CN1310612A - 新型颗粒制剂 - Google Patents

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CN1310612A CN99808935A CN99808935A CN1310612A CN 1310612 A CN1310612 A CN 1310612A CN 99808935 A CN99808935 A CN 99808935A CN 99808935 A CN99808935 A CN 99808935A CN 1310612 A CN1310612 A CN 1310612A
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X·李
D·希尔施
E·梅休
I·阿马德
S·阿利
A·雅诺夫
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Abstract

本发明提供了可以对动物传递高浓度低亲水性/低亲脂性化合物的载体,其包括以带有生物相容性疏水结构域的化合物与同时具有疏水性和亲水性区域的共轭物混合。所述制剂适于动物的多种应用,特别是可对其施用高浓度的治疗用化合物而没有过多的副作用。

Description

新型颗粒制剂
                        发明领域
本发明提供可用于治疗、诊断或其它用途含有高浓度化合物的颗粒。
                        发明背景
有潜在效果的化合物的有效使用，需要能够传递含有有效量化合物的组合物，而不产生过多的副作用。有多种可溶解有效量的亲水性和亲脂性化合物，然后有效地进行给药的载体。但是，目前还没有可有效用于低亲水性/低亲脂性化合物，如各种紫杉类化合物、长春花属生物碱类、头孢菌素类和甾族化合物的传递载体。
所述其中的一种化合物是紫杉醇(paclitaxel)，该化合物是一种低亲水性/低亲脂性的分子，其在大部分常用的药物载体中不能充分地溶解而制得治疗用的组合物。目前，紫杉醇(Taxol)在cremophor/乙醇载体CremophorEL中使用。但是，该组合物在能够提供治疗有效量紫杉醇的给药浓度下会产生某些不利的副作用，例如，使一些以该组合物给药的患者出现急性毒性(例如参见Straubinger等人的美国专利5,415,869)。
例如，Straubinger等人(参见美国专利5,415,869)以紫杉醇对脂质体脂类有限的比例在脂质体中配制紫杉醇。此外，Straubinger的最大紫杉醇浓度(参见摘要)明显低于本发明颗粒中所聚集的药物水平。此外，Desai等人(美国专利5,439,686),Wheeler(美国专利5,478,860)和Alkan-Onyuksel等人(《药物研究》(PharmaceuticalRes.)(1994),206～212页)分别在其载体中以化合物：载体成分低比例掺入化合物，其浓度也低于本发明所提供的载体中可以聚集的化合物浓度。
本发明提供了用于溶解低亲水性/低亲脂性化合物，例如紫杉醇的载体，从而使形成的组合物可安全地以高剂量化合物给药而不产生过多的副作用。以高比例的化合物：其它载体成分掺入化合物的本发明颗粒，既不是脂质体，也不是乳液颗粒，以前从未有过记载。
                       发明概述
本发明提供一种由用亲水性/疏水性共轭物包裹的核所组成的颗粒。该核含有低亲水性/低亲脂性化合物，例如紫杉类(taxanes)、长春花属生物碱类、薯司他丁、环状多肽类，例如头孢菌素类、甾族化合物、利福霉素类、丝裂霉素类、博莱霉素类、苯并萘并吡喃酮、双嵌入抗生素、核苷抗生素、吡咯并[1,4]苯并二氮杂单类、大环内酯类，包括大环内酯的抗生素，如哈霉素、双吲哚类生物碱、喜树碱类、依托泊苷类、替尼泊苷类、DNA嵌入剂、抗雌激素类、双(苯并咪唑)类和核苷类，如阿糖腺苷。所述化合物带有生物相容性疏水结构域，例如酰基链、疏水性肽或疏水性聚合物链，它们可以是天然存在于其中的，也可以是通过合成方法连接的。或者，该核可以含有与疏水性结构域共轭后的亲水性化合物，从而使核的组成总体来说是低亲水性的。
包裹核心的共轭物含有与生物相容性亲水结构域连接的生物相容性疏水性结构域。共轭物可以是具有疏水性和亲水性结构域的天然或合成的分子，或者可以是疏水性和亲水性结构域的共轭物。适宜的共轭物疏水性结构域包括，例如两亲脂类的酰基链区域，以及疏水性聚合物，例如硅聚合物和疏水性肽。适宜的亲水性结构域包括，例如聚乙二醇、纤维素、亲水性肽、多糖、聚氧化乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮和聚甲基丙烯酸酯。适宜的亲水性结构域还包括两亲脂类的极性端基；它们通常是带正电荷或带负电荷的，包括磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油和磷脂酸，以及其它脂类，例如磷脂酰乙醇胺，其上连接有有机二元羧酸，例如戊二酸。
优选的核化合物是其上连接了10-24个碳的直链饱和酰基链的紫杉类化合物，共轭物疏水性结构域是磷脂酰乙醇胺，共轭物亲水性结构域是亲水性聚合物，如分子量为50～5000的聚乙二醇。首选的核化合物是与12、14或16个碳的直链饱和α碳溴化酰基链连接的紫杉醇，共轭物亲水性结构域是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(“DSPE”)，而共轭物亲水性结构域为分子量2000的聚乙二醇(“PEG2000”)。
本发明还提供含有悬浮在可药用载体中的所述颗粒的组合物。这些组合物可用于高效率地向动物传递化合物，即以高比例化合物：颗粒中其它成分的方式传递化合物。所述传递法的毒性也低于目前可以获得的同种化合物的制剂。所述高效/低毒的制剂可用于向动物，例如人给药，用于治疗、诊断或其它目的，例如，用于治疗各种癌症。
从如下的详细描述可以清楚地看出本发明的其它特点、目的和优点及其优选的实施方案。
                          附图简述
图1．含有DOPC、DOPE-PEG2000和BrC16-紫杉醇(摩尔比30∶50∶20)的制剂的蔗糖-梯度馏份。X-轴：馏份号；Y-轴：其中A为样品中存在的总紫杉醇％；B为磷脂浓度(mM)。
图2．在不同等渗溶液中稀释的含有DOPC∶DOPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇(10∶10∶80)制剂的浊度。X-轴：时间(秒)；Y轴：吸收值(800纳米)。空心三角形：H2O；细线：75mM NaCl；实心方框：150mM NaCl；粗线：300mM NaCl。
图3．制剂在室温下存放的稳定性。X-轴：时间(天)；Y-轴：评分标准：0为+++结晶；1为++结晶；2为+结晶；3为无结晶，但规则形状的颗粒；4为无结晶。A为DOPC∶DOPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇(10∶10∶80)；B为DSPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇，20∶80(实心菱形)或10∶90(方框)；C为DOPC-PEG2000-BrC16-紫杉醇，20∶80(实心菱形)，15∶85(方框)或10∶90(星形)；D:PE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇和PE-PEG5000∶BrC16-紫杉醇均为15∶85:DPPE-PEG2000-实心菱形；DOPE-PEG5000-方框；DPPE-PEG5000-x；DMPE-PEG5000-三角形
图4．制剂(15∶85)在4℃下于黑暗中存放的稳定性。X-轴：制剂陈化时间(天)；Y-轴：主观评分(参见上图3中的图标)。A为DOPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇；B为DOPE-PEG5000∶BrC16-紫杉醇；C为DSPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇；D为DMPE-PEG5000∶BrC16紫杉醇；制剂的制备时间：X-5天(▲)；X天(◆)；X+15天(□)；X+22天(◇)；E为含BrC16-紫杉醇的制剂(15∶85):DPPE-PEG2000(◆)；DMPE-PEG2000(□)；DSPE-PEG5000(△)；DPPE-PEG5000(x)。
图5．制剂在大鼠血浆中保温的稳定性。X-轴：时间(小时)。Y轴：保留的溴化紫杉醇的百分比。PE-PEG制剂(摩尔比均为15∶85)-■:DSPE-PEG2000；▲:DPPE-PEG2000；:DMPE-PEG2000；◆:DOPEPEG2000；◇:DOPE-PEG5000；□:DSPE-PEG5000；△:DPPE-PEG5000；:DMPE-PEG5000。
图6．各种含紫杉醇制剂的光学显微照片，A为DSPE-PEG2000∶紫杉醇(摩尔比80∶20)；B为DSPE-PEG2000∶紫杉醇(80∶20)；C为DOPE-PEG2000∶BrC8-紫杉醇(20∶80)；D为DOPE-PEG2000∶BrC6-紫杉醇(20∶80)；E为DOPE-PEG2000∶BrC14-紫杉醇(20∶80)；F为DOPE-PEG2000∶BrC12-紫杉醇(20∶80)；G为DSPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇(10∶90)；H为DOPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇(20∶80)。
图7．DOPC∶DOPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇(摩尔比30∶50∶20)制剂的冷冻破碎电子显微照片(A和B)。
图8．DSPE-PEG2000∶C16-长春碱(摩尔比40∶60)制剂的显微照片。A,B为光学显微镜；C,D为电子显微镜。
图9．由DSPE-PEG2000和BrC16-紫杉醇(摩尔比15∶85)组成的颗粒的低温电子显微照片(A-D)。
图10．含有DSPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇(15∶85)的颗粒与Taxol(紫杉酚)相比对SCID小鼠产生的Ovcar3肿瘤的影响。治疗：在接种后的第20、22、24、26和28天腹膜内给药，其中：对照(*)；Taxol,12.5mg紫杉醇/kg(■)；Taxol,25mg紫杉醇/kg(□)；BrC16-紫杉醇，12.5mg/kg(▲)；25mg BrC16-紫杉醇/kg(ω)；BrC16-紫杉醇，50mg/kg(◇)；BrC16-紫杉醇，100mg/kg(◆)。X-轴：接种后的天数；Y-轴：存活百分比。
图11．含DSPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇(15∶85)的颗粒对SCID小鼠中产生的A549人非小细胞肺癌肺肿瘤的影响。治疗：在接种后的第1、3、5、7和9天静脉内给药，其中对照(■)；BrC16-紫杉醇，12.5mg/kg(▲)；25mg BrC16-紫杉醇/kg(△)；BrC16-紫杉醇，50mg/kg(◇)；BrC16-紫杉醇，100mg/kg(◆)。X-轴：接种后的天数；Y-轴：肿瘤体积(mm3)。
图12．DSPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇(15∶85)与Taxol相比对CDF1小鼠中的L1210鼠白血病的影响。治疗：在接种L1210细胞后的第1-5天口服给药，其中对照(*)；Taxol,12.5mg/kg(■)；Taxol,25mg/kg(□)；12.5mg BrC16-紫杉醇/kg(▲)；BrC16-紫杉醇，25mg/kg(△)；BrC16-紫杉醇，50mg/kg(○)；BrC16-紫杉醇，100mg/kg(◆)。X-轴：接种后(L1210细胞)的天数；Y-轴：存活百分比。
图13．含BrC16-紫杉醇/CremophorEL的颗粒的光学显微照片。
图14．使用Nomarski光学的含哈霉素的颗粒的光学显微照片，(A)1cm=27μm；(B)1cm=13.6μm。
图15．使用相衬显微镜的含哈霉素的颗粒的光学显微照片。1cm=27μm。
发明详述
在整个申请中使用如下首字母组合词和缩写以及相应的词、短语或分子式：Br：溴；BrC6:-C(O)CHBr(CH2)3CH3；BrC8:-C(O)CHBr(CH2)5CH3；BrC12:-C(O)CHBr(CH2)9CH3；BrC14:-C(O)CHBr(CH2)11CH3；BrC16:-C(O)CHBr(CH2)13CH3；HTD：疏水性紫杉(例如紫杉醇)衍生物；BrC16HTD：与16碳直链饱和α碳溴化的酰基链共价连接的紫杉醇；DOPC：二油酰磷脂酰胆碱；DMPE：二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺；DOPE：二油酰磷脂酰乙醇胺；DPPE：二棕榈酰磷脂酰乙醇胺；DSPE：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；PEG：聚乙二醇；PEG2000：分子量约2000的PEG；PEG5000：分子量约5000的PEG。此外，本发明颗粒中的化合物浓度用颗粒中各成分的摩尔百分比表示(例如，BrC16-紫杉醇/DSPE-PEG2000(85∶15)是含有与16碳的α碳溴化的酰基链共价连接的紫杉醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-2000分子量聚乙二醇的颗粒，其比例为85摩尔％紫杉醇/酰基链比15摩尔％DSPE-PEG2000)。
本发明提供用生物相容性疏水性结构域/生物相容性亲水性结构域共轭物包裹的低亲水性核组成的颗粒。本发明的疏水性核化合物是低亲水性的，当置于含水环境中时会自身缔合。核疏水性化合物可以是天然的疏水性化合物或合成的疏水性化合物。此外，核疏水性化合物还可以是任何化合物的疏水性或低亲脂性的衍生物。例如，可将亲水性化合物用疏水性结构域衍生以形成低亲水性的化合物。在一个实施方案中，疏水性化合物可以包括用疏水性结构域衍生的亲水性化合物阿糖胞苷(Ara C)以形成疏水性的核化合物。在颗粒核中所含的所需化合物的浓度明显高于以前的载体颗粒中所含的同种化合物的浓度。所述核化合物包括(但不仅限于)，例如：紫杉类，例如紫杉醇；长春花属生物碱类，例如长春碱；薯司他丁；环状多肽类，例如头孢菌素类；其它疏水性多肽、甾体化合物，例如泼尼松和可的松；利福霉素类，例如利福布丁和利福米特；丝裂霉素类；博莱霉素类；苯并萘并吡喃酮；双嵌入抗生素，例如醌霉素；核苷抗生素，例如ara-a；吡咯并[1,4]苯并二氮杂类，例如安曲霉素和偏端霉素；大环内酯类，例如美坦素和哈霉素；双吲哚类生物碱，例如长春碱和navelbine；喜树碱和喜树碱类似物；依托泊苷类和替尼泊苷类；DNA嵌入剂，例如安吖啶；抗雌激素类，例如他莫昔芬；双(苯并咪唑)类，例如Hoechst33258和疏水性肽类，特别是与酰基链连接的疏水性肽类(例如，表面活性剂肽)。
所述化合物具有生物相容性疏水性结构域；所述结构域以治疗水平安全地为动物给药，并使化合物的疏水性增加至足以使其以高浓度(即约20摩尔％或更高)聚集在颗粒内。该结构域可以是化合物中天然存在的，例如薯司他丁，也可以是其合成共轭的，例如紫杉醇等紫杉类。优选核化合物带有共轭的生物相容性疏水性结构域。“共轭的”是指结构域与化合物上的活泼部分通过合成化学反应共价连接。
优选核化合物是紫杉类，例如紫杉醇、taxotere、cephalomannine、19-羟基浆果赤霉素Ⅲ、浆果赤霉素Ⅲ、10-脱乙酰基cephalomannine、10-脱乙酰基紫杉醇(7α-OH)、表-10-脱乙酰基紫杉醇(7β-OH)、7-表-10-脱乙酰基cephalomannine(7β-OH)和10-脱乙酰基浆果赤霉素Ⅲ。首选核化合物是紫杉醇。
生物相容性疏水性结构域与所述化合物的连接，通过酰基链、疏水性肽和硅聚合物等部分与其它化合物连接的已知方法来完成。例如，当疏水性结构域是酰基链时，优选的连接方法是在酰基链的酰基和紫杉醇、喜树碱或长春碱等化合物上的羟基之间建立键。
例如，如紫杉醇等紫杉类含有羟基(例如2’和7OH)，可以在该羟基上连接疏水性结构域。一般认为这些基团活泼程度的相对顺序(从最活泼的至最不活泼的)为2’＞7，因此，可以用化学计量的酰基链的活泼形式，例如酰氯或酸酐在紫杉醇的2’连接酰基链。或者，可以同时在2’和7OH上连接酰基链，然后选择性地除去2’酰基链，从而仅保持与紫杉7位的连接。选择性除去2’酰基链可以用化学计量的弱碱，例如碳酸氢钠来完成。此外，可以通过先将2’OH用三苯甲基、甲氧基三苯甲基、三氟乙酰基和TrOC(三氯甲氧基氯甲酸酯)等基团用本领域普通技术人员公知的方法“保护”，然后将保护的紫杉与酰基链的活泼形式，例如酸酐或酰氯在无水有机溶剂中与碱，例如DMAP和吡啶反应，而对7OH进行修饰，随后通过熟知的方法从2’位除去保护基。所述反应通常在碱，例如吡啶、二甲基氨基吡啶(“DMAP”)、三乙胺等存在下，在常用的极性非质子溶剂如二氯甲烷、甲酰胺、氯仿、THF(四氢呋喃)、二甲基甲酰胺和二甲亚砜(DMSO)中进行。
适于和所述化合物连接的疏水性结构域包括(但不仅限于)，例如酰基链、疏水性肽、硅链和其它疏水性聚合物。优选疏水性结构域是酰基链，其可以是直链或支链的、饱和或不饱和的以及α碳溴化或未溴化的。更优选共轭的疏水性结构域是下式的酰基链：-C(O)CHX1(CH2)n1(CH=CH)n2(CH2)n3(CH=CH)n4(CH2)n5(CH=CH)n6(CH2)n7(CH=CH)n8(CH2)n9CH3，其中：n1等于0或是1至21的整数，n3等于0或是1至18的整数；n5等于0或是1至15的整数；n7等于0或是1至12的整数；n9等于0或是1至9的整数；而n2、n4、n6和n8彼此独立地等于0或1。n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9的总和是等于3至21的整数。更优选酰基链是直链饱和的、长度为12、14或16个碳的酰基链，即-C(O)CHX1(CH)9CH3、-C(O)CHX1(CH)11CH3或-C(O)CHX1(CH)13CH3。
所述酰基链的X1是H，或者更优选是“促进水解的基团”(“HPG”)，即可以在体内促进其母体链从其所连接的化合物上水解的原子或原子团。HPG相对于氢是电负性的，也就是说，当其在相同的分子中占据与氢相同的位置时，可以比氢更强烈地将电子拉向自己。因此，在酰基链的α碳用HPG取代氢原子时，会导致链上电子密度的重新分布，从而引起链中的诱导效应。此外，用含有芳香族基团的HPG取代酰基链α碳上的氢，可以引起电子密度重新分布的共振效应。这种由HPG引起的诱导效应和共振效应可以稳定酸的共轭碱形式而不是酸的形式。因此，当用HPG代替酰基链上H时，该酸将会是更强的酸。因此，用HPG修饰的酰基链通常比其原来的形式、即在α位存在CH2基团而不是HPG取代基的形式具有更低的pKa值。因此，HPG取代的酰基链比其原来的形式更容易在体内从母体化合物上水解。
促进水解的基团X1是具有如下特性的任何原子或基团：(1)电负性大于氢；和(2)可以连接在酰基链的α位上。所述基团包括(但不仅限于)，例如F、Cl、Br、I、NH3 +、-OC6H4X2或-C(O)X2，其中X2是例如F、Cl、Br、I、NH3 +、NO2或CN。优选X1是F、Cl、Br或I，首先是Br。因此，首选的与化合物连接的酰基链是-C(O)CHBr(CH2)9CH3、-C(O)CHBr(CH2)11CH3或-C(O)CHBr(CH2)13CH3。HPG-取代的酰基链可以购买到，或者可以通过本领域公知的在酰基链的α碳上进行取代的方法来制备。
核周围的共轭物由连接的亲水性和疏水性结构域组成。所述共轭物可以是天然或合成的带有疏水性和亲水性结构域的脂类。或者，共轭物可以是带有与疏水性结构域通过化学方法连接的亲水性结构域的化合物。适宜的共轭物中亲水性结构域是：1)生物相容性的，即可以向动物给药而没有过多的副反应；2)总的说来，亲水性要大于疏水性；和3)能够与疏水性结构域相连接。其包括(但不仅限于)例如：纤维素；聚乙二醇；聚氨基酸，例如聚甘氨酸；多糖；聚(氧化乙烯)；聚(丙烯酸)；聚(丙烯酰胺)；聚(乙烯吡咯烷酮)；和聚(甲基丙烯酸酯)。当亲水性结构域是亲水性聚合物时，聚合物优选是聚乙二醇(“PEG”)或聚氧乙烯，更优选分子量为约50至约5000的PEG或首选分子量约为2000的PEG(“PEG2000”)。亲水性结构域还可以是两亲脂类的极性端基区域。所述端基可以带有正电荷或负电荷；电荷可以是端基上天然存在的，也可以是通过在端基的活泼基团上连接带电荷的分子加入的。带电荷的分子包括(但不仅限于)例如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸和连接有有机二元羧酸如戊二酸、草酸和琥珀酸的磷脂酰乙醇胺。
适宜的共轭物疏水性结构域是：1)生物相容性的；2，带有能够与亲水性结构域相连接的部分；和3)总的说来，疏水性要大于亲水性。所述结构域包括(但不仅限于)两亲脂类的酰基链区域、各种疏水性聚合物，例如硅聚合物和疏水性肽。
两亲脂类的端基是亲水性的，因此，脂类本身便是疏水性/亲水性的共轭物。这些脂类共轭物通常在端基上带有正电荷或负电荷，其包括磷脂酰丝氨酸(PS’s)、磷脂酰甘油(PGs)和磷脂酸(PAs)。或者，端基带有可连接亲水性结构域的活泼部分。所述脂类优选磷脂酰乙醇胺类(“PEs”)，例如二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(“DPPE”)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(“POPE”)、二油酰磷脂酰乙醇胺(“DOPE”)或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(“DSPE”)；更优选的磷脂酰乙醇胺是DSPE。
因此，含有两亲性脂类的共轭物包括PEs和PEG的共轭物；其中优选DSPE和分子量为50-5000的PEG的共轭物，首选DSPE-PEG2000。含有两亲性脂类的共轭物还包括各种带电荷的脂类，例如磷脂酰乙醇胺-二羧酸DOPE-GA和POPE-GA(“GA”=戊二酸)。
生物相容性亲水性/疏水性共轭物还可以是亲水性/疏水性共聚物，例如分子式为HO(CH2CH2O)a(CH(CH3)CH2O)b(CH2CH2O)cH的共聚物。更优选在所述聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物中，a和b彼此独立地等于约10至约100的整数，c等于0或是约1至约100的整数。首选a和c分别等于75,b等于30。
含疏水性结构域的核化合物占所述颗粒的约20摩尔％至约99摩尔％，并且可以含有此范围内的任何含量，例如至少约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95摩尔％至约99摩尔％。疏水性结构域-亲水性结构域共轭物占所述颗粒的约1摩尔％至约80摩尔％，并且可以含有此范围内的任何含量，例如约80摩尔％至约75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5或1摩尔％。首选核化合物占所述颗粒的约80-99摩尔％，共轭物占所述颗粒的约1-20摩尔％。
由于它们的疏水性结构域，核化合物可以和周围的共轭物一起以高浓度聚集在本发明所提供的颗粒内。所述高浓度的聚集，无需在核中存在油或水等其它成分，因此，本发明颗粒的核基本上不含水或添加的油。如果没有疏水性结构域，当不存在油或水时，化合物就不能在载体，例如脂质体或乳液内聚集，或者不能以本发明颗粒的核中所含的化合物的浓度聚集。
因此，本发明的颗粒既不是脂质体(其在脂质双层内包裹有大量的水)，也不是乳液(其为水包油或油包水的组成，即一种液体在另一种液体内的小球)。事实上，本发明的颗粒与这些结构完全不同，这种差异很容易由本领域技术人员通过已知的方法证实。所述方法包括：例如按照下文实施例3中所给出的沉降研究来评定载体颗粒内核化合物的浓度；例如通过NMR谱、颗粒内包埋的可溶性标记物的百分比、测定含氚水的分布、通过测定外部加入的溶质测定体积分布以及根据脂质体在低渗环境中的膨胀测定浊度等来证实是否存在水或添加的油；以及通过冷冻碎裂和低温电子显微镜及NMR谱检测脂类分子结构来证实是否存在脂质双层结构。
本发明所提供的颗粒近似于球形，其直径(或粒度)至少为约15nm，优选不大于约10,000nm，太大的颗粒不能用于静脉内注射。颗粒可以为此范围内任何大小，但首选约15-200nm。粒度受多种因素的影响，这些因素是本领域技术人员可以确定的，包括颗粒中衍生物与共轭物的相对比例，并且可以根据如下等式确定：
(1)低亲水性化合物摩尔数/颗粒的摩尔数(X)=[密度×(4/3π)(d/2-t)3]/低亲水性化合物的分子量；
(2)共轭物摩尔数/颗粒的摩尔数(Y)=(πd2)/(a)×6.0225×1023；和
(3)低亲水性化合物的摩尔％=[X/(X+Y)]·100，其中“d”是颗粒的直径，“t”是共轭物层的厚度，“a”是共轭物成分每个分子的表面积，“密度”的单位是g/cm3。粒度可以通过本领域普通技术人员熟知的各种方法来测定(包括以下实施例5中所列的方法)。
本发明的颗粒通常通过乙醇注射或反相蒸发(REV)来制备，还可以通过透析法来制备。简单地说，在乙醇注射法(参见以下的实施例1)中，将适宜量的颗粒成分溶解在适宜量的有机溶剂，例如乙醇中。然后将形成的乙醇溶液缓慢注射到适宜量的适宜含水溶液(例如缓冲液HEPES/NaCl pH7.5)中而在缓冲液中形成颗粒，离心然后收集颗粒。根据反相蒸发法(参见以下的实施例1)，将适宜量的颗粒成分混合，然后溶解在适宜量的含水缓冲液/可混溶有机溶剂的混合物中，然后在惰性气体气流下真空蒸除有机溶剂。
本发明的颗粒可与可药用载体混合，因此，本发明还提供含有颗粒和载体的药物组合物形式。“可药用载体”是指可用于和治疗或诊断试剂一起对哺乳动物给药的常用介质。所述介质根据本领域普通技术人员可以确定的多种因素进行选择，所述因素包括但(不仅限于)：所给药的具体试剂及其浓度、稳定性和期望的生物利用度；用组合物进行治疗或诊断的的疾病或病症；使用者的年龄、体重和一般状况；组合物的给药途径，例如经鼻、口服、眼用、局部、经皮、阴道、直肠、鞘内、皮下、乳房内、腹膜内、静脉内、肿瘤内、腔内或肌肉内。可药用载体还包括其它成分，例如可以增强活性成分稳定性的物质，包括例如防腐剂和抗氧化剂。
药物组合物可以通过本领域公认的各种常规方法对动物，如人等哺乳动物进行给药。给药途径例如口服、静脉内、动脉内、皮下、肌肉内或腹膜内给药等，可根据本领域普通技术人员可以确定的多种因素进行选择。这些因素包括(但不限于)：所治疗个体的年龄、体重和一般健康状况；所期望的药物生物利用度；所治疗疾病的具体形式；所用的载体以及施用的治疗剂的剂量。口服和静脉内给药是本发明所提供的药物组合物的优选给药方法。本发明还优选以含有固体、半固体或液体形式颗粒的药物组合物进行腹膜内给药。
本发明提供用于口服给药的固体形式(例如片剂或胶囊)及液体形式(例如糖浆和混悬剂)的含颗粒药物组合物。含颗粒的片剂可以是药物领域常用的任何常规类型的片剂，例如圆形、椭圆形或长椭圆形的、包衣或未包衣的大小或重量不同的片剂，并且除了本发明的颗粒外，还可以含有本领域常用的各种成分。胶囊是颗粒包含在明胶壳之内的固体剂量形式；所述胶囊可以以各种颗粒剂量水平进行制备。本发明同时提供硬和软胶囊。将颗粒配制到所述片剂、胶囊或其它固体剂量形式中是制药领域普通技术人员熟知的。
与本发明的颗粒一起配制成药物组合物的静脉内用液体是糖、氨基酸和电解质等化学物质的无菌水溶液，这些化学物质很容易在哺乳动物体内运送然后吸收；除用作载体来进行活性成分给药外，这些液体还经常用于营养和电解质补充。适于和本发明的颗粒一起配制的常用静脉内液体包括(但不限于)，生理盐水和5(重量)％葡萄糖水溶液。
本发明还提供对动物施用化合物的方法，该方法包括，向动物施用本发明所提供的含有颗粒的药物组合物。所述方法是高效率的，即以化合物对颗粒中其它成分的高比例传递该化合物，并且该方法是低毒性的。具体地讲，该方法可用于对动物传递治疗有效量化合物，以治疗可以用所述化合物进行治疗的疾病或病症，这种治疗没有过多副作用。其中，化合物的“治疗有效量”是可以有效改善、减轻或预防疾病或病症的化合物的任何量，通常为至少约0.01mg化合物/kg施用化合物的动物体重。更优选化合物的治疗有效量为约0.01mg化合物/kg至约1000mg/kg。可用本发明的组合物治疗的病症包括(但不限于)例如各种癌症，例如脑癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、白血病、淋巴瘤、黑瘤、癌和肉瘤；寄生虫病、各种炎性和自身免疫疾病，例如关节炎和青少年糖尿病；以及各种微生物感染。术语“微生物感染”包括由病毒、细菌、立克次氏体、真菌、prions等引起的病症。此外，本发明所提供的组合物还可用于对动物施用非治疗性试剂，例如诊断剂或营养物质。
通过以下实施例可以更好地理解本发明。但是，本领域普通技术人员很容易理解，这些实施例仅仅是用来说明所附权利要求中所定义的本发明内容的。
                            实施例实施例1颗粒的制备通过乙醇注射法制备BrC16-紫杉醇/DSPE-PEG2000
为了通过乙醇注射法进行制备，称重20mg BrC16-紫杉醇和8.3mg DSPE-PEG2000，将其混合然后注射到0.1ml乙醇中进行溶解。然后将形成的乙醇溶液缓慢加入到含有2ml10mM HEPES,150mM NaCl缓冲液，pH7.5(HEPES缓冲液)的玻璃小瓶中，形成颗粒在缓冲液中的悬浮液。通过反相蒸发法制备BrC16-紫杉醇/DSPE-PEG2000
为了通过反相蒸发法进行制备，将20mg BrC16-紫杉醇和118mgDSPE-PEG2000混合，然后溶于6ml乙醇和2ml HEPES缓冲液中，然后通过旋转蒸发除去乙醇形成颗粒。通过反相蒸发(REV)法制备哈霉素/DSPE-PEG2000
为了通过改进的REV方法进行制备，将20mg大环内酯类抗生素哈霉素和80mg DSPE-PEG2000一起溶于40ml氯仿和甲醇(1/1,v/v)。向混合物中加入10ml生理盐水(约0.9％)然后将悬浮液在水浴超声仪中，在室温下短时间的超声(约10秒)以得到相对均匀的分散体。然后用旋转蒸发器在约45℃下蒸除溶剂。剩余的盐水溶液含有重量比为20∶80的哈霉素/DSPE-PEG2000颗粒的制剂。通过透析法制备哈霉素/DSPE-PEG2000
哈霉素颗粒还可以通过透析的方法制备。将80mg哈霉素和20mgDSPE-PEG2000一起溶于4ml DMSO。将1ml含有大环内酯哈霉素和脂类的溶液滴到9ml生理盐水(约0.9％)中，并同时在室温下涡漩振荡。将3ml含有哈霉素和脂类的盐水/DMSO溶液加到Slide-A-Lyzer(10k分子量截留值)中，并在室温下于2升盐水中透析过夜。透析结束时，基本上所有的DMSO均被除去。对颗粒的分析证实它们含有比例为80∶20的哈霉素和DSPE-PEG2000。实施例2蔗糖梯度离心
将200μl按照反相蒸发法(参见以上的实施例1)制备的含有6.9mg聚乙二醇化的脂类-疏水性药物衍生物组合物(例如30∶50∶20摩尔比的DOPC、DOPE-PEG2000和BrC16-紫杉醇的组合)加入到12ml用Biocomp Gradient Master Model 106(Biocomp.Instruments,Inc.,(操作参数：时间：2分钟，角度：81.5°，速度：19))制备的0-50％蔗糖梯度液的顶部。将梯度液以208,000g在Beckman L5-50超速离心机中离心过夜，然后从各顶部分出1ml。
通过改进的Chen等的方法(该文献的内容引入本文作为参考)确定各馏份中的磷脂浓度。通过将样品溶于乙醇，用UV2101PC UV扫描分光光度计(Shimadzu Scientific Instruments,Inc.)读出吸收值，然后将吸收值与标准物比较可确定化合物的浓度。结果示于图1A和1B，并通过光学显微镜检测梯度馏份证实结果(参见下文实施例6所述)。可用显微镜检测到的颗粒存在于较高密度的馏份中(#12)。在馏份12中，BrC16-紫杉醇与磷脂的摩尔比为94∶6。实施例3沉降研究
将按实施例1所述的乙醇注射法制备的1ml颗粒样品(10mg/mlBTC16-紫杉醇)在Beckman L5-60超离心机上以30,000g离心30分钟；除去上清液后，将沉淀重悬在水中达到与样品大约相同的体积。通过改进的Chen等的方法(该文献的内容引入本文作为参考)确定各馏份中的磷酸盐浓度。通过将样品溶于乙醇，用UV2101PC UV扫描分光光度计(Shimadzu Scientific Instruments,Inc.)读出吸收值，然后将吸收值与标准物比较可确定化合物的浓度。这些试验的结果列于表1。通常，沉淀中的BrC16-紫杉醇的摩尔百分比为约98。
                                   表1
                                 沉降研究
样品  馏份类型*       BrC16-紫杉醇浓度(mo/ml)  磷酸盐浓度(mM)     摩尔％BrC16-紫杉醇
DOPE-PEG2000     1       1.86      0.36     81.35
DOPE-PEG2000     2      10.39      1.33     86.95
DOPE-PEG2000     3       7.67      0.19     97.22
DSPE-PEG2000     1       1.25      0.35     75.13
DSPE-PEG2000     2      10.93      1.29     87.90
DSPE-PEG2000     3       8.74      0.18     97.65
DPPE-PEG2000     1       1.20      0.33     75.40
DPPE-PEG2000     2      10.77      1.26     88.00
DPPE-PEG2000     3       9.62      0.20     97.65
DMPE-PEG2000     1       0.99      0.23     78.34
DMPE-PEG2000     2      10.43      1.13     88.78
DMPE-PEG2000     3       9.82      0.20     97.72
DOPE-PEG5000     1       2.33      0.34     85.39
DOPE-PEG5000     2      10.15      1.04     89.27
DOPE-PEG5000     3       4.15      0.07     98.14
DSPE-PEG5000     1       2.17      0.35     84.26
DSPE-PEG5000     2      10.13      1.10     88.77
DSPE-PEG5000     3       4.53      0.08     98.00
DPPE-PEG5000     1       2.40      0.36     85.15
DPPE-PEG5000     2      10.21      1.11     88.77
DPPE-PEG5000     3       3.83      0.07     98.04
DMPE-PEG5000     1       1.88      0.32     83.26
DMPE-PEG5000     2       9.97      1.09     88.68
DMPE-PEG5000     3       4.65      0.08     98.13
*1：上清液；2：全部；3：沉淀。实施例4浊度测定
由于含有被包裹的含水溶液，因此当放在渗透压与该溶液不同的介质中时，脂质体会缩小或膨胀。这种由于渗透压的差异而引起的脂质体大小的改变会导致脂质体悬浮液浊度的改变。基本不含包裹含水体积的颗粒，例如本发明的颗粒，则不存在渗透压的差异，因此颗粒的悬浮液不会出现浊度的明显改变。
因此，在具有不同渗透压的介质中测量颗粒悬浮液的浊度，可以表明颗粒是否包裹有含水体积。因此，将0.1ml通过乙醇注射法(参见上文实施例1的描述)制备的含有3.45mg DOPC∶DOPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇(1∶1∶8摩尔比)颗粒的样品在各3ml的如下溶液中稀释(最终的紫杉醇浓度：0.66mg/ml):H2O、75、150和300mM NaCl。用UV-2101PC UV扫描分光光度计(Shimadzu Scientific Instruments,Inc)检测样品浊度随时间的改变(λ=800nm)。结果示于图2中。未观察到吸收值的变化，表明该颗粒与脂质体不同，不受渗透压的影响。实施例5粒度分析
用DSPE-PEG2000和BrC16-紫杉醇(15∶85摩尔比)通过乙醇注射法(参见上文实施例1的描述)制备颗粒；将颗粒样品(约1-3μl)通过370型亚微米粒度测量仪(Submicron Particle Sizer)(来自NICOMPParticle Sizing Systems,Inc)进行粒度测量；在整个过程中使用“固体颗粒”模式。下表2中列出了通过数量、强度或体积加权测得的各种组合物的颗粒悬浮液中的平均颗粒直径(nm)。
                     表2
             Nicomp粒度分析(nm)
脂类                           颗粒数量加权                强度加权              体积加权
 DOPE-PEG2000 20-119 96-208 44-181
 DSPE-PEG2000 32-81 94-197 57-147
 DPPE-PEG2000 43-93 104-172 69-138
 DMPE-PEG2000 54 111 80
 DOPE-PEG5000 34 68 48
 DSPE-PEG5000 35 69 49
 DPPE-PEG5000 34 73 50
 DMPE-PEG5000 15-36 85-137 31-56
实施例6存放
将按照乙醇注射法(参见上文实施例1的描述)制备的含有摩尔比为85∶15的BrC16-紫杉醇和DOPE-PEG2000、DPPE-PEG2000、DMPE-PEG2000、DOPE-PEG5000、DSPE-PEG5000、DPPE-PEG5000或DMPE-PEG5000之一的颗粒悬浮在HEPES缓冲液中然后以未稀释的形式存放。通过上文实施例1中描述的REV法制备摩尔比为20∶80的BrC16-紫杉醇和DSPE-PEG2000样品。将样品在室温或4℃下存放，然后在光学显微镜(Olympus BH-2,New York/New Jersey Scientific)下观察。将观察的样品就疏水性化合物的颗粒和结晶的存在进行主观评分，结果示于图3和4。
将悬浮在HEPES缓冲液中的颗粒加入到新鲜的雄性大鼠血浆中(Fisher大鼠，品系：f344，年龄：约60天，重量：175-200克，同系繁殖的，最终的衍生物化合物浓度：0.2mg/ml)；将血浆样品于37℃保温0、2、6、24或72小时。保温后，立即将样品通过液氮冷冻并存放在-70℃下，然后在室温融化并加入到等体积的含有0.04mg/ml(终浓度)C12-紫杉醇作为内标物的乙腈中。将混合物用Eppendorf Centrifuge5402于1000rpm离心10分钟，然后通过HPLC分析BrC16-紫杉醇的浓度。结果如图5所示。
在4℃下长时间存放后，还将BrC16-紫杉醇/DSPE-PEG2000(85∶15)颗粒样品进行了粒度分析(参见上文的实施例5)，结果如表3所示。每种样品分别制备，结果表示的是开始时的粒度测量值和存放后的粒度测量值。很明显，在4℃下长时间存放后，粒度仍保持不变。
                      表3
              Nicomp粒度分析(nm)
   存放的天数                   粒度(开始/最后)数量加权                强度加权             体积加权
       21  56/59  140/142     94/98
       31  53/61  143/145     94/101
       59  48/60  135/135     86/95
      100  48/52  138/139     87/91
      114  46/45  144/150     89/90
      141  43/35  116/117     73/67
实施例7光学显微镜检查
将DSPE-PEG2000和紫杉醇(80∶20，摩尔比)通过反相蒸发法(参见上文实施例1的描述)混合；该紫杉醇未与疏水性结构域连接。在放大200倍(参见图6，图6A和6B最终放大了277倍)下拍摄这些颗粒的光学显微照片(Olympus BH-2,New York/New JerseyScientific)。观察到结晶是主要的结构。
通过乙醇注射法(参见上文实施例1的描述)制备DOPE-PEG2000∶Br-紫杉醇(80∶20)颗粒，其中，与紫杉醇共价连接的酰基链具有不同的长度；这些颗粒的光学显微照片如图6C-6H所示(550倍)。
通过改进的美国专利5,580,899和5,703,117(引入本文作为参考)中公开的方法将长春碱在20位羟基上与酰基链共价连接。概括地讲，将长春碱(25mg)溶于二氯甲烷和吡啶(5∶1)并与过量的棕榈酰氯(60μl)一起在4mg DMAP的存在下于41℃加热回流过夜。用氯仿∶甲醇(95∶5)进行的薄层色谱(TLC)表明几乎所有的(＞95％)原料均已反应生成了C16-产物。蒸除溶剂并将产物通过制备型TLC，以氯仿∶甲醇(95∶5)纯化。最后，将产物从环己烷中冷冻干燥得到15mg(54％)白色固体粉末，将其通过1H和13C NMR进行鉴定。
通过REV法(参见上文实施例1的描述)用悬浮在1.1ml HEPES缓冲液中的18mg DSPE-PEG2000和11mg C16-长春碱制备DSPE-PEG2000∶C16-长春碱颗粒(40∶60，摩尔比)，所形成颗粒的光学显微照片(277倍)如图8A和8B所示。
通过改进的美国专利5,580,899和5,703,117(引入本文作为参考)中公开的方法将喜树碱在20位羟基上与酰基链共价连接。概括地讲，将喜树碱(20mg)在室温下溶于4ml无水吡啶，然后与56mg棕榈酸酐一起搅拌48小时。用氯仿∶甲醇(96∶4)进行的薄层色谱(TLC)表明了反应的进程。减压蒸除吡啶并将得到的残余物通过制备型TLC用氯仿∶甲醇(96∶4)纯化。得到30.1mg(90％)乳白色薄片粉末状产物，将其通过1H和13C NMR进行鉴定。
通过REV法(参见上文实施例1的描述)用悬浮在1.5ml HEPES缓冲液中的50mg DSPE-PEG2000和15mg C16-喜树碱制备DSPE-PEG2000∶C16-喜树碱(喜树碱通过其20位的羟基与16碳的饱和酰基链偶)颗粒(40∶60，摩尔比)。实施例8冷冻碎裂电子显微照片
通过REV法(参见上文实施例1的描述)用悬浮在1ml HEPES缓冲液中的4.7mg DOPC、27.4mg DOPE-PEG2000和5.85mg BrC16-紫杉醇制备DOPC∶DOPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇(30∶50∶20)颗粒。将1-3μl样品置于一对Balzers铜双复制支架之间，然后从室温转移至液态丙烷中冷冻，由此制得放大约91000倍(参见图7A)和约31000倍(参见图7B)的冷冻碎裂电子复制物。将冷冻样品碎裂(-100℃和10-6-10-7毫巴)，然后在Balzers BAF400冷冻碎裂装置中用铂(∠45°)和碳遮蔽。将复制物在5％次氯酸盐(市售漂白剂)中清洗过夜，用蒸馏水洗涤，安装到300目网格上并用Philips300TEM观察。图像表明颗粒的内部为固体，没有可见的薄层。
通过REV法(参见上文实施例1的描述)用悬浮在1.1ml HEPES缓冲液中的18mg DSPE-PEG2000和11mg C16-长春碱制备DSPE-PEG2000∶C16-长春碱(40∶60摩尔比)颗粒。将形成的颗粒通过前述方法加工进行电子显微镜检查；电子显微照片(55000倍)如图8C和8D所示。通过低温EM获得影像的再次表明颗粒具有固体的核并且没有内部分层。实施例9低温电子显微镜检查
根据乙醇注射法(参见上文实施例1的描述)用DSPE-PEG2000和BrC16-紫杉醇(15∶85)制备颗粒，使之含有约10mg/ml BrC16-紫杉醇；将样品(1ml体积)保持在室温下并同时制备网格。将未稀释的样品通过如下方法冷冻：将一滴样品置于EM网格上，使该液滴渗开呈薄膜状，然后将染样品的网格浸入液体乙烷中。在低电子剂量条件下拍摄悬在带状碳载体孔内的冷冻水合样品的照相底片。将镜头为60K调焦在1.8μm，为100K调焦至1.5μm。结果如图9所示(图A和B放大110000倍，图C和D放大184000倍)。实施例10截留体积测量
按照以上实施例1的描述制备颗粒，得到BrC16HTD浓度为10mg/ml,DSPE-PEG2000浓度为4mg/ml的颗粒悬浮液。按照乙醇注射法用DSPC制备脂质体悬浮液，以得到14mg/ml的脂类浓度。按照Perkins等的方法(《脂类化学和物理学》(Chemistry and Physics ofLipids),64(1993)197-217；其内容引入本文作为参考)用自旋标记探针tempone测定这些颗粒和脂质体(参见表4)的截留体积，所述自旋标记的探针引入乙醇溶液制剂中(方法1)或者引入HEPES缓冲液制剂中(方法2)。
为了通过离心浓缩颗粒，在冷却至室温后，通过将悬浮液样品(1.5ml)用Beckman L5-50型超速离心机以50,000g离心收集颗粒。将沉淀重新悬浮在约0.4ml相同的缓冲液中。将含有Tempone的样品分成两个100μl的等分试样，向其中的一份加入HEPES缓冲液，向另一份中加入100μl 100mM增宽剂(“BA”)草酸铬溶液。
不合增宽剂的ESR(电子自旋共振；i=-1共振)与总水体积的关系如等式：Atot=Vin+Vout=Vtot-Vlipid(Vin=内体积；Vtot=悬浮液体积；Vlipid=水合脂类的体积(从脂类的比体积和稀释后的内部脂类浓度计算))。然后用(1)与增宽剂混合的样品等分试样的信号幅度(ABA)和(2)脂类体积的校正因子的乘积来计算内体积，即根据如下等式计算：Vin=ABA×[(Vtot-Vlipid)/Atot]。两次测量(Atot和ABA)均使用稀释至相同浓度的样品。用内体积(Vin，微升)和脂类浓度(微摩尔/ml)计算截留体积。
                          表4
             脂质体             颗粒            颗粒(小丸)
          方法1    方法2    方法1    方法2    方法1    方法2相对信号幅度    62       51       62       54       63       59(w/BA)相对信号幅度    13       12       0        0         0       0(w/o BA)截留体积(微     2.7      3.0      0        0         0       0升/微摩尔脂类)实施例11急性毒性研究
将按照上文所述制备的含有DSPE-PEG2000/BrC16-紫杉醇的颗粒和Taxol(Bristol Myers-Squibb)以12.5至400mg/kg颗粒中BrC16-紫杉醇或Taxol中的紫杉醇五种日剂量(在相同的mg/kg剂量下，BrC16-紫杉醇的摩尔剂量比Taxol中的紫杉醇的摩尔剂量低27％；BrC16-紫杉醇的分子量：1169；紫杉醇的分子量：853)通过腹膜内(i.p.)或静脉内(i.v.)对每组5-10只的CDF1雌性小鼠给药。
将储备液制剂在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释至所需的浓度，然后以25ml/kg的量给药；将PBS用作对照。每天检查小鼠，确定各组中各小鼠的存活时间。表5和6分别给出了腹膜内(i.p.)和静脉内(i.v.)给药后的急性毒性结果。这些结果是对每个制剂在每个剂量水平下进行1-4次实验的混合数据。
                             表5
 BrC16-紫杉醇与Taxol相比在CDF1小鼠中的急性毒性(i.p.x5)
   每日剂量(mg/kg)    紫杉醇当量(mg/kg)        存活小鼠数/总数
 BrC16-紫杉醇    Taxol
     12.5       ----      ----    20/20
      25       ----      ----    10/20
     37.5       ----      ----     0/10
      50       ----      ----     0/25
     100        72      6/6     ----
     200       144     10/11     ----
     300       216      5/6     ----
     400       288      1/6     ----
*注射后存活30天
                        表6BrC16-紫杉醇与Taxol相比在CDF1小鼠中的急性毒性(i.v.x5)
    每日剂量(mg/kg)    紫杉醇当量(mg/kg)      存活小鼠数/总数
 BrC16-紫杉醇    Taxol
     12.5      ----      ----    15/15
    18.75      ----      ----     5/5
      25      ----      ----    13/15
    31.25      ----      ----     4/5
     37.5      ----      ----     0/7
      50       36       5/5     0/8
     100       72       4/5     ----
*注射后存活30天实施例12抗癌治疗研究
将六周大的CB17雌性SCID小鼠用5×106Ovcar3(人卵巢癌)细胞接种(i.p.)(第0天)；然后在肿瘤接种后的第20、22、24、26和28天给小鼠施用(i.p.)BrC16-紫杉醇(12.5、25、50或100mg/kg)或Taxol(12.5或25mg/kg)(10小鼠/组)。将储备液药物制剂在PBS中稀释，以达到所需的剂量水平；将稀释的制剂以25ml/kg的量给药。PBS也用作对照。每天检查小鼠，确定各组中各小鼠的存活时间。结果如图10所示。实施例13抗癌治疗研究
将六周大的CB17雌性SCID小鼠用5×106A549(人非小细胞肺癌)细胞接种(皮下)(第0天)；然后在肿瘤接种后的第1、3、5、7和9天对小鼠给药(i.v.)BrC16-紫杉醇(12.5、25、50或100mg/kg)(5小鼠/组)。将储备液药物制剂在PBS中稀释以达到所需的剂量水平；将稀释的制剂以10ml/kg的量给药。PBS还用作对照。从接种后的第9天开始，每周两次测量肿瘤的体积(mm3)，该体积通过(宽/2)2×长×π计算。当其肿瘤体积达到1500mm3时，处死小鼠。结果如图11所示。实施例14
将六周大的CB17雌性SCID小鼠用5×104L1210(鼠白血病)细胞接种(i.v.)(第0天)；然后在接种后的第1-5天对小鼠口服给药BrC16-紫杉醇(12.5、25、50或100mg/kg)或Taxol(12.5或25mg/kg)(9-10小鼠/组)。将储备液药物制剂在PBS中稀释以达到所需的剂量水平。每天检查小鼠，确定各组中各小鼠的存活时间。结果如图12所示。实施例15含BrC16-紫杉醇/Pluronic颗粒的粒度分析
通过上文所述的方法制备含有BrC16-紫杉醇和Pluronic F68(泊咯沙姆188,HO(CH2CH2O)75(CH(CH3)CH2O)30(CH2CH2O)75H)，比例为90摩尔％/10摩尔％的颗粒。概括地讲，将48mg紫杉醇衍生物和40mgPluronic溶于0.2ml乙醇；然后将形成的溶液的0.1ml等分试样缓慢加入到含有2ml磷酸盐缓冲盐水(PBS,10mM磷酸盐/150mM盐水，pH7)的试管中。然后将形成的2ml悬浮液合并成4ml体积的单一悬浮液。
将该悬浮液通过5微米的滤器，然后将得到的滤液用Nicomp370型亚微米粒度分析仪进行粒度分析。通过Gaussian分析的结果为(nm,±标准偏差)：44±17(数量加权)；70±27(体积加权)和105±40(强度加权)。这表明用Pluronics作为共轭物可以形成稳定的颗粒。实施例16含BrC16-紫杉醇/CremophorEL颗粒的粒度分析
按照上文实施例1的描述制备含有BrC16-紫杉醇和CremophorEL(甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯)的颗粒。概括地讲，将48mg紫杉醇衍生物和44mg甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯一起溶于0.2ml乙醇；然后将形成的溶液的0.1ml等分试样缓慢加入到含有2ml磷酸盐缓冲盐水(PBS,10mM磷酸盐/150mM盐水，pH7)的试管中。然后将形成的2ml悬浮液合并成4ml体积的单一悬浮液。
将该悬浮液通过Nomarski光学显微镜(700倍)进行检查。结果如图13所示。这表明用甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯作为共轭物可以形成稳定的颗粒。实施例17含BrC16-紫杉醇/DOPE-GA的颗粒的粒度分析
DOPE-GA，也称为N-戊二酰基-PE,18∶1，它是一种与戊二酸通过酰胺键共轭的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺组成的磷脂。按照上文实施例1中的描述制备含有50摩尔％/50摩尔％的BrC16-紫杉醇和DOPE-GA的颗粒。概括地讲，将48mg BrC16HTD和约33mgDOPE-GA溶于0.26ml乙醇；然后将该乙醇溶液的0.13ml等分试样缓慢加入到含有2ml HBS(20mM HEPES,150mM盐水，pH7.5)的试管中。然后将形成的2ml悬浮液合并成4ml体积的单一悬浮液。
该悬浮液为蓝白色并且是透明的。将4ml悬浮液通过标称孔径为5微米的注射滤器。滤液用Nicomp370型亚微米粒度分析仪进行粒度分析。通过Gaussian分析的结果为(nm，±标准偏差)：40±16nm(数量加权)；67±27nm(体积加权)和106±43nm(强度加权)。实施例18含哈霉素/DSPE-PEG2000的颗粒
将按照实施例1的描述通过改进的REV法制备的哈霉素/DSPE-PEG2000(20∶80)(wt/wt)颗粒用Nomarski光学仪器进行光学显微镜检查。悬浮液含有分布不均匀的直径小于6μm的颗粒。悬浮液为黄色，略微不透明。图14是哈霉素/DSPE-PEG2000颗粒的光学显微照片。照片上的1cm在图14A中相当于27μm，在图14B中相当于13.6μm。
将按照实施例1的描述通过透析法制备的哈霉素/DSPE-PEG2000(80∶20)(wt/wt)颗粒通过相衬光学显微镜进行检查。图15是哈霉素/DSPE-PEG2000(80∶20)颗粒的光学显微照片。照片上的1cm相当于27μm。该悬浮液为黄色并且是透明的。
按照实施例1的描述通过透析法制备颗粒。将悬浮液(4ml)通过标称孔径为5微米的注射滤器。滤液用Nicomp370型亚微米粒度分析仪进行粒度分析。这些颗粒的粒度是相对不均匀的。因此，Nicomp分析的结果表明有多种粒度的群体。粒度通过Gaussian分析或分布分析进行测定。Gaussian分析的结果为(nm，±标准偏差)：382±196nm(数量加权)；205±105nm(体积加权)和495±253nm(强度加权)。通过分布分析，66％的颗粒为105nm和34％为398nm(数量加权)；7％的颗粒为111nm和93％为412nm(强度加权)和3％的颗粒为111nm和97％为419nm(体积加权)。用分布分析测得的双峰分布表明有较大的颗粒(大于300nm)存在。无论如何，粒度研究表明哈霉素/DSPE-PEG2000的确形成了颗粒。
应当理解，以上描述只是用来说明而非限制性的。在阅读了上述介绍后，许多实施方案对于本领域技术人员是显而易见的。因此，本发明的范围并不仅限于上述的描述，而应当由所附的权利要求以及与之等同的全部范围来确定。所有文章和参考文献、包括专利申请和出版物均引入本文作为参考。

Claims (43)

1．一种颗粒，其包含：
(a)含低亲水性化合物的核；
(b)生物相容性亲水结构域和生物相容性疏水结构域的共轭物，所述共轭物包裹在核周围，其中：
低亲水性化合物占所述颗粒的约20摩尔％至约99摩尔％；
共轭物占所述颗粒的约1摩尔％至约80摩尔％；并且
颗粒的直径至少为约15nm。
2．权利要求1所述的颗粒，其中的化合物选自紫杉类(taxanes)、长春花属生物碱类、薯司他丁、头孢菌素类、甾族化合物、利福霉素类、丝裂霉素类、博莱霉素类、苯并萘并吡喃酮、双嵌入抗生素、核苷抗生素、吡咯并[1,4]苯并二氮杂类、大环内酯类、双吲哚类生物碱、喜树碱类、依托泊苷类、替尼泊苷类、DNA嵌入剂、抗雌激素类、双(苯并咪唑)类和阿糖腺苷。
3．权利要求2所述的颗粒，其中的化合物是紫杉类化合物。
4．权利要求3所述的颗粒，其中的紫杉化合物是紫杉醇。
5．权利要求1所述的颗粒，其中的低亲水性化合物包括与疏水性结构域共价连接的化合物，所述疏水性结构域选自酰基链、疏水性肽和疏水性聚合物链。
6．权利要求5所述的颗粒，其中的疏水性结构域是酰基链。
7．权利要求6所述的颗粒，其中的酰基链为如下结构式C(O)CHX1(CH2)n1(CH=CH)n2(CH2)n3(CH=CH)n4(CH2)n5(CH=CH)n6(CH2)n7(CH=CH)n8(CH2)n9CH3，其中：
n1等于0或是1至21的整数，
n3等于0或是1至18的整数，
n5等于0或是1至15的整数，
n7等于0或是1至12的整数，
n9等于0或是1至9的整数，
n2、n4、n6和n8彼此独立地等于0或1；
n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9的总和是等于3至21的整数；并且
X1是H或促进水解的基团。
8．权利要求7所述的颗粒，其中的酰基链为如下结构式：
C(O)CHX1(CH2)n1CH3。
9．权利要求8所述的颗粒，其中的酰基链是-C(O)CHX1(CH2)9CH3、-C(O)CHX1(CH2)11CH3或-C(O)CHX1(CH2)13CH3-。
10．权利要求9所述的颗粒，其中的X1是促进水解的基团。
11．权利要求10所述的颗粒，其中，促进水解的基团选自F、Cl、Br、I、-OC6H4X2和-C(O)X2，其中X2是F、Cl、Br、I、CN、NO2或NH3 +。
12．权利要求11所述的颗粒，其中，促进水解的基团是Br。
13．权利要求1所述的颗粒，其中的低亲水性化合物含有与紫杉醇连接的选自-C(O)CHBr(CH2)9CH3、-C(O)CHBr(CH2)11CH3或-C(O)CHBr(CH2)13CH3的酰基链。
14．权利要求1所述的颗粒，其中的共轭物疏水性结构域包括两亲性脂类的酰基链区域。
15．权利要求14所述的颗粒，其中的两亲性脂类是磷脂酰乙醇胺。
16．权利要求15所述的颗粒，其中的磷脂酰乙醇胺是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
17．权利要求1所述的颗粒，其中的共轭物疏水性结构域是疏水性聚合物。
18．权利要求17的化合物，其中的疏水性聚合物是硅聚合物或聚(氧化丙烯)。
19．权利要求1所述的颗粒，其中的共轭物亲水性结构域是亲水性聚合物。
20．权利要求19所述的颗粒，其中的亲水性聚合物选自聚乙二醇、纤维素、亲水性肽、多糖、聚氧化乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮和聚甲基丙烯酸酯。
21．权利要求20所述的颗粒，其中的亲水性结构域是分子量为约50至约5000的聚乙二醇(PEG)或聚氧化乙烯。
22．权利要求1所述的颗粒，其中的共轭物是DSPE-PEG2000。
23．权利要求1所述的颗粒，其中的共轭物含有至少一种带电荷的脂类。
24．权利要求23所述的颗粒，其中，带电荷的脂类带有净负电荷。
25．权利要求24所述的颗粒，其中，带负电荷的脂类是DOPE-GA。
26．权利要求23所述的颗粒，其中，带电荷的脂类带有净正电荷。
27．权利要求1所述的颗粒，其中的共轭物是共聚物，其结构式如下：HO(CH2CH2O)a(CH(CH3)CH2O)b(CH2CH2O)cH,a和b彼此独立地等于约10至约100的整数，c等于0或是约1至约100的整数。
28．权利要求27所述的颗粒，其中的a和c分别等于约75的整数，b等于约30的整数。
29．权利要求1所述的颗粒，其中的共轭物是甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯。
30．权利要求1所述的颗粒，其粒径最大为约10,000nm。
31．权利要求30所述的颗粒，其粒径为约15nm至约200nm。
32．权利要求1所述的颗粒，其中的疏水性化合物占颗粒的约50摩尔％以上，而共轭物占颗粒的约50摩尔％以下。
33．权利要求32所述的颗粒，其中的疏水性化合物占颗粒的约80摩尔％至约99摩尔％，而共轭物占颗粒的约1摩尔％至约20摩尔％。
34．权利要求1所述的颗粒，其含有：(a)约80摩尔％至约99摩尔％与-C(O)CHBr(CH2)9CH3、-C(O)CHBr(CH2)11CH3或-C(O)CHBr(CH2)13CH3共价连接的紫杉醇；和(b)约1摩尔％至约20摩尔％选自DSPE-PEG2000、DOPE-GA、HO(CH2CH2O)75(CH(CH3)CH2O)30(CH2CH2O)75H和甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯的共轭物，其中，颗粒粒径为约15nm至约200nm。
35．权利要求34所述的颗粒，其含有DSPE-PEG2000和与-C(O)CHBr(CH2)13CH3共轭的紫杉醇。
36．含有权利要求1所述的颗粒以及可药用载体的组合物。
37．对动物施用化合物的方法，该方法包括给动物施用权利要求36的组合物。
38．权利要求37的方法，其中所述动物是人。
39．权利要求37的方法，其中的给药包括口服、静脉内或腹膜内给药。
40．权利要求37的方法，其中的哺乳动物患有选自癌症、炎性疾病和微生物感染的疾病，其中的化合物可以有效地治疗所述疾病，并能以治疗有效量的化合物给药。
41．权利要求40的方法，其中所述疾病是癌症，低亲水性化合物是BrC16-紫杉醇，而共轭物是DSPE-PEG2000。
42．权利要求41的方法，其中颗粒的粒度为至少约15nm至约200nm，所述颗粒含有约80摩尔％至约99摩尔％的BrC16-紫杉醇和约1摩尔％至约20摩尔％的DSPE-PEG2000。
43．权利要求1所述的颗粒，其中的核疏水性化合物是非疏水性化合物的衍生物，所述衍生化合物包括与生物相容性疏水结构域连接的化合物。
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