), Os y: absorbancia (800 nanometrov). Trojuholníky:
···· ·· • B ··· · • · · • · · · • · · · ·· ··
9
9 9
9
H2O, tenké čiary: 75 mM NaCI; plné štvorčeky 150 mM NaCI; silné čiary. 300 mM NaCI.
Obr 3. Stabilita preparátov uložených pri teplote miestnosti. Os x: čas (dni);
Os y kritériá prípadov: O' kryštalizácia +++, 1: kryštalizácia ++, 2: kryštalizácia +; 3: bez kryštalizácie, častice niepravidelných tvarov; 4: bez kryštalizácie.
A: DOPC:DOPE-PEG2ooo : BrC16-paclitaxel (10:10:80)
B: DSPE: DOPE-PEG2000: BrC 16-paclitaxel 20:80 (plné kosoštvorčeky) alebo 10:90 (štvorčeky);
C: DOPE-PEG2ootl· BrC 16-paclitaxel 20:80 (plné kosoštvorčeky), 15:85 (štvorčeky) alebo 10:90 (hviezdička).
D: PE-PEG2000: BrC16-paclitaxel a PE-PEG5000: BrC16 paclitaxel, obidva v pomere 15:85; DPPE-PEG2000 - plné kosoštvorčeky; DOPEPEGsooo-štvorčeky; DPPE-PEG5000 - x; DMPE-PEG5000 - trojuholníky.
Obr. 4. Stabilita formulácií (15:85) uložených pri 4 °C v tme. Os x: vek formulácie (dni); Os y: príslušné prípady (legendu viď u Obr. 3 vyššie).
A: DOPE-PEG2000:BrC 16-paclitaxel.
B: DOPE-PEG5ooo:BrC16-paclitaxel.
C. DSPE-PEG2ooo:BrC16-paclitaxel.
D: DMPE-PEGsooo'BrCI6-paclitaxel. Formulácie pripravené v: deň X-5 (plný trojuholník; deň X (plný kosoštvorec); deň X+15 (štvorček); deň X+22 (kosoštvorec).
E: BrC 16-paclitaxel obsahujúci nasledujúcu formuláciu (15:85): DPPE-PEG200C (plný kosoštvorec); DMPE-PEG2000 (štvorček) ; DSPE-PEG5000 (trojuholníky); DPPE-PEG5Ooo (x) ·
Obr. 5. Stabilita preparátov po inkubácii v plazme krysy. Os x: čas (hodín).
Os y: percento zvyšného bromovaného paclitaxelu. Formulácia PE-PEG (každá v molárnom pomere 15 . 85) : (plný štvorček) DSPE-PEG2000; (plný trojuholník hore) . DPPE-PEG2000; (plný trojuholník dole) : DMPE-PEG2000. (plný kosoštvorec) : DOPE-PEG5000 % (kosoštvorec) : DOPE-PEG5000;
(štvorček) : DSPE-PEG5000: (trojuholník hore) : DPPE-PEG5Ooo; (trojuholník dole) DMPE-PEG5000 ···· ·· • · « • · « • · « • · · ·· ··
9999 ···♦ ··
Obr 6. Svetelná mikroskopia (mikrosnímky) rôznych preparátov obsahujúcich paclitaxel
A. DSPE-PEG2000: paclitaxel (molárny pomer 80:20)
B. DSPE-PEG2000: paclitaxel (80:20)
C : DOPE-PEG2000: BrC8-paclitaxel (20:80)
D: DOPE-PEG2000: BrC6-paclitaxel (20:80)
E DOPE-PEG2000 ' BrC14-paclitaxel (20:80)
F: DOPE-PEG2000. BrC12-paclitaxel (20:80)
G. DSPE-PEG2000: BrC16-paclitaxel (10:90)
H: DOPE-PEG2000: BrCI6-paclitaxel (20:80)
Obr. 7. Elektrónová mikrografia lomu pri nízkych teplotách (mikrosnímky A a B) preparátov DOPC : DOPE-PEG2ooo:BrC16-paclitaxel (mólový pomer 30:50:20)
Obr. 8. Mikrosnímky preparátov DSPE-PEG2ooo:C16-vinblastin. A, B: svetelná mikroskopia; C, D.elektrónová mikroskopia.
Obr. 9. Kryo-elektrónová mikroskopia (mikrosnímky A-D) častíc zložených z DSPEPEG2ooo 3 BrC16-paclitaxelu (mólový pomer 15:85)
Obr.10. Účinky častíc obsahujúcich DSPE-PEG2Ooo:BrC16 paclitaxel oproti preparátu „TaxolR“ na nádoroch Ovcar3 vyvolaných u myší SCID.
Liečba: Podávanie lieku intraperitonieálne, na 20., 2., 24., 26. a 28. deň po inokulácii (očkovaní), pričom je: Kontrola (x); TaxolR,12,5 mg paclitaxelu/kg (plný štvorček); TaxolR, 25mg paclitaxelu/kg (štvorček); BrC16-paclitaxel, 12,5 mg/kg (plný trojuholník); 25 mgBrC16-paclitaxelu/kg (trojuholník); BrC16paclitaxel, 50 mg/kg (kosoštvorec); BrC16-paclitaxel, 100 mg/kg (plný kosoštvorec). Os x: počet dni po naočkovaní, Os y: percento prežitých.
»··· ·· • · 9
9 9 • 9 · » · · · ·· ·· ···· » · 9 ·· ··
Obr. 11. Účinok častíc obsahujúcich DSPE-PEG2ooo:BrC16paclitexel (15.85) na A549-nie-malú bunku ľudského karcinómu pľúc v pľúcnych nádoroch vyvolaných u myší SCID
Liečba: podávanie lieku intravenózne 1, 3, 5, 7 a 9 dní po naočkovaní, pričom je: kontrola (plný štvorček), BrC16-paclitaxel, 12,5 mg/kg (plný trojuholník); 25 mg BrCI6-paclitaxelu/kg (trojuholník); BrCI6-paclitaxel, 50 mg/kg (kosoštvorec); BrC16-paclitaxel, 100 mg/kg (plný kosoštvorec). Os x. počet dní po očkovaní; Os y: objem nádoru (mm3).
Obr. 12. Účinky DSPE-PEG2ooo:BrC16-paclitexelu (15:85) oproti preparátu TaxolR na L 1210 (Murine Leukemias) vyvolaných u myší CDF1.
Liečba: podávanie ústne, stav po 1 - 5 dňoch, pričom je kontrola (hviezdička); TaxolR, 12,5 mg/kg (plný štvorček); TaxolR, 25 mg/kg (štvorček); 12,5 mg BrC16-paclitaxelu/kg (plný trojuholník hore); BrC16paclitaxel, 50 mg/kg (o); BrC16-paclitaxel, 100 mg/kg (plný kosoštvorec). Os x: počet dní po očkovaní (bunky L 1210); Os y: percento prežitých.
Obr. 13. Svetelná mikrografia (mikroskopické snímky) častíc obsahujúcich BrC16paclitaxel/CremophorREL.
Obr. 14. Svetelná mikrografia - mikroskopické snímky s použitím Nomarskiho optiky - častíc obsahujúcich Hamycín (A)1 cm = 27pm; (B) 1 cm = 13,6 pm.
Obr. 15. Snímky častíc obsahujúcich Hamycín s použitím mikroskopie s fázovým kontrastom.
Podrobný opis vynálezu
Nasledujú akronymá a skratky používané v celom texte prihlášky vynálezu, ako aj príslušné slová, vety alebo vzorce.
Br: bróm; BrC6: -C (0) CHBr (CH2) 3CH3; BrC8.
- C (0) CHBr (CH2) 5 CH3; BrCI2: -C (O) CHBr (CH2) g CH3; BrC14
Ί ···· ·· • · « ·· ··
C (0) CHBr (CH2)i 1 CH3; BrCI6. C (O) CHBr (CH2) 13CH3, HTD: derivát hydrofóbneho taxánu (ako je paclitaxel); BrC16HTD. paclitaxel pripojený kovalentne k priamemu nasýtenému acylovému reťazcu, brómovanému na uhlíku alfa; DOPC: dioleylfosfatidylcholín; DMPE dimyristoyl-fosfatidyletanolamín; DOPE: dioleylfosfatidyletanolamín; DPPE: dipalmitoyl-fosfatidyletanolamín; DSPE: distearoylfosfatidyletanolamín; PEG’ polyetylénglykol; PEG20o0: PEG s molekulovou hmotnosťou okolo 2000; PEG5000: PEG s molekulovou hmotnosťou okolo 5000. Ďalej koncentrácie zlúčenín v časticiach podľa tohto vynálezu sú uvádzané v pomeroch mólových percent každej komponienty v častici obsahujúcej paclitaxel kovalentne pripojený k acylovému reťazcu dlhému 16 uhlíkov a brómovanému na uhlíku alfa, a distearoyl-fosfatidyl-etanolamín-polyetylénglykol s molekulovou hmotnosťou 2000, a to v pomeroch 85 mólových percent paclitaxel/acylového reťazca ku 15 mólovým percentám DSPE-PEG2OooTento vynález poskytuje časticu zloženú zo slabo hydrofilného jadra obklopeného konjugátom, ktorý má biokompatibilnú hydrofóbnu zónu a biokompatibilnú hydrofilnú zónu. Zlúčeniny hydrofóbneho jadra podľa tohto vynálezu sú slabo hydrofilné, a po vložení do vodného prostredia sa samy združujú (asociujú). Zlúčeniny hydrofóbneho jadra môžu pochádzať z prírodného výskytu, alebo to sú syntetické hydrofóbne zlúčeniny. Okrem toho hydrofóbnymi zlúčeninami jadra môžu byť hydrofóbne alebo slabo lipofilné deriváty akejkoľvek zlúčeniny. Tak napr. hydrofilná zlúčenina môže byť spojená („derivatizovaná) s hydrofóbnou zónou a vytvoriť tak zlúčeninu, ktorá je slabo hydrofilná. V jednom vykonaní hydrofóbna zlúčenina môže pozostávať z hydrofilnej zlúčeniny arabinozyl-cytozínu (Ara C), spojeného s hydrofóbnou zónou, a vytvoriť tak zlúčeninu jadra, ktorá je hydrofóbna. Zlúčeniny nášho vynálezu sú obsiahnuté v jadrách častíc vo význačne vyšších hladinách, ako podobné zlúčeniny v časticiach nosičov, ktoré boli doteraz dostupné. Také zlúčeniny jadra obsahujú (mienené ako príklad 3 cez obmedzenia týmto príkladom) taxány ako napr. paclitaxel, alkaloidy vinea ako napr. vinblastin; bryostatíny; cyklické polypeptidy ako sú napr cefalosporíny; iné hydrofóbne polypeptidy, steroidné zlúčeniny ako napr. prednison a kortizon; rifamycíny ako je napr. rifabutin a rifamid; mitomyciny; bleomycíny; benzonaftopyranóny; bisinterkalatačné antibiotiká ako je napr. chinomycin; nukleozidové antibiotiká ako je napr. ara-a; pyrol[1, 4]benzodiazepíny ako napr. antramycín a distamycín; makrolidy ako je napr maytansin a hamycín; bisindol-alkaloidy ako je napr. vinblastin a ·· · • · ··· · ···· ·· • · · · · • · · · · · · · · · • 9 · · · · navolbin, kamptotecíny a ich analógy, etoposidy a temposidy, interkalátory DNA ako napr. amsakrin; antiestrogény ako sú napr. tamoxifény; bis(benzimidazol)y ako je napr preparát Hoechst 33258; a hydrofóbne peptidy, predovšetkým hydrofóbne peptidy s pripojenými acylovými reťazcami (napr peptidové surfaktanty)
Tieto zlúčeniny majú biokompatibilnú hydrofóbnu zónu, ktorú je možné bezpečne podávať živočíchom v terapeutických dávkach; táto zóna zvyšuje dostatečne hydrofobicitu zlúčeniny a umožňuje akumuláciu vysokých dávok (t.j. asi 20 mól % alebo viac) v častici. Táto zóna sa buď vyskytuje v zlúčenine prírodného pôvodu, ako sú napr. bryostatíny, alebo sa k nej synteticky pripojí (konjugáciou), ako je to u taxánov (napr u paclitaxelu). Je výhodné, aby zlúčenina jadra mala konjugovanú biokompatibilnú hydrofóbnu zónu, pričom „konjugovaná“ znamená kovalentné pripojenie zóny k reaktívnej skupine na zlúčenine, a to syntetickými chemickými reakciami.
Je výhodné, aby zlúčeninou jadra bol taxán, ako je paclitaxel, taxoter, cefalomannin, 19-hydroxybaccatin III, baccatin III, 10-deacetielcefalomanin, 10deacetieltaxol(7aOH), epi-10-deacetieltaxol(7p0H), 7-epi-10deacetielcefalomanin (7βΟΗ) a 10-deacetielbaccatin III. Najvýhodnejšou zlúčeninou jadra je paclitaxel.
Pripojenie biokompatibilnej hydrofóbnej zóny k týmto zlúčeninám sa vykoná známymi prostriedkami na spájanie reaktívnych skupín, ako sú acylové reťazce, hydrofóbne peptidy a silikónové polyméry, s inými zlúčeninami. Tak napríklad, ak je hydrofóbnou zónou acylový reťazec, potom výhodným pripojením je vytvorenie väzby medzi karboxylovou skupinou acylového reťazca a hydroxylovou skupinou zlúčeniny, ako je napr. paclitaxel, kamptotecín alebo vinblastin.
Taxány ako napr. paclitaxel majú hydroxylové skupiny (skupiny OH v polohe 2' a 7), ku ktorým je možné pripojiť hydrofóbne zóny. Ak relatívne poradie reaktivity týchto skupín (od reaktívnejšej k menej reaktívnej) býva obyčajne 2' > 7, je možné acylový reťazec pripojiť k taxánom v polohe 2', a to použitím stechiometrického množstva reaktívnej formy reťazca (napr. chloridové formy). Alternatívne je možné acylové reťazce pripojiť k obidvom skupinám OH (2' aj 7), a potom selektívne odstrániť acylový reťazec z polohy 2' tak, že k taxánu zostane pripojený len acylový reťazec v polohe 7 Selektívne odstránenie acylového reťazca z polohy 2' sa vykoná použitím stechiometrického množstva miernej bázy, ako je napr. bikarbonát sodný. Okrem toho skupinu 7 OH je možné modifikovať najprv „chránením skupiny 2 ' HO ···· ·· ι · · a ·· ·· skupinami ako trifenylmetyl, metoxytrifenylmetyl, trifluóracetyl a TrOC (trichlórmetoxy-chloroformát) použitím postupov, ktoré sú zručným odborníkom bežne známe. Chránený taxán potom reaguje s aktívnou formou acylového reťazca (ako sú anhydridy alebo chloridy) v bezvodom organickom rozpúšťadle s bázami, ako je DMAP a pyridín; chrániaca skupina sa potom odstráni z polohy 2 dobre známymi a ľahko uskutočniteľnými prostriedkami Tieto reakcie sa bežne vykonávajú za prítomnosti bázy ako je pyridín, dimetylaminopyridín („DMAP), trietylamín alebo iná báza, a to v normálnych polárnych aprotických organických rozpúšťadlách, ako je metylénchlorid, formamid, chloroform, THF (tetrahydrofurán), dimetylformamid a dimetylsulfoxid („DMSO).
Hydrofóbnymi zónami vhodnými na pripojenie k takýmto zlúčeninám sú (mienené ako príklad a bez obmedzenia týmto príkladom) acylové reťazce, hydrofóbne peptidy, silikónové reťazce a iné hydrofóbne polyméry. Je výhodné, aby hydrofóbnou zónou bol acylový reťazec vetvený alebo priamy, nasýtený alebo nenasýtený, a brómovaný na uhlíku alfa alebo nebrómovaný. Výhodnejšie je, ak je hydrofóbnou zónou konjugovaný acylový reťazec vzorca I
C (0) CHX1 (CHZ) n1 (CH=CH) n2 (CH2) n3 (CH=CH) n4 (CH2) n5 (CH=CH) n6 (CH2) n7 ( CH=CH) n8 (CH2) n9CH3 (I ) kde n1 sa rovná nule alebo celému číslu od 1 do 21; n3 sa rovná nule alebo celému číslu od 1 do 18; n5 sa rovná nule alebo celému číslu od 1 do 15; n7 sa rovná nule alebo celému číslu od 1 do 12; n9 sa rovná nule alebo celému číslu od 1 do 9; a každé párne n (n2, n4, n6, a n8) sa nezávisle od seba rovná nule alebo jednej. Súčet n1 + 2n2 + n3 + 2n4 + n5 + 2n6 + n7 + 2n8 + n9 je celé číslo od 3 do 21. Najvýhodnejší je acylový reťazec priamy, nasýtený s dĺžkou 12, 14 alebo 16 atómov uhlíka, t.j. ak je
C (O) CHX1 (CH) 9CH3, -C (0) CHX1 (CH) nCH3, alebo -C (0) CHX1 (CH) i3CH3X1
V týchto acylových reťazcoch je buď vodík H, alebo výhodnejšie „hydrolýzu podporujúca skupina“ (HPG), t.j. atóm alebo skupina atómov podporujúcich hydrolýzu in vivo svojho príslušného reťazca zo zlúčeniny, ku ktorej bol reťazec pripojený Skupiny HPG sú vzhľadom k vodíku elektronegatívne, čo znamená, že k sebe priťahujú elektróny viac, ako by ich priťahoval atóm vodíka, ktorý by zaujímal rovnakú polohu v tej istej molekule. V dôsledku toho náhrada HPG za atóm vodíka na uhlíku alfa acylového reťazca vedie k prerozdeleniu elektrónovej hustoty reťazca, čo vedie k indukčnému efektu v reťazci Okrem toho substitúcia skupín HPG
ΙΟ ···· ·· • · · ·· ····
9 «
I · · « ·· ··
B · · « ·· ·· obsahujúcich aromatickú zložku za vodíky z uhlíka alfa acylového reťazca spôsobuje rezonančné efekty z redistribúcie elektrónovej hustoty. Táto HPG-navedená indukcia a rezonančné efekty stabilizujú príslušnú zásaditú formu (časť) kyseliny, nie však kyslú formu. Teda kyselina je silnejšou kyselinou, než by bola v prípade, že na mieste v acylovom reťazci zaujímaným HPG by bol vodik Acylové reťazce modifikované skupinami HPG majú teda všeobecne nižší pKa ako príslušné natívne formy, t j formy, v ktorých v polohe alfa je skupina CH2 namiesto substitujúcej skupiny HPG. Acylové reťazce substituované skupinami HPG sú teda oveľa ľahšie hydrolyzovateľné in vivo z materských zlúčenín, ako je tomu u natívnych (pôvodných) reťazcov.
Hydrolýzu podporujúca skupina X1 je akýkoľvek atóm alebo skupina atómov, ktorá (1) má elektronegativitu väčšiu ako vodík, a (2) môže byť pripojená v polohe alfa k acylovému reťazcu. Takýmito skupinami sú (mienené ako príklad bez obmedzenia ďalším výpočtom): F, Cl, Br, J, NH+3, -OC6H4X2 alebo C(0)X2, kde X2 je napr. F, Cl, Br, J, NH+3, NO2 alebo CN. Výhodne X1 je F, Cl, Br alebo J, najvýhodnejšie Br. Acylové reťazce najvýhodnejšie na pripojenie ku zlúčeninám podľa vynálezu teda sú: -C (O) CHBr (CH2) 9CH3l - C (0) CHBr (CH2) nCH3, alebo - C (0) CHBr (CH2) 13CH3.
Acylové reťazce so substitúciou HPG sú dostupné komerčne, alebo môžu byť pripravené niektorým zo spôsobov, používaných v obore na substituovanie acylových reťazcov v polohe alfa.
Konjugát okolo jadra sa skladá z chemicky viazaných hydrofilných a hydrofóbnych zón. Konjugátom môže byť prírodný alebo syntetický lipid s hydrofilnou a hydrofóbnou zónou. Alternatívnym konjugátom môže byť syntetická zlúčenina, ktorá má hydrofilnú zónu viazanú chemicky k hydrofóbnej zóne. Vhodnými hydrofilnými zónami konjugátu sú tie, ktoré 1) sú biokompatibilné, t.j. môžu byť podávané zvieratám bez neúnosných vedľajších účinkov; 2) sú celkovo viac hydrofilné ako hydrofóbne, a 3) sú schopné pripojiť sa k hydrofóbnej zóne. Sú to (mienené ako príklady bez obmedzenia ďalším výpočtom): celulóza, polyetylénglykoly, polyaminokyseliny ako napr. polyglycin; polysacharidy, poly(etylénoxidy); poly(akrylové kyseliny), poly(akrylamidy), poly(vinylpyrolidóny); a poly(metakryláty). Ak má byť hydrofilnou zónou hydrofilný polymér, potom je to výhodne polyetylénglykol („PEG) alebo polyoxyetylén, výhodnejšie PEG alebo polyoxyetylén s molekulovou hmotnosťou 50 až 5000, a najvýhodnejšie je to PEG s • · • · · • · • · • · ·· · ••·· ·· • · · • · · • · · ·
I I ·· ···· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· molekulovou hmotnosťou 2000 („PEG2000)· Hydrofilnou zónou môže byť tiež polárna koncová skupina amfipatického (obojakého) lipidu Tieto koncové skupiny môžu niesť náboj, a to pozitívny alebo negatívny: náboj môže byť buď prirodzeného výskytu na koncovej skupine, alebo môže byť pridaný viazaním nabitej molekuly s reaktívnou skupinou na koncovej skupine. Medzi nabité lipidy patria napr. (a bez obmedzenia príkladom) fosfatidylseríny, fosfatidylglyceroly, fosfatidické kyseliny a fosfatidyletanolamíny, ku ktorým boli pripojené organické dikarboxylové kyseliny, ako je napr. kyselina glutarová, oxalová a jantárová.
Vhodnými hydrofóbnymi zónami konjugátu sú tie, ktoré 1) sú biokompatibilné, 2) majú skupinu schopnú väzby k hydrofilnej zóne, 3) celkovo sú viac hydrofóbne ako hydrofilné. Takými zónami sú (bez obmedzenia týmito príkladmi): oblasti acylových reťazcov u amfipatických lipidov, rôzné hydrofóbne polyméry, ako sú silikónové polyméry alebo hydrofóbne peptidy.
Koncové skupiny amfipatických lipidov sú hydrofilné, teda lipidy samotné sú hydrofóbno-hydrofilné konjugáty.
Tieto lipidové konjugáty obyčajne nesú pozitívny alebo negatívny náboj na koncovej skupine, a patria k nim fosfatidylseríny (PS), fosfatidylglyceroly (PG) a fosfatidické kyseliny (PA). Alternatívne koncové skupiny majú reaktívne (pod)skupiny, ku ktorým sa viažu ďalšie hydrofilné zóny. Z týchto lipidov výhodné sú fosfatidyletanolamíny (PE) ako je dipalmitoylfosfatidyletanolamín („DPPE), palmitoyloleoylfosfatidyletanolamín („POPE), distearoylfosfatidyletamolamín („DSPE); najvýhodnejším fosfatidyletanolamínom je DSPE.
Medzi konjugáty s obsahom amfipatických lipidov teda patria konjugáty PE a PEG; z týchto sú výhodné konjugáty DSPE a PEG s molekulovou hmotnosťou 50 až 5000, a najvýhodnejšie sú DSPE-PEG2Ooo- Konjugáty obsahujúce amfipatické lipidy rovnako zahrňujú lipidy s rôznym nábojom, ako sú fosfatidyletanolamíndikarboxylové kyseliny DOPEGA a POPE-Ga („GA = kyselina glutarová).
Biokompatibilnými hydrofilno-hydrofóbnymi konjugátmi sú tiež nydrofilnohydrofóbne kopolyméry, ako sú kopolyméry vzorca HO (CHzCH2O)a(CH (CH3) CH2O)b(CH2CH2O)cH. Výhodnejšie z týchto kopolymérov polyoxyetylén u a polyoxypropylénu majú a a b nezávisle od seba rovné celému číslu od 10 do 100, a c je rovné nule alebo celému číslu od 1 do 100. Najvýhodnejšie a a c je rovné (každé) 75, a b je rovné 30.
···· ··
4 · • · · · t · • 4 · · ·· 44 ·· ···· • · · • · · • · · • · · · • 4 ·4
4
Zlúčeniny jadra obsahujúceho hydrofóbnu zónu tvoria 20 mól % až 99 mól % častice, a môže to byť akékoľvek množstvo najmenej od 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 alebo 95 mól % do 99 mól %. Konjugáty hydrofóbnej zónyhydrofilnej zóny tvoria 1 mól % až 80 mól % častice, a môžu byť v akomkoľvek množstve medzi tým, ako napr. od 80 mól do 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5 alebo 1 mól %. Najvýhodnejšie zlúčeniny jadra tvoria 88 až 99 mól % častice, zatiaľ čo konjugáty tvoria 1 až 20 mól % častice.
V časticiach podľa vynálezu sa zlúčeniny jadra vzhľadom k hydrofóbnym zónam akumulujú do vysokých koncentrácií, a to v združení (v asociácii) s okolitým konjugátom. Táto vysoká akumulácia nevyžaduje prítomnosť (a dochádza k nej v neprítomnosti) ďalších komponentov, ako je voda alebo olej, v jadre. Jadra častíc podľa tohto vynálezu sú teda v podstate bez vody a pridaného oleja. Ak by nebolo hydrofóbnej zóny, zlúčeniny by sa nemohli akumulovať v nosičoch, napr. v hpozómoch alebo emulziách, bez použitia oleja alebo vody, alebo by sa zlúčeniny akumulovali v množstvách menších, aké sa vyskytujú v jadrách častíc podľa tohto vynálezu.
Častice podľa tohto vynálezu nie sú teda ani lipozómy, ktoré by mali určitý objem vody zachytený v dvojvrstve lipidu, ani emulzie, ktoré by mali usporiadanie olej vo vode alebo voda v oleji, t.j. ako globule (kvapky) jednej kvapaliny v druhej. Častice podľa tohto vynálezu sú podstatne odlišné od uvedených štruktúr, pričom tieto rozdiely môže bežne skúsený odborník ľahko demonštrovať známymi metódami. Týmito metódami sú: určenie koncentrácie zlúčeniny jadra v častici nosiča, napr. sedimentačnej štúdii, opísanej v príklade 3 nižšie; preukázanie prítomnosti alebo absencie vody alebo pridaného oleja v častici napr. NMR spektroskopiou, stanovenie percenta zadržania rozpustných značkovacích látok v čast'n, meranie rozdelenia trítiovej vody, určenie rozdelenia objemu stanovením externe pridaného solutu (rozpustenej látky), meranie birbidity (zakalenia) založenej na bobtnaní lipozómov v hypo-osmotickom prostredí, a preukázanie prítomnosti alebo absencie lipidovej dvojvrstvy skúmaním lomu pri zmrazení a kryo-elektrónovou mikroskopiou, ako i NMR-spektroskopické skúmanie usporiadania molekuly lipidu.
Častice podľa vynálezu majú približne guľový tvar a priemery (alebo veľkosť) najmenej 15 nm a výhodnejšie najviac 10 000 nm, aj keď sa zamýšľa používať (okrem intravenóznych) i väčších častíc. Veľkosť častíc teda môže mať hodnotu medzi týmito údajmi, avšak najvýhodnejšia veľkosť je 15 až 200 nm. Veľkosť častíc
• · · • · · •e ···· ·· • · · · • · · · ·· ·· ·· je ovplyvňovaná mnohými faktormi, ktoré je možné stanoviť v medziach bežnej odbornosti, vrátane relatívnych podielov derivátov a konjugátu v častici, ktoré je možné stanoviť podľa nasledujúcich rovníc:
(1) Počet (#) molov slabo hydrofilnej zlúčenmy/častici (X) = [hustota x (4/3 π) (D/2 - t)3]/mol. hmotnosť slabo hydrofilnej zlúčeniny;
(2) Počet (#) molov konjugátu/častici (Y) = (rcd2) (a) x 6, 0225 x 1023 a (3) mól % slabo hydrofilnej zlúčeniny = [X/X+Y)]. 100, kde „d je priemer častice, „t je hrúbka vrstvy konjugátu, „a je povrchová plocha na molekulu komponenty konjugátu, pričom „hustota je daná v g/cm3 Veľkosť častíc je možné merať rôznymi metódami známymi bežným odborníkom (vrátane metód opísaných v príklade 5 nižšie).
Častice podľa tohto vynálezu sa bežne pripravia vstrekovaním etanolu alebo reverzným odparovaním (REV). Môžu sa tiež pripraviť metódou dialýzy. Stručne povedané: Pri postupe vstrekovania etanolu (viď nižšie uvedený príklad 1) sa vhodné množstvo časticových komponentov rozpustí v príslušnom množstve vhodného organického rozpúšťadla, ako napr. etanolu. Výsledný etanolový roztok(y) sa potom pomaly vstrekuje do príslušného množstva vhodného vodného rozpúšťadla (napr. pufor HEPES/NaCI pH 7,5), a vytvorí sa častica v pufri (tlmivom roztoku), a častice sa potom zhromaždia následným odstreďovaním. Pri postupe reverzného odparovania (viď príklad 1 nižšie) sa vhodné množstvá komponentov častíc zmiešajú, a potom sa rozpustia v príslušnom množstvo kombinácie vodného pufru a miešateľného organického rozpúšťadla; potom nasleduje odstránenie organického rozpúšťadla vo vákuu alebo prúdom inertného plynu.
Častice podľa tohto vynálezu je možné kombinovať s farmaceutický prijateľnými nosičmi, a môžu sa teda vyskytovať tiež vo forme farmaceutických kompozícii, ktoré obsahuji častice a nosiče „Farmaceutický prijateľné nosiče sú médiá všeobecne prijateľné na použitie v spojení s podávaním terapeutických alebo diagnostických látok cicavcom. Tieto médiá sa formulujú podľa mnohých faktorov, ktoré sa určujú v medziach bežnej odbornosti, predovšetkým čo sa týka (bez obmedzenia nasledujúcim výpočtom) zvláštnosti podávanej látky (činidla), ako aj jej koncentrácie, stability a zamýšľanej biologickej účinnosti, choroby, poruchy alebo stavu liečených alebo diagnostikovaných touto kompozíciou, a tiež čo sa týka «··· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ··
N ·· ···· subjektu, jeho veku, pohlavia a všeobecného stavu, a spôsobu podávania kompozície, ako napr. nosom, orálne, oftalmicky, miestne, transdermálne, vaginálne, rektálne, intratekálne, podkožné, intramamálne, intraperitoneálne, intravenózne, intratumorálne, intrakavitárne alebo intramuskulárne Farmaceutický prijateľné nosiče môžu obsahovať i ďalšie ingredience, ako napr. látky podporujúce stabilitu obsiahnutej aktívnej ingredience, ktorými môžu byť konzervačné činidlá alebo antioxidanty.
Farmaceutické kompozície môžu byť podávané živočíchom, napr. cicavcom a ľuďom, ktorýmkoľvek štandardným a všeobecným používaným spôsobom a prostriedkom. Spôsob podávania, napr. orálny, vnútrožilový, intraarteriálny (vnútrotepnový), podkožný, intramuskulárny i intraperitoneálny, sa zvolí podľa mnohých faktorov na základe bežnej odbornosti a v medziach obsahu tohto vynálezu. Týmito faktormi sú (bez obmedzenia týmto výpočtom): vek, telesná hmotnosť a zdravotný stav liečeného subjektu, zamýšľaná biologická účinnosť lieku, zvláštnosti liečenej choroby, použitý nosič a dávka podávaného terapeutického prostriedku. V súčasnosti prednostným spôsobom podávania farmaceutických kompozícií podľa vynálezu je orálne a intravenózne podávanie. Podľa vynálezu je rovnako výhodné intraperitoneálne podávanie farmaceutických kompozícií obsahujúcich pevné, polopevné a fluidné častice.
Farmaceutické kompozície obsahujúce častice podľa vynálezu sú určené na orálne podávanie v pevnej forme, napr. vo forme tabliet a toboliek (kapsúl), alebo vo fluidnej forme, napr. vo forme sirupov a suspenzií. Tabletky obsahujúce častice sú bežného typu, napr. guľaté, oválne či pozdĺžne, potiahnuté alebo nepotiahnuté, líšiace sa veľkosťou a hmotnosťou, ktoré sú bežne používané vo farmaceutickom odbore, a ktoré okrem častíc podľa vynálezu môžu obsahovať najrôznejšie ingrediencie všeobecne v odbore používané. Tobolky (kapsule) sú formou podávania pevného lieku, a častice sú v nich uzavreté v želatínovom plášti; tobolky je možné pripraviť pre najrôznejšie dávkovanie (obsah) častíc. Vynález predpokladá použitie tvrdých i mäkkých toboliek. Formulovanie častíc do týchto tabliet, toboliek alebo iných foriem pevných preparátov je v možnostiach bežne skúseného praktického odborníka vo farmácii.
Intravenóznymi (vnútožilovými) kvapalinami formulovanými vo farmaceutických kompozíciách s časticami podľa vynálezu, sú sterilné vodné roztoky chemikálie, napr. cukrov, aminokyselín a elektrolytov, ktoré je možné ľahko zaviesť ·· ···· • · ···· ·· • · · • · · • · · · • · · 4 ·· ·· ·· · • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· do tela cicavcov, kde sa absorbujú; tieto kvapaliny okrem funkcie nosičov na podávanie aktívnych ingrediencií sú tiež bežne používané na doplňovanie živín a elektrolytu. Bežne používané vnútrožilové kvapaliny, vhodné na formulácie s obsahom častíc podľa vynálezu, obsahujú fyziologický soľný roztok a 5 % (hmotnostných) roztok dextrózy vo vode.
Ďalej predmetom vynálezu sú metódy podávania zlúčenín živočíchom, a tieto metódy spočívajú v podávaní farmaceutických kompozícii obsahujúcich častice podľa vynálezu. Tieto metódy sú vysoko účinné, t.j. dodávajú zlúčeniny vo vysokých pomeroch zlúčeniny k iným komponentom častíc, a indukujú nízku toxicitu. Týchto metód je možné použiť predovšetkým na dodávanie terapeuticky účinných množstiev zlúčenín živočíchom na liečenie chorôb, porúch alebo chorobných stavov liečiteľných týmito zlúčeninami, pričom toto liečenie je bez vedľajších účinkov. Z tohto hľadiska „terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny je také množstvo zlúčeniny, ktoré účinne zlepší, potlačí alebo predíde chorobu, poruchu alebo chorobný stav, a bežne toto množstvo predstavuje najmenej 0,01 mg zlúčeniny na kg telesnej hmotnosti živočícha, ktorému je zlúčenina podaná. Výhodnejšie terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny je v rozmedzí od 0,01 mg zlúčeniny na kg do 1000 mg/kg. Stavy liečiteľné kompozíciami podľa tohto vynálezu sú napr. (bez obmedzenia predmetu vynálezu týmito príkladmi); rôzne rakoviny, napr. rakovina mozgu, rakovina pŕs, rakovina vaječníka, karcinómy pľúc, leukémia, lymfómy, melanómy, karcinómy a sarkómy, parazitické choroby, rôzne zápalové a autoimunitné stavy, ako napr. artritis a juvenilný diabetes, a rôzné mikrobiálne infekcie. Termín „mikrobiálna infekcia je mienený ako zahrňujúci patologické stavy spôsobené vírusmi, baktériami, rickettsiami, hubami, priónmi apod. Okrem toho kompozície podľa vynálezu je možné použiť tiež na podávanie neterapeutických preparátov živočíchom, napr. diagnostických činidiel a živín.
Na lepšie pochopenie vynálezu poslúžia nasledujúce príklady. Avšak bežne skúsení odborníci ľahko zistia, že tieto príklady sú len ilustrativnym znázornením vynálezu, ktorý je definovaný v nárokoch, uvedených po týchto príkladoch.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1 Príprava častíc
ΒΒ ···· ···· ·· • · · · • · · · • · · · · • · · · · ·· ·· · <· • · · · · • · · · • · · · ·
B B B · B
BB BB B
Príprava BrC16-pachtaxel/DSPE-PEG2ooo vstrekovaním do etanolu.
Na prípravu metódou vstrekovania do etanolu sa odvážilo 20 mg BrC16paclitaxelu a 8,3 mg DSPE-PEG2ooo, zmiešalo sa a potom solubilizovalo vstrekovaním do 0,1 ml etanolu Výsledné etanolové roztoky boli potom pomaly pridávané do sklenenej fiolky (liekovky) obsahujúcej 2 ml 10 mM HEPES, 150 mM NaCI-pufru pri pH 7,5 (tlmivý roztok HEPES), aby sa vytvorila suspenzia častíc v pufri
Príprava BrC16-paclitaxel/DSPE-PEG2ooo postupom odparovania reverznej fázy
Na prípravu postupom odparovania reverznej fázy bolo zmiešané 20 mg BrC16-paclitaxelu a 118 mg DSPE-PEG2ooo, 3 potom rozpustené v 6 ml etanolu a 2 ml pufri HEPES, potom bol etanol odstránený rotačným odparovaním, aby sa vytvorili častice.
Príprava hamycinu DSPE-PEG2OOo postupom reverzného odparovania (REV)
Na prípravu modifikovaným postupom REV bolo spolu rozpustené 20 mg makrolidového antibiotika Hamycín a 80 mg DSPE-PEG2oOo v 40 ml chloroformu a metanole (objemovo 1:1). Potom bolo k zmesi pridané 10 ml fyziologického roztoku soli (cca 0,9 %) a suspenzia bola krátko (asi 10 sec) vystavená pôsobeniu ultrazvuku v kúpeľovom sonikátori pri teplote miestnosti, aby vznikla pomerne homogénna disperzia. Rozpúšťadlá boli potom odstránené rotačnou odparkou pri 45 °C. Zvyškový soľný roztok obsahoval preparát s časticami Hamycín/DSPE-PEG2ooo v hmotnostnom pomere 20:80.
Príprava častíc Hamycín/DSPE-PEG20oo postupom s dialýzou
Častice hamycinu je možné pripraviť rovnako metódou s dialýzou. Bolo spolu rozpustené 80 mg hamycinu a 20 mg DSPE-PEG2ooo v 4 ml DMSO. 1 ml tohto roztoku obsahujúceho hamycín a lipid boli odkvapkané do 9 ml fyziologického roztoku soli (asi 0,9 %) počas vírivého miešania pri teplote miestnosti. 3 ml roztoku ·· ···· ···· ·· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ·· • · · • · • · · • · ·· · soli a DMSO, obsahujúceho hamycín a lipid, bolo vložené do dialyzátora „Slide-ALyzer (frakcia s molekulovou hmotnosťou 10 k) a dialyzované do 2 litrov soľného roztoku cez noc pri teplote miestnosti Analýza častíc preukázala, že obsahujú hamycín a DSPE-PEG2ooo v pomere 80 20. Na konci dialyzačného času bol odstránený v podstate všetok DMSO. Analýza častíc preukázala, že obsahovali hamycín a DSPEPEG2ooo v pomere 80.20
Príklad 2 Odstreďovanie „sacharózového gradientu
Dvestomikrolitrové vzorky obsahujúce 6,9 mg kombinácie PEG-ylovaného lipidu a hydrofóbneho derivátu drogy (napr. DOPC, DOPE-PEG20oo a BrC16paclitaxelu v molárnom pomere 30:50.20), pripravené postupom reverzného odparovania (opísaným v príklade 1 vyššie), boli vložené do hornej časti „gradientu (nádobky s gradovanou koncentráciou sacharózy) s objemom 12 ml a obsahujúceho 0 % až 50 % sacharózy. Tento „gradient bol generovaný použitím prístroja „Biocomp Gradient Master Model 106 (firmy Biocomp Instruments, Inc., (prevádzkové parametre: čas: 2 min, uhol: 81,5°, rýchlosť: 19)). Gradienty boli odstreďované pri 208.000 g (zrýchlenia) cez noc na Beckmanovej ultracentrifúge L550, a frakcionované po 1 ml zhora.
Koncentrácie fosfolipidov v rožných frakciách boli určované modifikovanou verziou postupu podľa Chena a i. (ktorého obsah tu odkazovo uvádzame). Koncentrácie zlúčenín boli stanovené rozpustením vzorky v etanole, odčítaním absorbancie na UV snímacom spektrofotometri „UV2101PC (Shimadzu Scientific Instruments, Inc.), a potom porovnaním absorbancie so štandardmi. Výsledky sú uvedené na obrázkoch 1A a 1B, a boli potvrdené svetelnou mikroskopiou (opísanou v príklade 6 nižšie) gradovaných frakcií. Mikroskopicky viditeľné častice boli prítomné vo frakciách vyššej hustoty (# 12). Mólový pomer BrC16/paclitaxelu k fosfolipidu vo fosToiipide vo frakcii 12 bol 94:6.
Príklad 3 Sedimentačné štúdie
Vzorky po 1 ml (10 mg/ml BrCI6-paclitaxelu) častíc pripravených postupom vstrekovania etanolu (opísaným v príklade 1 vyššie) boli odstreďované pri 30.000 g v trvaní 30 minút na Beckmanovej ultracentrifúge L5-60; po odstránení supernatantu ·· ···· ···· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ·· ·· ·· • · · • · • · • · ·· · boli pelety znova suspendované vo vode na približne rovnaký objem ako vo vzorkách Koncentrácie fosfátov v rôznych frakciách boli stanovené modifikovanou verziou postupu podľa Chena a i; koncentrácie zlúčenín boli stanovené rozpustením vzorky v etanole, odčítaním absorbancie na UV snímacom spektrofotometri UV2101PC (firmy Shimadzu Scientific Instruments.lnc.), a potom porovnaním absorbancie so štandardmi. Výsledky týchto experimentov sú uvedené v tabuľke 1. Bežný mólový pomer BrCI6-paclitaxe!u v pelete činil 98 molových percent.
Tabuľka 1
Sedimentačná štúdia
Vzorka Typ frakcie * Kone. BrC16- paclitaxelu (mg/ml) Koncentrácia fosfátu (mM) Mol % BrC16- paclitaxeiu
DOPE-PEG2000 1 1, 86 0, 36 81, 35
DOPE-PEG2000 2 10, 39 1, 33 86, 95
DOPE-PEG2000 3 7, 67 0, 19 97, 22
DSPE-PEG2000 1 1, 25 0, 35 75, 13
DSPE-PEG2000 1 10, 93 1, 29 87, 90
DSPE-PEG2000 3 8, 74 0, 18 97, 65
DPPE-PEG2000 1 1, 20 0, 33 75, 40
DPPE-PEG2000 2 10, 77 1, 26 88, 00
DPPE-PEG2000 3 9, 62 0, 20 97, 65
DMPE-PEG2000 1 0, 99 0, 23 78, 34
DMPE-PEG2000 2 10, 43 1, 13 88, 78
DMPE-PEG2000 3 9, 82 0, 20 97, 72
DOPE-PEG5000 1 2, 33 0, 34 85, 39
DOPE-PEG5000 2 10, 15 1, 04 89, 27
DOPE-PEG5000 3 4, 15 0, 07 98, 14
DSPE-PEG5000 1 2, 17 0, 35 84, 26
DSPE-PEG5000 2 10, 13 1, 10 88, 77
···· ·· • · · ·· • · ·· ····
PdSPE’-PEGsooo 3 4, 53 0, 08 98, 00
| DPPE-PEGsooo 1 2, 40 0, 36 85, 15
: DPPE-PEGsooo 2 10, 21 1, 11 88, 77
' DPPE-PEGsooo 3 ~3? 83 0, 07 98, 04' ”
1 ĎMPE-PEG7ooo í 1?88 ~~ Ô?32 83, 26
i DMPE-PEG5ooo 2 9, 97 1,09 88, 68
t ĎMPE-PEGsooo 3 4, 65 0, 08 98, 13
*/1 = supernatant; 2 = celok; 3 = peleta
Príklad 4 Meranie turbidity
Ak majú lipozómy absorbovaný vodný roztok, zmrštia sa alebo nabobtnajú, ak ich vložíme do prostredia s odlišným osmotickým tlakom, ako má tento roztok. Tieto zmeny veľkostí lipozómov v odozve na rozdielnosť v osmotickom tlaku vedú ku zmene turbidity (zakalenosti) suspenzie lipozómov. Častice, ktoré nemajú zachytený podstatnejší objem vody, ako sú napr. častice podľa tohto vynálezu, tie nie sú ovplyvňované rozdielnosťami osmotického tlaku, a ich suspenzie nevykazujú viditeľnejšie zmeny turbidity.
Na základe toho, merania turbidity suspenzií častíc v prostrediach s rôznym osmotickým tlakom môžu ukázať, či je v častici zachytený určitý objem vody. Preto 0,1 ml vzorky častíc obsahujúcich 3,45 mg DOPC:DOPE-PEG2ooo:BrC16paclitaxelu a pripravených metódou vstrekovania etanolu (opísanou v príklade 1 vyššie) bolo zriedené do 3 ml každého z nasledujúcich roztokov (konečná koncentrácia paclitaxelu:0,66 mg/ml): H20 150 a 300 mM NaCl. Potom boli vzorky monitorované ( λ = 800nm) v čase na turbiditu použitím UV snímacieho spektrofotometru UV-2101PC (Shimadzu Scientific Instruments, Inc.). Výsledky sú uvedené na obr. 2. Neboli zaznamenané žiadne zmeny absorbancie, čo naznačovalo, že tieto častice na rozdiel od lipozómov nie sú osmoticky aktívne.
Príklad 5 Analýza veľkostí častíc ·· ···· ···· ·· • · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · · ·· ·· · ·· ·· ·
Postupom vstrekovania etanolu (opísaným v príklade 1 vyššie) boli pripravené častice obsahujúce DSPE-PEG2000 a BrC16-paclitaxel (molárny pomer 15:85); vzorky častíc (cca 1 až 3 mikrolitrov) boli podrobené meraniu veľkostí na prístroji „Submicron Particle Sizer (model 370) firmy NICOMP Particle Sizing Systems, Inc.; v celom priebehu bol použitý režim „pevná častica („solid particle). Stredné priemery častíc (nm) v suspenziách častíc rôzneho zloženia, merané podľa počtu, intenzity a objemu, sú uvedené v tabuľke 2.
Tabuľka 2
Analýza veľkosti častíc na prístroji Nicomp (v nm)
Lipid Častice spriemerované podľa
počtu intenzity objemu
DOPE-PEG2000 20-11S 96-208 44-181
DSPE-PEG2000 32-81 94-197 57-147
DPPE-PEG2000 43-93 104-172 69-138
DMPE-PEG2000 54 111 80
DOPE-PEGsooo 34 68 48
DSPE-PEGsooo 35 69 49
DPPE-PEGsooo 34 7 3 50
DMPE-PEGsooo 15-36 85-137 31-56
Príklad 6 Uskladnenie
Častice, pripravené postupom vstrekovania etanolu (uvedeným v príklade 1 vyššie) tak, aby v molárnom pomere 85Ί5 obsahovali BrCI6-paclitaxel a buď DOPEPEG2000 , alebo DPPE-PEG2000 DMPE-PEG2000 , DOPE-PEGsooo. DSPE-PEG5000 ···· ·· ·· ···· ·· • » · · · · · · · ·· ··· · · · · · τι ·········· · ·· ·· ·· ·· ·
DPPE-PEG 5οοο alebo DMPE-PEG5000 boli suspendované v pufri HEPES a skladované nezriedené. Postupom REV (opísaným v príklade 1 vyššie) bola pripravená vzorka BrC16-pachtaxelu a DSPE-PEG2000 v molárnom pomere 20:80. Tieto vzorky boli uskladnené pri teplote miestnosti alebo pri 4 °C, a potom boli pozorované svetelným mikroskopom („Olympus BH-2, Firmy New York/New Jersey Scientific) Pozorované vzorky boli hodnotené subjektívne na prítomnosť častíc a na kryštalizáciu hydrofóbnej zlúčeniny; výsledky sú uvedené na obrázkoch 3 a 4.
Častice suspendované v pufri HEPES boli tiež pridané k čerstvej plazme krysieho samca (druh Fisher, kmeň: 1344, vek: cca 60 dni, hmotnosť 175 - 200 gramov, z príbuzenskej plemenitby, finálna koncentrácia derivatizovanej zlúčeniny:
0,2 mh/ml): vzorky plazmy boli nechané na inkubáciu pri 37 °C v čase 0, 2, 6, 24 alebo 72 hodín. Ihneď po inkubácii boli vzorky zmrazené kvapalným dusíkom a uskladnené pri -70 ’C, potom boli ponechané topeniu pri teplote miestnosti, a boli pridané k rovnakému objemu acetonitrilu obsahujúceho 0,04 mg/ml (konečný stav) C12-paclitaxelu ako vnútorného štandardu. Zmesi boli odstreďované pri 1000 ot/min v čase 10 minút s použitím odstredivky „Eppendorf 5402, a nakoniec boli stanovené koncentrácie BrC16-paclitaxelu kvapalinovou chromatografiou HPLC. Výsledky sú uvedené na obr. 5.
Vzorky častíc BrC16-paclitaxel/DSPE-PEG2ooo (88:15) boli tiež podrobené analýze veľkostí častíc (postupom uvedeným v príklade 5 vyššie), a to v dlhšom čase uskladnenia pri 4 °C, výsledky sú uvedené v tabuľke 3. Každá vzorka bola pripravená zvlášť. Výsledky sa týkajú stanovenia počiatočnej veľkosti a stanovenia veľkostí po určitom čase uskladnenia. Výsledky jasne dokazujú, že veľkosť častíc bola rovnaká aj po predĺženom čase uskladnenia pri 4 °C.
·· ···· ·· ·· · ···· ·· • · · • · · • · · • · · ·· ·· • · · • · · · • · · · ·· ··
Tabuľka 3
Analýza veľkosti častíc na prístroji Nicomp (v nm)
Analýza veľkostí častíc na prístroji Nicomp (v nm)
Počet dní Veľkosť častíc (počiatočná/konečná) spriemerovaná podľa
uskladnenia počtu intenzity objemu
21 56/59 140/142 94/98
31 53/61 143/145 94/101
59 48/60 135/135 86/95
100 48/52 138/139 87/91
114 46/45 144/150 89/90
141 43/35 116/117 73/67
Príklad 7 Svetelná mikroskopia
DSPE-PEG2000 a paclitaxel boli kombinované postupom reverzného odparovania (v molárnom pomere 80:20), opísaným v príklade 1 vyššie, avšak paclitaxel nebol pripojený (viazaný) k hydrofóbnej zóne. Mikrosnímky („Olympus BH2,.New York/New Jersey Scientific) týchto častíc boli urobené vo zväčšení 200 x (viď obr. 6, u obr. 6A a 6B konečné zväčšenie bolo 277x). Bolo pozorované, že prevládajúcou štruktúrou boli kryštály.
Etanolovým injekčným postupom (opísaným v príklade 1 vyššie) boli pripravené častice DOPE-PEG2ooo::Br-paclitaxel (80:21), v ktorých acylový reťazec kovalentne pripojený k paclitaxelu mal rôznu dĺžku; na obrázkoch 6C až 6H sú mikrosnímky týchto častíc (550x).
Vinblastin bol kovalentne pripojený k acylovému reťazcu na dvadsiatej polohe hydroxylovej skupiny, a to modifikovanou metódou, ktorú uvádza USP 5 580 899 a USP 5 703 117 (ktoré tu uvádzame ako odkaz) V stručnosti, vinblastin /25 mg), rozpustený v CH2CI2 a pyridíne (5.1) bol zahrievaný s refluxom (deflegmátorom) pri 41 °C po celú noc, a to pri prebytku palmitoylchloridu (60 μΙ) a v prítomnosti 4 mg ···· ·· ·· ···· ·· ··· · · · · · · ··· ··· · ·
9*1 ·········· ··«······· ·· ·· ·· ·· ·· ·
DMAP. Tenkovrstevná chromatografia (TLC) v CHCb : MeOH (95:5) ukázala, že reagoval takmer všetok (>95 %) východiskový materiál a poskytol C16-produkt. Rozpúšťadlá boli odparené pod zníženým tlakom a produkt bol prečistený preparatívnou tenkovrstevnou chromatografiou (TLC) s použitím CHCb'MeOH (95:5). Nakoniec bol produkt lyofilizovaný z cyklohexánu a poskytol 15 mg (54 %) pevného bieleho prášku, ktorý bol identifikovaný podľa 1H a 13C nukleárnou magnetickou rezonanciou ( NMR).
Postupom REV (opísaným v príklade 1 vyššie) boli pripravené častice DSPEPEG2ooo'CI6-vinblastinu (v molárnom pomere 40:60) s použitím 18 mg DSPEPEG2OOo a 11 mg C16-vinblastinu. Tieto častice boli suspendované v 1,1 ml pufri HEPES. Na obrázkoch 8A a 8B sú mikrosnímky (277x) výsledných častíc.
Modifikovanou metódou opísanou v USP 5 580 899 a USP 5703 117 (ktoré tu uvádzame ako odkaz na prameň) bol k acylovému reťazci na 20. polohe hydroxylovej skupiny kovalentne pripojený kamptotecín. Stručne popísané: kamptotecín (20 mg) bol rozpustený pri teplote miestnosti v 4 ml bezvodého pyridínu, a potom miešaný s 56 mg anhydridu kyseliny palmitovej v čase 48 hodín. Postup reakcie ukázala tenkovrstevná chromatografia TLC) v CHCb:Me0H (96:4).
Pri zníženom tlaku bol odparený pyridín a rezíduum (zvyšok) bolo prečistené preparatívnou TLC s použitím CHC^MeOH (96:4). Získalo sa 30,1 mg (90 %) produktu vo forme krémovo sfarbeného prášku, ktorý bol identifikovaný metódou 1H a 13C NMR.
Častice DSPE-PEG20oo:C16-kamptotecínu (kamptotecín konjugovaný na 20. pozícii skupiny OH na 16-uhlíkový nasýtený acylový reťazec) v molárnom pomere 40:60 boli pripravené postupom REV (opísaným v príklade 1 vyššie) s použitím 50 mg DSPE-PEG2000 a 15 mg C16-kamptotecínu suspendovaného v 1,5 ml pufri HEPES.
Príklad 8 Elektrónová mikroskopia lomu pri nízkej teplote
Postupom REV (opísaným v príklade 1 vyššie) boli pripravené častice DOPC DOPE-PEG20oo:BrC16-paclitaxelu (v pomere 30:50:20) s použitím 4,7 mg DOPC, 27,4 mg DOPE-PEG2ooo a 5,85 mg BrC16-paclitaxelu, suspendované v 1 ml pufri HEPES. Potom boli zriadené elektrónové replikácie lomu pri zmrazení, zväčšené 91.000x (viď obr 7A) a 31.000x (viď obr 7B), a to tak, že 1 až 3 μΙ vzorky ·· ···· ···· ·· • · • · • · · · · · ·· ··· · ··· · • · · · · · · · · · ·· ·· ·· ·· ·· bolo vložené medzi pár Balzerových medených a dvojitých replikácii, potom bola vzorka s teplotou miestnosti zmrazená vložením do kvapalného propánu. Zmrazené vzorky boli podrobené lomu (pri -100°C a tlaku 10‘6 až 10'7 mPa (mbar)) a tieňované (tónované) platinou (c 45°) a uhlom v Balzerovom zariadení BAF400 na lom pri nízkej teplote. Rephkácie boli ponechané cez noc na čistenie 5 %-chlórnanom (komerčné bielidlo), premyté destilovanou vodou, uložené na sieť 300 ok (mesh) a prezerané elektrónovým mikroskopom „Philips 300 TEM. Snímok ukázal, že častice majú pevný vnútrajšok bez pozorovateľných lamiel.
Postupom REV (opísaným v príklade 1 vyššie) boli pripravené častice DSPEPEG2ooo:C16-vinblastinu (molárny pomer 40:60) s použitím 18 mg DSPE-PEG2ooo a 11 mg C16-vinblastinu, ktoré boli suspendované v 1,1 ml pufri HEPES. Výsledné častice boli upravené pre elektrónovú mikroskopiu vyššie uvedeným postupom. Mikrosnímky (zväčšenie 55.000x) sú uvedené na obr. 8C a 8D. Snímok z kryo-EM opäť ukázal, že tieto častice majú pevné jadro bez vnútorných lamiel.
Príklad 9 Elektrónová kryo-mikroskopia
Postupom vstrekovania etanolu (opísaným v príklade 1 vyššie) boli pripravené častice s použitím DSPE-PEG2ooo a BrC16-paclitaxelu (15:85) tak, aby obsahovali 10 mg/ml BrC16-paclitaxelu; vzorky (obsahu 1 ml) boli udržované pri teplote miestnosti v čase, kedy sa pripravili mriežky. Nezdedené vzorky sa zmrazili postupom, ktorý sa skladal z nasledujúcich krokov: kvapka vzorky sa vložila na EM-mriežku, stlačila sa na tenký film, a potom sa navlhnutá mriežka ponorila do kvapalného etánu. Boli zriadené fotografické negatívy zmrazených hydratovaných vzoriek zavesených v otvoroch krajkovitého (strapatého) uhlíkového suportu, a to pri malej dávke elektrónov. Šošovka bola zaostrená na 1,8 μιυ na 60K, a na 1,5 (im na 100K. Výsledky sú zobrazené na obr. 9 (zväčšenie HO.OOOx na obrázku A a B, a 184.000x na obrázkoch C a D) ···· ·· • · • · • · • · · ·* ·· ·· ···· ·· • · · · · · • · · · · • · · · · ·
9 9 9 · · ·· ·· ·· ·
Príklad 10 Meranie zaberaného objemu
Postupom vstrekovania etanolu (opísaným v príklade 1 vyššie) boli pripravené častice tak, aby koncentrácia BrC16HTD bola 10 mg/ml a koncentrácia DSPEPEG2000 4 mg/ml Tiež suspenzie lipozómov boli pripravené metódou vstrekovania etanolu s použitím DSPC tak, aby koncentrácia lipidu bola 14 mg/ml. Objem zaberaný týmito časticami a hpozómami (viď tabulka 4 nižšie) bol meraný metódou Perkinsa a j. (viď. Publikáciu „Chemistry and Physics of Lipids,,, 64 (19930), str. 197217 - ktorých obsah tu uvádzame ako prameň) s použitím spinovej sondy Temponie, zavedenej do preparátov buď v etanole (metóda čís. 1), alebo v pufri HEPES (metóda čís. 2.)
Na koncentrovanie častíc odstreďovaním boli častice ochladené na teplotu miestnosti a potom nazhromaždené odstreďovaním vzoriek suspenzií (1,5 ml) pri 50.000 g použitím Beckmanovej ultraodstredivky model L5-50. Pelety boli znova uvedené do suspenzie v 0,4 ml toho istého pufru. Vzorky obsahujúce „Tempone,, boli rozdelené na dva stomikrolitrové podiely; k jednému alikvotnému podielu bol pridaný pufor HEPES, a k druhému podielu bolo pridané 100 mikrolitrov stomilimólového roztoku „rozširovacieho,, činidla (,,BA„) oxalátu chrómu.
ESR (rezonancia špinu elektrónu; rezonancia i = -1 bez rozširovacieho činidla má vzťah k celkovému vodnému objemu podľa rovnice
Atot — V|H + Vout
U,o,-U lipid· ( kde V,n = vnútorný objem; Vtot = objem suspenzie; a V|ipid = objem hydratovaného lipidu (počítaný zo špecifických objemov lipidov a z vnútornej koncentrácie lipidu po zriedení)). Potom sa vypočítal vnútorný objem ako súčin 1) signálnej amplitúdy (Aba) alikvotnej vzorky zmiešanej s rozširovacím činidlom, a 2) korekčného faktora na objem lipidu podľa rovnice
Vn — Aba X [ (Vtot - Ulipid) /Atot] ·
Pre obidve merania (Atot a ABa) boli použité vzorky zriedené na rovnakú koncentráciu. Zaberaný objem bol vypočítaný použitím vnútorného objemu (V,n v mikrolitroch) a koncentrácie lipidu (mikromóly/milimetre).
···· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ·· ·
Tabuľka 4 ·· ···· • · · • · · • · · • · · · ·· ··
ľ i 1 Lipozómy Metóda M 1 etóda 2 Častice Metóda 1 Častice (pelety) Metóda 2
Metóda 2 Metóda 1
| Relatívna signálna 62 51 62 54 63 59
| amplitúda (w/BA)
Relatívna signálna 1 3 12 0 0 0 0
1 amplitúda (w/o BA)
zaberaný objem 2,7 3,0 0 0 0 0
(mikrolitre/mikromól lipidu)
Príklad 11 Štúdie akútnej toxicity
Častice obsahujúce DSAP-PEG2ooo/BrCI6-paclitaxel, pripravené vyššie opísaným postupom, a „TaxolR„ (firmy Bristol Myers-Squibb) boli podávané intraperitoneálne (i.p.) alebo intravenózne (i.v.) skupinám 5 až 10 CDF1-samíc myší, a to v piatich denných dávkach od 12,5 do 400 mg/kg buď BrC-16 paclitaxelu v časticiach alebo v TaxolR-u (pri týchto rovnakých dávkach v mg/kg boli molárne dávky BrC16-paclitaxelu o 27 % nižšie ako molárne dávky paclitaxelu v TaxolR-u, pričom molekulová hmotnosť BrC16-paclitaxelu je 1169 a molekulová hmotnosť paclitaxelu je 853).
Zásobné zmesi sa zriedili fosfátom pufrovaným soľným roztokom (PBS) na požadované koncentrácie a podávali sa pri objeme dávky 25 ml/kg; roztok PBS slúžil ako kontrola. Myši boli kontrolované denne a určoval sa čas prežitia každého člena každej skupiny V tabuľke 5 a 6 sú uvedené výsledky akútnej toxicity po intraperitoneálnom (i.p.) a intravenóznom (i.v.) podávaní. Tieto výsledky predstavujú extrapolované dáta z 1 až 4 experimentov na každú zmes a na každú dávku.
·· • · · · · • · · • · · · ·· ··
Tabuľka 5 • · · • · · • · · · • · · ·· ·· • · 9 99 9
Akútna toxicita BrC16-paclitaxelu oproti „Taxolu,, u myší CDF 1 (i.p. x 5) Denná dávka Ekvivalent Počet prežitých myší/celkový počet* (mg/kg) ' paclitaxelu(mg/kg) '
-------— j------- BrC16-pachtaxel Taxol^
12,5 20/20
25 — 10/20
3705 — — 0/10
50 ____ — 0/25
100 72 6,6
200 144 10/11 —
300 216 5/6
400 288 1/6
*/Prežitie po 30. dňoch po injekci
Tabuľka 6
Akútna toxicita BrC16-Paclitaxelu oproti Taxolu u myši CDF 1 (i.v. x 5) Denná dávka Ekvivalent Počet prežitých myší/celkový počet* (mg/kg) paclitaxelu (mg/kg)
12,5 BrCI6-paclitaxel TaxolR 15/15
18,75 — 5/5
25 — 13/15
31,25 — 4/5
37,5 — 0/7
50 36 5/5 0/8
100 72 4/5 ____
Prežitie po 30 dňoch po injekci
Príklad 12 Protirakovinové terapeutické štúdie
Šesť týždňov starým myším (SCID-CB17) samičkám bolo naočkované 5x106 buniek Ovcar3 (karcinóm ľudského vaječníka) (deň 0), potom bol podaný (i.p.) BrC16-paclitaxel (12, 5, 25, 50 alebo 100 mg/kg) alebo TaxolR (12,5 alebo 25 mg/kg) skupine 10 myši, a to vo 20., 22., 24., 26. a 28 deň po naočkovaní tumoru. Zásobné formulácie drog boli zriedené roztokom PBS tak, aby sa dosiahla požadovaná úroveň dávok. Zriedené formulácie boli podávané v objeme 25 ml/kg. Roztok PBS sa tiež použil na kontrolu. Myši boli kontrolované denne, a určoval sa čas prežitia každého kusu každej skupiny. Výsledky sú uvedené na obr. 10.
Príklad 13 Protirakovinové terapeutické štúdie
Šesť týždňov starým myším (CB17.SCID) samičkám bolo podkožné naočkované 5 x 106 buniek A549 (nie-malé bunky ľudského karcinómu pľúc) (deň 0); potom bol podaný (i.v.) (skupineh 5 myší) BrC16-paclitaxel (12, 5, 25, 50 alebo 100 mg/kg, a to v deň 1, 3, 5, 7 a 9 po naočkovaní tumoru. Zásobné formulácie drogy boli zriedené roztokom PBS tak, aby sa dosiahla požadovaná úroveň dávok; zriedené formulácie sa podávali v objeme 10ml/kg. Roztok PBS sa tiež použil na kontrolu. Objemy tumoru (mm3), počítané ako (šíŕka/2)2 x dĺžka χπ, sa merali dvakrát týždenne, počnúc deviatym dňom po naočkovaní. Myši boli likvidované, akonáhle objem ich tumoru dosiahol 1500 mm3. Výsledky sú uvedené na obr. 11.
Príklad 14 Protirakovinové terapeutické štúdie
Šesť týždňov starým myším samičkám (CB17, SCID) bolo (i.v.) naočkované 5 x 104 buniek L1210 (myšej leukémie) (deň 0); potom bol orálne podaný (skupine 9 10 myší) BrC-16 paclitaxel (12, 5, 25, 50 alebo 100 mg/kg) alebo TaxolR (12, 5 alebo mg/kg), a to na 1. až 5. deň po naočkovaní. Zásobné formulácie drogy boli zriedené roztokom PBS tak, aby sa dosiahla požadovaná úroveň dávok. Myši boli ·· ···· kontrolované denne a určoval sa čas prežitia každého člena každej skupiny.
Výsledky sú uvedené na obr. 12 ···· ·· • · · · · • 9 · · · • · · · · · » · · · · · ·· ·· ··
Príklad 15 Analýza veľkostí častíc obsahujúcich BrC16 paclitaxel/pluronik
Postupmi opísanými vyššie boli pripravené častice obsahujúce Br126paclitaxel a pluronik F68 (poloxamér 188,
HO(CH2CH20)75(CH(CH3)CH20)3o(CH2CH20) v molárnom pomere 90: 10 mol %. Stručne povedané: 48 mg derivátu paclitaxelu a 40 mg pluroniku sa rozpustilo v 0,2 ml etanolu; 0,1 ml alikvotného podielu výsledného roztoku sa potom pomaly pridávalo do skúšobnej liekovky (trubičky) obsahujúcej 2 ml fosfátom pufrovaného soľného roztoku (PBS: 10 mM fosfátu/150 mM soli, pH 7). Výsledné dvojmililitrové suspenzie sa potom skombinovali do jedinej suspenzie s objemom 4 ml.
Suspenzia sa preliala cez päťmikrónový filter a výsledný filtrát sa podrobil analýze veľkostí častíc, a to použitím analyzátora submikrónových častíc „Nicomp Model 370„. Výsledky (nm, ± smerodajná odchýlka) Gaussiánskej analýzy boli nasledujúce: 44±17 (vážený priemer počtu), 70 ±27 (vážený priemer objemu) a 105 ± 40 (vážený priemer intenzity). Tým sa potvrdilo, že použitím pluronika ako konjugátu je možné vytvoriť stabilné častice.
Príklad 16 Analýza veľkostí častíc obsahujúcich BrC16-paclitaxel/„CremophorR EL„
Postupmi opísanými v príklade 1 vyššie boli pripravené častice obsahujúce BrC-16 paclitaxel a „CremophorREL,, (glycerol-polyetylén-ricinoleát). Stručne povedané: 48 mg derivátu paclitaxelu sa rozpustilo spolu so 44 mg glycerolpolyetylén-ricinoleátu v 0,2 ml etanole, 0,1 ml alikvotného podielu výsledného roztoku sa potom pomaly pridávalo do skúšobných liekoviek obsahujúcich po 2 ml fosfátom pufrovaného soľného roztoku (PBS: 10 mM fosfátu/150 mM soli, pH 7). Výsledné dvojmililitrové suspenzie boli potom kombinované do jedinej suspenzie s objemom 4 ml ···· ·· ·· ···· ·· • · · ·· · · · · ··· · · · ·
JO ·········· ···· ···· · · ·· ·· ·· ·· ·· ·
Táto suspenzia bola potom skúmaná Nomarski-ho (svetelným) mikroskopom. Výsledky sú znázornené na obr 13 Tým sa potvrdilo, že použitím glycerolpolyetylén-oleátu ako konjugátu je možné vytvoriť stabilné častice
Príklad 17 Analýza veľkostí častíc obsahujúcich BrC16-paclitaxel/DOPE-GA
DOPE-GA, známy tiež ako B-glutaryl-PE, 18:1, je fosfolipid zložený z 1,2dioleyl-sn-glycero-3-fosfoetanolaminu konjugovaného na kyselinu glutarovú amidovou väzbou. Častice obsahujúce BrC-16 paclitaxel a DOPE-GA v molárnom pomere 50:50 mol % boli pripravené postupom opísaným v príklade 1 vyššie. Stručne povedané: 48 mg BrC16HTD a 33 mg DOPE-GA sa rozpustilo v 0,26 ml etanolu, a 0,13 ml alikvotného podielu tohto etanolického roztoku sa potom pomaly pridávalo do skúšobnej liekovky obsahujúcej 2 ml HBS (30 mM HEPES, 0 mM SOLI, pH 7,5). Výsledné dvojmililitrové suspenzie boli potom kombinované do jedinej suspenzie s obsahom 4 ml.
Tieto suspenzie mali modrobielu farbu a boli priesvitné. 4 ml tejto suspenzie ľahko prešlo syringovým filtrom (v injekčnej striekačke) s nominálnou veľkosťou pórov 5 mikrónov. Filtrát bol podrobený analýze veľkosti častíc, a to použitím analyzátora submikrónových častíc „Nicomp Model 370„. Výsledky (nm, ± smerodajná odchýlka) Gaussiánskej analýzy boli nasledujúce: 40 +16 (vážený priemer počtu), 67 ±27 nm (vážený priemer objemu) a 106 ±43 nm (vážený priemer intenzity).
Príklad 18 Častice obsahujúce Hamycín/DSPE-PEG2ooo
Častice Hamycín/DSPE-PEG2Goo (v hmotnostnom pomere (20:80), pripravené modifikovaným postupom REV z príkladu 1, boli skúmané mikroskopicky s použitím Nomarski-ho optiky. Suspenzie obsahovali heterogénne rozdelené častice s priemerom pod 6 pm. Suspenzia mala žltú farbu a bola slabo nepriehľadná. Obrázok 14 je mikroskopickým snímkom častíc Hamycínu/DSPE-PEG2ooo- Jeden centimeter na snímke predstavuje 27pm na obr. 14A a 13,6 pm na obr. 14B.
·· ···· ·· • · · · · ···· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· • · · · · · • · · · · · ·· »· ·· ···
Častice Hamycínu(DSPE-PEG2ooo (v hmotnostnom pomere 80:20), pripravené metódou dialýzy podľa príkladu 1, boli skúmané fázovou kontrastnou (svetelnou) mikroskopiou. Obr 15 je mikrosnimok častíc Hamycin/DSPE-PEG2ooo (80.20) Jeden centimeter na snímke predstavuje 27 pm Suspenzia mala žltú farbu a bola priesvitná.
Častice boli pripravené metódou dialýzy opísanej v príklade 1. Suspenzia (4 ml) prešla ľahko injekčným filtrom s nominálnou veľkosťou pórov 5 pm. Filtrát bol podrobený analýze veľkostí častíc použitím analyzátora submikrónových častíc „Nicomp Model 370„. Častice čo do veľkosti boli pomerne heterogénne. Výsledky analýzy prístrojom Nicomp ukázali, že je veľa veľkostných tried. Veľkosti boli stanovené buď Gaussiánskou analýzou, alebo distribučnou analýzou. Výsledky (v nanometroch ± smerodajná odchýlka) Gaussiánskej analýzy boli: 382 ± 196 (vážený priemer počtu), 205 ±105 nm (vážený priemer objemu) a 495 ±253 (vážený priemer intenzity). Distribučná analýza ukázala, že 66 % častíc malo 105 nm a 34 častíc malo 398 nm (vážený priemer počtu); 7 % častíc malo 111 nm a 93 % častíc malo 412 nm (vážený priemer intenzity), a 3 % častíc malo 111 nm a 97 % častíc malo 419 nm (vážený priemer objemu). Bimodálne rozdelenie zistené distribučnou analýzou ukázalo, že sú obsiahnuté i väčšie častice (nad 300 nm). V každom prípade veľkostná štúdia ukázala, že častice tvoria Hamycín/DSPE-PEGžooo·
Samozrejme sa rozumie, že vyššie uvedený opis vynálezu je len ilustratívny, a nie je obmedzujúci (reštriktívny). Skúseným odborníkom budú po prečítaní opisu tohto vynálezu zrejmé mnohé ďalšie vykonania. Predmet tohto vynálezu nie je teda obmedzený len vyššie uvedeným opisom vynálezu, ale je aj určovaný priloženými patentovými nárokmi a celým výpočtom obsahových ekvivalentov, na ktorých sa tieto nároky vzťahujú. Závery všetkých článkov a referencií, vrátane patentových prihlášok a publikácii, sú do textu vynálezu včlenené ako odkaz na pramene, a to na všetky ciele a použitia.
·· φ··· ···· ·· • ·

Claims (25)

1 . Častica, vyznačujúca sa tým, že pozostáva:
a) z jadra obsahujúceho slabo hydrofilnú zlúčeninu;
b) z konjugátu biokompatibilnej hydrofilnej zóny a biokompatibilnej hydrofóbnej zóny, a tento konjugát obklopuje jadro, pričom slabo hydrofilná zlúčenina tvorí 20 mol % až 99 mol % častice, konjugát tvorí 1 mol % až 80 mol % častice, a častica má priemer najmenej 15 nm.
2 . Častica podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že zlúčenina je zvolená zo skupiny látok, ktorú tvoria taxány, alkaloidy vinea, bryostatíny, cefalosporíny, steroidy, rifamycíny, mitomycíny, bleomycíny, benzonaftopyranón, bisinterkalačné antibiotiká, nukleozidové antibiotiká, pyrol[1,4] benzodiazepíny, makrolidy, bis-indolalkaloidy, kamptotecíny, etoposidy, teniposidy, interkalátory DNA, antiestrogény, bis(benzimidazol)y a adenin-arabinozidy.
3 . Častica podľa nároku 2, vyznačujúca sa tým, že zlúčeninou je taxán.
4 . Častica podľa nároku 3, vyznačujúca sa tým, že taxánom je paclitaxel.
5 . Častica podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že slabo hydrofilnou zlúčeninou je zlúčenina kovalentne viazaná k hydrofóbnej zóne tvorenej látkou zvolenou zo skupiny pozostávajúcej z acylových reťazcov, hydrofóbnych peptidov a hydrofóbnych polymérnych reťazcov.
6. Častica podľa nároku 5, vyznačujúca sa tým, že hydrofóbnu zónu tvorí acylový reťazec.
7 . Častica podľa nároku 6, vyznačujúca sa tým, že acylový reťazec má vzorec
I
C(0)CHX1(CH2)n1(CH=CH)n2(CH2)n3(CH=CH)n4(CH2)n5(CH=CH)n6(CH2)n7(CH= CH)n8(CH2)n9CH3 (I ) v ktorom. n1 sa rovná nule alebo celému číslu od 1 do 21, n3 sa rovná nule alebo celému číslu od 1 do 18, n5 sa rovná nule alebo célomu číslu od 1 do 15, n7 sa rovná nule alebo celému číslu od 1 do 12, n9 sa rovná nule alebo celému číslu od 1 do 9, n2, n4, n6 a n8 - každé z nich sa nezávisle od soba rovná 0 alebo 1;
···· ·· ·· ···· ·· ··· ·· · ···
33 »········· • · · · ···· ·· ·· ·· ·· ·· ·· · súčet η1 + 2n2 + n3 + 2n4 + n5 + 2n6 + n7 + 2n8 + n9 sa rovná celému číslu od 3 do 21; a X1 je vodík alebo skupina podporujúca hydrolýzu.
8 Častica podľa nároku 7, vyznačujúca sa tým, že acylový reťazec má vzorec C((0)CHX1(CH2)niCH3
9 Častica podľa nároku 8, vyznačujúca sa tým, že acylový reťazec je -C(O)CHX1(CH2)9CH3, -C(O)CHX1(CH2)11CH3i alebo -C(0)CHX1(CH2)13CH3 .
10. Častica podľa nároku 9, vyznačujúca sa tým, že X1 je skupina podporujúca hydrolýzu
11. Častica podľa nároku 10, vyznačujúca sa tým, že hydrolýzu podporujúca skupina je vybraná zo skupiny látok tvorenej F, Cl, Br, J, -OC6H4X2 a -C(O)X2, kde X2 je F, Cl, Br, J, CN, NO2 alebo NH3 +.
12 . Častica podľa nároku 11, vyznačujúca sa tým, že skupinou podporujúcou hydrolýzu je bróm Br.
13. Častica podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že slabo hydrofilná zlúčenina obsahuje acylový reťazec zvolený z nasledujúcich skupín pripojených na paclitaxel: -C(0)CHBr(CH2)9CH3, -C(O)CHBr(CH2)nCH3, alebo -C(0)CHBr(CH2)i3CH3.
14 . Častica podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že konjugát hydrofóbnej zóny obsahuje amfipatický lipid v oblasti acylového reťazca.
15. Častica podľa nároku 14, vyznačujúca sa tým, že amfipatickým lipidom je fosfatidyl-etanolamín.
16 . Častica podľa nároku 15, vyznačujúca sa tým, že fosfatidyl-etanolamínom je distearoyl-fosfatidyletanolamín (DSPE).
17 . Častica podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že konjugátom hydrofóbnej zóny je hydrofóbny polymér.
18. Častica podľa nároku 17, vyznačujúca sa tým, že hydrofóbnym polymérom je silikónový polymér alebo poly(oxypropylén).
19. Častica podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že konjugátom hydrcfíinej zóny je hydrofilný polymér.
20 Častica podľa nároku 19, vyznačujúca sa tým, že hydrofilný polymér je zvolený zo skupiny látok, ktorú tvoria polyetylénglykoly, celulózy, hydrofilné peptidy, polysacharidy, polyetylénoxidy, polyakrylové kyseliny, polyakrylamidy, polyvinyl-pyrolidóny a polymetakryláty.
•e ···· ···· ·· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ·· • · · • · • · • · ·· ·
25.
26.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
Častica podľa nároku 20, vyznačujúca sa tým, že hydrofilnou zónou je polyetylénglykol (PEG) alebo polyetylénoxid s molekulovou hmotnosťou od 50 do 5000
Častica podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že konjugátom je DSPEPEG2000
Častica podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že konjugát obsahuje najmenej jeden lipid s nábojom
Častica podľa nároku 23, vyznačujúca sa tým, že nabitý lipid má výsledný záporný náboj.
Častica podľa nároku 24, vyznačujúca sa tým, že záporne nabitým lipidom je DOPE-GA.
Častica podľa nároku 23, vyznačujúca sa tým, že nabitý lipid má výsledný kladný náboj.
Častica podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že konjugátom je kopolymér vzorca
HO(CH2CH20 )a(CH (CH3)CH20)b(CH2CH20)cH, kde a_ a b sú nezávisle od seba celé čísla od 10 do 100.
Častica podľa nároku 27, vyznačujúca sa tým, že každé a_ a c sa rovná celému číslu 75, a b znamená celé číslo 30.
Častica podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že konjugátom je glycerol(polyetylénglykol)ricinoleát.
Častica podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že má priemer do 10 000 nm. Častica podľa nároku 30, vyznačujúca sa tým, že má priemer v rozmedzí 15 nm až 200 nm.
Častica podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že obsah hydrofóbnej zlúčeniny je viac ako 50 mol % častice a obsah konjugátu menej ako 50 mol % častice.
Častica podľa nároku 32, vyznačujúca sa tým, že obsah hydrofóbnej zlúčeniny tvorí 80 mol % až 99 mol % častice, a obsah konjugátu je 1 mol % až 20 mol % častice.
Častica podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že pozostáva z
a) 80 mol % až 90 mol % paclitaxelu kovalentne pripojeného na C(0)CHBr(CH2)9CH3, -C(O)CHBr(CH2)uCH3 alebo -C(0)CHBr(CH2)i3CH3, alebo
99 9999 ···· ·· • · · • · ·
9 9 9 9 • 9 9 9 ·· · • · · • · · • · · • · · ·
99 99
99 9
b) z 1 mol % až 20 mol % konjugátu zvoleného zo skupiny látok, ktorú tvorí DSPE-PEG2000. DOPE-GA, HO(CH2CH20)75(CH(CH3)CH20)3o(CH2CH20)75H a glycerol(polyetylénglykol)ricinoleát, pričom častica má priemer od 15nm do 200 nm
35. Častica podľa nároku 34, vyznačujúca sa tým, že obsahuje DSPEPEG2000 a paclitaxel konjugovaný na C(0)CHBr(CH2)i3CH3.
36. Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje časticu podľa nároku 1 a farmaceutický prijatelný nosič.
37 Spôsob podávania zlúčeniny živočíchom, vyznačujúci sa tým, že sa živočíchom podáva kompozícia podľa nároku 36.
38 Sposob podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, že živočíchom je človek.
39. Spôsob podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, že podávanie lieku je orálne, intravenózne alebo intraperitoneálne.
40. Spôsob podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, že pri postihnutí cicavcov chorobou zo skupiny rakovín, zápalových porúch a mikrobiálnych infekcií sa aplikuje zlúčenina terapeuticky účinná proti týmto chorobám, a že sa aplikuje terapeuticky účinné množstvo tejto zlúčeniny.
41. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že postihnutím je rakovina, slabo hydrofilnou zlúčeninou je BrC 16-paclitaxel a konjugátom je DSPE-PEG2000·
42. Spôsob podľa nároku 41, vyznačujúci sa tým, že veľkosť častice je v rozmedzí 15 nm až 200 nm, a že častica obsahuje 80 mol % až 99 mol % BrC16-paclitaxelu a 1 mol % až 20 mol % konjugátu DSPE-PEG2000·
43. Častica podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že hydrofóbna zlúčenina jadra je derivátom nehydrofóbnej zlúčeniny, a že tento derivát tvorí zlúčeninu viazanú na biokompatibilnú hydrofóbnu zónu.
·· ····
1/25 ···· ·· • e · e · · • · · 9 • · · ·
99 99 ·· • · • · ·· ·· • · · • ·
9 9
9 ·
99 9
Koncentrácia fosfolipidu (mM) % z celkového obsahu 2Br-C16-HTD frakcia # • ft ··· ftftftft ftft ftft · • ftft • · ftft • ftft · • ft ·· • ·
2/25 • · • · ft · • · · • ft • · ft · · • · • · • · • ft ·
Obr. 2
3/25 ••·· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ···· • · · • · · • · i • · · · ·· ··
Obr. 3A čas (dni) čas (dni) XPBd!Jd Xpedud ···· ···· • · • ·
4/25
Äpedud
Äpedud
Äpedud
Äpedud čas (dni) čas (dni) ·· ·
9 9 99
9 9 9
9 9 9
9 9 9
99 999 ·· ···· • •99 ·· • · • · · • · 9 • · · · ·· ··
9 9 · • · · • · ·
9 9 9 9
99 ··
5/25
Obr. 4E
J čas (dni) ···· ··
9 9 · • · · • · · • · · · ·· • · · • · · · • · · ·· ··
99 ····
6/25 % z počiatočného BrC16-HTD čas (hodiny) ftftftft ·· • · · ft · · • · · ft ftft · • · · · ftftftft
7/25
Obr. 6A
Obr. 6B ···· ·· • · · · · ·
8/25 ·· · ··· ·· · · · · · • · · ··· ··· • · ··· · · (* · · · ··· ·«·· ·· · ·· ·· ·· ·· · · · · ·
Obr. 6C
Obr. 6D • β · · • · · · ·
9/25 • · · ··
Obr. 6Ε
Obr. 6F ···· ·· ·· ··· ·
10/25
Obr. 6G
Obr. 6H * s
11/25
Obr. 7Α • · • · • · • · • · ·· ···· ·· • · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · · ···· ·· ·· ···· ·· ····
13/25
Obr. 8A
Obr. 8B ···· ·· ·· ··«· • · ·
14/25
Obr. 8C • · • · • · • · · • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· ···· · • · • · • · • · · ·· 4 ·· ···· ··
15/25
Obr. 8D ···· ·· ···· • 4 ···
16/25
Obr. 9A *
···· • ·
17/25
Obr. 9B ···· ·· • · 4 • · ι • · i • · · 4
Φ J*· • · ···
18/25
Obr. 9C ···· ·· • · · • · · • · · · • · · · ·· ·· ·· ···· • · · • · · • · · · • · · · ·· ··
9 9 9
9 9 9
9 9 9 9
9 9 9
99 99
999
19/25 ···· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ·· ···· ·· ft
Obr. 9D ···· ·· • · ·
20/25 ·· ···· B · · • · I B · · <
·· ··
B · ·
B · · I ·· ·· o
v o
M
O o
e (D
O
ΊΤ
O
N
O o
(O dni po naočkovaní qoÄjiz&id % ·· ···· ···· ·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· • · • · • · ·· • · • · • · • · · ··
21/25
Obr. 11 «· dni po naočkovaní
Quiui) njotunj Lusfqo ···· ···· ··
22/25
I · ·
I · · • · • · ·
Obr.12
O in in v
o ’T o
Γ»
CM
O
CM «0 dni po naočkovaní qoÄjizejd % ·· ····
23/25
Obr. 13a
Obr. 13b
9999
24/25
9999 ··
9 9 · • · 9 • · 9 · • · · e · ·· • · • · • · • ·
Obr. 14A
25/25 ···· ·· • · ·
9 9 9
9 9 9
9 9 9 9
99 99 ·· ···· »9 9
I · 9 »9 9 » 9 9 9
Obr. 15
SK1742-2000A 1998-05-20 1999-05-19 Kompozöcie ¬astöc SK17422000A3 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8610898P 1998-05-20 1998-05-20
PCT/US1999/010975 WO1999059550A1 (en) 1998-05-20 1999-05-19 Novel particulate formulations

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK17422000A3 true SK17422000A3 (sk) 2001-09-11

Family

ID=22196324

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1742-2000A SK17422000A3 (sk) 1998-05-20 1999-05-19 Kompozöcie ¬astöc

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6500461B2 (sk)
EP (1) EP1079812A4 (sk)
JP (1) JP2002535242A (sk)
KR (1) KR20010052368A (sk)
CN (1) CN1310612A (sk)
AR (1) AR019308A1 (sk)
AU (1) AU745015B2 (sk)
BR (1) BR9911031A (sk)
CA (1) CA2332545A1 (sk)
EA (1) EA200001109A1 (sk)
EE (1) EE200000693A (sk)
ID (1) ID28166A (sk)
IL (1) IL139541A0 (sk)
NO (1) NO20005832L (sk)
PL (1) PL344327A1 (sk)
SK (1) SK17422000A3 (sk)
TR (1) TR200003435T2 (sk)
WO (1) WO1999059550A1 (sk)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8853260B2 (en) 1997-06-27 2014-10-07 Abraxis Bioscience, Llc Formulations of pharmacological agents, methods for the preparation thereof and methods for the use thereof
US9700866B2 (en) 2000-12-22 2017-07-11 Baxter International Inc. Surfactant systems for delivery of organic compounds
US6977085B2 (en) * 2000-12-22 2005-12-20 Baxter International Inc. Method for preparing submicron suspensions with polymorph control
US20040022862A1 (en) * 2000-12-22 2004-02-05 Kipp James E. Method for preparing small particles
US8067032B2 (en) * 2000-12-22 2011-11-29 Baxter International Inc. Method for preparing submicron particles of antineoplastic agents
AU2002337692B2 (en) 2001-09-26 2007-09-13 Baxter International Inc. Preparation of submicron sized nanoparticles via dispersion and solvent or liquid phase removal
US7241456B2 (en) * 2002-10-25 2007-07-10 Australian Importers Ltd. Formulations for topical delivery of bioactive substances and methods for their use
US7772188B2 (en) 2003-01-28 2010-08-10 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
US20050281740A1 (en) * 2004-06-16 2005-12-22 Glen Gong Imaging damaged lung tissue
US7608579B2 (en) 2004-06-16 2009-10-27 Pneumrx, Inc. Lung volume reduction using glue compositions
US20050281799A1 (en) 2004-06-16 2005-12-22 Glen Gong Targeting damaged lung tissue using compositions
US7678767B2 (en) 2004-06-16 2010-03-16 Pneumrx, Inc. Glue compositions for lung volume reduction
US7553810B2 (en) 2004-06-16 2009-06-30 Pneumrx, Inc. Lung volume reduction using glue composition
EP1781182B1 (en) 2004-07-08 2019-11-13 PneumRx, Inc. Pleural effusion treatment device
EP1786443B1 (en) 2004-07-19 2018-06-06 Celator Pharmaceuticals, Inc. Particulate constructs for release of active agents
BRPI0600285C1 (pt) * 2006-01-13 2011-10-11 Brz Biotecnologia Ltda compostos farmacêuticos contendo nanopartìculas úteis para tratamento de lesões reestenóticas
US20090136937A1 (en) 2007-05-09 2009-05-28 Coleman Matthew A Methods and systems for monitoring production of a target protein in a nanolipoprotein particle
WO2009015037A2 (en) 2007-07-21 2009-01-29 Albany Molecular Research, Inc. 5-pyridinone substituted indazoles
EP2209420A4 (en) 2007-10-09 2014-01-22 Univ St Louis IMAGING PARTICLES
US9468607B2 (en) 2007-10-09 2016-10-18 Washington University Ligand directed toroidal nanoparticles for therapy and diagnostic imaging
EP2628727A3 (en) 2007-11-21 2013-12-25 Decode Genetics EHF Biaryl PDE4 inhibitors for treating pulmonary and cardiovascular disorders
AU2009204048B2 (en) 2008-01-11 2013-08-01 Albany Molecular Research, Inc. (1-azinone) -substituted pyridoindoles as MCH antagonists
JP5539993B2 (ja) * 2008-09-23 2014-07-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 薬物送達のためのナノ担体
WO2010059836A1 (en) 2008-11-20 2010-05-27 Decode Genetics Ehf Substituted aza-bridged bicyclics for cardiovascular and cns disease
RU2506266C2 (ru) 2009-01-26 2014-02-10 Израэл Инститьют Фо Байолоджикал Рисерч Бициклические гетероциклические спиросоединения
CN101670095B (zh) * 2009-04-13 2012-05-23 北京大学 一种用于栓塞治疗的药物组合物及其制备方法
KR20120104512A (ko) 2009-07-14 2012-09-21 알바니 몰레큘라 리써치, 인크. 5-ｈｔ3 수용체 조절체, 이의 제조 방법, 및 그의 용도
US9808500B2 (en) 2009-12-17 2017-11-07 Washington University Antithrombotic nanoparticle
US9764043B2 (en) 2009-12-17 2017-09-19 Washington University Antithrombotic nanoparticle
TWI438009B (zh) * 2010-02-19 2014-05-21 Teikoku Pharma Usa Inc 紫杉烷前－乳劑調配物及其製造與使用之方法
AU2011239414A1 (en) 2010-04-15 2012-11-08 The Washington University Prodrug compositions, prodrug nanoparticles, and methods of use thereof
WO2011139899A2 (en) 2010-05-03 2011-11-10 Teikoku Pharma Usa, Inc. Non-aqueous taxane pro-emulsion formulations and methods of making and using the same
US9644038B2 (en) 2011-12-21 2017-05-09 The Regents Of The University Of California Apolipoprotein nanodiscs with telodendrimer
US8895055B2 (en) 2011-12-21 2014-11-25 The Regents Of The University Of California Telodendrimer nanodiscs without apolipoprotein
JO3685B1 (ar) 2012-10-01 2020-08-27 Teikoku Pharma Usa Inc صيغ التشتيت الجسيمي للتاكسين غير المائي وطرق استخدامها
US9642916B2 (en) 2012-12-12 2017-05-09 The Regents Of The University Of California Porphyrin modified telodendrimers
WO2017044899A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 Lawrence Livermore National Security, Llc Synthetic apolipoproteins, and related compositions methods and systems for nanolipoprotein particles formation
WO2018053316A1 (en) 2016-09-15 2018-03-22 The Regents Of The University Of California Improved hybrid telodendrimers
WO2018204421A2 (en) 2017-05-02 2018-11-08 Lawrence Livermore National Security, Llc Momp telonanoparticles, and related compositions, methods and systems
JP2021518413A (ja) 2018-03-20 2021-08-02 アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ キナーゼ阻害剤化合物及び組成物ならびに使用方法
EP3906233B1 (en) 2018-12-31 2024-01-31 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Kinase inhibitor compounds and compositions and methods of use

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8601100D0 (en) * 1986-01-17 1986-02-19 Cosmas Damian Ltd Drug delivery system
MX9203504A (es) * 1988-04-20 1992-07-01 Liposome Co Inc Complejo agente: lipido activo de alta proporcion.
JP2687448B2 (ja) * 1988-06-22 1997-12-08 大正製薬株式会社 イブプロフェン徐放性製剤
JPH0429924A (ja) * 1990-05-28 1992-01-31 Terumo Corp 脂溶性薬物含有注射用製剤
CA2085342A1 (en) 1990-06-14 1991-12-15 Milton R. Kaplan Stable aqueous drug suspensions
US5599556A (en) * 1991-12-31 1997-02-04 Abbott Laboratories Prolamine coatings for taste masking
CA2141582C (en) 1992-08-05 2003-09-30 Angelo Mario Morella Pelletised pharmaceutical composition
US5346702A (en) * 1992-12-04 1994-09-13 Sterling Winthrop Inc. Use of non-ionic cloud point modifiers to minimize nanoparticle aggregation during sterilization
US5439686A (en) 1993-02-22 1995-08-08 Vivorx Pharmaceuticals, Inc. Methods for in vivo delivery of substantially water insoluble pharmacologically active agents and compositions useful therefor
US5776486A (en) * 1993-05-28 1998-07-07 Aphios Corporation Methods and apparatus for making liposomes containing hydrophobic drugs
US5478860A (en) 1993-06-04 1995-12-26 Inex Pharmaceuticals Corp. Stable microemulsions for hydrophobic compound delivery
US5565215A (en) * 1993-07-23 1996-10-15 Massachusettes Institute Of Technology Biodegradable injectable particles for imaging
US5415869A (en) 1993-11-12 1995-05-16 The Research Foundation Of State University Of New York Taxol formulation
DK0902783T3 (da) * 1995-09-12 2002-07-22 Liposome Co Inc Hydrolysefremmende, hydrofobe taxanderivater
HRP970493A2 (en) * 1996-09-23 1998-08-31 Wienman E. Phlips Oral delayed immediate release medical formulation and method for preparing the same

Also Published As

Publication number Publication date
JP2002535242A (ja) 2002-10-22
AU745015B2 (en) 2002-03-07
ID28166A (id) 2001-05-10
CN1310612A (zh) 2001-08-29
TR200003435T2 (tr) 2001-03-21
AR019308A1 (es) 2002-02-13
EP1079812A1 (en) 2001-03-07
NO20005832L (no) 2001-01-18
NO20005832D0 (no) 2000-11-17
PL344327A1 (en) 2001-10-22
BR9911031A (pt) 2002-01-29
WO1999059550A1 (en) 1999-11-25
US20020034536A1 (en) 2002-03-21
US6500461B2 (en) 2002-12-31
EA200001109A1 (ru) 2001-06-25
IL139541A0 (en) 2004-02-08
CA2332545A1 (en) 1999-11-25
AU4190699A (en) 1999-12-06
EE200000693A (et) 2002-04-15
EP1079812A4 (en) 2001-12-12
KR20010052368A (ko) 2001-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6500461B2 (en) Particulate formulations
Nie et al. Cholesterol derivatives based charged liposomes for doxorubicin delivery: preparation, in vitro and in vivo characterization
US20030235619A1 (en) Polymer-lipid delivery vehicles
US7368254B2 (en) Lipid-based systems for targeting diagnostic agents
US20030059465A1 (en) Stabilized nanoparticle formulations of camptotheca derivatives
EP1458365A1 (en) Improved polymer-lipid delivery vehicles
US20190038556A1 (en) Formulations and carrier systems including compound interactive domains
KR20080009196A (ko) 중합체 및 패신저 약물의 마이셀 조성물
WO2007106683A2 (en) Biomimetic iron-oxide-containing lipoprotein and related materials
US20100166843A1 (en) Pharmaceutical composition comprising a campothecin derivative
CN106821987B (zh) 一种载含酚羟基难溶性药物的脂质体及制备方法和应用
WO2003105765A2 (en) Phospholipid micelles in liposomes as solubilizers for water-insoluble compounds
Accardo et al. Naposomes: A new class of peptide-derivatized, target-selective multimodal nanoparticles for imaging and therapeutic applications
CZ20004260A3 (cs) Nové kompozice částic
MXPA00011361A (en) Novel particulate formulations
CN110575549B (zh) 一种tbFGF配体修饰的具有肿瘤主动靶向功能的脂质体及其制备方法与用途
JP2023507617A (ja) 脳腫瘍を治療するための架橋ナノセラノスティクスにおけるシーケンシャルターゲティング
JP5303269B2 (ja) 骨髄指向性薬物送達物質およびその用途
Dos Santos Characterization of cholesterol-free liposomes for use in delivery of anti-cancer drugs
Magarkar Design of cholesterol arabinogalactan anchored
Scherphof et al. Pegylation of Liposomes in Cell-Specific Targeting: It Does Not Always Make Sense
Longman In vivo targeting of liposomal drug carriers