CZ20004260A3 - Nové kompozice částic - Google Patents

Abstract

Řešení se týká nosičů schopných vpravovat do těla živočichů vysoké koncentrace slabě hydrofilních/slabě hydrofobních lipofílních sloučenin, a to kombinováním sloučenin s v biokompaktibilní hydrofobní zónou s konjugáty, které mají jak hydrofobní, tak i hydrofilní oblast. Tyto kompozice jsou CO vhodné pro četné aplikace u živočichů, a to zejména pro podávání vysokých koncentrací terapeuticky účinných sloučenin bez neúnosných vedlejších účinků.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká částic obsahujících vysoké koncentrace sloučenin pro terapeutické, diagnostické a jiné použití.

Dosavadní stav techniky

Účinné použití sloučenin s léčivě blahodárnými účinky si vyžaduje vytvořit kompozice obsahující dostatečné množství sloučenin bez větších vedlejších účinků. Vyskytují se nosiče, v nichž je možno v dostatečných koncentracích solubilizovat jek hydrofilní, tak i lipofilní sloučeniny, a tyto potom podávat jako účinný lék. Avšak dosud byl nedostatek farmaceutických nosičů, v nichž by bylo možno účinně použít slabě hydrofilních a současně slabě lipofilních sloučenin, jako jsou různé taxany, alkaloidy vinca, cefalosporiny a steroidy.

Jednou takovou sloučeninou je taxan paclitaxel. Jeho slabě hydrofilní/slabě lipofilní molekula je nedostatečně rozpustná v běžnějších farmaceutických nosičích, připraví-li se z ní terapeuticky použitelné kompozice. Paclitaxel (Taxol^R) je často běžně dostupný v „kremofor/etanolovém nosiči „Cremophor^REL. Avšak tato kompozice mívá určité nežádoucí vedlejší účinky v koncentracích, zajišťujících účinnou terapeutickou hladinu paclitaxelu. Těmito účinky jsou např. akutní toxicity některých pacientů, jimž tato kompozice byla podána (viz např. Straubinger aj., USP 5 415

869) .

···· · ·· · »· • · · · · · · « • · 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 • · · · · 9 9 999 9 9

Straubinger aj. (viz USP 5 415 869) na příklad formuluje paclitaxel v liposomech, a to v limitovaném poměru paclitaxelu k liposomálnímu lipidu. Mimo to Straubingerova maximální koncentrace paclitaxelu (viz anotace) je značně pod hladinou koncentrace této drogy akumulované v částicích podle tohoto vynálezu. A dále, Desai aj. (USP 5 439 686), Wheeler (USP 5 478 860) a Alkan-Onyuksel a jiní (čas. Pharmaceutical Research, stránky 206 - 212) - tito všichni také aplikují tyto sloučeniny v příslušných nosičích při nízkých poměrech sloučeniny k nosiči,a při koncentracích menších, než jsou koncentrace, při nichž je možno akumulovat tyto sloučeniny v nosičích podle tohoto vynálezu.

Tento přihlášený vynález poskytuje takový nosič pro solubilizaci slabě hydrofilních/slabě lipofilních sloučenin, jako je např. paclitaxel, že výsledné kompozice jsou bezpečně použitelné pro podávání vysokých dávek uvedených sloučenin, a to bez neúnosných vedlejších účinků. Částice podle vynálezu, která obsahuje tuto sloučeninu ve vysokém poměru sloučeniny k ostatním komponentám nosiče, není ani liposom, ani emulzní částice, a dosud nebyla popsána.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje částici složenou z jádra, obklopeného hydrofilním/hydrofobním konjugátem. Jádro sestává ze slabě hydrofilních/slabě lipofilních sloučenina, jako jsou např. taxany, alkaloidy vinca,bryostatiny, cyklické polypeptidy jako jsou cefalosporiny, steroidální sloučeniny, rifamyciny, mitomyciny, bleomyciny, benzo-naftopyranon, bis-interkalační antibiotika,nukleosidová antibiotika, pyrol [1, 4]benzodiazepiny, makrolidy včetně makrolidových antibiotik jako je hamycin, bisindol-alkaloidy, kamptotheciny, etoposidy, teniposidy, interkalátory DNA, antiestrogeny, bis(benzimidazoly) a nukleosidy jako je adenin-arabinosid. Tyto sloučeniny mají biokompatibilní hydrofobní zónu, jako např. některý acylový řetězec, hydrofobní peptid nebo hydrofobní polymerní řetězec, kteréžto jsou v nich buď přirozeného původu, nebo byly připojeny syntetickými prostředky. Alternativně může jádro tvořit hydrofilní sloučenina, na níž je konjugována (připojena) hydrofobní zóna, a výsledkem je, že složení jádra je slabě hydrofilní.

Konjugát obklopující jádro sestává z biokompatibilní hydrofobní zóny a připojené biokompatibilní hydrofilní zóny. Konjugátem je buď přírodní nebo syntetická molekula, která má hydrofobní a hydrofilní zónu, nebo je to konjugát hydrofilní a hydrofobní zóny. Vhodnými hydrofobními zónami konjugátu jsou např. oblasti acylových řetězců v amfipatických (obojetných) lipidech, jakož i hydrofobní polymery, jako silikonové polymery a hydrofobní peptidy. Vhodnými hydrofilními zónami jsou např. polyethylenglykoly, celulózy, hydrofilní peptidy, polysacharidy, polyethylenoxidy, polyakrylové kyseliny, polyakrylamidy, polyvinylpyrolidony a polymetakryláty. Vhodnými hydrofilními zónami jsou také polární koncové skupiny amfipatických (obojetných) lipidů; tyto mají obvykle kladný nebo záporný náboj, a patří mezi ně fosfatidyl-seriny, fosfatidylglyceroly a fosfatidické kyseliny, jakož i jiné lipidy, jako např. fosfatidyl-etanolaminy, k nimž jsou připojeny organické dikarboxylové kyseliny, jako je např. kyselina glutarová.

Je výhodné, je-li sloučeninou jádra taxan s připojeným přímým nasyceným acylovým řetězcem o délce 10 až 24 atomů uhlíku, dále je-li konjugátem hydrofobní zóny fosfatidylethanolamin a hydrofilní zóny hydrofilní polymer, jako je polyethylenglykol o molekulové hmotnosti 50 až 5 000.

Nejvýhodnější sloučeninou jádra je paclitaxel s připojeným přímým nasyceným acylovým řetězcem o délce 12, 14 nebo 16 uhlíků a brómovaným na uhlíku alfa. Nejvýhodnějším konjugátem hydrofobní zóny je distearoyl-fosfatidylethanolamin („DSPE), a nejvýhodnějším konjugátem hydrofilní zóny je polyethylenglykol o molekulové hmotnosti 2000 (//PEG2000) ·

Vynález se také vztahuje na kompozice obsahující tyto částice suspendované ve farmaceuticky přijatelných nosičích. Tyto kompozice se použijí pro vysoce účinné podávání sloučenin živočichům, t.j. pro podávání sloučenin ve vysokém poměru ko,astatním komponentám částic. Při takovém způsobu podávání léků se dosahuje nižší toxicity, než při běžných formulacích podobných sloučenin. Uvedené vysoce účinné a nízkotoxické formulace jsou použitelné k podávání působících látek živočichům, jako jsou lidé, a to pro terapeutické, diagnostické a jiné účely, jako např. k ošetření různých druhů rakoviny.

Ostatní rysy, předměty a výhody vynálezu se stanou zřejmými z podrobného popisu, který následuje.

Stručný popis obrázků

Obr. 1. Sacharózová gradientová frakcionace preparátu

obsahujícího DOPC, DOPE-PEG₂ooo a BrCl6-paclitaxel (molovy poměr 30:50:20). Osa x: frakce #; osa y: A:% z celkového obsahu paclitaxelu ve vzorku;

B:koncentrace fosfolipidu (mM).

Obr. 2. Turbidita (zakalenost) preparátu obsahujícího DOPC: DOPE-PEG₂ooo:BrC16-paclitaxel (10:10:80) a zředěného v roztocích o různém osmotickém tlaku. Osa x: doba (sec); osa y: absorbance (800 nanometrů).

Trojúhelníky: H₂O; tenké čáry: 75 mM NaCl; plné čtverečky: 150 mM NaCl; silné čáry: 300 mM NaCl.

Obr. 3. Stabilita preparátů uložených při teplotě místnosti. Osa x: doba (dnů); osa y: kriteria případů: O: krystalizace +++; 1: krystalizace ++; 2:

krystalizace +; 3: bez krystalizace, částice nepravidelných tvarů; 4: bez krystalizace.

A: DOPC: DOPE-PEG₂₀₀₀ :BrC16-paclitaxel (10:10:80)

B: DSPE: DOPE-PEG₂ooo: BrCl 6-paclitaxel 20:80 (plné kosočtverečky) nebo 10:90 (čtverečky);

C: DOPE-PEG₂₀₀o:BrCl6-paclitaxel 20:80 (plné kosočtverečky), 15:85 (čtverečky) nebo 10:90 (hvězdička).

D: PE-PEG₂ooo·BrC16-paclitaxel a PE-PEG5000:BrC16paclitaxel, oba v poměru 15:85; DPPE-PEG₂ooo - plné kosočtverečky; DOPE-PEG5000 - čtverečky; DPPEPEG5000 ~ x; DMPE-PEG5000 - trojúhelníky.

Obr. 4. Stabilita formulací (15:85) uložených při 4 °C v temnu. Osa x: stáří formulace (dnů); osa y:

··· · • · • · · · · · · ·· ··· ·· ··· příslušné případy (legendu viz u Obr. 3 výše).

A: DOPE-PEG2000:BrC16-paclitaxel.

B: DOPE-PEG₅ooo:BrC16-paclitaxel.

C: DSPE-PEG2000: BrCl6-paclitaxel.

D: DMPE-PEG₅ooo·’BrCl 6-paclitaxel. Formulace připraveny v: den X-5 (plný trojúhelník; den X (plný kosočtverec); den X+15 (čtvereček); den X+22 (kosočtverec).

E: BrCl6-paclitaxel obsahující následující formulace (15:85): DPPE-PEG2000 (plný kosočtverec); DMPEPEG2000 (čtvereček) ; DSPE-PEG_5OOo (trojúhelníky) ; DPPE-PEG5000 (x)

Obr. 5. Stabilita preparátů po inkubaci v krysí plazmě. Osa x: doba (hodin). Osa y: procento zbylého brómovaného paclitaxelu. Formulace PE-PEG (každá v molárním poměru 15 : 85) : (plný čtvereček) : DSPE-PEG2000; (plný trojúhelník nahoru) : DPPE-PEG2000; (plný trojúhelník doů) : DMPE-PEG2000; (plný kosočtverec) : DOPE-PEG2000; (kosočterec) : DOPE-PEG5000; (čtvereček) : DSPE-PEG_5Ooo; (trojúhelník nahoru) : DPPE-PEG5000; (trojúhleník dolu) : DMPE-PEG5000

Obr. 6. Světelná mikroskopie (mikrosnímky) různých preparátů obsahujících paclitaxel.

A: DSPE-PEG2000: paclitaxel (molární poměr 80:20) B: DSPE-PEG2000: paclitaxel (80:20)

C: DOPE-PEG2000: BrC8-paclitaxel (20:80)

D: DOPE-PEG2000: BrC6-paclitaxel (20:80)

E: DOPE-PEG2000: BrC14-paclitaxel (20:80) ·· · ·

F: DOPE-PEG2000: BrC12-paclitaxel (20:80)

G: DSPE-PEG2000: BrCl6-paclitaxel (10:90)

H: DOPE-PEG2000: BrC16-paclitaxel (20:80)

Obr. 7. Elektronová mikrografie lomu při nízkých teplotách (mikrosnímky A a B) preparátů DOPC: DOPE-PEG2000: BrCl 6paclitaxel (molový poměr 30:50:20)

Obr. 8. Mikrosnímky preparátů DSPE-PEG₂ooo-'C16-vinblastin.

A,B: světelná mikroskopie; C,D:elektronová mikroskopie.

Obr. 9. Kryo-elektronová mikroskopie (mikrosnímky A-D) částic složených z DSPE-PEG2000 a BrC16-paclitaxelu (molový poměr 15:85)

Obr. 10. Účinky částic obsahujících DSPE-PEG2000: BrC16paclitaxel oproti preparátu „Taxol^R„ na nádorech Ovcar3 vyvolaných u myší SCID.

Léčba: Podávání léku intraperitoneální, ve 20, 2, 24, a 28 dnech po inokulaci (očkování), při čemž je: Kontrola (x); Taxol^R, 12,5 mg paclitaxelu/kg (plný čtvereček); Taxol^R, 25mg paclitaxelu/kg (čtvereček); BrC16-paclitaxel, 12,5 mg/kg (plný trojúhelník); 25 mgBrC16-paclitaxelu/kg (trojúhelník); BrC16-paclitaxel, 50 mg/kg (kosočtverec); BrC16-paclitaxel, 100 mg/kg (plný kosočtverec). Osa x: počet dnů po naočkování; osa y: procento přeživších.

Obr. 11. Účinek částic obsahujících DSPE-PEG2000:BrCl6paclitexel (15:85) na A549-ne-malou buňku lidského karcinomu plic v plicních nádorech vyvolaných u myší

SCID

Léčba: podávání léku intravenózní 1,3,5,7 a 9 dnů po naočkování, při čemž je: kontrola (plný čtvereček); BrCl6-paclitaxel, 12,5 mg/kg (plný trojúhelník); 25 mg BrC16-paclitaxelu/kg (trojúhelník); BrC16-paclitaxel, mg/kg (kosočtverec); BrC16-paclitaxel, 100 mg/kg (plný kosočtverec). Osa x: počet dnů po očkování; osa y: objem nádoru (mm³) .

Obr. 12. Účinky DSPE-PEG2ooo:BrC16-paclitexelu (15:85) oproti preparátu Taxol^R na L 1210 (Murine Leukemias) vyvolaných u myší CDF1.

Léčba: podávání ústní, stav po 1 - 5 dnech, při čemž je_ kontrola (hvězdička); Taxol^R, 12,5 mg/kg (plný čtvereček); Taxol^R, 25 mg/kg (čtvereček); 12,5 mg BrCl6paclitaxelu/kg (plný trojúhelník nahoru); BrC16paclítaxel, 50 mg/kg (o); BrC16-paclitaxel, 100 mg/kg (plný kosočtverec). Osa x: počet dnů po očkování (buňky L 1210); osa y: procento přeživších.

Obr. 13. Světelná mikrografie (mikroskopické snímky) částic obsahujících BrC16-paclitaxel/Cremophor^REL.

Obr. 14. Světelná mikrografie - mikroskopické snímky s použitím Nomarski-ho optiky - částic obsahujících Hamycin (A)1 cm = 27pm; (Β) 1 cm = 13,6pm.

Obr. 15. Snímky částic obsahujících Hamycin s použitím mikroskopie s fázovým kontrastem.

··· ··· ··. ·· ··· ·· ··· · «««

Podrobný popis vynálezu

Následují akronyma a zkratky používané v celém textu přihlášky vynálezu, jakož i příslušná slova, věty nebo vzorce.

Br: brom; BrC6: -C (0) CHBr (CH₂) ₃CH₃; BrC8 :

- C (0) CHBr (CH₂) 5 CH₃; BrC12: -C (0) CHBr (CH₂) ₉ CH_3; BrC14 C (0) CHBr (CH₂) 11 CH₃; BrC16: C (0) CHBr (CH₂) i₃CH₃; HTD: derivát hydrofobního taxanu (jako je paclitaxel); BrC16HTD: paclítaxel připojený kovalentně k přímému nasyceném acylovému řetězci, brómovanému na uhlíku alfa; DOPC: dioleyl-fosfatidylcholin; DMPE: dimyristoylfosfatidylethanolamin; DOPE: dioleyl-fosfatidylethanolamin;

DPPE: dipalmitoyl-fosfatidylethanolamin; DSPE: distearoylfosfatidylethanolamin; PEG: polyethylenglykol; PEG₂ooo: PEG s molekulovou hmotností kolem 2000; PEG5000: PEG s molekulovou hmotností kolem 5000. Dále koncentrace sloučenin v částicích podle tohoto vynálezu jsou uváděny v poměrech molových procent každé komponenty v částici obsahující paclitaxel kovalentně připojený k acylovému řetězci dlouhému 16 uhlíků a brómovanému na uhlíku alfa, a distearoyl-fosfatidyl-ethanolamin-polyethylenglykol o molekulové hmotnosti 2000, a to v poměrech 85 molových procent paclitaxel/acylového řetězce ku 15 molovým procentům DSPE-PEG_2OOo) ·

Tento vynález poskytuje částici složenou ze slabě hydrofilního jádra obklopeného konjugátem, který má biokompatibilní hydrofobní zónu a biokompatibilní hydrofilní zónu. Sloučeniny hydrofobního jádra podle tohoto vynálezu jsou slabě hydrofilní, a po vložení do vodného prostředí se samy sdružují (asociují). Sloučeniny hydrofobního jádra mohou pocházet z přírodního výskytu, nebo to jsou syntetické hydrofobní sloučeniny. Mimo to hydrofobními sloučeninami jádra mohou být hydrofobní nebo slabě lipofilni deriváty jakékoliv sloučeniny. Tak např. hydrofilní sloučenina může být spřažena („derivatizována) s hydrofobní zónou a vytvořit tak sloučeninu, která je slabě hydrofilní. V jednom provedení hydrofobní sloučenina může sestávat z hydrofilní sloučeniny arabinosyl-cytosinu (Ara C), spřaženého s hydrofobní zónou, a vytvořit tak sloučeninu jádra, která je hydrofobní. Sloučeniny našeho zájmu jsou obsaženy v jádrech částic ve význačně vyšších hladinách, než podobné sloučeniny v částicích nosičů, které byly dosud dostupné. Takové sloučeniny jádra obsahují (míněno jako příklad a bez omezení tímto příkladem) taxany jako např. paclitaxel, alkaloidy vinca jako např. vinblastin; bryostatiny; cyklické polypeptidy jako jsou např. cefalosporiny; jiné hydrofobní polypeptidy, steroídní sloučeniny jako např. prednison a kortison; rifamyciny jako je např. rifabutin a rifamid; mitomyciny; bleomyciny; benzonaftopyranony; bisinterkalatační antibiotika jako je např. chinomycin; nukleosidová antibiotika jako je např. ara-a; pyrol[1,4]benzodiazepiny jako např. anthramycin a distamycín; makrolidy jako je např. maytansin a hamycin; bisindol-alkaloidy jako je např. vinblastin a navelbin; kamptotheciny a jejich analoga; etoposidy a teniposidy; interkalátory DNA jako např. amsakrin; antiestrogeny jako jsou např. tamoxifeny; bis(benzimidazol)y jako je např. preparát Hoechst 33258; a hydrofobní peptidy, zejména hydrofobní peptidy s připojenými acylovými řetězci (např.

♦ · · · · · · · ·* ··· ·· ··· ·· · peptidové surfaktanty).

Tyto sloučeniny mají biokompatibilní hydrofobní zónu kterou lze bezpečně podávat živočichům v terapeutických dávkách; tato zóna zvyšuje dostatečně hydrofobicitu sloučeniny a umožňuje akumulaci vysokých dávek (t.j. asi 20 mol % nebo více) v částici. Tato zóna se buď vyskytuje ve sloučenině přírodního původu, jako jsou např. bryostatiny, nebo se k ní synteticky připojí (konjugací), jako je to u taxanů (např. u paclitaxelu). Je výhodné, aby sloučenina jádra měla konjugovanou biokompatibilní hydrofobní zónu, při čemž „konjugovaná znamená kovalentní připojení zóny k reaktivní skupině na sloučenině, a to syntetickými chemickými reakcemi.

Je výhodné, aby sloučeninou jádra byl taxan, jako je paclitaxel, taxoter, cefalomannin, 19-hydroxybaccatin III, baccatin III, 10-deacetylcefalomanin, 10deacetyltaxol(7aOH), epi-10-deacetyltaxol(7βΟΗ), 7-epi-10deacetylcefalomanin (7βΟΗ) a 10-deacetylbaccatin III.

Nejvýhodnější sloučenininou jádra je paclitaxel.

Připojení biokompatibilní hydrofobní zóny k těmto sloučeninám se provede známými prostředky pro spojování reaktivních skupin, jako jsou acylové řetězce, hydrofobní peptidy a silikonové polymery, s jinými sloučeninami. Tak na příklad je-li hydrofobní zónou acylový řetězec, pak výhodným připojením je vytvoření vazby mezi karboxylovou skupinou acylového řetězce a hydroxylovou skupinou sloučeniny, jako je např. paclitaxel, kamptothecin nebo vinblastin.

Taxany jako např. paclitaxel mají hydroxylová skupiny (skupiny OH v poloze 2'a 7), k nimž je možno připojit hydrofobní zóny. Jelikož relativní pořadí reaktivity těchto ··*· * · · ♦ * · · ·· »·· *· «· · skupin (od reaktivnější k méně reaktivní) bývá obvykle 2'>7, je možno acylový řetězec připojit k taxanům v poloze 2', a to s použitím stechiometrického množství reaktivní formy řetězce (např. chloridové formy). Alternativně je možno acylové řetězce připojit k oběma skupinám OH (2'i 7), a potom selektivně odstranit acylový řetězec z polohy 2', takže k taxanu zůstane připojen pouze acylový řetězec v poloze 7. Selektivní odstranění acylového řetězce z polohy 2'se provede s použitím stechiometrického množství mírné báze, jako je např. bikarbonát sodný. Mimo to skupinu 7 OH je možno modifikovat nejprve „chráněním skupiny 2'HO skupinami jako trifenylmethyl, methoxytrifenylmethyl, trifluoracetyl a TrOC (trichlormethoxy-chloroformát) s použitím pochodů, které jsou zručným odborníkům běžně známé. Chráněný taxan potom reaguje s aktivní formou acylového řetězce (jako jsou anhydridy nebo chloridy) v bezvodém organickém rozpouštědle s bázemi, jako je DMAP a pyridin; chránící skupina se potom odstraní z polohy 2 dobře známými a snadno proveditelnými prostředky. Tyto reakce se běžně provádějí za přítomnosti báze jako je pyridin, dimethlaminopyridin („DMAP), triethylamin nebo jiná báze, a to v běžných polárních aprotických organických rozpouštědlech, jako je methylenchlorid, formamid, chloroform, THF (tetrahydrofuran), dimethylformamid a dimethylsulfoxid („DMSO).

Hydrofobními zónami vhodnými pro připojení k takovým sloučeninám jsou (míněno jako příklad a bez omezení tímto příkladem) acylové řetězce, hydrofobní peptidy, silikonové řetězce a jiné hydrofobní polymery. Je výhodné, aby hydrofobní zónou byl acylový řetězec větvený nebo přímý, • · · · · ·· ··· ·· · nasycený nebo nenasycený, a brómovaný na uhlíku alfa nebo nebromovaný. Výhodnější je, je-li hydrofobní zónou konjugovaný acylový řetězec o vzorci I

C (0) CHX¹ (CH2) m (CH=CH) n2 (CH2) n3 (CH=CH) n4 (CH²) n5 (CH=CH) _n6 (CH₂) _n7 (CH=CH)_n8(CH₂)_n9CH₃ (I) kde nl se rovná nule nebo celému číslu od 1 do 21; n3 se rovná nule nebo celému číslu od 1 do 18; n5 se rovná nule nebo celému číslu od 1 do 15; n7 se rovná nule nebo celému číslu od 1 do 12; n9 se rovná nule nebo celému číslu od 1 do

9; a každé sudé n (n2, n4, n6, a n8) se nezávisle na sobě rovná nule nebo jedné. Součet nl + 2n2 + n3 + 2n4 + n5 + 2n6 + n7 + 2n8 + n9 je celé číslo od 3 do 21. Nejvýhodnější je acylový řetězec přímý, nasycený a délky 12, 14 nebo 16 atomů uhlíku, t.j. je-li

C (0) CHX¹ (CH) 9CH3, -C (0) CHX¹ (CH) _UCH₃, nebo -C (0) CHX¹ (CH) 13CH3X¹ V těchto acylových řetězcích je buď vodík H, nebo výhodněji „hydrolýzu podporující skupina (HPG), t.j. atom nebo skupina atomů podporující hydrolýzu in vivo svého příslušného řetězce ze sloučeniny, k níž byl řetězec připojen. Skupiny HPG jsou vzhledem k vodíku elektronegativní, což znamená, že k sobě přitahují elektrony více, než by je přitahoval atom vodíku, který by zaujímal stejnou polohu v téže molekule. V důsledku toho náhrada HPG za atom vodíku na uhlíku alfa acylového řetězce vede k přerozdělení elektronové hustoty řetězce, což vede k indukčnímu efektu v řetězci. Mimo to substituce skupin HPG obsahujících aromatickou složku za vodíky z uhlíku alfa acylového řetězce způsobují rezonanční efekty z redistribuce elektronové hustoty. Tato HPG-navozená indukce a rezonanční efekty stabilizují příslušnou zásaditou formu (část) kyseliny, ne však kyselou formu. Tudíž kyselina je silnější kyselinou, než by byla v případě, že na místě v acylovém řetězci zaujímaném HPG by byl vodík. Acylové řetězce modifikované skupinami HPG mají tudíž obecně nižší pK_a než příslušné nativní formy, t.j. formy, v nichž v poloze alfa je skupina CH₂ místo substituující skupiny HPG. Acylové řetězce substituované skupinami HPG jsou tudíž mnohem snadněji hydrolyzovatelné in vivo z mateřských sloučenin, než je tomu u nativních (původních) řetězců.

Hydrolýzu podporující skupina X¹ je jakýkoliv atom nebo skupina atomů, která (1) má elektronegativitu větší než vodík, a (2) může být připojena v poloze alfa k acylovému řetězci. Takovými skupinami jsou (míněno jako příklad bez omezení dalším výčtům) : F, Cl, Br, I, NH⁺3, -OC6H4X² nebo C(O)X², kde X² je např. F, C. , Br, I, NH⁺3, N0₂ nebo CN. Výhodné X¹ je D, Co, Br nebo I, nejvýhodněji Br. Acylové řetězce nej výhodnější pro připojení ke sloučeninám podle vynálezu tudíž jsou: -C (O) CHBr (CH₂) ₉CH₃, - C (0) CHBr (CH₂) _nCH₃, nebo - C (0) CHBr (CH₂) ₁₃CH₃ .

Acylové řetězce se substitucí HPG jsou dostupné komerčně, nebo mohou být připraveny některým ze způsobů, používaných v oboru pro substituování acylových řetězců v poloze alfa.

Konjugát kolem jádra se skládá z chemicky vázaných hydrofilních a hydrofobních zón. Konjugátem může být přírodní nebo syntetický lipid s hydrofilní a hydrofobní zónou. Alternativně konjugátem může být syntetická sloučenina, která má hydrofilní zónu vázanou chemicky hydrofobní zóně. Vhodnými hydrofilními zónami konjugátu jsou ty, které l)jsou biokompatibilní, t.j. mohou být podávány zvířatům bez neúnosných vedlejších účinků; 2) jsou celkově ···· · ·· · ·· ··· · · · · · · · • · · · · β · • · · · · · · · · • · · · · · β · • · · ·· * · · · · ·· · více hydrofilní než hydrofobní, a 3) jsou schopny připojení k hydrofobní zóně. Jsou to (míněno jako příklady bez omezení dalším výčtům): celulóza, polyethylenglykoly, polyaminokyseliny jako např. polyglycin; polysacharidy; póly(ethylenoxidy); póly(akrylové kyseliny); póly(akrylamidy); póly(vinylpyrolidony); a póly(methakryláty). Má-li být hydrofilní zónou hydrofilní polymer, pak je to výhodně polyethylenglykol („PEG) nebo polyoxethylen, výhodněji PEG nebo polyoxyethylen s molekulovou hmotností 50 až 5000, a nejvýhodněji je to PEG s molekulovou hmotností 2000 („PEG2000)· Hydrofilní zónou může být také polární koncová skupina amfipatického (obojetného) lipidu. Tyto koncové skupiny mohou nést náboj, a to pozitivní nebo negativní; náboj může být buďto přirozeného výskytu na koncové skupině, nebo může být přidán vázáním nabité molekuly s reaktivní skupinou na koncové skupině. Mezi nabité lipidy patří např. (a bez omezení příkladem) fosfatidylseriny, fosfatidylglyceroly, fosfatidické kyseliny a fosfatidylethanolaminy, k nimž byly připojeny organické díkarboxylové kyseliny, jako je např. kyselina glutarová, oxalová a jantarová.

Vhodnými hydrofobními zónami konjugátu jsou ty, které 1) jsou biokompatibilní, 2) mají skupinu schopnou vazby k hydrofilní zóně, 3) celkově jsou více hydrofobní než hydrofilní. Takovými zónami jsou (bez omezení těmito příklady) : oblasti acylových řetězců u amfipatických lipidů, různé hydrofobní polymery, jako jsou silikonové polymery nebo hydrofobní peptidy.

Koncové skupiny amfipatických lipidů jsou hydrofilní, tudíž lipidy samotné jsou hydrofobně-hydrofilní konjugáty.

• · ·

Tyto lipidové konjugáty obvykle nesou pozitivní nebo negativní náboj na koncové skupině, a patří k nim fosfatidylseriny (PS), fosfatidylglyceroly (PG) a fosfatidické kyseliny (PA). Alternativně koncové skupiny mají reaktivní (pod)skupiny, k nimž se vážou další hydrofilní zóny. Z těchto lipidů výhodné jsou fosfatidyletanolaminy (PE) jako je dipalmitoylfosfatidyletanolamin („DPPE), palmitoyloleoylfosfatidyletanolamin („POPE), distearoylfosfatidyletamolamin („DSPE); nejvýhodnějším fosfatidyletanolaminem je DSPE.

Mezi konjugáty s obsahem amfipatických lipidů tudíž patří konjugáty PE a PEG; z těchto jsou výhodné konjugáty DSPE a PEG o molekulové hmotnosti 50 až 5000, a nej výhodně j ší jsou DSPE-PEG₂ooo · Konjugáty obsahující amfipatické lipidy rovněž zahrnují lipidy s různým nábojem, jako jsou fosfatidyletanolamin-dikarboxylové kyseliny DOPEGA a POPE-Ga („GA = kyselina glutarová).

Biokompatibilními hydrofilně-hydrofobními konjugáty jsou také hydrofilně-hydrofobní kopolymery, jako jsou kopolymery o vzorci HO (CH₂CH₂O) _a (CH (CH₃) CH₂O) _b (CH₂CH₂O) _CH. Výhodnější z těchto kopolymerů polyoxyetylenu a polyoxypropylenu mají a a b nezávisle na sobě rovné celému číslu od 10 do 100, a c je rovno nule nebo celému číslu od 1 do 100. Nejvýhodnější a a c je rovno (každé) 75, a b je rovno 30.

Sloučeniny jádra obsahujícího hydrofobní zónu tvoří 20 mol % až 99 mol % částice, a může to být jakékoliv množství nejméně od 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80,

85, 90 nebo 95 mol % do 99 mol %. Konjugáty hydrofobní zóny17 hydrofílní zóny tvoří 1 mol % až 80 mol % částice, a mohou být v jakémkoliv množství mezi tím, jako např. od 80 mol % do 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5 nebo 1 mol %. Nej výhodněji sloučeniny jádra tvoří 88 až 99 mol % částice, zatímco konjugáty tvoří 1 až 20 mol % částice.

V částicích podle vynálezu se sloučeniny jádra vzhledem k hydrofobním zónám akumulují do vysokých koncentrací, a to ve sdružení (v asociaci) s okolním konjugátem. Tato vysoká akumulace nevyžaduje přítomnost (a dochází k ní v nepřítomnosti) dalších komponent, jako je voda nebo olej, v jádře. Jádra částic podle tohoto vynálezu jsou tudíž v podstatě bez vody a přidaného oleje. Kdyby nebylo hydrofobní zóny, sloučeniny by se nemohly akumulovat v nosičích, např. v liposomech nebo emulzích, bez použití oleje nebo vody, nebo by se sloučeniny akumulovaly v množstvích menších, než jaká se vyskytují v jádrech částic podle tohoto vynálezu.

Částice podle tohoto vynálezu nejsou tudíž ani liposomy, které by měly určitý objem vody zachycený ve dvojvrstvě lipidu, ani emulze, které by měly uspořádání olej-ve-vodě nebo voda-v-oleji, t.j. jako globule (kapičky) jedné kapaliny ve druhé. Částice podle tohoto vynálezu jsou podstatně odlišné od uvedených struktur, při čemž tyto rozdíly může běžně zkušený odborník snadno demonstrovat známými metodami. Těmito metodami jsou: určení koncentrace sloučeniny jádra v částici nosiče např. sedimentační studií,popsanou v Příkladu 3 níže; prokázání přítomnosti nebo absence vody nebo přidaného oleje v částici např. NMR spektroskopií, stanovení procenta zadržení rozpustných značkovacích látek v částici, měření rozdělení tritiové vody, určení rozdělení objemu stanovením externě přidaného solutu (rozpouštěné látky), měření turbidity (zakalení) založené na bobtnání liposomů v hypo-osmotickém prostředí, a prokázání přítomnosti neb absence lipidové dvojvrstvy zkoumáním lomu při zmražení a kryo-elektronovou mikroskopií, jakož i NMR-spektroskopické zkoumání uspořádání molekuly lipidu.

Částice podle vynálezu mají přibližně kulový tvar a průměry (nebo velikost) nejméně 15 nm a výhodně nejvíce 10 000 nm, ačkoliv se zamýšlí používat (vyjma intravenózně) i větších částic. Velikost částic tedy může mít hodnotu mezi těmito údaji, avšak nejvýhodnější velikost je 15 až 200 nm. Velikost částic je ovlivňována četnými faktory, které lze stanovit v mezích běžné odbornosti, včetně relativních podílů derivátu a konjugátu v částici, které lze stanovit podle následujících rovnic:

(1) Počet (#) molů slabě hydrofilní sloučeniny/částici (X) = [hustota x (4/3π)(D/2 - t)³]/mol. hmotnost slabě hydrofilní sloučeniny;

(2) Počet (#) molů konjugátu/částici (Y) = (Kd²) (a) x 6, 0225 x 10²³ a (3) mol % slabě hydrofilní sloučeniny = [X/X+Y)] . 100, kde „d je průměr částice, „t je tloušťka vrstvy konjugátu, „a je povrchová plocha na molekulu komponenty konjugátu, při čemž „hustota je dána v g/cm³. Velikost částic lze měřit různými metodami známými běžným odborníkům (včetně metod popsaných v Příkladu 5 níže).

Částice dle tohoto vynálezu se běžně připraví • · · · • · · · · · « • · · · * ·· · · · · « vstřikováním ethanolu nebo reverzním odpařováním (REV).

Mohou se také připravit metodou dialýzy. Stručně řečeno: při postupu vstřikování ethanolu (viz níže uvedený Příklad 1) se vhodné množství částicových komponent rozpustí v příslušném množství vhodného rozpouštědla organického, jako např. ethanolu. Výsledný ethanolový roztok(y) se potom pomalu vstřikuje do příslušného množství vhodného vodného rozpouštědla (např. pufr HEPES/NaCl pH 7,5), a vytvoří se částice v pufru (ústojném roztoku), a částice se potom shromáždí následným odstřeďováním. Při postupu reverzního odpařování (viz Příklad 1 níže) se vhodná množství komponent částic smísí, a potom se rozpustí v příslušném množství kombinace vodného pufru a mísitelného organického rozpouštědla; potom následuje odstranění organického rozpouštědla ve vakuu nebo proudem inertního plynu.

Částice podle tohoto vynálezu je možno kombinovat s farmaceuticky přijatelnými nosiči, a mohou se tudíž vyskytovat také ve formě farmaceutických kompozic, které obsahují částice a nosiče. „Farmaceuticky přijatelné nosiče jsou média obecně přijatelná pro použití ve spojení s podáváním terapeutických nebo diagnostických látek savcům. Tato média se formulují podle četných faktorů, které se určují v mezích běžné odbornosti, zejména co se týče (bez omezení následujícím výčtem) zvláštnosti podávané látky (činidla), jakož i její koncentrace, stability a zamýšlené biologické účinnosti, nemoci, poruchy nebo stavu léčených nebo diagnostikovaných touto kompozicí, a také co se týče subjektu, jeho věku, pohlaví a všeobecného stavu, a způsobu podávání kompozice, jako např. nosem, orálně, oftalmicky, místně, transdermálně, vaginálně, rektálně, intrathekálně,

• * · ·· ·· ··· · · podkožně, intramamálně, intraperitoneálně, intravenózně, intratumorálně, intrakavitárně nebo íntramuskulárně. Farmaceuticky přijatelné nosiče mohou obsahovat i další ingredience, jako např. látky podporující stabilitu obsažené aktivní ingredience jimiž mohou být konzervační činidla nebo antioxidanty.

Farmaceutické kompozice mohou být podávány živočichům, např. savcům a lidem, kterýmkoliv standardním a obecně používaným způsobem a prostředkem. Způsob podávání, např. orální, nitrožilní, intraarteriální (nitrotepenní), podkožní, intramuskulární i intraperitoneální podávání, se zvolí podle četných faktorů na základě běžné odbornosti a v mezích obsahu tohoto vynálezu. Těmito faktory jsou (bez omezení tímto výčtem): věk, tělesná hmotnost a zdravotní stav léčeného subjektu, zamýšlená biologická účinnost léku, zvláštnosti léčené nemoci, použitý nosič a dávka podávaného terapeutického prostředku. V současné době přednostním způsobem podávání farmaceutických kompozic podle vynálezu je orální a intravenózní podávání. Podle vynálezu je rovněž výhodné intraperitoneální podávání farmaceutických kompozic obsahujících pevné, polopevné a fluidní částice.

Farmaceutické kompozice obsahující částice podle vynálezu jsou určeny pro orální podávání v pevné formě, např. ve formě tablet a tobolek (kapslí), nebo ve fluidní formě, např. ve formě sirupů a suspenzí. Tablety obsahující částice jsou běžného typu, např. kulaté, oválné či podélné, povlečené nebo nepovlečené, lišící se velikostí a hmotností, které jsou běžně používané ve farmaceutickém oboru, a které vedle částic podle vynálezu mohou obsahovat nej různější ingredience všeobecně v oboru používané. Tobolky (kapsle) ···· • · ♦ · · · · • · · · · • · · · · · · ·· ··· ·· ··· · · jsou formou podávání pevného léku, a částice jsou v nich uzavřeny v želatinovém plášti; tobolky lze připravit pro nejrůznšjší dávkování (obsah) částic. Vynález předpokládá použití tvrdých i měkkých tobolek. Formulování částic do těchto tablet, tobolek nebo jiných forem pevných preparátů je v možnostech běžně zkušeného praktického odborníka ve farmacii.

Intravenózními (nitrožilními) kapalinami formulovanými ve farmaceutických kompozicích s částicemi podle vynálezu jsou sterilní vodné roztoky chemikálií, např. cukrů, aminokyselin a elektrolytů, které lze snadno zavést do těla savců, kde se absorbují; tyto kapaliny vedle funkce nosičů pro podávání aktivních ingrediencí jsou také běžně používány pro doplňování živinami a elektrolytem. Běžně používané nitrožilní kapaliny, vhodné pro formulace s obsahem částic podle vynálezu, obsahují fyziologický solný roztok a 5% (hmotnostně) roztok dextrózy ve vodě.

Dále předmětem vynálezu jsou metody podávání sloučenin živočichům, a tyto metody spočívají v podávání farmaceutických kompozic obsahujících částice podle vynálezu. Tyto metody jsou vysoce účinné, t.j. dodávají sloučeniny ve. vysokých poměrech sloučeniny k jiným komponentám částic, a indukují nízkou toxicitu. Těchto metod lze použít zejména k dodávání terapeuticky účinných množství sloučenin živočichům k léčení nemocí, poruch nebo chorobných stavů léčitelných těmito sloučeninami, při čemž toto léčení je bez vedlejších účinků. Z tohoto hlediska „terapeuticky účinné množství sloučeniny je takové množství sloučeniny, které účinně zlepší, potlačí nebo předejde nemoc, poruchu nebo chorobný stav, a běžně toto množství činí nejméně 0,01 • · * ·

mg sloučeniny na kg tělesné hmotnosti živočicha, kterému je sloučenina podána. Výhodnější terapeuticky účinné množství sloučeniny je v rozmezí od 0,01 mg sloučeniny na kg do 1000 mg/kg. Stavy léčitelné kompozicemi podle tohoto vynálezu jsou např. (bez omezení předmětu vynálezu těmito příklady): různé rakoviny, např. rakovina mozku, rakovina prsu, rakovina vaječníku, karcinomy plic, leukémie, lymfomy, melanomy, karcinomy a sarkomy, parazitické nemoci, různé zánětlivé a autoimunitní stavy, jako např. arthritis a juvenilní diabetes, a různé mikrobiální infekce. Termín „mikrobiální infekce je míněn jako zahrnující patologické stavy způsobené viry, bakteriemi, rickettsiemi, houbami, priony apod. Mimo to kompozic podle vynálezu je možno použít také k podávání neterapeutických preparátů živočichům, např. diagnostických činidel a živin.

K lepšímu porozumění vynálezu poslouží následující Příklady. Nicméně běžně zkušení odborníci snadno zjistí, že tyto příklady jsou pouze ilustrativním znázorněním vynálezu, který je definován v nárocích, uvedených po těchto příkladech.

Příklady

Příklad 1 Příprava částic

Příprava BrC16-paclitaxel/DSPE-PEG2ooo vstřikováním do ethanolu

Pro přípravu metodou vstřikování do ethanolu se odvážilo 20 mg BrCl6-paclítaxelu a 8,3 mg DSPE-PEGžoooř smísilo a potom solubilizovalo vstřikováním do 0,1 ml ···· ·· · ·· * ♦ · · · * · · · · · · • · · · · ·· ··· 00 ethanolu. Výsledné ethanolové roztoky byly potom pomalu přidávány do skleněné fiolky (lékovky) obsahující 2 ml 10 mM

HEPES, 150 mM NaCl-pufru při pH 7,5 (ústojný roztok HEPES), aby se vytvořila suspenze částic v pufru.

Příprava BrC16-paclitaxel/DSPE-PEG₂ooo postupem odpařování reverzní fáze

Pro přípravu postupem odpařování reverzní fáze bylo smíseno 20 mg BrC16-paclitaxelu a 118 mg DSPE-PEG2000 , a potom rozpuštěno v 6 ml ethanolu a 2 ml pufru HEPES, načež byl ethanol odstraněn rotačním odpařováním, aby se vytvořily částice.

Příprava hamycinu DSPE-PEG2000 postupem reverzního odpařování (REV)

Pro přípravu modifikovaným postupem REV bylo spolu rozpuštěno 20 mg makrolidového antibiotika Hamycin a 80 mg DSPE-PEG2000 ve 40 ml chloroformu a methanolu (objemově 1:1). Potom bylo ke směsi přidáno 10 ml fyziologického roztoku soli (cca 0,9 %) a suspenze byla krátce (asi 10 sec) vystavena působení ultrazvuku v lázňovém sonikátoru při teplotě místnosti, aby vznikla poměrně homogenní disperze. Rozpouštědla byla potom odstraněna rotační odparkou při 45 °C. Zbývající solný roztok obsahoval preparát s.částicemi Hamycin/DSPE-PEG2ooo v hmotnostním poměru 20:80.

Příprava částic Hamycin/DSPE-PEG₂ooo postupem s dialýzou

Částice hamycinu je možno připravit rovněž metodou s dialýzou. Bylo spolu rozpuštěno 80 mg hamycinu a 20 mg

DSPE-PEG₂ooo ve 4 ml DMSO. 1 ml tohoto roztoku obsahujícího hamycin a lipid bylo odkapáno do 9 ml fyziologického roztoku soli (asi 0,9 %) za vířivého míchání při teplotě místnosti.

ml roztoku soli a DMSO, obsahujícího hamycin a lipid, bylo vloženo do dialyzátoru „Slide-A-Lyzer (frakce o molekulové hmotnosti lOk) a dialyzováno do 2 litrů solného roztoku přes noc pří teplotě místnosti. Analýza částic prokázala, že obsahují hamycin a DSPE-PEG₂ooo v poměru 80:20. Ke konci dialyzační doby byl odstraněn v podstatě veškerý DMSO. Analýza částic prokázala, že obsahovaly hamycin a DSPEPEG_2Ooo v poměru 80:20.

Příklad 2 Odstřeďování „sacharózového gradientu

Dvěstěmikrolitrové vzorky obsahující 6.9 mg kombinace PEG-ylovaného lipidu a hydrofobního derivátu drogy (např. DOPC, DOPE-PEG₂ooo a BrC16-paclitaxelu v molárním poměru 30:50:20), připravené postupem reverzního odpařování (popsaným v Příkladu 1 výše), byly vloženy do horní části „gradientu (nádobky s gradovanou koncentrací sacharózy) o objemu 12 ml a obsahujícího 0 % až 50 % sacharózy. Tento „gradient byl generován s použitím přístroje „Biocomp Gradient Master Model 106 (firmy Biocomp Instruments, lne., (provozní parametry: doba: 2 min, úhel: 81,5°, rychlost:

19)). Gradienty byly odstřeďovány při 208.000 g (zrychlení) přes noc na Beckmanově ultracentrifuze L5-50, a frakcionovány po 1 ml shora.

Koncentrace fosfolipidů v různých frakcích byly určovány modifikovanou verzí postupu podle Chena aj. (jehož obsah zde odkazově uvádíme). Koncentrace sloučenin byly ···· · ·· · ·· ··· · ··· · · • · * · · « · · ···· ···» • · · * · · · « ·· ··· ·· ··· ·« stanoveny rozpuštěním vzorku v ethanolu, odečtením absorbance na UV snímacím spektrofotometru „UV2101PC (Shimadzu Scientific Instruments, lne.), a potom porovnáním absorbancí se standardy. Výsledky jsou uvedeny na obrázcích 1A a 1B, a byly potvrzeny světelnou mikroskopií (popsanou v Příkladu 6 níže) gradovaných frakcí. Mikroskopicky viditelné částice byly přítomny ve frakcích vyšší hustoty (# 12). Molový poměr BrC16/paclitaxelu k fosfolipidu ve fosfolipidu ve frakci 12 činil 94:6.

Příklad 3 Sedimentační studie

Vzorky po 1 ml (lOmg/ml BrC16-paclitaxelu) částic připravených postupem vstřikování ethanolu (popsaným v Příkladu 1 výše) byly odstředbvány při 30.000 g po dobu 30 minut na Beckmanově ultracentrifuze L5-60; po odstranění supernatantu byly pelety znova suspendovány ve vodě na přibližně stejný objem jako ve vzorcích. Koncentrace fosfátů v různých frakcích byly stanovovány modifikovanou verzí postupu dle Chena aj.; koncentrace sloučenin byly stanovovány rozpuštěním vzorku v ethanolu, odečtením absorbance na UV snímacím spektrofotometru UV2101PC (firmy Shimadzu Scientific Instruments,lne.), a potom porovnáním absorbancí se standardy. Výsledky těchto experimentů jsou uvedeny v tabulce 1. Běžný molový poměr BrC16-paclitaxelu v peletě činil 98 molových procent.

Tabulka 1

Sedimentační studie ···· φφ • φ

Vzorek	Typ frakce*	Konc. BrC16- paclitaxelu (mg/ml)	Koncentrace fosfátu (mM)	Mol % BrC16- paclitaxelu
DOPE-PEG2ooo	1	1,86	0,36	81,35
DOPE- PEG2000	2	10,39	1,33	86,95
DOPE- PEG2000	3	7,67	0,19	97,22
DSPE-PEG2OOo	1	1,25	0,35	75,13
DSPE-PEG2ooO	1	10,93	1,29	87,90
DSPE-PEG2ooo	3	8,74	0,18	97,65
DPPE-PEG2000	1	1,20	0, 33	75,40
DPPE-PEG2ooo	2	10,77	1,26	88,00
DPPE-PEG2000	3	9, 62	0, 20	97,65
DMPE-PEG2OOo	1	0,99	0,23	78,34
DMPE-PEG2OOo	2	10,43	1,13	88,78
DMPE-PEG2Ooo	3	9,82	0,20	97,72
DOPE-PEG5000	1	2,33	0,34	85, 39
DOPE-PEG5000	2	10,15	1,04	89,27
DOPE—PEG5000	3	4,15	0,07	98,14
DSPE-PEG5000	1	2,17	0,35	84,26
DSPE-PEG5000	2	10,13	1,10	88,77
DSPE-PEG5000	3	4,53	0,08	98,00
DPPE-PEG5000	1	2,40	0,36	85,15
DPPE-PEG5000	2	10,21	1,11	88,77
DPPE-PEG5000	3	3,83	0, 07	98,04
DMPE-PEG5000	1	1,88	0,32	83, 26
DMPE-PEG5000	2	9,97	1,09	88,68
DMPE-PEG5000	3	4,65	0,08	98,13

• · · · */ 1 = supernatant; 2 = celek; 3 - peleta Příklad 4 Měření turbidity

Mají-li liposomy absorbovaný vodný roztok, smrští se nebo nabobtnají, vložíme-li je do prostředí s odlišným osmotickým tlakem, než jaký má tento roztok. Tyto změny velikosti liposomů v odezvě na rozdílnosti v osmotickém tlaku vedou ke změně turbidity (zakalenosti) suspenze liposomů. Částice, které nemají zachycený podstatnější objem vody, jako jsou např. částice podle tohoto vynálezu, ty nejsou ovlivňovány rozdílnostmi osmotického tlaku, a jejich suspenze nevykazují znatelnější změny turbidity.

Na základě toho, měření turbidity suspenzí částic v prostředích o různém osmotické tlaku mohou ukázat, zda je v částici zachycen určitý objem vody. Proto 0,1 ml vzorku částic obsahujících 3,45 mg DOPC: DOPE-PEG₂ooc>: BrC16paclitaxelu a připravených metodou vstřikování ethanolu (popsanou v Příkladu 1 výše) bylo zředěno do 3 ml každého z následujících roztoků (konečná koncentrace paclitaxelu:0,66 mg/ml): H₂O 75, 150 a 300 mM NaCl. Potom byly vzorky monitorovány (λ = 800nm) v čase na turbiditu s použitím UV snímacího spektrofotometru UV-2101PC (Shimadzu Scientific Instruments, lne.). Výsledky jsou uvedeny v obr.

2. Nebyly zaznamenány žádné změny absorbance, což naznačovalo, že tyto částice na rozdíl od liposomů nejsou osmoticky aktivní.

Příklad 5 Analýza velkosti částic

Postupem vstřikování ethanolu (popsaným v Příkladu 1 • 99

9 9 9 ·

9 9

9 • 9 • 9 9 ·· 999

9 • 9

9 ·

9

9 výše) byly připraveny částice obsahující DSPE-PEG2000 a BrC16-paclitaxel (molární poměr 15:85); vzorky částic (cca 1 až 3 mikrolitrů) byly podrobeny měření velikostí na přístroji „Submicron Particle Sizer (model 370) firmy NICOMP Particle Sizing Systems, lne.; v celém průběhu byl použit režim „pevná částice („solid particle). Střední průměry částic (nm) v suspenzích částic různého složení, měřené podle počtu, intenzity a objemu, jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2

Analýza velikosti částic na přístroji Nicomp (v nm)

Lipid	Částice zprůměrovaná podle
počtu	intenzity	objemu
DOPE-PEG2000	20-119	96-208	44-181
DSPE-PEG2000	32-81	94-197	57-147
DPPE-PEG2000	43-93	104-172	69-138
DMPE-PEG2000	54	111	80
DOPE-PEG5000	34	68	48
DSPE-PEG5000	35	69	49
DPPE-PEGsooo	34	73	50
DMPE-PEG5000	15-36	85-137	31-56

Příklad 6 Uskladnění

Částice, připravené postupem vstřikování ethanolu • 444 • 4 • ·· *44

4 4 4 4 4 4 • 444 4 444 4 •44 4 4 4 4 4

444 44 444 44 4 (uvedeným v Příkladu 1 výše) tak, aby v molárním poměru 85:15 obsahovaly BrC16-paclitaxel a buď DOPE-PEG2000 t nebo DPPE-PEG₂oooz DMPE-PEG2000 z DOPE-PEG5000, DSPE-PEG5000 z DPPEPEG5000 nebo DMPE-PEG5000 byly suspendovány v pufru HEPES a uskladněny nezředěné. Postupem REV (popsaným v Příkladu 1 výše) byl připraven vzorek BrC16-paclitaxelu a DSPE-PEG2000 v molárním poměru 20:80. Tyto vzorky byly uskladněny při teplotě místnosti nebo při 4 °C, a potom byly pozorovány světelným mikroskopem („Olympus BH-2, Firmy New York/New Jersey Scíentific). Pozorované vzorky byly hodnoceny subjektivně na přítomnost částic a na krystalizací hydrofobní sloučeniny; výsledky jsou uvedeny na obrázcích 3 a 4 .

Částice suspendované v pufru HEPES byly také přidány k čerstvé plazmě krysího samce (druh Fisher, kmen: 1344, věk: cca 60 dnů, hmotnost 175 - 200 gramů, z příbuzenské plemenitby, finální koncentrace derivatizované sloučeniny:

0,2 mh/ml): vzorky plazmy byly ponechány k inkubaci při 37 °C po dobu 0, 2, 6, 24 nebo 72 hodin. Ihned po inkubaci byly vzorky zmraženy kapalným dusíkem a uskladněny při -70 °C, potom byly ponechány k tání při teplotě místnosti, a byly přidány ke stejnému objemu acetonitrilu obsahujícího 0,04 mg/ml (konečný stav) C12-paclitaxelu jako vnitřního standardu. Směsi byly odstřeďovány při 1000 ot/min po dobu 10 minut s použitím odstředivky „Eppendorf 5402, a nakonec byly stanoveny koncentrace BrC16-paclítaxelu kapalinovou chromatografií HPLC. Výsledky jsou uvedeny v obr. 5.

Vzorky částic BrC16-paclitaxel/DSPE~PEG₂ooo (88:15) byly také podrobeny analýze velikosti částic (postupem uvedeným v Příkladu 5 výše), a to po delší době uskladnění při 4 °C;

výsledky jsou uvedeny v tabulce 3. Každý vzorek byl připraven zvlášť. Výsledky se týkají stanovení počáteční velikosti a stanovení velikosti po určitém období uskladnění. Výsledky jasně dokazuji, že velikost částic byla stejná i po prodloužené době uskladnění při 4 °C.

Tabulka 3

Analýza velikosti částic na přístroji Nicomp (v nm)

	Analýza velikosti částic na přístroji Nicomp (v nm)
Počet dnů	Velikost částic	(počáteční/konečná)
uskladnění	zprůměrovaná podle
	počtu	intenzity	objemu
21	56/59	140/142	94/98
31	53/61	143/145	94/101
59	48/60	135/135	86/95
100	48/52	138/139	87/91
114	46/45	144/150	89/90
141	43/35	116/117	73/67

Příklad 7 Světelná mikroskopie

DSPE-PEG2000 a paclitaxel byly kombinovány postupem reverzního odpařování (v molárním poměru 80:20), popsaným v Příkladu 1 výše, avšak paclitaxel nebyl připojen (vázán) k hydrofobní zóně. Mikrosnímky („Olympus BH-2, .New York/New Jersey Scientific) těchto částic byly pořízeny ve zvětšení ·· · · · ·· «· · · · ·

200 x (viz obr. 6, u obr. 6A a 6B konečné zvětšení bylo 277x). Bylo pozorováno, že převládající strukturou byly krystaly.

Ethanolovým injekčním postupem (popsaným v Příkladu 1 výše) byly připraveny částice DOPE-PEG2000: : Br-paclitaxel (80:21), v nichž acylový řetězec kovalentně připojený k paclitaxelu měl různou délku; v obrázcích 6C až 6H jsou mikrosnímky těchto částic (550x)

Vinblastin byl kovalentně připojen k acylovému řetězci na dvacáté poloze hydroxylové skupiny, a to modifikovanou metodou, kterou uvádí USP 5 580 899 a USP 5 703 117 (které zde uvádíme jako odkaz). Ve stručnosti: vinblastin /25 mg), rozpuštěný v CH₂C1₂ a pyridinu (5:1) byl zahříván s refluxem (deflegmátorem) při 41 °C po celou noc, a to při přebytku palmitoylchloridu (60 μΐ) a v přítomnosti 4 mg DMAP. Tenkovrstvá chromatografie (TLC) v CHCl3:MeOH (95:5) ukázala, že reagoval takřka veškerý (>95 %) výchozí materiál a poskytl C16-produkt. Rozpouštědla byla odpařena pod sníženým tlakem a produkt byl přečištěn preparativní tenkovrstvou chromatografií (TLC) s použitím CHCl₃:MeOH (95:5). A nakonec byl produkt lyofilizován z cyklohexanu a poskytl 15 mg (54 %) pevného bílého prášku, který byl identifikován podle ^XH a ¹³C nukleární magnetickou rezonancí (NMR).

Postupem REV (popsaným v Příkladu 1 výše) byly připraveny částice DSPE-PEG20001 C16-vinblastinu (v molárním poměru 40:60) s použitím 18 mg DSPE-PEG₂₀oo a 11 mg C16vinblastinu. Tyto částice byly suspendovány v 1,1 ml pufru HEPES. V obrázcích 8A a 8B jsou mikrosnímky (277x) výsledných částic.

·· · ·

USP 5 • · · · · • · · ® · · • · · · · · ♦ * ··· ·· ··<

Modifikovanou metodou popsanou v USP 5 580 899 a 703 117 (které zde uvádíme jako odkaz na pramen) byl k acylovému řetězci na 20. poloze hydroxylové skupiny kovalentně připojen kamptothecin. Stručně popsáno: kamptothecin (20 mg) byl rozpuštěn při teplotě místnosti ve 4 ml bezvodého pyridinu, a potom míchán s 56 mg anhydridu kyseliny palmitové po dobu 48 hodin. Postup reakce ukázala tenkovrstvá chromatografie TLC) v CHCl₃:MeOH (96:4). Za sníženého tlaku byl odpařen pyridin a residuum (zbytek) bylo přečištěno preparativní TLC s použitím CHCl₃:MeOH (96:4). Získalo se 30,1 mg (90 %) produktu ve formě krémově zbarveného prášku, který byl identifikován metodou ^ΧΗ a ¹³C NMR.

Částice DSPE-PEG2000:C16-kamptothecinu (kamptothecin konjugovaný na 20. pozici skupiny OH na 16-uhlíkový nasycený acylový řetězec) v molárním poměru 40:60 byly připraveny postupem REV (popsaným v Příkladu 1 výše) s použitím 50 mg DSPE-PEG2000 a 15 mg C16-kamptothecinu suspendovaného v 1,5 ml pufru HEPES.

Příklad 8 Elektronová mikroskopie lomu při nízké teplotě

Postupem REV (popsaným v Příkladu 1 výše) byly připraveny částice DOPC: DOPE-PEG2000: BrC16-paclitaxelu (v poměru 30:50:20) s použitím 4,7 mg DOPC, 27,4 mg DOPE-PEG2000 a 5,85 mg BrC16-paclitaxelu, suspendované v 1 ml pufru HEPES. Potom byly pořízeny elektronové repliky lomu při zmrazení, zvětšené 91.000x (viz obr. 7A) a 31.000x (viz obr. 7B), a to tak, že 1 až 3 μΐ vzorku bylo vloženo mezi pár Balzerových měděných a dvojitých replik, potom byl vzorek o • · · · • · c · teplotě místnosti zmražen vložením do kapalného propanu. Zmražené vzorky byly podrobeny lomu (při -100°C a tlaku 10’⁶ až 10'⁷ hPa (mbar)) a stíněny (tónovány) platinou (< 45°) a uhlem v Balzerově zařízení BAF400 pro lom při nízké teplotě. Repliky byly ponechány přes noc k čištění 5%-hypochloritem (chlornanem) (komerční bělidlo), promyty destilovanou vodou, uloženy na síťku 300 ok (mesh) a prohlíženy elektronovým mikroskopem „Philips 300 TEM. Snímek ukázal, že částice mají pevný vnitřek bez pozorovatelných lamel.

Postupem REV (popsaným v Příkladu 1 výše) byly připraveny částice DSPE-PEG2000: C16-vinblastinu (molární poměr 40:60) s použitím 18 mg DSPE-PEG2000 a 11 mg C16vinblastinu, které byly suspendovány v 1,1 ml pufru HEPES. Výsledné částice byly upraveny pro elektronovou mikroskopii výše uvedeným postupem. Mikrosnímky (zvětšení 55.000x) jsou uvedeny v obr. 8C a 8D. Snímek z kryo-EM opět ukázal, že tyto částice mají pevné jádro bez vnitřních lamel.

Příklad 9 Elektronová kryo-mikroskopie

Postupem vstřikování ethanolu (popsaným v Příkladu 1 výše) byly připraveny částice s použitím DSPE-PEG2000 a BrC16-paclitaxelu (15:85) tak, aby obsahovaly 10 mg/ml BrC16-paclitaxelu; vzorky (obsahu 1 ml) byly udržovány při teplotě místnosti po dobu, než se připravily mřížky. Nezředěné vzorky se zmrazily postupem, který se skládal z následujících kroků: kapka vzorku se vložila na EM-mřížku, stlačila se na tenký film, a potom se smočená mřížka ponořila do kapalného ethanu. Byly pořízeny fotografické negativy zmražených hydratovaných vzorků zavěšených • « v otvorech krajkovitého (střapatého) uhlíkového suportu, a to při malé dávce elektronů. Čočka byla zaostřena na 1,8 μτη pro 60K, a na 1,5 μιη pro 100K. Výsledky jsou zobrazeny na obr. 9 (zvětšení llO.OOOx u obrázku A a B, a 184.000x u obrázků C a D).

Příklad 10 Měření zaujímaného objemu

Postupem vstřikování ethanolu (popsaným v Příkladu 1 výše) byly připraveny částice tak, aby koncentrace BrC16HTD činila 10 mg/ml a koncentrace DSPE-PEG2000 4 mg/ml. Také suspenze liposomů byly připraveny metodou vstřikování ethanolu s použitím DSPC tak, aby koncentrace lipidu činila 14 mg/ml. Objem zaujímaný těmito částicemi a liposomy (viz tabulka 4 níže) byla měřen metodou Perkinse a j. (viz. Publikaci „Chemistry and Physics of Lipids,,, 64 (19930), str. 197-217 - jejíž obsah zde uvádíme jako pramen) s použitím spinové sondy Tempone, zavedené do preparátů buď v ethanolu (metoda čís. 1), nebo v pufru HEPES (metoda čís.

2. )

Pro koncentrování částic odstřeďováním byly částice ochlazeny na teplotu místnosti a potom nashromážděny odstřeďováním vzorků suspenzí (1,5 ml) při 50.000 g s použitím Beckmanovy ultraodstředivky model L5-50. Pelety byly znova uvedeny do suspenze v 0,4 ml téhož pufru. Vzorky obsahující „Tempone,, byly rozděleny na dva stomikrolitrové podíly; k jednomu alikvotnímu podílu byl přidán pufr HEPES, a ke druhému podílu bylo přidáno 100 mikrolitrů stomilimolového roztoku „rozšiřovacího,, činidla (,,BA„) oxalátu chrómu.

·· ··. *,,· ·,.· .j

ESR (rezonance spinu elektronu; rezonance i = -1 bez rozšiřovacího činidla má vztah k celkovému vodnému objemu podle rovnice

Atot ⁼ t Vout ⁼ Vtot ~ Viipid, (kde V_in - vnitřní objem; V_tot = objem suspenze; a V_lipid = objem hydratovaného lipidu (počítaný ze specifických objemů lipidů a z vnitřní koncentrace lipidu po zředění)). Potom se vypočítal vnitřní objem jako součin 1) signální amplitudy (A_Ba) alikvotního vzorku smíšeného s rozšiřovacím činidlem, a 2) korekčního faktoru pro objem lipidu podle rovnice

Vin — Aba X [ (Vtot ^— Viipid) /Atot] ·

Pro obě měření (A_tot a A_Ba) byly použity vzorky zředěné na stejnou koncentraci. Zaujímaný objem byl vypočítán s použitím vnitřního objemu (V_in v mikrolitrech) a koncentrace lipidu (mikromoly/milimetry).

Tabulka 4

	Liposomy	Částice	Částice (pelety)
	Metoda	Metoda	Metoda	Metoda	Metoda	Metoda
	1	2	1	2	1	2
Relativní signální amplituda (w/BA)	62	51	62	54	63	59
Relativní signální amplituda (w/o BA)	13	12	0	0	0	0
Zaujatý objem (mikrolitry/mikromo 1 lipidu)	2,7	3,0	0	0	0	0

• · ♦ · · ·♦·>

• * * · · · · · · · · · «· 99 9 · · _A

Příklad 11 Studie akutní toxicity

Částice obsahující DSEP-PEG₂ooo/BrC16-paclitaxel, připravené výše popsaným postupem, a „Taxol^R„ (firmy Bristol Myers-Squibb) byly podávány intraperitoneálně (i.p.) nebo intravenózně (i.v.) skupinám 5 až 10 CDFl-myších samic, a to v pěti denních dávkách od 12,5 do 400 mg/kg buď BrC16~ paclitaxelu v částicích nebo v Taxol^R-u (při těchto stejných dávkách v mg/kg byly molární dávky BrC16-paclitaxelu o 27 % nižší než molární dávky paclitaxelu v Taxol^R-u, při čemž molekulová hmotnost BrC16-paclitaxelu je 1169 a molekulová hmotnost paclitaxelu je 853).

Zásobní formulace se zředily fosfátem pufrovaným solným roztokem (PBS) na požadované koncentrace a podávaly se při objemu dávky 25 ml(kg; roztok PBS sloužil jako kontrola.

Myši byly kontrolovány denně a určovala se doba přežití každého člena každé skupiny. V tabulce 5 a 6 jsou uvedeny výsledky akutní toxicity po intraperitoneálním (i.p.) a intravenózním (i.v.) podávání. Tyto výsledky představují extrapolovaná data z 1 až 4 experimentů pro každou formulaci a pro každou dávku.

Tabulka 5

Akutní toxicita BrCl6-paclitaxelu oproti „Taxolu,, u myší CDF 1 (i.p. x 5)

Denní dávka	Ekvivalent	Počet přeživších myší/celkový
(mg/kg)	paclitaxelu (mg/kg)	počet*

		BrC16-paclitaxel	TaxolR
12,5	—	—	20/20
25	—	—	10/20
3705	—	—	0/10
50	—	—	0/25
100	72	6/6	—
200	144	10/11	-----
300	216	5/6	—
400	288	1/6	—

*/Přežití ve 30 dnech po injekci

Tabulka 6

Akutní toxicita BrC16-Paclitaxelu oproti Taxolu u myší CDF 1 (i.v. x 5)

Denní dávka (mg/kg)	Ekvivalent paclitaxelu (mg/kg)	Počet přeživších m	yší/celkový počet*
		BrC16-paclitaxel	TaxolR
12,5	____	—	15/15
18,75	____	____	5/5
25	____	____	13/15
31,25	____	____	4/5
37,5	____	____	0/7
50	36	5/5	0/8
100	72	4/5	—

·♦ · ·· » · · · · ·» ··· ·· · */ Přežití ve třiceti dnech po injekci

Příklad 12 Protirakovinové terapeutické studie

Šest týdnů starým myším (SCID-CB17) samičkám bylo naočkováno 5xl0⁶ buněk 0vcar3 (karcinom lidského vaječníku) (den 0); potom byl podán (i.p.) BrC16-paclitaxel (12,5,25,50 nebo 100 mg/kg) nebo Taxol^R (12,5 nebo 25 mg/kg) skupině 10 myší, a to ve 20., 22., 24., 26. a 28. den po naočkování tumoru. Zásobní formulace drog byly zředěny roztokem PBS tak, aby se dosáhlo požadované úrovně dávek. Zředěné formulace byly podávány v objemu 25 ml/kg. Roztoku PBS se také použilo ke kontrole. Myši byly kontrolovány denně, a určovala se doba přežití každého kusu každé skupiny.

Výsledky jsou uvedeny v obr. 10.

Příklad 13 Protirakovinové terapeutické studie

Šest týdnů starým myším (CB17,SCID) samičkám bylo podkožně naočkováno 5 x 10⁶ buněk A549 (ne-malé buňky lidského karcinomu plic) (den 0); potom byl podán (i.v.) (skupině 5 myší) BrC16-paclitaxel (12,5, 25, 50 nebo 100 mg/kg, a to v den 1, 3, 5, 7 a 9 po naočkování tumoru.

Zásobní formulace drogy byly zředěny roztokem PBS tak, aby se dosáhlo požadované úrovně dávek; zředěné formulace se podávaly v objemu lOml/kg. Roztoku PBS se také použilo ke kontrole. Objemy tumoru (mm³), počítané jako (šířka/2)² x délka χπ, se měřily dvakrát týdně, počínaje devátým dnem po naočkováni. Myši byly likvidovány, jakmile objem jejich • * tumoru dosáhnul 1500 mm³. Výsledky jsou uvedeny v obr. 11.

Příklad 14 Protirakovinové terapeutické studie

Šest týdnů starým myším samičkám (CB17, SCID) bylo (i.v.) naočkováno 5 x 10⁴ buněk L1210 (myší leukémie) (den 0); potom byl orálně podán (skupině 9-10 myší) BrC16paclitaxel (12,5 25, 50 nebo 100 mg/kg) nebo Taxol^R (12,5 nebo 25 mg/kg), a to v den 1 až 5 po naočkování. Zásobní formulace drogy byly zředěny roztokem PBS tak, aby se dosáhlo požadované úrovně dávek. Myši byly kontrolovány denně a určovala se doba přežití každého člena každé skupiny. Výsledky jsou uvedeny v obr. 12.

Příklad 15

Analýza velikosti částic obsahujících BrC16paclitaxel/pluronik

Postupy popsanými výše byly připraveny částice obsahujcí Brl26-paclitaxel a pluronik F 68 (poloxamer 188,

HO (CH₂CH₂O) 75 (CH (CH₃) CH₂O) 3o (CH₂CH₂O) v molárním poměru 90:10 mol %. Stručně řečeno: 48 mg derivátu paclitaxelu a 40 mg pluroniku se rozpustilo v 0,2 ml ethanolu; 0,1 ml alikvotního podílu výsledného roztoku se potom pomalu přidávalo do zkušební lékovky (trubičky) obsahující 2 ml fosfátem pufrovaného solného roztoku (PBS:10 mM fosfátu/150 mM soli, pH 7). Výsledné dvoumililitrové suspenze se potom skombinovaly do jediné suspenze o objemu 4 ml.

Suspenze se přelila přes pětimikronový filtr a výsledný filtrát se podrobil analýze velikosti částic, a to s použitím analyzátoru submikronových částic „Nicomp Model 370„. Výsledky (nm, ± směrodatná odchylka) Gaussiánské analýzy byly následující: 44±17 (vážený průměr počtu), 70 ±27 (vážený průměr objemu) a 105 ± 40 (vážený průměr intenzity). Tím se potvrdilo, že s použitím pluroniku jako konjugátu je možno vytvořit stabilní částice.

Příklad 16

Analýza velikosti částic obsahujících BrCl6paclitaxel/„Cremophor^R EL„

Postupy popsanými v Příkladu 1 výše byly připraveny částice obsahující BrC16-paclitaxel a „Cremophor^REL„ (glycerol-polyethylen-ricinoleát). Stručně řečeno: 48 mg derivátu paclitaxelu se rozpustilo spolu se 44 mg glycerolpolyethylen-ricinoleátu v 0,2 ml ethanolu, 0,1 ml alikvotního podílu výsledného roztoku se potom pomalu přidávalo do zkušebních lékovek obsahujících po 2 ml fosfátem pufrovaného solného roztoku (PBS: 10 mM fosfátu/150 mM soli, pH 7). Výsledné dvoumililitrové suspenze byly potom kombinovány do jediné suspenze o objemu 4 ml.

Tato suspenze byla potom zkoumána Nomarski-ho (světelným) mikroskopem. Výsledky jsou znázorněny v obr. 13. Tím se potvrdilo, že s použitím glycerol-polyethylen-oleátu jako konjugátu je možno vytvořit stabilní částice.

Příklad 17

Analýza velikosti částic obsahujících BrCl6-paclitaxel/DOPE GA

DOPE-GA, známý také jako B-glutaryl-PE, 18:1, je fosfolipid složený z 1,2-dioleyl-sn-glycero-3fosfoethanolamin konjugovaný ke kyselině glutarové amidovou vazbou. Částice obsahující BrC16-paclitaxel a DOPE-GA v molárním poměru 50:50 mol % byly připraveny postupem popsaným v Příkladu 1 výše. Stručně řečeno: 48 mg BrC16HTD 33 mg DOPE-GA se rozpustilo v 0,26 ml ethanolu, a 0,13 ml alikvotního podílu tohoto ethanolického roztoku se potom pomalu přidávalo do zkušební lékovky obsahující 2 ml HBS (30mM HEPES, 0 Mm SOLI, Ph 7,5). Výsledné dvoumililitrové suspenze byly potom kombinovány do jediné suspenze obsahu 4 ml.

Tyto suspenze měly modrobílou barvu a byly průsvitné. ml této suspenze snadno prošlo syringovým filtrem (v injekční stříkačce) o nominální velikosti pórů 5 mikronů. Filtrát byl podroben analýze velikosti částic, a to s použitím analyzátoru submikronových částic „Nicomp Model 370„. Výsledky (nm, ± směrodatná odchylka) Gaussiánské analýzy byly následující: 40 ±16 (vážený průměr počtu), 67 ±27 nm (vážený průměr objemu) a 106 ±43 nm (vážený průměr intenzity).

Příklad 18 Částice obsahující Hamycin/DSPE-PEG₂ooo

Částice Hamycin/DSPE-PEG₂ooo (v hmotnostním poměru (20:80), připravené modifikovaným postupem REV z Příkladu 1, byly zkoumány mikroskopicky s použitím Nomarski-ho optiky. Suspenze obsahovaly heterogenně rozdělené částice o průměru pod 6 pm. Suspenze měla žlutou barvu a byla slabě opákní (neprůhledná). Obrázek 14 je mikroskopickým snímkem částic Hamycinu/DSPE-PEG₂ooo· Jeden centimetr na snímku představuje 27pm na obr. 14A a 13,6pm na obr. 14B.

Částice Hamycinu (DSPE-PEG2000 (v hmotnostním poměru 80:20), připravené metodou dialýzy podle Příkladu 1, byly zkoumány fázově kontrastní (světelnou) mikroskopií. Obr. 15 je mlkrosnímek částic Hamycin/DSPE-PEG₂ooo (80:20). Jeden centimetr na snímku představuje 27 pm. Suspenze měla žlutou barvu a byla průsvitná.

Částice byly připraveny metodou dialýzy popsané v Příkladu 1. Suspenze (4 ml) prošla snadno injekčním filtrem o nominální velikosti pórů 5pm. Filtrát byl podroben analýze velikosti částic s použitím analyzátoru submikronovch částic „Nicomp Model 370„. Částice co do velikosti byly poměrně heterogenní. Výsledky analýzy přístrojem Nicomp ukázaly, že je mnoho velikostních tříd. Velikosti byly stanoveny buď Gaussiánskou analýzou, nebo distribuční analýzou. Výsledky (v nanometrech ± směrodatná odchylka) Gaussiánské analýzy byly: 382 ± 196 (vážený průměr počtu), 205 ±105 nm (vážený průměr objemu) a 495 ±253 (vážený průměr intenzity). Distribuční analýza ukázala, že 66 % částic mělo 105 nm a 34 % částic mělo 398 nm (vážený průměr počtu); 7 % částic mělo 111 nm a 93 % částic mělo 412 nm (vážený průměr intenzity), a 3 % částic mělo 111 nm a 97 % částic mělo 419 nm (vážený průměr objemu). Bimodální rozdělení zjištěné distribuční analýzou ukázalo, že jsou obsaženy i větší částice (nad 300

ΦΦΦΦ φ ΦΦ · ·· ♦ ΦΦ > φ ΦΦ φ φ • φ φφφ φ φ • φφφφ φφφφ φφφ φφφ ΦΦ • · φφφ ΦΦ φφφ ΦΦ φ nm). V každém případě velikostní studie ukázala, že částice tvoří Hamycin/DSPE-PEGžooo·

Samozřejmě se rozumí, že výše uvedený popis vynálezu je pouze ilustrativní, a není omezující (restriktivní).

Zkušeným odborníkům budou po přečtení popisu tohoto vynálezu zřejmá mnohá další provedení. Předmět tohoto vynálezu není tudíž omezen pouze výše uvedeným popisem vynálezu, nýbrž je určován také přiloženými patentovými nároky a celým výčtem obsahových ekvivalentů, na něž se tyto nároky vztahují. Závěry všech článků a referencí, včetně patentových přihlášek a publikací, jsou do textu vynálezu vtěleny jako odkaz na prameny, a to pro všechny účely a použití.

Claims (39)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Částice vyznačující se tím, že sestává:

   a) z jádra obsahujícího slabě hydrofilní sloučeninu;

   b) z konjugátu biokompatibilní hydrofilní zóny a biokompatibilní hydrofobní zóny, a tento konjugát obklopuje jádro, při čemž slabě hydrofilní sloučenina tvoří 20 mol % až 99 mol % částice, konjugát tvoří 1 mol % až 80 mol % částice, a částice má průměr nejméně 15 nm.
2. 2. Částice podle nároku 1, vyznačující se tím, že sloučenina se zvolí ze skupiny látek, kterou tvoří taxany, alkaloidy vinca, bryostatiny, cefalosporiny, steroidální sloučeniny, rifamyciny, mitomyciny, bleomyciny, benzonaftopyranon, bis-interkalační antibiotika, nukleosidová antibiotika, pyrol[l,4] benzodiazepiny, makrolidy, bis-indolalkaloidy, kamptotheciny, etoposidy, teniposidy, interkalátory DNA, antiestrogeny, bis(benzimidazol)y a adenin-arabinosidy.
3. 3. Částice podle nároku 2, vyznačující se tím, že sloučeninou je taxan.
4. 4. Částice podle nároku 3, vyznačující se tím, že taxanem je paclitaxel.
5. 5. Částice podle nároku 1, vyznačující se tím, že slabě hydrofilní sloučeninou je sloučenina kovalentně vázaná k hydrofobní zóně tvořené látkou zvolenou ze skupiny sestávající z acylových řetězců, hydrofobních peptidů a hydrofobních polymerních řetězců.
6. 6. Částice podle nároku 5 vyznačující se tím, že hydrofobní zónu tvoří acylový řetězec.

   ··« · ·· · ·· • ·· · · ·· ··· • · ♦ · · · · • · · · · · * · · ··· · · · · · ·· ··· ·· ··· ·· ·
7. 7. Částice podle nároku 6, vyznačující se tím, že acylový řetězec má vzorec I

   C (0) CHX¹ (CH₂) m (CH=CH) _n2 (CH₂) _n3 (CH=CH) _n4 (CH₂) „5 (CH=CH) _n6 (CH₂) (CH=CH)_ng (CH₂)_n9CH₃ (I)

   němž: nl se rovná nule nebo celému číslu od 1 do 21; n3 se rovná nule nebo celému číslu od 1 do 18; n5 se rovná nule nebo celému číslu od 1 do 15; n7 se rovná nule nebo celému číslu od 1 do 12; n9 se rovná nule nebo celému číslu od 1 do 9; n2, n4, n6 a n8 - každé z nich se nezávisle na

   sobě rovná 0 nebo 1;

   součet nl + 2n2 + n3 + 2n4 + n5 + 2n6 + n7 + 2n8
8. 8.
9. 9.

   + n9 se rovná celému číslu od 3 do 21; a X¹ je vodík nebo skupina podporující hydrolýzu.

   Částice podle nároku 7, vyznačující se tím, že acylový řetězec má vzorec C ( (O) CHX¹ (CH2) nlCH3 Částice podle nároku 8, vyznačující se tím, že acylový řetězec je -C (O) CHX¹ (CH2) ₉CH₃, -C (O) CHX¹ (CH2) uCH3, nebo -C (O) CHX¹ (CH2) i₃CH₃-.

   Částice podle nároku 9, vyznačující se tím, že X¹ je skupina podporující hydrolýzu.

   Částice podle nároku 10, vyznačující se tím, že hydrolýzu podporující skupina se vybere ze skupiny látek tvořené fluorem F, Cl, Br, I, -OC6H4X² a -C(O)X² kde X² je F, Cl, Br, I, CN, NO2 nebo NH⁺3.

   Částice podle nároku 11, vyznačující se tím, že skupinou podporující hydrolýzu je brom Br.

   Částice podle nároku 1, vyznačující se tím, že slabě hydrofilní sloučenina obsahuje acylový řetězec zvolený z následujících skupin připojených • 9 9 9 · *« · ·*

   999 ···· ··· • · 9 9 9 9 9

   9 9 · 9 9 9 9 9 9

   9 9 9 9 9 9 9 9 ·· 9 99 99 99 9 9 9 9 k paclitaxelu: -C (O) CHBr (CH₂) ₉CH₃, -C (O) CHBr (CH₂) _UCH₃, nebo -C (O) CHBr (CH₂) 13CH3.
10. 14. Částice podle nároku 1, vyznačující se tím, že konjugát hydrofobní zóny obsahuje amfipatický lipid v oblasti acylového řetězce.
11. 15. Částice podle nároku 14, vyznačující se tím, že amfipatickým lipidem je fosfatidyl-ethanolamin.
12. 16. Částice podle nároku 15, vyznačující se tím, že fosfatidyl-ethanolaminem je distearoyl-fosfatidylethanolamin (DSPE).
13. 17. Částice podle nároku 1, vyznačující se tím, že konjugátem hydrofobní zóny je hydrofobní polymer.
14. 18. Částice podle nároku 17, vyznačující se tím, že hydrofobním polymerem je silikonový polymer nebo póly(oxypropylen).
15. 19. Částice podle nároku 1 vyznačující se tím, že konjugátem hydrofilní zóny je hydrofilní polymer.
16. 20. Částice podle nároku 19, vyznačující se tím, že hydrofilní polymer se zvolí ze skupiny látek, kterou tvoří polyethylenglykoly, celulózy, hydrofilní peptidy, polysacharidy, polyethylenoxidy, polyakrylové kyseliny, polyakrylamidy, polyvinyl-pyrolidony a polymetakryláty.
17. 21. Částice podle nároku 20, vyznačující se tím, že hydrofilní zónou je polyethylenglykol (PEG) nebo polyethylenoxid o molekulové hmotnosti od 50 do 5000.
18. 22. Částice podle nároku 1, vyznačující se tím, že konjugátem je DSPE-PEG_2Ooo ·
19. 23. Částice podle nároku 1, vyznačující se tím, že konjugát obsahuje nejméně jeden lipid s nábojem.
20. 24. Částice podle nároku 23, vyznačující se tím, že nabitý lipid má výsledný záporný náboj.
21. 25. Částice podle nároku 24, vyznačující se tím, že záporně nabitým lipidem je DOPE-GA.
22. 26. Částice podle nároku 23, vyznačující se tím, že nabitý lipid má výsledný kladný náboj.
23. 27. Částice podle nároku 1, vyznačující se tím, že konjugátem je kopolymer o vzorci

    HO (CH₂CH₂O) _a (CH (CH₃) CH₂O)_b (CH₂CH₂O) _CH kde a a b jsou nezávisle na sobě celá čísla od 10 do 100.
24. 28. Částice podle nároku 27, vyznačující se tím, že že a a c se (každé) rovná celému číslu 75, a b znamená celé číslo 30.
25. 29. Částice podle nároku 1, vyznačující se tím, že konjugátem je glycerol(polyethylenglykol)ricinoleát.
26. 30. Částice podle nároku 1, vyznačující se tím, že má průměr do 10 000 nm.
27. 31. Částice podle nároku 30, vyznačující se tím, že má průměr v rozmezí 15 nm až 200 nm.
28. 32. Částice podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsah hydrofobní sloučeniny činí více než 50 mol % částice a obsah konjugátu méně než 50 mol % částice.
29. 33. Částice podle nároku 32, vyznačující se tím, že obsah hydrofobní sloučeniny tvoří 80 mol % až 99 mol % částice, a obsah konjugátu činí 1 mol % až 20 mol % částice.
30. 34. Částice podle nároku 1, vyznačující se tím, že sestává ze

    a) 80 mol % až 90 mol % paclitaxelu kovalentně připojeného k -C (O) CHBr (CH₂) ₉CH₃, -C (O) CHBr (CH₂) hCH₃ nebo -C (O) CHBr (CH₂) i₃CH₃, nebo

    ΦΦΦ Φ φφ φ φφ · > φ« φ * φφ ΦΦΦ· • » · φ < φ « φ • φ · φ φ φ φ φ φ φ • ΦΦ φφφ φ φ · ♦· Φ«Φ Φ· ΦΦΦ ΦΦ ·9

    b) z 1 mol % až 20 mol % konjugátu zvoleného ze skupiny látek, kterou tvoří DSPE-PEG₂ooo, DOPE-GA,

    HO (CH2CH2O) 75 (CH (CH₃) CH₂O) 30 (CH2CH2O) 75H a glycerol(polyethylenglykol)ricinoleát, při čemž částice má průměr od 15nm do 200 nm.
31. 35. Částice podle nároku 34, vyznačující se tím, že obsahuje DSPE-PEG2000 a paclitaxel konjugoavný k

    C (O) CHBr (CH2) 13CH3.
32. 36. Kompozice vyznačující se tím, že obsahuje částici podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.
33. 37. Způsob podávání sloučeniny živočichům vyznačující se tím, že se živočichům podává kompozice podle nároku

    36.
34. 38. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že živočichem je člověk.
35. 39. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že podávání léku je orální, intravenózní nebo intraperitoneální.
36. 40. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že při postižení savců nemocí ze skupiny rakovin, zánětlivých poruch a mikrobiálních infekcí se aplikuje sloučenina terapeuticky účinná proti těmto nemocím, a že se aplikuje terapeuticky účinné množství této sloučeniny.
37. 41. Způsob podle nároku 40, vyznačující se tím, že postižením je rakovina, slabě hydrofilní sloučeninou je BrC16-paclitaxel a konjugátem je DSPE-PEG2000·
38. 42. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, že velikost částice je v rozmezí 15 nm až 200 nm, a že částice obsahuje 80 mol % až 99 mol % BrC16-paclitaxelu a 1 mol % až 20 mol % konjugátu DSPE-PEG2000· ·*« · ·♦ * 99

    9 99 9 · ·« t>

    • 9 9 9 9 9 9 • · « · · > « 9 9

    9 9 9 9 9 9 9 9 e· »<4 ·« ··· ·« *
39. 43. Částice podle nároku 1, vyznačující se tím, že hydrofobní sloučenina jádra je derivátem nehydrofobní sloučeniny, a že tento derivát tvoří sloučeninu vázanou k biokompatibilní hydrofobní zóně.

    1/25 celkového obsahu 2Br-C16-HTD