KR20080009196A

KR20080009196A - 중합체 및 패신저 약물의 마이셀 조성물

Info

Publication number: KR20080009196A
Application number: KR1020077025059A
Authority: KR
Inventors: 글랜 에스 권; 마커스 엘 포레스트
Original assignee: 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
Priority date: 2005-04-12
Filing date: 2006-04-12
Publication date: 2008-01-25
Also published as: JP2008535927A; WO2006110862A2; US20120309780A1; CA2603987A1; WO2006110862A3; EP1871343A2; WO2006110862A9; US8173167B2; AU2006235538A1; US20060251710A1; US9107814B2

Abstract

소수성 약물은 용해도를 증가시키기 위해 마이셀 조성물로 캡슐화됨으로써 치료에 보다 실용적이 된다. 마이셀 조성물은 부형제 토코페롤 및/또는 약물의 전구약물 제형을 포함할 수 있다. 마이셀은 약물이 마이셀에 잔류하는 시간을 연장시켜 약물 순환 시간을 개선시키고, 이에 따라 약물 전달을 개선시킨다. 마이셀 캡슐화를 위한 소수성 약물은 라파마이신, 겔다나마이신 및 파클리탁셀을 포함할 수 있다. 이러한 마이셀 조성물의 투여는 크레모포 EL 또는 트윈 80을 필요로 하지 않아서, 이전에 이러한 약물 투여된 동반되었던 이들 약물과 관련된 심각한 부작용을 피할 수 있다.

Description

중합체 및 패신저 약물의 마이셀 조성물 {MICELLE COMPOSITION OF POLYMER AND PASSENGER DRUG}

본 발명은 일반적으로 마이셀 조성물, 마이셀 제조 방법 및 질병 치료용 약물을 함유하는 마이셀 조성물의 용도에 관한 것이다.

암은 매우 치명적인 질병이다. 다양한 세포독성 화학치료제가 암을 규명하고/하거나 암의 확산을 억제하기 위해 사용되어 왔다. 시스플라틴 및 클로르암부실과 같은 알킬화제는 NDA와 가교되어 세포 분할을 억제한다. 닥티노마이신 및 블레오마이신과 같은 항암 항생제는 DNA와 결합하고, 이에 따라 DNA 분리 및 mRNA 합성을 억제한다. 푸린 및 피리미딘 길항제 및 5-플루오로우라실과 같은 항대사물질은 세포 영양물질을 모방할 수 있어 정상적인 DNA 합성을 억제한다. 파클리탁셀 및 빈블라스틴과 같은 식물체 알칼로이드는 미세소관 형성을 차단함으로써 세포 분할을 차단한다. 캄프토테신, 토포테칸 및 이리노테칸과 같은 토포아이소머라제(topoisomerase) 억제제는 DNA 수퍼코일화(supercoiling)를 억제하고, 전사 및 복제를 차단한다. 암과 같은 질병을 치료하는 데 유효한 효능이 있는 많은 약물은 유용성을 제한하는 불량한 용해성을 갖는다.

라파마이신(rapamycin)은 화학요법, 면역억제, 항재협착, 진균 감염 및 신경성 장애에 적용되는 크고 매우 소수성인 화합물이다. 항암제로서 라파마이신은 일반적으로, 신속하게 가수분해되어 적혈구로 격리되는 에스테르 유사체로서 형성되며, 이로써 종양 부위에서 라파마이신의 효능을 감소시킨다. 라파마이신은 최근 신장 이식 환자를 위한 면역억제제인 라파뮨(Rapamune)(Wyeth-Ayerst)으로서 사용되며, 장기간 임상적으로 안전한 것으로 나타났다. 그러나, 라파마이신은 물에 잘 녹지 않는 약물이며 이에 따라 환자의 약물 투여에 문제점을 갖는다.

겔다나마이신(Geldanamycin) 또한 암의 치료를 포함하는 적용에 사용되는 소수성 화합물이다. 겔다나마이신은 항종양 및 신경성 질환 둘 모두에 사용되는 열쇼크 단백질 억제제로서 공지된 새로운 부류의 화합물 중 하나이다. 작용 방식은 열쇼크 단백질 90(Hsp90)을 억제하고, Hsp90에 강력하게 결합하고(Kd =1.2 μM), 다운스트림 성분과의 상호작용을 억제함으로써 이루어진다. Hsp 90은 다수의 클라이언트 단백질(client protein)의 폴딩(folding), 안정성 및 기능을 담당하는 분자 샤페론(chaperon)이다. Hsp 90의 억제는 많은 암유발성 클라이언트 단백질의 탈안정화 및 궁극적으로 유비퀴틴화(ubiquitination)를 유도한다. 다중 암유발성 단백질을 표적함으로써, 겔다나마이신은 광범위한 종양에 대해 효능이 있을 수 있으며, 약물 내성 극복 기회를 증가시킬 수 있다. 또한, Hsp 90의 억제는 Hsp 70의 상향 조절을 유도하는 데, 이는 알츠하이머병 및 파킨슨병의 플라크 침착의 주 성분인 비정상 tau 종의 형성을 감소시킨다.

파클리탁셀(paclitaxel)은 암의 치료를 포함하는 적용을 갖는 또 다른 소수성 화합물이다. 파클리탁셀은 세포의 성장을 억제하는 항신생물제로 불리우는 약제군에 속한다. 억제는 튜불린(tubulin)의 베타 서브유닛에 결합하여 미소관 기능을 방해함으로써 달성된다. 방해된 미소관은 예를 들어 세포 복제 동안에 염색체 이동에서 있어서 필요한 기능인 분해능이 약해진다. 또한, 연구에 의해 파클리탁셀이 Bcl-2 로 불리우는 아폽토시스(apoptosis) 정지 단백질과 결합하여, 그 기능을 정지시킴으로써 프로그래밍된 세포 치사인 아폽토시스를 유도하는 것으로 나타났다.

모두 다중 상을 지닐 수 있고, 일부는 불안정할 수 있으며 분리되는 경향이있을 수 있는, 에멀젼, 리포좀 또는 마이셀의 형성과 같이 용해성이 불량한 화합물을 용해시키기 위한 다양한 기술이 존재한다.

블록 공중합체를 사용하는 양쪽성 중합체(ABC)를 기재로 하는 마이셀 시스템은 이를 극복하는 약물을 제형하기 위해 사용되어 왔다. 폴리(프로필렌 글리콜) 과 같은 소수성 블록 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)와 같은 친수성 블록으로 이루어진 ABC는 선택적 용매 중에서 마이크로상 분리된 코어/쉘 구조로 집합될 수 있다. PEG-폴리(ε-카프롤락톤)(PEG-PCL) 및 PEG-폴리(아미노산)은 이러한 고분자 마이셀을 형성할 수 있다. 다르게는, PEG-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(PEG-DSPE)와 같은 인지질이 사용되어 이러한 고분자 마이셀을 형성할 수도 있다. 수성 환경에서, 소수성 약물은 마이셀의 소수성 코어로 캡슐화될 수 있어, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 및 코로나(쉘)에 의해 제공되는 수용해성을 지닌다. PEG 코로나에 의해 부여된 나노 치수 및 은폐 성질로 인해, 마이셀은 장기간 순환 능력을 지닐 수 있다. 순환 기간 동안, 마이셀은 점차적으로 약물을 방출시킬 수 있고, 궁극적으로 해리되어 순환으로부터 제거될 수 있다.

부형제 및 보조부형제가 용해성이 불량한 화합물을 용해시키기 위해 사용되어 왔다. 비타민 E 또는 간단히 토코페롤로서 일반적으로 공지된 알파-토코페롤은 공통적인 고리 및 알킬쇄 구조로 인해 많은 용해성이 불량한 약물에 대해 부형제로서 사용되어 왔다. 비타민 E는 살아있는 유기체에 대해 비독성이다. 또한, 토코페놀은 생물학적 막을 안정화시킨다. 그러나, 토코페놀은 물에 용해성이 아니며, 이에 따라 정맥내 용액에서 제한된 유용성을 갖는다.

발명의 요약

마이셀 조성물은 양쪽성 중합체, 소수성 부형제 및 친수성 운반 약물을 포함할 수 있다. 일면에서, 양쪽성 중합체는 PEG-DSPE이다. 또 다른 일면에서, 부형제는 토코페롤이다. 또 다른 일면에서, PEG-DSPE에 대한 토코페롤의 비는 약 0.1 내지 약 3이다.

일면에서, 마이셀 조성물은 양쪽성 중합체 및 라파마이신을 포함한다. 또 다른 일면에서, 마이셀 조성물은 양쪽성 중합체, 라파마이신 및 토코페롤을 지닐 수 있다. 또 다른 일면에서, PEG-DSPE의 농도는 약 1 내지 약 10mM일 수 있으며, 토코페롤의 농도는 약 2 내지 약 20mM일 수 있고, 라파마이신의 농도는 약 0.1 내지 약 1.0mg/ml일 수 있다.

마이셀 조성물은 양쪽성 중합체 및 겔다나마이신을 포함할 수 있다. 겔다나마이신은 소수성 특성이 증가된 겔다나마이신 전구약물일 수 있다.

마이셀 조성물은 양쪽성 중합체 및 파클리탁셀을 포함할 수 있다. 파클리탁셀은 소수성 특성이 증가된 파클리탁셀 전구약물일 수 있다.

마이셀 조성물을 형성시키는 방법은 양쪽성 중합체, 소수성 부형제 및 소수성 약물을 유기 용매와 혼합하여 용액을 형성시키고, 이 용액으로부터 유기 용매를 실질적으로 전부 제거하여 실질적으로 용매를 함유하지 않는 혼합물을 잔류시키고, 용매-부재 혼합물을 물 또는 완충액에 재현탁시키는 것을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 방법은 상기 용액으로부터 유기 용매를 실질적으로 전부 제거하기 전에 실질적으로 물 용액에 상기 용액을 첨가하여 실질적으로 용매-부재 혼합물이 되게 하는 것을 포함할 수 있다.

이러한 방법 및 형성되는 전구약물 조성물은 소수성 약물의 마이셀 캡슐화 효능을 개선시키기 위한 것이다. 또 다른 일면에서는, 캡슐화를 위한 겔다나마이신 전구약물을 제조하기 위한 방법이 제공된다. 또 다른 일면에서는, 캡슐화를 위한 파클리탁셀 전구약물을 제조하기 위한 방법이 제공된다.

사람 또는 동물의 질병 또는 질환을 치료하는 방법은 양쪽성 중합체, 소수성 부형제 및 소수성 운반 약물을 포함하는 유효량의 마이셀 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.

도 1은 소수성 코어 및 친수성 코로나를 포함하는, 약물 전달을 위한 마이셀 구조를 보여주는 개략도이다.

도 2는 소수성 상호작용을 통해 임계 마이셀 농도를 초과하는 유니머(unimer)에 의한 마이셀 형성을 묘사한 개략도이다.

도 3은 마이셀 농도의 함수로서 극성을 나타내는 그래프이다.

도 4는 정맥내 투여되는 마이셀과 누출 맥관계로 인한 종양에 의한 흡수를 보여주는 개략도이다.

도 5는 PEG-DSPE의 구조를 도시한 것이다.

도 6은 PEG-PCL의 구조를 도시한 것이다.

도 7은 PEG-DSPE로의 토코페롤 도입을 보여주는 개략도이다.

도 8은 토코페롤의 구조를 도시한 것이다.

도 9는 라파마이신의 구조를 도시한 것이다.

도 10은 겔다나마이신의 구조를 도시한 것이다.

도 11은 파클리탁셀의 구조를 도시한 것이다.

도 12는 PEG-DSPE 마이셀의 농도의 함수로서 상이한 토코페롤에 대한 PEG-DSPE 비에서의 임계 마이셀 농도의 그래프를 보여준다.

도 13은 토코페롤에 대한 PEG-DSPE 비의 함수로서 상대적 코어 점도의 막대 그래프이다.

도 14는 다양한 토코페롤에 대한 PEG-DSPE 비의 함수로서 코어내 응집체 수가 증가하는 것을 보여주는 막대 그래프이다.

도 15는 시간의 함수로서 인산염 완충염수 및 4% 소혈청 알부민 중에서의 PEG-DSPE 마이셀의 안정성을 보여주는 그래프이다.

도 16은 시간의 함수로서 4% 소혈청 알부민 중에서의 PEG-PCL 마이셀의 안정성을 보여주는 그래프이다.

도 17은 시간의 함수로서 4% 소혈청 알부민 중에서의 PEG-DSPE 마이셀의 안정성을 보여주는 그래프이다.

도 18은 다양한 토코페롤에 대한 PEG-DSPE 비 및 PEG-DSPE 농도에 대한 PEG-DSPE 마이셀의 코어 극성을 보여주는 그래프이다.

도 19는 1:2, 1:1의 PEG-DSPE: 토코페롤 비 및 토코페롤 비함유에 대한, 양쪽성 중합체에 대한 라파마이신의 비의 함수로서 확산-증발에 의한 라파마이신 로딩 효율을 보여주는 그래프이다.

도 20은 PEG-DSPE 마이셀을 형성하는 방법의 개략도이다.

도 21은 중합체 마이셀을 형성하는 적가 방법의 개략도이다.

도 22는 양쪽성 중합체에 대한 라파마이신의 비의 함수로서 마이셀의 라파마이신 로딩 효능을 보여주는 그래프이다.

도 23은 상이한 소혈청 알부민 농도에서 시간의 함수로서 알루민의 존재 하에서의 라파마이신 방출을 보여주는 그래프이다.

도 24는 혈청 알부민, 피브리노겐, 및 소췌장 트립신 억제제의 PEG-DSPE 마이셀과의 상호작용을 보여주는 막대 그래프이다.

도 25는 토코페롤 도입이 형성되는 마이셀의 크기에 어떠한 영향을 미치는 지를 보여주는 막대 그래프이다.

도 26은 크기 배제 크로마토그래피를 통한 마이셀내 라파마이신의 도입을 보여주는 그래프이다.

도 27은 단시간 동안 구로부터 픽키안(Fickian) 확산에 근거하여 방출 속도를 분석한 것이다.

도 28은 인산염 완충 염수 용액 중 PEG-DSPE 마이셀로부터의 라파마이신의 방출에 대한 토코페롤의 영향을 보여주는 그래프이다.

도 29는 4% 소혈청 알부민 중 PEG-DSPE 마이셀로부터의 라파마이신의 방출에 대한 토코페롤의 영향을 보여주는 그래프이다.

도 30은 토코페롤의 존재 하에서의 PEG-PCL 마이셀의 안정성을 보여준다.

도 31은 인산염 완충 염수 중 시간의 함수로서 도입된 토코페롤의 갖는 PEG-PCL 마이셀로부터의 라파마이신의 방출을 보여주는 그래프이다.

도 32는 4% 소혈청 알부민 중 시간의 함수로서 도입된 토코페롤의 갖는 PEG-PCL 마이셀로부터의 라파마이신의 방출을 보여주는 그래프이다.

도 33은 정맥내 투여 후 전혈내 라파마이신 대조군 제형 성향을 보여주는 그래프이다.

도 34는 정맥내 투여후 전혈내 라파마이신 PEG-PLC 제형 성향을 보여주는 그래프이다.

도 35는 정맥내 투여후 전혈내 라파마이신 PEG-PCL +α-토코페롤 제형 침착을 보여주는 그래프이다.

도 36은 정맥 투여 1분 후에 라파마이신 대조군 제형, 라파마이신 PEG-PCL, 라파마이신 PEG-PCL + α-토코페롤 제형에 대한 혈장 또는 적혈구내 라파마이신 농도를 보여주는 막대 그래프이다.

도 37은 정맥 투여 1분 후에 라파마이신 대조군 제형, 라파마이신 PEG-PCL, 라파마이신 PEG-PCL + α-토코페롤 제형의 혈장/RBC 비를 보여주는 막대 그래프이다.

도 38은 정맥 투여 12시간 후에 라파마이신 대조군 제형, 라파마이신 PEG-PCL, 라파마이신 PEG-PCL + α-토코페롤 제형에 대한 혈장 또는 적혈구내 라파마이신 농도를 보여주는 막대 그래프이다.

도 39는 정맥 투여 12시간 후에 라파마이신 대조군 제형, 라파마이신 PEG-PCL, 라파마이신 PEG-PCL + α-토코페롤 제형의 혈장/RBC 비를 보여주는 막대 그래프이다(N=4 평균 ± SEM).

도 40은 겔다나마이신의 표적을 보여주는 개략도이다(박스로).

도 41은 겔다나마이신 및 겔다나마이신 전구약물의 특성을 보여준다.

도 42는 겔라나마이신의 마이셀로의 로딩율을 보여준다.

도 43은 겔다나마이신의 지방산 전구약물의 제형을 보여준다.

도 44는 상이한 겔다나마이신 전구약물의 친지성 및 로딩율을 보여준다.

도 45는 겔다나마이신의 C17 위치에 지방산을 첨가하는 개략적인 방법을 보여준다.

도 46은 겔다나마이신-C17-아미노-헥사데칸을 형성하는 개략적인 방법을 보여준다.

도 47은 겔다나마이신-C17-아미노에틸-2-이소프로필헥사데카노에이트를 형성하는 개략적인 방법을 보여준다.

도 48은 겔다나마이신-C17-아미노에틸로네이트-Phe-Leu-Phe-아민을 형성하는 개략적인 방법을 보여준다.

도 49는 겔다나마이신-C17-아미노에틸리덴-팔미토히드라지드를 형성하는 개략적인 방법을 보여준다.

도 50은 PE0-β-PEGA를 형성하는 개략적인 방법을 보여준다.

도 51은 시간에 따른 겔다나마이신 전구약물의 방출을 보여주는 그래프이다.

도 52는 마이셀내 겔다나마이신 전구약물의 캡슐화 및 시간에 따른 방출을 보여주는 챠트 및 그래프이다.

본 발명에 따르면, 양쪽성 중합체, 소수성 부형제 및 소수성 패신저 약물이 마이셀 조성물을 형성할 수 있다. 이러한 조성물을 제조하는 방법 또한 본 발명의 범위의 일부이다. 또한, 이러한 마이셀을 이용하여 질병 또는 질환을 치료하는 방법이 본 발명의 범위의 일부이다. 토코페롤이 도입된 마이셀은 마이셀의 약물 로딩 능력을 증가시킬 수 있으며, 또한 생체내 조건 동안에 마이셀의 안정성을 증가시킬 수 있다. 라파마이신은 다양한 고형 종형을 포함하는 많는 종양 이종이식 모델에 대해 나노몰 범위에서 강한 활성을 입증하는 약물이다. 본 발명의 일면에서, 라파마이신의 낮은 용해성은 표적 종양 부위에 전달하기 위한 마이셀 조성물에 라파이신을 도입시킴으로써 극복될 수 있다.

1.0 마이셀

크레모포어(Cremophor) EL 및 트윈(Tween) 80과 같은 비이온성 계면활성제가 암 치료의 정맥내 투여를 위해 사용될 수 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 마이셀은 코어-쉘 형태를 갖는 초분자 구조이다. 마이셀 형성은 엔트로피 유도된다[도 2 참조]. 물 분자는 벌크 상으로 축출된다. ΔG_mic = RTln(CMC) 는 마이셀의 형성을 알려준다. 임계 마이셀 농도(CMC)를 초과하는 경우, 양쪽성 유니머는 구조화된 마이셀로 응집된다. 중합체 마이셀은 구체이고, 일반적으로 20 내지 100nm 범위의 나노 치수를 가질 수 있다. 이는 순환하는 입자가 비장에서의 내피간 세포 슬릿에 의해 여과되는 것을 피하기 위해 약 200nm 보다 작아야 하기 때문에 유리하다. 고분자 마이셀은 오랜 기간 동안 혈액 중에서 순환하고, 수용해성이 불량한 화합물의 표적화된 전달을 가능하게 할 수 있는 것으로 나타났다. 해리시, 마이셀 유니머는 일반적으로 50,000g/mol 미만이며, 이는 신장에 의한 제거를 허용한다. 이상적으로, 이는 저장 질환으로 유도할 수 있는 간내 마이셀 성분의 축적 없이 장기간 순환을 가능하게 한다.

1.1 양쪽성 중합체

수용해성이 불량한 약물을 캡슐화시킬 수 있는 중합체는 페길화된 인지질 및 페길화된 폴리-ε-카프롤락톤을 포함한다. 이들 중합체는 광범위한 화합물에 대해 높은 생체적합성 및 용해 능력을 나타낸다. α-토코페롤과 같은 보조부형제는 사실상 이들 중합체로부터 형성된 마이셀의 약물 로딩 능력을 증가시킬 수 있으며, 이전에 존재하는 중합체 담체에 의해 부적합하거나 불량하게 용해되는 것으로 간주된 잠재적 약물 후보의 용해를 가능하게 할 수 있다.

양쪽성 중합체는 일반적으로 친화성 도메인, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 소수성 도메인, 예컨대 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리(L-아미노산), 폴리(에스테르), 및 인지질로 구성된다. 이들 중합체는 작은 소수성 화합물 및 친수성 외부를 캡슐화시킬 수 있는 소수성 내부를 갖는 고도로 정렬된 초분자 코어-쉘 구조인 고분자 마이셀로 집합될 수 있다. 도 3에 도시된 바와 같이, 마이셀 코어는 낮은 극성을 가지며, 소수성 환경이다. 소수성 화합물에 대해 높은 코어 능력이 있다. 약 4:1까지의 약물:중합체 로딩이 가능할 수 있다. 마이셀 코어는 약 30,000배까지 용해도를 증가시킬 수 있다. 마이셀 코로나는 친수성이다.

중합체 마이셀은 오랜 기간 동안 혈액 중에 순환하는 것으로 나타났으며, 수용해성이 불량한 화합물의 표적화된 전달을 가능하게 할 수 있다. 실시예 1은 독소루비신 및 파클리탁셀과 같은 약물이 마이셀로 캡슐화되어 종양에 대해 표적화될 수 있음을 예시하고 있다.

마이셀 조성물의 주요 이점으로는 저장 및 운반의 용이성이 포함되어, 조성물이 동결건조되어 정맥내 투여 전에 재구성될 수 있다. 이는 약물 침전 및 색전증 유발 위험성을 낮춘다. 마이셀 조성물은 오랜 혈액 순환, 낮은 단핵탐식세포 흡수율, 및 낮은 수준의 신장 배설을 가능하게 한다. 또한, 마이셀 조성물은 증진된 투과성 및 보유율(EPR)을 가져 화학치료제의 종양 도달 가능성을 증대시킨다. 도 4에 도시된 바와 같이, 종양은 높은 혈관 밀도 뿐만 아니라 결함성 맥관계를 가져 많은 혈관외유출이 일어난다. 손상된 림프 클리어런스(clearance)가 존재할 수 있다. 엔도시토시스(endocytosis) 및 이후의 약물 방출은 종양에 대한 화학치료제의 효과를 증가시킨다.

초기 연구는 약물 용해화에 대해 PEG-DSPE(도 5) 및 블록 공중합체 및 PEG-PCL(도 6)에 대해 집중되었다. PEG-DSPE는 두 화학치료제에 대해 안전하고, 효과적인 마이셀 담체일 수 있다. PEG-PCL은 생분해성이고, 생체적합성을 지닐 수 있다.

중성 PEG-DSPE와 음하전된 PEG-DSPE 막 간의 근본적인 차이점은 두개의 하전된 막 간의 정전기적 힘에 있다. 막전하는 하전된 막 및 중성 막에 대해 산성 및 염기성 단백질의 흡착에 영향을 미친다. 이는 이층을 갖는 다양한 단백질의 상호작용을 변경시킬 수 있다. 이러한 차이점은 중성 대 하전된 리포좀의 옵소니제이션(opsonization) 및 식균작용에서의 차이의 원인이 될 수 있다. PEG-DSPE의 소수성 헤드에서의 인산염기는 정전기적 반발력으로 인해 코어-물 경계면에서 PEG-PSPE의 긴장성(tightness)에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 이러한 하전 특성은 단백질이 PEG 코로나를 관통해야 하는 소수성 코어와의 단백질 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. 토코페롤(도 7)은 인지질 헤드 기 사이에 끼어있는 것으로 나타났으며, 토코페롤의 헤드에서 고리-구조는 또한 단백질 통과 및 상호작용을 억제할 수 있[도 8 참조]. 또한, 토코페롤 헤드 기 및 히드록실기는 항산화제로서 작용하는 것으로 나타났으며, 인지질 층의 단백질 차단을 억제할 수 있다. PEG-b-PCL은 생체적합성이며 생분해성일 수 있다. PEG-b-PCL은 낮은 임계 마이셀 농도(CMD)를 가질 수 있다. 약 5:6의 PEG:PCL 비는 약 0.5μM 이하의 CMC를 가질 수 있다. PEG-PCL은 알부민의 존재 하에서 안정할 수 있으며, 강성 코어 구조를 가질 수 있다.

중합체 마이셀 조성물의 선택은 표적 약물 화합물과 담체의 소수성 코어 간의 구조적 관계에 크게 의존할 수 있다. 토코페롤의 사용은 마이셀의 코어 특성을 개질시켜, 그렇지 않을 경우 조사중인 마이셀에 불량하게 용해되는 약물의 보다 높은 로딩을 유도할 수 있다.

2.0 패신저 화합물

본 발명에 따르면, 약물은 중합체 담체 중의 패신저 화합물일 수 있다. 이러한 약물은 라파마이신(도 9), 겔다나마이신(도 10), 및 파클리탁셀(도 11)을 포함한다. 이들 약물은 특이한 표적 작용을 갖는 효능있는 소분자 화학치료제이다. 이들 화합물의 연구 및 임상 제품의 개발은 이들의 극히 낮은 수용해성(예를 들어 라파마이신은 약 2.6μg/ml이고, 겔다나마이신은 약 1.5μg/ml)에 의해 방해받아 왔다. 마이셀 구조로의 상기 중합체 화합물 및 통합되는 토코페롤의 조합을 사용함으로써, 약 5mg/ml 이하의 라파마이신(안정성에 있어서 1900배 증가), 및 약 500μg/ml 이하의 겔다나마이신(300배 증가)이 도입되는 이들 화합물의 안정한 마이셀 용액이 달성되었다. 또한, 겔다나마이신 또는 파클리탁셀의 전구약물 사용은 용해도를 상당히 증가시킨다.

이들 화합물의 화학치료제로서의 전망은 시험관내 및 생체내 종양 모델로 추가의 평가를 받을만한 가치가 있다. 인지질 및 폴리-카프롤락톤/토코페롤 시스템을 사용하는 이러한 화합물의 성공적인 제형은 다른 용해되기 어려운 약물 화합물에 대해 적용하는 것에 대해 조사해 볼 만한 가치가 있다.

중합체 마이셀 담체의 선택은 표적 패신저 약물 화합물과 담체의 소수성 코어 간의 구조적 관련성에 크게 의존할 수 있다. 3% 미만(w/w)의 파클리탁셀이 PEG-PCL 마이셀에 로딩될 수 있다. 그러나, PEG-폴리(D,L-락타이드) 마이셀은 20%(w/w) 초과의 로딩 용량을 갖는다. 그러므로, 중합체 마이셀 담체의 조건은 목적하는 패신저 화합물을 로딩하도록 최적화되어야 한다.

2.1 라파마이신

보조 용매, 예를 들어 에탄올 또는 폴리에틸렌 글리콜을 사용하지 않고 정맥내 전달을 위한 이들 화합물, 특히 라파마이신의 제형은 치료적 용도를 허용한다. 마이셀 담체의 사용은 화학적 개질 없이 이러한 약물의 치료적 용량을 전달할 수 있게 한다. 또한, 마이셀 전달은 EPR 효과를 통해 종양에 대한 표적화된 치료를 가능하게 하여, 면역억제 가능성, 유리된 라파마이신의 부작용 및 이의 수용해성 유도체를 감소시킨다.

라파마이신(도 9)은 화학치료, 면역억제, 항재협착, 진균 감염 및 신경성 장애, 예를 들어, 알츠하이머병 및 헌팅톤 병에 있어서 적용성을 갖는 크고, 고도로 소수성인 화합물이다. 라파마이신은 이뮤노필린 FKBP12와 결합하고, 포유동물의 라파마이신 표적(mTOR) 경로를 억제하여 세포 사이클 G₁의 S로의 상 전이를 억제하는, 특이적인 표적 작용을 갖는다. 라파마이신은 림프구 백혈병, 흑색암, 뇌실막모세포종, 및 일반적으로 10^-8M의 IC₅₀을 갖는 여러 고형 종양을 포함하는 광범위한 사람 종양 이종이식 모델에 대해 강한 활성이 입증되었다.

신규 메커니즘은 FK506-12에 결합하는 라파마이신을 가질 수 있으며, 여기에서 라파마이신은 mTOR 성장 조절제를 억제하고, G₁의 S로의 상 전이를 억제하고, NF-kB를 억제하고, 아폽토시스를 증진시킨다.

불행하게도, 라파마이신은 실질적으로 물에 불용성(약 2.6μg/ml)이고, 이온화기를 전혀 갖지 않는다. EPR 효과를 사용하여, 라파마이신의 종양 부위로의 표적화된 전달 및 보유는 실질적으로 그 효능을 증대시킬 수 있다. 또한, 표적화된 전달은 면역억제를 포함하는 라파마이신 치료의 부작용을 약화시킬 수 있다. 라파마이신의 원래의 소수성 특성의 보유는 개질화(수용해성을 증가시키는)가 혈뇌장벽의 통과를 방해할 수 있는 신경학적 적용에 중요할 수 있다.

중합체 마이셀을 사용함으로써 라파마이신은 임상적 편의를 위해 요구되는 범위내에서 충분히 다량으로 용해될 수 있다. 라파마이신은 토코페롤이 첨가되는 PEG-PCL 및 PEG-DSPE 마이셀을 사용함으로써 용해된다. 결과가 실시예 2에 요약된다.

2.2 겔다나마이신

겔다나마이신(도 10)은 항종양 및 신경성 질환 적용 둘 모두를 갖는 열쇼크 단백질 억제제로서 공지된 새로운 부류의 화합물중 하나이다. 작용 방식은 열쇼크 단백질 90(Hsp 90)을 억제하고, Hsp 90과 강하게 결합하여(Kd = 1.2μM), 다운스트림 성분과의 상호작용을 억제하는 것이다. 이는 이어서 광범위한 종양유전자 클라이언트 단백질의 유비퀴틴화 및 이들 단백질의 이후의 분해를 유도한다.

Hsp90 억제제는 라파마이신 내성 종양에서와 같은 상이한 경로를 유도함으로써 약물 내성 암에 유용할 수 있다. 겔다나마이신과 같은 Hsp90 억제제의 유망함에도 불구하고, 이러한 치료법의 임상적 진전이 적합한 제형의 결핍으로 인하여 늦추어져 왔다. Hsp90 억제제인 라디시콜(radicicol) 또한 생체내 불안정하다. 겔다나마이신은 극히 불량한 수용해성을 지니며, 생체내 간독성이다(MTD dog < 100mg/m²). 17-AAG와 같은 겔다나마이신 전구약물은 보다 우수한 용해도를 가지고, 보다 낮은 간독성을 가지나(MTD dog 500mg/m²), 여전히 제형화하기 어렵고 크레마포(Cremaphor), 트윈 80 및 DMSO와 같은 독성 부형제를 필요로 한다. 17DMAG(MTD dog 8mg/m²)과 같은 겔다나마이신의 수용성 전구약물은 이러한 제형화 문제점을 피할 수 있으나, 이들 전구약물의 넓은 생체분포 및 증가된 독성은 추가의 문제점은 제공할 수 있다.

임상적 제형을 위해, 약 1mg/ml 이상의 용해도가 바람직할 수 있다. 상 I 결과는 17-AGG에 대해 투여 제한적이 되는 GI 독성을 발견하였고, 제안된 상 II 투여량은 40mg/m²이다. 사전임상 시험에서는 모화합물인 겔다나마이신(4mg/kg)에 대해 투여 제한적이 되도록 하는 심각한 간독성을 발견하였다.

다수의 종양유전자 단백질을 표적화함으로써, 겔다나마이신은 광범위한 종양에 대한 효능이 유망하고, 약물 내성을 극복할 가능성을 증가시킨다. 또한, Hsp90의 억제는 Hsp70의 상향조절을 유도하는 데, 이는 알츠하이머병 및 파킨슨병에서 플라크 침착의 주 성분인 비정상 tau 종의 형성을 감소시킨다.

겔다나마이신의 극히 낮은 수용해성(약 1.5μg/ml)로 인해, 제형은 17-AAA와 같은 다양한 가용성 유사체를 사용하여 왔다. 라파마이신과 같이, 겔다나마이신의 종양 부위로의 표적화된 전달 및 EPR 효과는 그 효능을 실질적으로 증가시키는 것으로 기대된다. 또한, 늘어난 순환 시간 및 감소된 간 체류는 간독성을 극적으로 감소시킨다. 끝으로, 신경성 질환에서의 치료제로서 겔다나마이신의 가능한 진전에는 혈뇌 장벽을 통과하기 위해 가용성 유사체 중에서 약화되는 모화합물의 높은 소수성 특성이 필요할 것이다.

2.3 파클리탁셀

파클리탁셀은 암 치료를 포함하는 적용을 갖는 또 다른 소수성 화합물이다. 파클리탁셀은 세포 성잘을 억제하는 소위 항신생물제로 불리우는 약제군에 속한다. 억제는 튜불린의 베타 서브유닛에 결합함으로써 미세관 기능을 방해함으로써 달성된다. 방해된 미세관은 예를 들어 세포 복제 동안에 염색체 이동에 있어서 필요한 기능인 분해능을 약화시킨다. 또한, 연구에 의해 파클리탁셀이 Bcl-2 로 불리우는 아폽토시스 정지 단백질과 결합하여, 그 기능을 정지시킴으로써 프로그래밍된 세포 치사인 아폽토시스를 유도를 하는 것으로 나타났다.

3.0 부형제

다성분 부형제가 수용해성이 불량한 성분이 제 2 부형제 또는 보조 용매를 함께 첨가하여 약물 화합물을 용해시키는 약물 제형에 사용될 수 있다. 고분자 마이셀의 용해력 및 안정성은 마이셀 유니머에 의해 형성된 소수성 마이셀 코어 및 로딩된 약물 둘 모두에 고도로 적합성을 갖는 보조 부형제를 포함함으로써 증진될 수 있다.

다성분 부형제는 수용해성이 불량한 성분이 제 2 부형제 또는 보조용매를 함께 첨가하여 약물 화합물을 용해시키는 약물 제형, 예를 들어, 벤조산, 타르타르산, 및 수산화나트륨을 함유하는 리스페리돈 경구 제형에 사용될 수 있다. 고분자 마이셀 조성물의 용해력 및 안정성은 마이셀 유니머에 의해 형성된 소수성 마이셀 코어 및 로딩된 약물 둘 모두에 고도로 적합성을 갖는 보조 부형제를 포함함으로써 증진될 수 있다.

부형제는 높은 Po/w, 바람직하게는 약 3.5 초과, 및 낮은 분자량, 바람직하게는 1000Da 미만을 가질 수 있다. 부형제는 생체적합성을 개선시킬 수 있으며, 약물-담체 적합성을 증진시키거나, 담체로부터 약물 로딩 및 방출 시간을 증대시킬 수 있다.

3.1 토코페롤

가장 보편적인 이성질체 토코페롤인 알파-토코페롤의 고리 및 알킬쇄 구조(도 7)는, 약물을 제형하는 데 많은 어려움이 있는 부형제로서의 토코페롤의 오랜 역사로 인해, 많은 용해성이 불량한 약물과 공통되는 특징이다. 또한, 토코페롤은 마이셀 구조로의 개질화제일 수 있다. DEP-DSPE 및 PEG-PCL마이셀의 약물 로딩 능력은 토코페롤의 첨가에 의해 현저히 증진된다[실시예 2 참조].

또한, 토코페롤의 포함은 마이셀의 안정성을 증진시킬 수 있다. 예를 들어, PEG-DSPE 마이셀은 약 4g/ml 이하의 라파마이신으로 형성될 수 있으며, 마이셀은 신속하게 "붕괴"되어 약물이 용액으로부터 벗어나게 한다(일반적으로 2시간 미만). 토코페롤이 도입된 동일한 마이셀은 적어도 7일 동안 안정하다[실시예 3 및 6 참조]. 임계 마이셀 농도는 마이셀 조성물로의 토코페롤의 도입을 증가시키고, 이에 따라 마이셀 조성물의 동역학적 안정성을 증가시킨다[도 13 참조].

토코페롤의 피톨 사슬은 인지질 아실 사슬 사이에 끼어 있다. 상이 0.2:1 초과의 토코페롤:인지질 비를 갖는 경우, 이 상은 토코페롤 풍부상이다. 도 8은 PEG-DSPE 사슬 사이의 토코페롤 도입을 보여준다. 토코페롤 도입은 분리된 토코페롤 상의 형성을 초래한다. 혼합된 아실 및 피톨 사슬의 이동성은 토코페롤 도입 이후에 감소된다. 마이셀 조성물 안정성에 대해 중합체의 동력학적 분포가 존재한다. 마이셀 유니머 교체율은 매우 점성이거나 강성인 코어의 경우에 느리다. 감소된 코어 점성 또는 강성은 패신저 약물의 확산율을 증가시킬 수 있다. 도 13은 코어 강성 데이터를 보여준다. PEG-DSP에 대한 토코페롤의 비가 증가함에 따라, 코어 강성은 일반적으로 감소한다. 토코페롤의 첨가에 의해 영향받는 소수성 코어 크기에서 증가는 약물 확산율을 조절할 수 있다. 증가된 코어 크기는 약물이 추가의 거리를 이동할 수 있게 하지만, 낮아진 점성 코어는 약물의 이동을 보다 빠르게 한다. 토코페롤과 약물 간의 최적화된 상호작용이 있지 않을 경우, 확산은 느려질 수 있다. 마이셀 조성물로의 토코페롤 및 약물 도입은 마이셀의 크기에 영향을 끼치고, 이에 따라 종양 부위에서의 혈관외 유출에 영향을 미칠 수 있다[실시예 9 및 14 참조]. 도 15에 도시된 바와 같이, PEG-DSPE 마이셀은 인산염 완충 염수 용액에서 안정하지만 대략 생체내 조건인 4% 소혈청 알부민 중에서는 불안정하다. 도 16은 PEG-PCL이 4% 알부민 혈청에서 안정하다는 것을 보여준다. 도 17에 도시된 바와 같이, 토코페롤이 도입된(토코페롤: PEG-DSPE가 약 2:1의 비로) PEG-DSPE 마이셀 조성물은 약 25시간 동안 4% 소혈청 알부민 중에서 약 60% 용해된 상태로 머무른다[실시예 6 참조].

실시예 3에서 알 수 있는 바와 같이, 임계 마이셀 농도(CMC)는 토코페롤의 마이셀 조성물로의 도입시에 증가한다. 마이셀 조성물은 10^-6 내지 10^-5M PEG-DSPE에서 형성된다. PEG-DSPE:토코페롤 비 및 CMC에 대한 영향이 실시예 3에 기술된다.

도 18에 도시된 바와 같이, 토코페롤이 도입된 마이셀 조성물의 코어 극성은 토코페롤의 비율에 따라 달라진다. 코어 극성은 보다 많은 토코페롤이 도입될 경우 감소한다.

라파마이신 및 토코페롤은 둘 모두 매우 소수성이고, 유사한 구조적 성분을 지닌다. 둘 모두 고리 구조 및 긴 알킬쇄를 갖는다. 둘 모두 마이셀 조성물내 약물 도입의 안정성을 증가시킬 수 있다.

도 19에 도시된 바와 같이, 라파마이신 로딩 효율은 PEG-DSPE에 대한 라파마이신의 모든 비에서 토코페롤의 도입시 증가한다. PEG-DSPE에 대한 토코페롤의 가장 효과적인 비는 약 2 및 약 4이며, 두 비 모두 약 25%의 로딩 효율을 유도한다.

4.0 마이셀 및 약물 도입의 결과

토코페롤은 PEG-DSPE 및 PEG-PCL 마이셀의 구조 및 특성에 영향을 미칠 수 있다. 간략하게 기재하면, PEG-DSPE₂₀₀₀ 마이셀은 루키아노브(Lukyanov) 등의 용매 필름 방법에 따라 제조되는데(도 20에 요약되어 있음), 여기에서, 인지질, 첨가제 및 약물이 유기 용매에 용해되고, 증발되어 건조 필름을 생성하고, 마이셀이 물의 첨가에 의해 형성된다. 이후, 마이셀은 여과되고/되거나 원심분리되어 비도입 약물 응집체를 제거하고, 약물 도입이 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 검증된다. 이 과정에서 사용된 PEG-DSPE₂₀₀₀은 약 1mM 내지 약 20mM, 바람직하게는 약 1.5mM 내지 약 10mM, 매우 바람직하게는 약 5mM의 농도를 가질 수 있다. 이 과정에서 사용된 토코페롤은 약 1mM 내지 약 20mM, 바람직하게는 약 2mM 내지 약 15mM, 매우 바람직하게는 약 10mM의 농도를 가질 수 있다. 유기 용매에 용해된 인지질, 첨가제 및 약물은 약 50rpm 내지 약 200rpm, 바람직하게는 약 70rpm 내지 약 150rpm, 매우 바람직하게는 약 100rpm으로 회전될 수 있다. 용매는 약 1 내지 약 500μbar, 바람직하게는 약 5 내지 약 200μbar, 매우 바람직하게는 약 10 내지 약 100μbar에서 진공에 의해 제거될 수 있다.

도 21에 기술된 바와 같이, PEG-PCL 마이셀은 또한 혼화성 용매인 아세톤에 용해된 PEG-PCL 및 약물을 격렬하게 교반된 물에 적가하고, N₂ 퍼어지에 의해 용매를 제거하고, 0.2μm 여과 및/또는 원심분리에 의해 제조된다. 물에 대한 용매의 최종 비는 약 0.1 내지 약 5, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 4, 매우 바람직하게는 약 2이다. 마이셀 용액은 약 2s/점적 내지 약 60s/점적, 바람직하게는 약 5s/점적 내지 약 30s/점적, 보다 바람직하게는 약 10s/점적 내지 약 20s/점적의 속도로 전달되어야 한다.

도 22에 도시된 바와 같이, 용매 필름 방법에 의한 라파마이신 로딩은 약 2:1의 라파마이신 대 PEG-DSPE 비에서, 약 30% 내지 약 50%, 바람직하게는 약 32% 내지 약 47%, 보다 바람직하게는 약 40%의 로딩 효율을 갖는다. 2:1의 비에서 라파마이신의 중량%는 약 10% 내지 약 40%, 바람직하게는 약 15% 내지 약 30%, 보다 바람직하게는 약 20%이다.

도 23에 도시된 바와 같이, 라파마이신은 생체내 조건 하에서 유리 약물과 비교하여 마이셀 조성물에 로딩되는 경우에 보다 오랜 기간 동안 안정하게 머무른다. 도 24에 도시된 바와 같이, PEG-DSPE는 사람 혈청 알부민의 존재 하에서 불안정하다.

4.1 토코페롤 도입에 의한 마이셀 조성물의 특성

토코페롤은 페길화되지 않은 DSPE 마이셀에 대한 연구에 기초하여 기대되는 바와 같이 PEG-DSPE의 코어 구조를 변경시킨다. 실시예 3에 기재된 바와 같이, 2:1 이하의 몰비의 토코페롤 대 PEG-DSPE2000 마이셀의 첨가는 임계 마이셀 농도(CMC)를 2.1μM에서 28μM로 증가시키나, 이러한 CMC 범위는 계속해서 매우 안정한 마이셀을 나타내는 것이다. 유사하게, PEG-PCL 마이셀은 10 및 20:1 비의 토코페롤 대 PEG-PCL 유니머의 비에서 매우 낮은 CMC를 유지한다. 도 18에 도시된 바와 같이, 토코페롤 도입은 코어 극성을 감소시키고, 친지성 분자의 로딩을 증가시킬 수 있다.

토코페롤의 첨가는 PEG-DSPE로 형성된 마이셀의 크기를 증대시키지 않는다. 이는 토코페롤의 알킬쇄로의 도입과 소수성 코어의 최소 팽윤화에 기인될 수 있다(실시예 6). 그러나, PEG-PCL 마이셀은 토코페롤의 첨가시에 크기가 증가한다. 도 25에 도시된 바와 같이, 토코페롤 도입은 마이셀 조성물의 크기에 현저히 영향을 미치지 않는다. 도 14에 도시된 바와 같이, 도입되는 응집체 수의 증가는 또한 코어의 크기 증대를 반영한다. 0.5의 지질에 대한 토코페롤의 비에서, 응집체 수의 변화는 통계적으로 중요시된다. 이는 부분적으로는 토코페롤이 PEG-PCL 마이셀에 보다 많이 로딩한 것에 기인할 수 있다.

4.2 토코페롤 및 패신저 약물의 도입에 의한 마이셀 특성

라파마이신 또는 겔다나마이신은 다양한 양의 토코페롤과 함께 PEG-DPSE 및 PEG-PCL 마이셀에 로딩될 수 있다[실시예 1 참조]. 도 26에 도시된 바와 같이, 라파미이신은 PEG-DSPE 마이셀에 로딩될 수 있다. 라파미이신의 로딩은 PEG-DSPE 및 PEG-PCL 마이셀로의 토코페롤의 첨가에 의해 약 2 내지 약 7배, 바람직하게는 약 4 내지 약 6배, 보다 바람직하게는 3배 이상 증가될 수 있다. 또한, 토코페롤의 부재 하에서, 침전은 1-4시간 후에 관찰될 수 있는 데, 이는 토코페롤이 약물 로딩된 PEG-DSPE 마이셀의 안정성을 증가시킬 수 있음을 나타낸다[실시예 10 참조]. 토코페롤은 PEG-DSPE 마이셀로의 겔다나마이신의 로딩을 약 1 내지 약 4배, 바람직하게는 약 1 내지 약 3배, 보다 바람직하게는 약 2배 증가시켰으며, PEG-PCL 마이셀로의 겔다나마이신의 로딩을 약 7 내지 약 15배, 바람직하게는 약 8 내지 약 12배, 보다 바람직하게는 약 10배 증가시켰다.

사람 신체는 완벽한 싱크(sink)와 같다. 도 27에 도시된 바와 같이, 픽키안확산을 위한 크랭크(Crank) 용액은 마이셀 조성물로부터 약물의 확산을 알려준다.

토코페롤의 이점은 겔다나마이신 및 PEG-PCL의 경우에 가장 극적이다. 토코페롤의 첨가가 없을 경우, PEG-PCL은 용해화제로서 무능할 수 있다. 약 0.2 내지 약 0.8mg/ml, 바람직하게는 약 0.4 내지 약 0.6mg/ml, 보다 바람직하게는 0.5mg/ml의 최대 로딩 농도는 1:20의 PEG-PCL:토코페롤에 의해 달성될 수 있다[실시예 11 및 12 참조]. 담체 및 첨가제의 추가의 최적화가 요구될 수 있다. 또한, 마이셀 조성물 제형의 EPR 효과가 화학치료를 위한 용량 요건을 감소시킬 수 있다.

도 28에 도시된 바와 같이, 토코페롤은 라파마이신이 인산염 완충 용액 중에서 방출되는 시간 동안에 증가하나, 현저히 증가하는 것은 아니다. 도 29에서, 토코페롤은 라파마이신이 4% 소혈청 알부민 용액 중에서 방출되는, 증가된 시간에 대해 상당한 효과를 갖는 것으로 보여진다.

PEG-PCL 마이셀 조성물은 토코페롤이 도입되는 경우에 보다 많은 라파마이신을 로딩할 수 있다[도 30 참조]. 또한, 도 31 및 32에 도시된 바와 같이, PEG-PCL은 인산염 완충 염수 용액 및 4% 소혈청 용액 둘 모두에서 보다 오래 라파마이신을 용해된 상태로 유지시킨다.

앞서 결과는 이들 중합체가 화학치료 화합물에 대한 담체로서 가능성을 가짐을 입증한다. 토코페롤에 의한 결과는 구조적으로 유사한 첨가제가 약물 로딩 용량을 상당히 증가시킬 수 있음을 입증한다.

4.3 마이셀 투여를 위한 용량

마이셀 전달 시스템의 마이셀을 통한 라파마이신의 용량은 라파마이신 유사체: CCI-779, RAD-001 및 AP-23573에 대해 임상 시험에서 사용된 용량과 유사할 수 있다. CCI-779에 대한 용량은 약 7.5 내지 220mg/m²/주 i.v., 2 내지 3주마다 약 5일 동안 약 0.75 내지 20mg/m²/일 i.v., 2주마다 약 5일 동안 약 25 내지 100mg/일 p.o.이다. AP-23573에 대해서는 2주마다 약 5일 동안 약 6.0 내지 100mg/주 i.v., 약 3 내지 30mg/일 i.v.이다. 이러한 용량은 약 1 내지 4mg/ml에서의 라파마이신의 용해가 주어질 경우 PEG-b-PCL 마이셀에 의해 용이하게 달성되어야 한다. PEG-b-PCL 마이셀 중 라파마이신의 함량은 약 10 내지 20% wt 약물/wt 중합체이다. PEG-b-PCL 마이셀은 적어도 약 40mg/ml에 도달할 수 있다.

겔다나마이신 전구약물의 용량은 약 1 내지 7mg/ml에서 약 100 내지 1000mg/m², 바람직하게는 약 2 내지 6mg/ml에서 약 200 내지 700mg/m², 보다 바람직하게는 약 4.0mg/ml에서 약 100ml이다.

4.4 마이셀로의 겔다나마이신 전구약물의 로딩

도 42에 도시된 바와 같이, 겔다나마이신은 친지성이 충분하지 않아 PEG-b-PCL 마이셀 및 PEG-DSPE 마이셀로의 로딩이 불충분하다. 도 43 및 44에 도시된 바와 같이, 겔다나마이신의 지방산(에스테르) 전구약물은 친지성을 증가시킬 수 있다. 도 14에 도시된 바와 같이, log Po/w 증가는 겔다나마이신 전구약물의 로딩 중량%를 증가시킨다[실시예 18 참조].

나노담체의 설계에 있어서, 주요 관심사는 약물-담체 상호작용이어야 한다. 초기 연구에서는 겔다나마이신이 페길화된 인지질 및 PEG-b-폴리카프롤락톤(PEG-PCL) 마이셀과 같은 나노담체에 의해 충분히 캡슐화되지 않을 수 있는 것으로 밝혀졌다. Hsp90 억제제의 캡슐화는 약물 분자의 소수성에 의존할 수 있다. 겔다나마이신의 옥탄올-물 분배 계수는 마이크로에멀젼 전기역학적 크로마토그래피에 의해 결정되었다. 비교로서 PEG-PCL 마이셀에 높은 수준(>10% w/w)으로 로딩된 라파마이신은 MEEKC에 의해 측정하여 3.77의 log Po/w를 갖는다.

몇몇 전구약물이 도 44에 도시된 바와 같이, DMAP/DCC 화학방법에 의해 합성되었다. 도 45 및 46에 도시된 바와 같이 지방산 사슬 길이 연장은 형성된 분자의 소수성을 증가시켜 보다 높은 log Po/w 값을 초래한다. 에스테르의 카르보닐에 인접하는 브롬의 첨가는 전기 끌기기로서 작용하여 에스테르 결합을 탈안정화시킨다. 그러나, 브롬(Br)은 극히 소수성이어서 분자의 전반적인 log Po/w 계수를 증가시킨다. Br의 첨가는 또한 나노담체로의 로딩을 증가시킬 수 있으나, 에스테르 결합에 대한 히드로늄 및 히드록시드 이온의 접근가능성을 감소시켜 캡슐화된 에스테르의 가수분해율을 감소시킨다. 이어서, 느린 가수분해는, 전구약물이 모약물 보다 현저히 양호하게 마이셀 코어로 분배될 경우 약물 방출율을 연장시킬 수 있다. 안정한 에스테르 결합을 지닌 고도로 분배된 약물은, Br이 도 47에 도시된 이소프로필기와 같은 전자 끌기기가 아닌 소수성 기로 대체될 경우에 실현될 수 있다.

표 1. 겔다나마이신 및 전구약물의 소수성 특성

화합물	log Po/w
겔다나마이신	2.77
17-아미노에틸-헥소네이트-17-데메톡시겔다나마이신	3.87
17-아미노에틸-도데코네이트-17-데메톡시겔다나마이신	4.16
17-아미노에틸-브로모팔미테이트-17-데메톡시겔다나마이신	4.31
17-아미노에틸-브로모헥소네이트-17-데메톡시겔다나마이신	4.49
17-아미노에틸-헥실데실-17-데메톡시겔다나마이신	4.30

표 1에 도시된 바와 같이, 겔다나마이신 전구약물은 높은 log Po/w값에 의해 입증되는 바와 같이 매우 소수성이다. 개질되지 않은 겔다나마이신은 약 2.77의 log Po/w 값을 가지며, 이는 PEG-b-PCL에 의해 캡슐화되기에 충분한 소수성은 아니다. PEG-b-PCL에 의한 효과적인 캡슐화는, 담체가 약 3.5 이상의 소수성을 가질 경우에 일어날 수 있다. 화합물 17-아미노에틸-헥사노에이트-17-데메톡시겔다나마이신은 약 3.87의 log Po/w를 가지며, 이는 분자가 PEG-b-PCL과 같은 마이셀로 실질적으로 캡슐화되도록 하는 데 충분하다. 화합물 17-아미노에틸-브로모헥사노에이트-17-데메톡시겔다나마이신은 약 4.49의 log Po/w를 지닌 매우 소수성인 분자이며, PEG-b-PCL과 같은 마이셀로 캡슐화된다.

도 45는 표 1에 기재된 바와 같은 17-아미노에틸-헥소네이트-17-데메톡시겔다나마이신, 17-아미노에틸-도데코네이트-17-데메톡시겔다나마이신, 17-아미노에틸-브로모팔미테이트-17-데메톡시겔다나마이신, 17-아미노에틸-브로모헥소네이트-17-데메톡시겔다나마이신을 제형화하는 방법을 도시한 것이다. 17-아미노에틸-헥소네이트-17-데메톡시겔다나마이신을 제형화함에 있어서, n=3이고, X=H이다. 17-아미노에틸-도데코네이트-17-데메톡시겔다나마이신을 제형화함에 있어서, n=9이고, X=H이다. 17-아미노에틸-브로모팔미테이트-17-데메톡시겔다나마이신을 제형화함에 있어서, n=13이고, X=H이다. 17-아미노에틸-브로모헥소네이트-17-데메톡시겔다나마이신을 제형화함에서, n=13이고, X=Br이다.

도 45는 지방산 사슬의 연장을 보여준다. 제 1 단계에서, 에탄올의 겔다나마이신으로의 첨가(도 45에서 1로서 도시됨)는 약 1 내지 약 4시간 동안 클로로포름 중의 겔다나마이신을 약 10당량의 에탄올 아민과 함께 용해시킴으로써 달성될 수 있다. 반응은 완료될 때까지 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 모니터링된다. 유기층은 중탄산나트륨(NaHCO₃)로 세척된 후, 염수로 세척된다. 이후, 유기층은 황산나트륨(NaSO₄) 상에서 건조된 후, 용매가 회전 증발에 의해 제거된다.

도 45의 제 2 단계에서, 지방산 사슬이 DMAP/DCC 반응에 의해, 2로서 도시된 겔다나마이신 전구약물 구조에 첨가된다. 지방산은 에스테르의 카르보닐에 인접한 소수성 실체(Br 또는 H)와 함께 첨가된다. 제 2 단계에서, 2로부터의 겔다나마이신 전구약물은 약 1.5당량의 지방산, 약 3당량의 DCC 및 약 1 당량의 DMAP를 함유하는 약 10ml의 디클로로메탄 중에 현탁된다. 반응은 완료될 때까지 약 2 내지 약 6시간 동안 TLC에 의해 모니터링된다. 이후, 용액은 약 1:9의 메탄올:클로로포름으로 로딩된 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제된다. 이후, 용액은 회전 증발되어 생성물을 수득한다.

도 46은 17-아미노-헥실데실-17-데메톡시겔다나마이신을 제형화시키는 방법을 보여준다. 도 46은 도 45와는 제 1 단계는 상이하나, 제 2 단계를 동일하다는 것을 보여준다. 제 1 단계에서, NH₂(CH₂)₁₅CH₃ 아민의 겔다나마이신의 첨가(도 45에서 1로서 도시됨)는, 약 1 내지 약 4시간 동안 클로로포름 중의 겔다나마이신을 약 5당량의 NH₂(CH₂)₁₅CH₃와 함께 용해시킴으로써 달성될 수 있다. 반응은 완료될 때까지 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 모니터링된다. 유기층은 중탄산나트륨(NaHCO₃)로 세척된 다음, 염수로 세척된다. 이후, 유기층은 황산나트륨(NaSO₄) 상에서 건조된다. 이후, 용액은 약 1:9의 메탄올:클로로포름으로 로딩된 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제된다. 이후, 용액은 회전 증발되어 생성물을 수득한다.

도 47은 17-히드록시에틸아미노-(1-이소프로필-팔미테이트)-17-데메톡시겔다나마이신을 제형화시키는 방법을 보여준다. 이는 디에틸 말로네이트를 에탄올 중의 약 1 당량의 NaOCH₂CH₃ 중에 현탁시키고, 약 1시간 동안 환류시킴으로써 이루어진다. 이후, 약 0.95 당량의 2-브로모-이소프로판이 적가되고, 약 4시간 동안 환류된다. 2배의 냉각수를 용액에 첨가한다. 생성물은 에테르로 3회 추출된 후, 진공 증류된다. 이소프로필마로네이트 디에스테르가 에탄올 중의 약 1 당량의 NaOCH₂CH₃와 혼합되고, 약 1시간 동안 환류된다. 이후, 약 0.95당량의 1-1-브로모테트라데크단이 첨가되고, 용액은 TLC에 의해 완료될 때까지 약 4시간 동안 환류된다. 약 2배 용적의 냉각수가 상기 용액에 첨가될 수 있다. 생성물은 에테르로 3회 추출된 후, 진공 증류될 수 있다.

이후, 2-이소프로필-2-테트라데크단-말로네이트디에스테르가 약 1:1의 KOH:물에 용해되고, 약 8시간 동안 환류될 수 있다. 이후, 물이 고형물이 사라질 때가지 첨가된다. 수성층이 추출된다. 농축된 염산을 더 이상 고형물이 존재하지 않을 때까지 첨가된다. 이 용액을 에테르로 3회 추출하고, 진공 하에서 감소시킨다. 이후, 생성물은 약 3시간 동안 약 180℃로 가열된 후, 진공 증류된다. 이는 도 2의 3으로서 도시된 이소프로필을 갖는 지방산을 형성시킨다. 이후, 도 1a의 2에서 겔다나마이신 전구약물이 도 2의 3과 혼합된다. 겔다나마이신 전구약물은 약 2 내지 약 6시간 동안 약 1.5당량의 이소프로필 함유 지방산과, 약 3당량의 DCC와, 약 1 당량의 DMAP와 약 10ml의 디클로로메탄 중에서 혼합된다. 이 용액은 냉각되고 여과된다. 이후, 용액은 약 1:9의 메탄올:클로로포름으로 로딩된 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제된다. 이후, 용액은 회전 증발되어 겔다나마이신-C17-아미노에틸-2-이소프로필헥사데카노에이트를 수득한다.

도 48은 겔다나마이신-C17-아미노에틸로네이트-Phe-Leu-Phe-아민을 제형화시키는 방법을 보여준다. 소수성 펩티드가 도 45에서 2로서 도시된 겔다나마이신 전구약물에 첨가된다. 3당량의 DCC 및 1 당량의 DMAP가 약 10ml의 디클로로메탄과 함께 첨가된다. 반응 시간은 약 2 내지 약 6시간일 수 있다. 이 용액은 냉각되고 여과된다. 이후, 용액은 약 1:9의 메탄올:클로로포름으로 로딩된 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제되고, 회전 증발된다. 형성된 생성물은 약 2:8의 피페리딘:DMF와 혼합되고, 약 1 내지 약 2시간 동안 반응한다. 이후, 용액은 약 1:9의 메탄올:클로로포름으로 로딩된 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제된다. 이후, 용액은 회전 증발되어 겔다나마이신-C17-아미노에틸로네이트-Phe-Leu-Phe-아민을 수득한다.

도 49는 겔다나마이신-C17-아미노에틸리덴-팔미토히드라지드를 제형화시키는 방법을 보여준다. Fmoc-에탄올아민이 DCM 중의 약 1 당량의 데스-마틴(Dess-Martin)을 사용하여 알데히드로 전환될 수 있다. 약 20분 후, 반응은 약 1 부피의 포화된 중탄산나트륨 및 약 7당량의 포화된 나트륨 티오설페이트로 희석될 수 있다. 반응은 약 20분 동안 교반되고, 실질적으로 동일한 부피의 디에틸 에테르로 약 3회 추출될 수 있다. 이후, 유기물질은 약 1M HCl 및 H₂O로 세척되고, 황산나트륨 상에서 건조되고, 회전 증발에 의해 용매가 제거될 수 있다. 생성물은 약 99:1의 EtOac:TEA로 용리되는 실리카 상에서의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제된다. Fmoc-에틸알데히드는 약 1 당량의 팔미트산 히드라지드와 혼합되고, 밤새 EtOH 중에서 환류될 수 있다.

Fmoc-히드라지드 생성물은 약 89:10:1의 클로로포름:MeOH:TEA로 용리되는 실리카 상에서의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. Fmoc-히드라지드는 약 2:2:98의 DBU:피페리딘:DMF 중에서 실온에서 밤새 탈보호될 수 있다. 생성물 (E)-N-(2-아미노에틸리덴)팔미토히드라지드는 여과되고, 약 89:10:1의 클로로포름:MeOH:TEA에 의한 플래시 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 이후, 히드라지드는 C17-메톡시에서의 친핵성 공격에 의해 DMF 중에서 겔다나마이신에 컨쥬게이트된다. 생성물인 17-(2-아미노에틸리덴)팔미토히드라지드-17-겔다나마이신은 1:9의 MeOH:클로로포름으로 용리되는 실리카 상에서의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제된다.

도 50은 PEO-b-PEGA를 제형화시키는 방법을 보여준다. PEO-b-PBLA는 DMF 및 2-히드록시피리딘 중에서 HOOC(CH₂)₅NH₂ 로 아미노분해되고, 이에 따라 히드록실 부분이 도입된다. 이후, 생성물은 DCM 중에서 DCC/DMAP 화학방법을 사용하여 17-히드록시에틸-아미노-17-겔다나마이신에 컨쥬게이트된다. 생성물은 냉각 여과 및 에테르 침전에 의해 정제될 수 있다.

겔다나마이신의 소수성 증가는 화합물의 나노캡슐화를 증가시킬 수 있다. 17번 탄소에서의 겔다나마이신의 전구약물은 다른 위치에서보다 겔다나마이신의 생활성에 대해 보다 낮은 영향을 갖는 것으로 나타났으며, 유도체화는 종종 특히 거대 기에서 활성을 감소시킬 수 있다[참조: Sasaki et al, 미국 특허 제 4261989(1981)].

상기 사사키는 베타-히드록시에틸아미노-17-디메톡시겔다나마이신 전구약물이 시험관내 생활성에 대해 최소의 영향을 갖는 것으로 보여주었다. 이 전구약물은 에스테르화를 허용하는 히드록실기를 제공한다. 에스테르 전구약물은 모 화합물의 활성형으로 가수분해할 수 있다.

겔다나마이신으로의 변형은 상기 기재된 것들로 제한되지 않는다. 지방산 대신에 소수성 펩티드 서열이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 에스테르 결합을 사용하여 말단 C-그룹을 통해 결합될 수 있다. 예를 들어, 페닐알라닌 및 류신의 서열이 사용될 수 있다. 이 서열은 아미노산 사이에 교대로 존재하여 거대 제 2 구조의 형성을 억제한다. 대표적인 전구약물인 C17-아미노-에스테르-Phe-Leu-Phe가 도 48에 도시된다. 아미노산, 예를 들어 Fmoc 보호된 아미노산은 표준 고체상 펩티드 화학방법을 사용하여, HATU/HOAt 활성화 커플링으로 집합될 수 있다. 형성된 N-보호된 펩티드는 도 47에서와 같이 DMAP/DCC 화학방법을 사용하여 컨쥬게이트될 수 있다. 컨쥬게이션 후에, 말단 아미노산인 Fmoc 보호기가 제거될 수 있다.

에스테르 이외의 다른 기가 소수성 기의 결합을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 중성 pH 에서 안정성의 이점을 지니며, 산성 조건에서 가수분해가 증대되는 히드라존 링커가 사용될 수 있다. 종양은 약물의 방출을 증진시킬 수 있는 산성 환경을 제공할 수 있는 반면, 약물은 비특이적 방출 및 이에 따른 독성을 감소시키는 나노담체 JM 혈장에서 안정할 수 있다. 링커의 한 예가 도 44에 도시된다.

Hsp90 약물은 또한 아세틸 및 디설파이드 결합, 분해성 펩티드 결합(예를 들어, Ala-Val), 또는 이들 링커의 조합과 같은 다른 결합을 사용하여 결합될 수 있다. 예를들어, 종양 선택적으로 분해되는 링커(예를 들어, Ala-Val 펩티드)는 C-말단을 통해 지방산 또는 소수성 펩티드에 결합될 수 있다. N-말단은 Hsp90 억제제에 직접 결합되거나(예를 들어, 겔다나마이신의 C17 탄소를 통해), 아미노에탄올 또는 아미노헥산올과 같은 스페이서 링커를 통해 결합될 수 있다. N-말단은 또한 또 다른 분해성 링커를 통해 결합될 수 있다. 형성된 화합물은 Hsp90에 대해 약물 친화성을 감소시키는 벌크한 Ala-Val-(약물 링커) 기로 인해 나노담체 방출 후에 감소된 비특이성 독성을 나타낼 수 있다. Ala-Val의 종양 특이적 분해 후, 형성되는 화합물은 억제를 위한 충분한 Hsp90 결합을 나타낼 수 있다.

Hsp90 억제제는 또한 나노담체에 연결될 수 있다. 가역적으로 결합될 경우, 약물은 나노담체로부터 방출되고, 생활성이 될 수 있다. 비가역으로 또는 가역적으로 결합될 경우, 결합된 약물의 존재는 유리 약물의 마이셀로의 분배를 증가시킬 수 있다. 담체로서 PEO-β-PEGA를 사용하는 예가 도 45에 도시되어 있다.

이러한 개질된 Hsp90 억제제는 담체로부터 서방형 방출을 나타낼 수 있다. 몇몇 이러한 담체의 방출 속도가 표 2에 기재된다. 약물은 0.5mM PEG-b-PCL(5000:10000Da) 마이셀로 로딩되어 25중량% 로딩(또는 1.9mg/ml 용액)을 달성한다. 이러한 데이터는 37℃에서 완벽한 싱크 조건 하에 pH 7.4의 인산염 완충제로의 10000MWCO 투석 카셋트로부터의 방출을 측정함으로써 얻어졌다. 약물 확산은 포레스트(Forrest) 및 퀀(Kwon)의 문헌(2005, Journal of Controlled Release)에 기술된 바와 같이 계산된다.

PEG-PCL 마이셀은 혼화성 용매인 아세톤 중에 용해된 PEG-PCL 및 겔다나마이신 전구약물을 격렬하게 교반된 물에 적가한 후, N₂ 퍼어지에 의해 용매를 제거하고, 0.2μm 여과함으로써 제조된다. 다르게는, 용액은 도입되지 않고 응집된 약물을 제거하기 위해, 원심분리될 수 있다. 물에 대한 최종 매의 비는 약 0.1 내지 약 5, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 4, 보다 바람직하게는 약 2이다. 마이셀 용액은 약 2s/점적 내지 약 60s/점적, 바람직하게는 약 5s/점적 내지 약 30s/점적, 보다 바람직하게는 약 10s/점적 내지 약 20s/점적의 비율로 전달되어야 한다.

표 2. 겔다나마이신 전구약물 특성

약물	확산 계수cm²/s	계산된방출시간t 1/2	w/w약물/담체	농도mg/ml
17-아미노에틸-브로모헥소네이트-17-데메톡시겔다나마이신	2.14x10^-20	6.7일	2.8±0.0%	0.21
17-아미노에틸-도데코네이트-17-데메톡시겔다나마이신	2.55x10^-20	5.6	21±2%	1.6
17-아미노에틸-브로모도데코네이트-17-데메톡시겔다나마이신	1.65x10^-20	8.7	21±2%	1.6
17-아미노에틸-팔미테이트-17-데메톡시겔다나마이신	3.61x10^-20	4.0	22±5%	1.7
17-아미노에틸-브로모팔미테이트-17-데메톡시겔다나마이신	1.51x10^-20	9.5	25±2%	1.9
17-아미노에틸-헥실데실-17-데메톡시겔다나마이신	1.69x10^-20	8.5	20±2%	1.5

도 51은 도데코네이트, 브로모도데코네이트 및 아미노헥실데실과 함께 겔다나마이신 전구약물, C16-아미노-겔다나마이신 및 C16-브로모-에스테르-겔다나마이신의 방출 시간에 대한 로딩을 나타낸다. C16-에스테르-겔다나마이신을 포함하는 PEG-PCL 마이셀은 약 1.1mg/ml의 약물을 지닐 수 있으며, 약 13중량%의 담체일 수 있다. C16-아미노-겔다나마이신을 포함하는 PEG-PCL 마이셀은 약 1.1mg/ml의 약물을 지닐 수 있으며, 약 14중량%의 담체일 수 있다. C16-브로모-에스테르-겔다나마이신을 포함하는 PEG-PCL 마이셀은 약 1.1mg/ml의 약물을 지닐 수 있으며, 약 14중량%의 담체일 수 있다.

MDA-MB-468 유방암 세포주(ATCC)에 대한 약물의 세포독성이 측정된다. 세포는 96웰 플레이트(100㎕/양호한 DMEM 매질)에 3000개의 세포/웰의 밀도로 플레이팅된다. 24시간 후, 약물은 1% DMSO에 용해된다. 세포는 4일 동안 약물로 인큐베이팅되고, 제조업자의 지시에 따라(Progega, Madison, WI) MTS 세포독성 검정을 사용하여 독성이 검출된다.

링커의 가수분해가 느리기 때문에, 독성은 4일 초과의 노출 시간에 대해 증대될 수 있다.

표 3. 겔다나마이신 및 전구약물 방출

약물	IC50(nM)
겔다나마이신	5
17-히드록시에틸아미노-17-데메톡시겔다나마이신	73
17-아미노에틸-헥소네이트-17-데메톡시겔다나마이신	240
17-아미노에틸-팔미테이트-17-데메톡시겔다나마이신	350
17-아미노에틸-브로모팔미테이트-17-데메톡시겔다나마이신	120

4.5 마이셀로의 파클리탁셀 전구약물 로딩

파클리탁셀의 크레메포® 및 용매-부재 제형을 폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(e-카프롤락톤)(PEG-PCL)의 양쪽성 블록 공중합체 마이셀을 사용하여 제조하였다. PEG-PCL(<1% w/w)의 마이셀 중 파클리탁셀의 불량한 로딩은 파클리탁셀의 가수분해성 지방산 전구약물을 형성함으로써 극복되었다. 파클리탁셀 전구약물은 PEG-PCL 마이셀 중에서 5mg/ml 초과의 용해도를 가졌다. 약물 로딩된 PEG-PCL 마이셀은 보조용매 추출 기술에 의해 제조하였다. 형성된 PEG-PCL 마이셀은 17-22%w/w 전구약물을 함유하였고, 직경이 50nm 미만이었다. PEG-PCL 마이셀은 수일 동안 파클리탁셀 전구약물을 방출시켰다, t₁ _/2 >3d.

5.0 본 발명의 또 다른 일면

요약하면, 마이셀 조성물은 양쪽성 중합체, 소수성 부형제 및 소수성 패신저 약물을 포함할 수 있다. 양쪽성 중합체는 PEG-DSPE와 같은 페길화된 인지질, 또는 PEG-b-PCL 및 PEG-b-아미노산과 같은 블록 공중합체일 수 있다. 소수성 부형제는 약 3.5 초과의 log Po/w 및 약 1000Da 미만의 분자량을 가질 수 있다. 소수성 부형제는 알파-토코페롤, 베타-토코페롤, 감마-토코페롤, 델타-토코페롤, 알파-토코트리에놀, 베타-토코트리에놀, 감마-토코트리에놀, 델타-코토트리놀을 포함하는 많은 이성질체를 지닌 비타민 E일 수 있다. 소수성 패신저 약물은 겔다나마이신, 겔다나마이신 전구약물, 라파마이신, 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 전구약물일 수 있다.

마이셀 조성물은 양쪽성 중합체일 수 있으며, 소수성 패신저 약물은 마이셀을 위해 이용될 수 있다. 소수성 패신저 약물은 겔다나마이신, 겔다나마이신 전구약물, 라파마이신, 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 전구약물일 수 있다. 양쪽성 중합체는 PEG-DSPE, PEG-PCL, 또는 PCG-폴리아미노산일 수 있다. 소수성 부형제는 바람직하게는 비타민 E가 포함될 수 있다. 마이셀 조성물은 약 1 내지 약 50mM의 농도를 가질 수 있으며, 비타민 E는 약 2 내지 약 100mM의 농도를 가질 수 있으며, 라파마이신의 농도는 약 0.1 내지 약 10.0mg/ml일 수 있다. 마이셀 조성물은 또한 약 3 내지 약 7mM의 양쪽성 중합체 농도를 가질 수 있으며, 비타민 E는 약 8 내지 약 12mM의 농도를 가질 수 있으며, 라파마이신은 약 0.3 내지 약 0.7mg/ml의 농도를 가질 수 있다. 양쪽성 중합체에 대한 비타민 E의 비는 약 0.2 내지 약 50일 수 있으며, 마이셀은 직경이 약 200nm 미만일 수 있다. 중합체에 대한 라파마이신의 비는 약 0.1 내지 약 4일 수 있다.

마이셀 조성물을 형성시키는 방법은 양쪽성 중합체, 소수성 부형제, 및 소수성 약물을 유기 용매에 혼합시켜 용액을 형성시키고, 용액으로부터 실질적으로 용매 전부를 제거하여 실질적으로 용매-부재 혼합물을 잔류시키는 것을 포함할 수 있다. 이 방법은 추가로 물 또는 완충제 중에 실질적으로 용매-부재 혼합물을 재현탁시키는 것을 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 실질적으로 용매-부재 혼합물을 잔류시키기 위해 용액으로부터 실질적으로 용매 전부를 제거하기 전에 용액을 실질적으로 물 용액에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 마이셀 조성물을 형성시키는 방법은 추가로 상기 마이셀 조성물에 도입되지 않는 약물을 제거하는 것을 포함할 수 있다. 이 방법은 용액을 약 50 내지 약 1000rpm에서 회전시키는 혼합 단계를 가질 수 있다.

최종 수용액의 특징으로서, 양쪽성 중합체는 약 0.1mM 내지 약 60mM의 농도를 가질 수 있으며, 소수성 부형제는 약 0.1mM 내지 약 600mM의 농도를 가질 수 있으며, 약물은 약 0.1mg/ml 내지 약 10.0mg.ml의 농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 모든 성분이 용해될 수 있는 대부분의 임의의 유기 용매가 이 방법에 사용될 수 있으나, MeOH, 아세톤, THF, ACN은 제외되지 않는다. 용매는 약 50:50의 클로로포름:메탄 용액일 수 있다. 추가로, 상기 방법의 회전 단계 및 제거 단계는 동시에 일어날 수 있으며, 재현탁 단계는 약 3 내지 약 20분 동안 초음파처리와 병용될 수 있다. 소수성 패신저 약물은 라파마이신, 파클리탁셀, 파클리탁셀 전구약물, 겔다나마이신 및 겔다나마이신 전구약물일 수 있다.

라파마이신을 용해시키는 방법은 양쪽성 중합체, 소수성 부형제 및 라파마이신을 유기 용매에 용해시켜 용액을 형성시키고; 상기 용액을 혼합하고; 상기 용액으로부터 용매를 제거하여 실질적으로 용매-부재 조성물을 형성시키고, 상기 실질적으로 용매-부재 혼합물을 물 또는 완충제 중에 재현탁시키는 것을 포함할 수 있다. 재현탁 단계가 마이셀 조성물을 형성시킬 수 있다. 중합체는 PEG-DSPE일 수 있다. PEG-DSPE에 대한 소수성 부형제의 비는 약 0.1 내지 약 3일 수 있다. 소수성 부형제는 비타민 E일 수 있다.

마이셀 조성물은 양쪽성 중합체 및 겔다나마이신을 포함할 수 있다. 마이셀 조성물은 또한 소수성 부형제를 포함할 수 있다. 소수성 부형제는 비타민 E일 수 있다. 겔다나마이신은 약 200 내지 약 800μg/ml일 수 있다.

전구약물 조성물은 약 3.5 이상의 log Po/w를 가질 수 있다. 전구약물은 겔다나마이신 또는 파클리탁셀일 수 있다. 겔다나마이신 전구약물은 C17 위치에서 아미노 스페이서 기, 및 상기 스페이서 기에 인접하여 R기를 가질 수 있다. R기는 약 4 내지 약 24개의 탄소, 보다 바람하게는 약 6 내지 약 16개의 탄소로 된 탄소 사슬일 수 있다. 이 사슬은 포화되거나 부분적으로 불포화될 수 있다. R기는 에스테르, 브로모에스테르, 아미노에틸-헥소네이트, 아미노에틸-도데오네이트, 아미노에틸-팔미테이트, 아미노에틸-브로모팔미테이트 또는 아미노-헥사데실일 수 있다. 마이셀 조성물은 양쪽성 중합체 및 이러한 겔다나마이신 전구약물 중 하나를 포함할 수 있다. 겔다나마이신 전구약물은 약 3.5 이상의 log Po/w를 가질 수 있다.

파클리탁셀 전구약물은 아미노 링커 및 이 링커 기에 인접한 R기를 가질 수 있다. 아미노 링커기는 C7 또는 C2 위치에서 존재할 수 있다. 파클리탁셀 전구약물은 약 3.5 이상의 log Po/w를 가질 수 있다. R기는 약 4 내지 약 24개의 탄소, 보다 바람하게는 약 6 내지 약 16개의 탄소로 된 탄소 사슬일 수 있다. 이 사슬은 포화되거나 부분적으로 불포화될 수 있다. R기는 에스테르, 브로모에스테르, 아미노에틸-헥소네이트, 아미노에틸-도데오네이트, 아미노에틸-팔미테이트, 아미노에틸-브로모팔미테이트 또는 아미노-헥사데실일 수 있다. 마이셀 조성물은 양쪽성 중합체 및 이러한 파클리탁셀 전구약물 중 하나를 포함할 수 있다. 파클리탁셀 전구약물은 약 3.5 이상의 log Po/w를 가질 수 있다.

마이셀 조성물은 7-팔미테이트-파클리탁셀, 7-팔미테이트-파클리탁셀, 2-TBS-파클리탁셀, 2-팔미테이트-파클리탁셀, 2-TBS-7-팔미테이트-파클리탁셀 중 하나를 포함하는 파클리탁셀 전구약물을 포함할 수 있다. 마이셀 조성물을 형성시키는 방법은 약 3.5 이상의 log Po/w를 갖는 파클리탁셀 전구약물을 제형화시키고; 양쪽성 중합체 및 상기 파클리탁셀 전구약물을 유기 용매에 혼합하여 용액을 형성시키고; 상기 용액으로부터 용매를 제거하여 실질적으로 용매-부재 혼합물을 잔류시키고, 상기 용매-부재 혼합물을 물 또는 완충제 중에 재현탁시키는 것을 포함할 수 있다. 마이셀 조성물을 형성시키는 방법은 또한 약 3.5 이상의 log Po/w를 갖는 파클리탁셀 전구약물을 제형화시키고; 양쪽성 중합체 및 상기 파클리탁셀 전구약물을 유기 용매에 혼합하여 용액을 형성시키고; 상기 용액으로부터 용매를 제거하여 실질적으로 용매-부재 혼합물을 잔류시키고, 상기 용매-부재 혼합물을 물 또는 완충제 중에 재현탁시키는 것을 포함할 수 있다.

겔다나마이신 전구약물로 마이셀 조성물을 형성시키는 방법은 17-히드록시-에틸아미노-17-데메톡시겔다나마이신, 17-아미노에틸-헥소네이트-17-데메톡시겔다나마이신, 17-아미노에틸-브로모헥소네이트-17-데메톡시겔다나마이신, 17-아미노에틸-도데코네이트-17-데메톡시겔다나마이신, 17-아미노에틸-브로모도데코네이트-17-데메톡시겔다나마이신, 17-아미노에틸-팔미테이트-17-데메톡시겔다나마이신, 17-아미노에틸-브로모팔미테이트-17-데메톡시겔다나마이신, 17-아미노-헥실데실-17-데메톡시겔다나마이신을 포함하거나 생성시킬 수 있다.

파클리탁셀 전구약물로 마이셀 조성물을 형성시키는 방법은 7-팔미테이트-파클리탁셀, 7-팔미테이트-파클리탁셀, 2-TBS-파클리탁셀, 2-팔미테이트-파클리탁셀, 2-TBS-7-팔미테이트-파클리탁셀을 포함하거나 생성시킬 수 있다.

사람 또는 동물의 질병 또는 질환을 치료하는 방법은 양쪽성 중합체, 소수성 부형제 및 소수성 패신저 약물을 포함하는 마이셀 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 소수성 패신저 약물은 겔다나마이신, 겔다나마이신 전구약물, 라파마이신, 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 전구약물일 수 있다. 양쪽성 중합체는 PEG-DSPE, PEG-PCL, 또는 PEG-폴리아미노산일 수 있다. 소수성 부형제는 비타민 E일 수 있다. 사람 또는 동물의 질병 또는 질환은 암, 신경성 장애, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 재협착증, 진균 감염, 면역억제일 수 있다. 진균 감염은 칸디다 알비칸스(Candidi albicans) 감염일 수 있다.

본 발명이 바람직한 구체예 및 이의 실시예를 참조로 하여 기술되었지만, 본 발명의 범위는 이와 같이 기술된 구체예로만 제한되는 것은 아니다. 당업자들에게 자명한 바와 같이, 본 발명의 사상 및 범주에서 출발하지 않고, 본 발명에 대한 변경 및 변형이 이루어질 수 있으며, 이는 첨부되는 청구의 범위에 의해 정의되고, 한정된다. 하기 실시예는 본 발명의 구체예 및 이점을 예시하고자 제시된 것이며, 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.

실시예 1

마이셀 및 패신저 약물의 형성

독소루비신 및 파클리탁셀은 표적화된 종양에 전달되어야 하는 마이셀 조성물에 도입될 수 있다. PEG-폴리(아스파르트산), PEG-폴리(아스파르테이트), PEG-폴리(락타이드), PEF-DSPE는 패신저 약물 화합물을 캡슐화할 수 있는 몇몇 마이셀 담체이다[표 1 참조].

표 4. 패신저 약물

담체 /약물	표적	단계
PEG-폴리(아스파르트산) 컨쥬게이트된 독소루비신	전이성 췌장암	상 II
PEG-폴리(아스파르테이트) 엔트랩핑 파클리탁셀	다양한 고형 종양	상 I임상전
PEG-폴리(락타이드) 엔트랩핑 파클리탁셀	다양한 고형 종양	상 I
플루로닉 엔트랩핑 독소루비신	다양한 고형 종양	상 I/II

실시예 2

라파마이신 로딩 효율

용해도가 수중에서 2.6μg/ml인 라파마이신을 마이셀 조성물에 로딩시켰다. 라파마이신의 PEG-DSPE로의 로딩 효율은 도입 토코페롤의 증가에 따라 비례적으로 증가하였다. 라파마이신의 PEG-PCL로의 로딩 효율 또한 도입 토코페롤의 증가에 따라 비례적으로 증가하였다[표 2 참조].

표 5. 마이셀로의 라파마이신 로딩

약물	담체	약물 로딩mg/ml	약물중량%	로딩효율	로딩개선율 %
라파미이신	5mM 토코페롤	<0.01	-	-
	5mM PEG-DSPE₂₀₀₀	1.5	10%	75%	-
	+ 토코페롤(1:1)	1.6	11%	80%	7%
	+ 토코페롤(1:2)	2.3	14%	77%	53%
	+ 토코페롤(1:3)	3.9	21%	79%	160%
	0.05mM PEG₅₀₀₀-PCL₆₀₀₀	0.20	18%	43%	-
	+ 토코페롤(1:10)	0.34	44%	74%	70%
	+ 토코페롤(1:20)	0.41	34%	90%	105%
	1.7mM PEG_5k-PCL_10k+토코페롤(1:15)	4.9	14%	59%

실시예 3

임계 마이셀 농도

임계 마이셀 농도는 마이셀 조성물로의 토코페롤 도입에 따라 증가하였으며, 이에 따라 마이셀 조성물의 안정성을 증가시켰다[도 12 참조].

표 6. 임계 마이셀 농도

PEG-DSPE:토코페롤의 비	임계 마이셀 농도(μM)
토코페롤 비함유	2
1:0.1	3
1:0.5	8
1:1	17
1:2	28

실시예 4

도입 토코페롤 및 라파마이신을 함유하는 마이셀 조성물의 형성

마이셀 조성물을 형성시키는 적가 추출 방법

도 19에 따라, 양쪽성 중합체 및 목적하는 패신저 약물을 탁월한 용해도를 갖는 고도로 물 혼화성인 용매에 용해시켰다. 이러한 용매의 예로는 MeOH, 아세톤, EtOH, 아세토니트릴, THF, 디옥산 및 IPA가 포함된다.

예를 들어, 1mg/ml의 약물 및 2.5mM PEG-DSPE 및 1:2 토코페롤의 0.5ml 용액을 제조하기 위해, 명시된 양의 토코페롤, PEG-DSPE, 및 라파마이신을 0.5ml의 아세톤에 용해시키고, 시린지에 로딩시킨다. 시린지 펌프를 사용하여 용액을 25-50㎕/분(대략 1 점적/10-15s)로 상기 용액을 물의 용액에 전달한다.

물의 용량은 최종 용매 대 물의 비가 2:1 이하가 되도록 충분해야 한다. 일반적으로 1ml 이상의 물이 사용되어야 한다.

물(또는 다른 수성 완충제[예를 들어, PBS])를 교반막대가 장착된 작은 비이커에 넣고, 파라필름으로 덮어, 격렬하게 교반되는 교반판 상에 두었다. 전달을 개시하고, 전달율에 근거하여 15-45분 후에 종료해야 한다.

매우 소수성인 중합체(예를 들어, PEG 5000:PCL 15000)에 대해서는 느린 유속(20s/점적)이 사용될 수 있으며, 용이하게 형성된 시스템(예를 들어, PEG-DSPE)에 대해서는 유속이 10s/점적으로 증가될 수 있다.

전달이 이행된 후, 바이알을 질소 또는 다른 건조된 비반응성 기체(예를 들어, 정제된 건조 공기, 아르곤, 헬륨)의 스트림 하에 두고, 용매를 증발시켰다. 필요에 따라, 용액은 물이 모두 사라지는 시점을 지나 증발을 계속함으로써 농축될 수 있다. 공비 형성 용매(예를 들어, EtOH) 대신에 아세톤을 사용하는 것의 이점은 이러한 조건 하에서 모든 용매가 제거될 수 있다는 점이다. 또한, DMSO 또는 DMF와 같은 용매는 물보다 먼저 증발하지 않을 것이다. 또한, 바이알은 밤새 또는 그보다 오래(아마도 퍼어지 기체 없이) 용매가 서서히 증발되도록 할 수 있다. 이는 아세톤의 존재 하에서 팽윤될 수 있는 PEG-PCL과 같은 소수성 장쇄 중합체에 대해 중요할 수 있으며, 마이셀 안정성을 허용하기 위해 아세톤을 서서히 제거할 필요가 있을 수 있다.

모든 유기물질이 제거된 후(그리고, 필요에 따라 용액이 추가로 농축된 후), 용액은 살균 여과되어(예를 들어, 0.2μm 또는 0.45μm 시린지 필터) 200nm 초과 크기 입자인 비도입 약물 또는 다른 비-마이셀의 응집체를 제거할 수 있다. 다르게는, 용액은 원심분리되어 약물 응집체를 제거할 수 있다(예를 들어, 5분 동안 16000xg)

마이셀 조성물을 형성하는 박막 증발 방법.

마이셀 조성물을 형성시키는 박막 증발 방법의 예는 하기와 같다:

1. 목적하는 패신저 약물, 토코페롤, 및 양쪽성 중합체를 이들이 용해되는 고도로 휘발성 유기 용액에 용해시킨다[도 18 참조].

2. 최종 5mM의 PEG-DSPE, 10mM의 토코페롤, 0.5mg/ml의 라파마이신의 1ml 용액을 제조하기 위해, 상기 성분을 50:50의 클로로포름:MeOH 용액에 용해시킨다. 이를 50-100ml 둥근 바닥 진공 플라스크에 넣는다. 플라스크를 회전 증발기 또는 로토뱁(rotovap) 상에 넣고, 약 100rpm으로 회전시키고, 진공 하에 두어 용매를 제거한다. 용매가 "범프(bump)"되거나 세차게 증발/비등하여 로토뱁 응축기로 역류되지 않도록 진공을 제어하는 것이 중요하다.

3. 모든 용매가 증발된 후, 매우 높은 진공(10-100μbar)에 두어 모든 미량의 용매를 제거한다. 이는 높은 토코페롤 로딩의 경우에 특히 중요한데, 그 이유는 토코페롤은 오일성 점성 물질이여서, 용매가 토코페롤 함유 막으로부터 증발하는 것이 느릴 수 있기 때문이다.

4. 적합한 용적의 물 또는 완충제를 첨가한다. 이 경우에, 1ml를 첨가한다. 격렬하게 교반하면, 마이셀이 형성될 것이다. 이는 5-15분 동안의 초음파처리에 의해 보조될 수 있다.

도 18에 따르면, 약물의 로딩 효율은 약물 대 양쪽성 유니머 비가 2:1에 도달할 때까지 증가하였다. 로딩 효율은 휘발성 용액에 용해된 목적하는 라파마이신의 약 40%였다. 이후, 목적하는 라파마이신의 로딩 효율은 약물:유니머 비가 2:1을 초과하여 증가한 후 감소하였으며, 약물 로딩 효율은 약물:유니머 비가 3:1 및 4:1에서 20% 미만이었다. PEG-DSPE 마이셀 토코페롤 크기는 약 14±2nm 였으며, 마이셀-토코페롤-라파마이신 조성물은 크기가 약 약 16±2nm 일 수 있다. 따라서, 라파마이신은 마이셀 조성물이 EPR 표준을 초과하도록 증가시키지 않는다.

실시예 5

마이셀 조성물로의 라파마이신 도입

마이셀 조성물로의 라파마이신의 도입은 SEC에 의해 검출되리 수 있다. 도 24에 도시된 바와 같이, 마이셀 및 라파마이신 둘 모두는 동시에 칼럼으로부터 유출되며, 따라서 이들이 하나의 화합물로 도입된다는 것을 보여준다. 비도입된 양쪽성 유니머는 마이셀 화합물을 형성하지 않으며, 나중에 칼럼으로부터 유출된다. 본 실시예는 쇼덱스 804 SEC 칼럼(Shodex 804 SEC column)에서 0.75ml/분, 및 37℃, 및 RI 및 277nm UV 검출로 수행되었다.

실시예 6

PEG-DSPE 마이셀 단독의 불안정성

도 14에 도시된 바와 같이, 인산염 완충 염수 용액 중에서, PEG-DSPE 마이셀은 매우 안정하다. PEG-DSPE 마이셀 조성물이 4% 소혈청 알부민(BSA)을 함유하는 인산염 완충 용액 중에서 혼합되는 경우, 마이셀 조성물은 훨씬 덜 안정하며, 패신저 화합물은 1시간 내로 약물로부터 붕괴된다. 마이셀 조성물은 7500 분자량 이하 투석법으로부터 37℃ 탈이온수로 방출되었다.

표 7. BSA 비함유

2.5mM PEG-DSPE2000, 라파마이신 0.5mg/ml 로딩
마이셀 크기: 14.3nm ± 1.9nm
마이셀 코어 크기: 1.5nm
7500MWCO 투석 카셋트로부터 37C dH₂O로의 방출
확산 계수	5.50E-21	cm²/s
t50%	45	h

	프랙탈.(fract.) 총 약물
시간, h	방출	표준편차
0	0	0
1	0.02939325	0.029442
2	0.090356997	0.040463
4	0.16267178	0.08748
6	0.176771948	0.022576
12	0.281604694	0.036934
24	0.42668326	0.115854
48	0.701218068	0.022382
72	0.89437857	0.045244

표 8. 0.23 mg/ml BSA 중 라파마이신 방출

표 9. 40 mg/ml BSA와 함께 라파마이신 방출

표 10. 유리 약물 방출

토코페롤이 도입되는 경우 PEG-DSPE의 안정성

도 28에 나타낸 바와 같이, 마이셀 조성물에 토코페롤이 도입되는 경우, 조성물은 시간에 따라 더욱 안정적이며 약물은 붕괴되지 않는다. 4% BSA의 존재하에, 토코페롤이 존재하지 않는 5 mM PEG-DSPE는 최초 20 시간 내에 붕괴되었지만, 10 mM 토코페롤 조성물을 지닌 5 mM PEG-DSPE 마이셀 조성물은 거의 60 시간 동안 용액 중에서 함께 유지되었다.

도 16에 나타낸 바와 같이, 마이셀 조성물의 약 60%는 적어도 25 시간 동안 손상되지 않은채 유지되었다.

실시예 7

토코페롤을 지닌 마이셀 조성물의 코어 강도

도 13에 나타낸 바와 같이, 마이셀 조성물의 코어 점도, 또는 강도는 토코페롤이 도입되는 경우 약간 감소한다. 임의의 토코페롤이 존재하지 않는 PEG-DSPE는 약 3 I_m/I_e 보다 약간 작은 상대 코어 점도를 갖는다. 코어 점도는 토코페롤이 마이셀 조성물에 첨가될 때 감소한다. 코어 점도는 선형으로 감소하지 않지만, PEG-DSPE:토코페롤 비가 1:1 이상으로 증가할 때 약 1 I_m/I_e에서 안정되게 유지된다. 마이셀 조성물 코어 강도의 감소는 마이셀 안정성을 감소시키고 약물 확산을 증가시킬 수 있다.

표 11. 0.23 mg/ml BSA 중 라파마이신 방출

표 12. 중합체 시스템의 임계적 마이셀 농도

실시예 8

토코페롤을 지닌 마이셀 조성물의 코어 극성

도 17에 나타낸 바와 같이, 토코페롤 분자가 도입된 마이셀 조성물의 코어 극성은 토코페롤 분자가 존재하지 않는 마이셀 보다 낮다. PEG-DSPE 만의 코어 극성은 약 1.1이다. 1:2의 PEG-DSPE:토코페롤 비를 갖는 PEG-DSPE 및 토코페롤 마이셀 조성물의 코어 극성은 약 0.8이다. 토코페롤의 도입은 코어 극성을 감소시킬 수 있으며, 이에 따라 소수성 분자의 로딩을 증가시킬 수 있다. 이는 향상된 분할화로 인해 방출 동력학에 영향을 미칠 것이다.

실시예 9

토코페롤을 지닌 마이셀 조성물의 크기 증가

마이셀 조성물의 크기는 종양 부위로의 혈관의 유출 때문에 중요하다. 마이셀은 이상적으로 종양 부위에 도달시키기 위해 약 400 nm 미만의 직경을 가져야 한다. 도 24에 나타낸 바와 같이, 마이셀 조성물에 토코페롤의 도입은 얻어진 마이셀 조성물의 크기를 400 nm를 넘는 직경으로 증가시키지 않는다.

실시예 10

도입된 응집체 수의 증가

도 14에 나타낸 바와 같이, 중합체의 응집체 수는 마이셀 조성물에 토코페롤의 도입으로 증가한다. 증가된 응집체 수는 확장된 코어를 지시할 수 있다. 코어는 PEG-PCL 1:0 토코페롤 내지 1:20 토코페롤에 대해 5 nm 내지 6 nm 반경으로 크기를 증가시킨다. 코어는 PEG-DSPE 1:0 토코페롤 내지 1:2 토코페롤에 대해 1.5 nm 내지 3 nm 반경으로 증가한다. 1:0.5의 PEG-DPSE:토코페롤 비에서 마이셀 조성물내의 응집체 수의 차이는 통계적으로 유의적이다.

실시예 11

확산-증발에 의한 파라마이신 로딩

토코페롤이 도입되는 경우 마이셀 조성물 중 라파마이신의 중량퍼센트는 토코페롤 도입의 이점을 나타낸다. 도 18에 나타낸 바와 같이, 토코페롤이 도입되지 않은 경우, 2:1의 라파마이신:마이셀 유니머(unimer) 비에서, 마이셀 조성물에 약 20 중량% 라파마이신이 존재한다. 1:1 또는 1:2 PEG-DSPE:토코페롤 비인 경우, 라파마이신의 중량%은 25% 이상으로 증가한다.

실시예 12

라파마이신 방출에서 토코페롤의 효과

도 27에 나타낸 바와 같이, 토코페롤은 라파마이신이 극성 완충용액에 방출되는 시간을 증가시키지만, 그렇게 현저하지는 않다. 토코페롤이 존재하지 않는 PEG-DSPE 마이셀과 도입된 토코페롤을 지닌 PEG-DSPE 간의 약물 머무름의 차이는 통계학적으로 유의하지 않다.

표 13. 토코페롤이 존재하지 않음

표 14. 토코페롤을 지님

표 15. 유리 약물 방출

실시예 13

도 28에 나타낸 바와 같이, 4% BSA를 지닌 용액에서 PEG-DSPE 마이셀 조성물의 약물 머무름에 대한 토코페롤의 효과는 통계학적으로 유의하다. 4% BSA는 인간 척수 중 알부민의 농도이다. 토코페롤은 개선된 약물 전달을 위해 생체내 조건에서 PEG-DSPE 마이셀 조성물을 안정하게 유지시키는데 도움을 준다.

표 16. 4% BSA 중 토코페롤이 존재하지 않는 라파마이신

표 17. 4% BSA 중 토코페롤을 지닌 라파마이신

표 18. 유리 약물 방출

실시예 14

PEG-PCL 마이셀 제형 및 패신저 약물의 로딩

도 29에 나타낸 바와 같이, 토코페롤은 PEG-PCL 마이셀에 로딩될 수 있는 라파마이신 및 겔다나마이신의 양을 증가시킨다. 1:10의 PEG-PCL:토코페롤 비는 0.34 mg/ml의 라파마이신 로딩량에 이르게 한다. 즉 로딩 효율은 90%이다. 1:20의 PEG-PCL:토코페롤의 비는 54%의 겔다나마이신 로딩 효율을 초래한다.

표 19. 마이셀의 약물 로딩

실시예 15

BSA 용액 중 PEG-PCL 라파마이신 방출

도 30에 나타낸 바와 같이, PEG-PCL 마이셀에 토코페롤의 도입은 또한 얻어진 마이셀 조성물이 4% BSA 용액에 라파마이신을 유지시키는데 도움을 준다. 이는 생체내 조건에서 PEG-PCL 마이셀에 토코페롤 도입의 안정한 효과를 나타낸다.

표 20. BSA를 사용하지 않고 토코페롤이 존재하지 않는 PEG-PCL

표 21. 4% BSA 중 토코페롤이 존재하지 않는 PEG-PCL

표 22. 유리 약물 방출

표 23. 4% BSA를 사용하지 않고 토코페롤을 지닌 PEG-PCL

표 24. 4% BSA 중 토코페롤을 지닌 PEG-PCL

실시예 16

뇌척수액내로 모의화된 연장된 방출

PEG-DSPE2000 1:2 토코페롤을 0.23 mg/ml BSA로 방출하였다.

표 25. 0.23 mg/ml BSA에 라파마이신 방출

실시예 17

생체내 라파마이신 연구

동물 및 수술 과정

수컷 스프라그-돌리 랫트(200 내지 240 g)를 시몬센 실험실(Gilroy, CA, USA)로부터 수득하였으며, 사용하기 전 적어도 3일 동안 동물 설비에서 음식물(Purina Rat Chow 5001) 및 물을 임의로 제공하였다. 랫트를 온도-조절된 방에서 12 시간 낮/밤 주기로 사육하였다. 약력동력학 실험 전날에, 랫트의 오른쪽 경정맥에 할로세인 마취하에서 멸균 실라스틱 캐뉼라(Dow Corning, Midland, MI, USA)를 도관삽입하였다. 이는 캐뉼라 삽입 전에 도관의 노출을 수반하였다. 캐뉼라 삽입후에, 캐뉼라에 연결된 인트라메딕(Intramedic) PE-50 폴리에틸렌 관(Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)을 등부분 피부를 통해 몸밖으로 내었다. 캐뉼라에 0.9% 염수를 흘려보내었다. 동물을 신진대사 케이지로 옮기고, 하룻밤 동안 금식시켰다. 워싱톤 주립 대학의 실험동물운용위원회로부터 동물 윤리 승인을 받았다.

12마리의 수컷 스프라그 돌리 랫트(평균 중량:220 g)를 이전 섹션에서 기술된 바와 같이 캐뉼라처리하였다. 각각의 동물을 별도의 신진대사 케이지에 배치시키고, 하룻밤 동안 회복시키고, 투약 전 12 시간 동안 금식시켰다. 실험 당일에, 동물을 DMA, PEG, 및 트윈 80 중 하나에 용해된 라파마이신(10 mg/kg)(대조군 제형), 폴리(에틸렌 글리콜)-β-폴리((ε-카프로락톤)(PEG-PCL 제형), 또는 α-토코페롤과 동시 도입된 PEG-PCL(PEG-PCL+α-토코페롤 제형)을 정맥으로 투약하였다(각 치료 군에 대해 N=4). 일련의 혈액 샘플(0.25 ml)을 0, 1 분, 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 및 48 시간에 수집하였다. 각 혈액 샘플을 두개의 0.1 ml 분획물로 나누고, 먼저 하나의 분획물을 통상의 폴리프로필렌 마이크로원심분리 튜브에 수집하고, 전혈 샘플로서 라벨링하고, 분석할 때까지 -70℃에서 저장하였다. 두번째 분획물을 헤파린 처리된 튜브(Monoject, Mansfield MA)에 수집하고 원심분리한 후, 혈장 및 적혈구(RBC) 분획물을 수집하고 분석할 때까지 -70℃에서 저장하였다.

안네슬레이 및 클라이톤(Annesley and Clayton, 2004[1])에 의해 종래 기술된 프로토콜을 약간 개조하였다. 본 출원인의 목적을 위하여, 10 ㎕의 전혈, 혈장, 캘리브레이터(calibrator) 또는 대조군을 통상의 폴리프로필렌 마이크로원심분리 튜브에 첨가하였다. 이후, 250 ㎕의 탈이온수, 250 ㎕의 수성 0.1 mol/L 아연 설페이트, 및 500 ㎕의 내부 표준물을 함유한 메탄올을 첨가하였다. 혼합물을 30 초 동안 와동시키고, 튜브를 실온에서 5 내지 10 분 동안 방치하였다. 이후, 튜브를 4 분 동안 원심분리하고, 무색의 상청액을 분석하였다. 60 mg, 3 ml 오아시스 HLB 컬럼을 샘플의 고형상 추출(SPE) 정제를 위해 사용하였다. 컬럼을 1 ml 메탄올, 이후 1 ml 물로 안정화시켰다. 제조된 상청액을 컬럼을 서서히 통과(1 내지 2 ml/분)시킨 후, 컬럼을 1 ml 물로 세척하고, 약 30 초 동안 공기-건조시켰다. LC/MS 분석을 Agilent 1100 시스템으로 수행하였다. 양이온 모드에서 모니터링된 다중-반응 모니터링 전이(m/z)는 라파마이신 931.6→864.5이었다. 40℃로 유지된 Waters Xtterra MS₁₈ 2.1×100 mm로 분리하였다. 주입 용량은 25 ㎕이었으며, 유속은 0.4 ml/분이었다. 이동상은 (A) 10 mM 암모늄 아세테이트 및 0.1% 수중 포름산, 및 (B) 10 mM 암모늄 아세테이트 및 0.1% 메탄올 중 포름산이었다. 구배 프로그램은 전체 구동 동안(15 분 동안) 50% A 및 50% B이었다.

약력동력학 분석을 WinNONLIN^® 소프트웨어(Ver. 1)를 사용하여 수행하였다. 요약한 데이타를 평균±평균의 표준오차(S.E.M.)로 표시하였다. 제거 속도 상수(λ_n)를 log-선형 말단 단계에서 혈장 농도의 선형 회귀법으로 추정하였다. AUC_0-∞를 최종 측정된 농도로 투약한 시간으로부터의 데이타, 플러스 λ_n으로 나누어진 최종 측정된 농도의 지수에 대한 조합된 log-선형 사다리꼴 법칙을 사용하여 계산하였다. 비-구획된 약력동력학적 방법을 사용하여 정맥내 투약 후 제거(CL) 및 분포 부피(V_d)를 계산하였다. 라파마이신의 혈액 분포를 상이한 라파마이신 제형을 정맥내 투약 후에 상이한 시점에서 RBC에서 검출된 농도로 혈장에서 검출된 라파마이신 농도를 나눔으로써 계산하였다.

라파마이신 대조군 제형의 정맥내 투여 후에, 라파마이신 농도의 약간의 증가는 12 시간에 나타났으며, 이는 창자간 재순환의 가능성을 지시하는 증거이다(도 1). 라파마이신의 전체 제거는 1.12±0.14 L/h/kg인 것으로 나타났다(표 1). 라파마이신의 분포 부피은 20.94±3.65 L/kg이며, 이는 몸 전체 중의 물 보다 높은 것으로, 조직에 라파마이신이 많이 분포됨을 제시하는 것이다. 라파마이신의 농도는 11.52±0.57 h의 평균 제거 반감기로 서서히 떨어지는 것으로 나타났다. 곡선 아래의 평균 면적(AUC)은 시간에 따른 혈액 중 약물 노출의 총량을 나타내는 것으로, 8.34 ±0.91 ㎍.h/ml이었다.

라파마이신 PEG-PCL 제형의 정맥내 투여 후에(도 2), 라파마이신의 전체 제거는 1.11±0.07 L/h/kg인 것으로 나타났다(표 1). 라파마이신의 분포 부피은 24.85±2.10 L/kg이었으며, 이는 몸 전체의 물 보다 높은 것으로, 조직에 라파마이신이 많이 분포됨을 제시하는 것이다. 라파마이신의 농도는 15.55±0.71 h의 평균 제거 반감기로 느리게 떨어지는 것으로 나타났다. 곡선 아래의 평균 면적(AUC)은 시간에 따른 혈액 중 약물 노출의 총량을 나타내는 것으로, 9.23 ±0.71 ㎍.h/ml이었다.

라파마이신 PEG-PCL 및 α-토코페롤 제형의 정맥내 투여 후에(도 3), 라파마이신의 전체 제거는 0.84±0.03 L/h/kg인 것으로 나타났다(표 1). 라파마이신의 분포 부피는 17.74±1.27 L/kg이었으며, 이는 몸 전체의 물 보다 높은 것으로, 조직에 라파마이신이 많이 분포됨을 제시하는 것이다. 라파마이신의 농도는 14.63±0.81 h의 평균 제거 반감기로 느리게 떨어지는 것으로 나타났다. 곡선 아래의 평균 면적(AUC)은 시간에 따른 혈액 중 약물 노출의 총량을 나타내는 것으로, 11.93±0.41 ㎍.h/ml이었다.

혈장/RBC 비율을 상이한 라파마이신 제형의 정맥내 투약 후에 1 분(도 4) 및 12 시간(도 5)에 계산하였다. 라파마이신 대조군 제형의 정맥내 투약후 1 분 및 12 시간 후의 혈장/RBC 비율은 각각 2.21 및 0.41이었다. 라파마이신 PEG-PCL 제형의 정맥내 투약 후의 비율은 각각 3.44 및 0.48이었으며, 라파마이신 PEG-PCL+α-토코페롤의 정맥내 투약 후의 비율은 각각 4.80 및 0.76이었다.

정맥내 투약한 후에, 라파마이신 대조군 제형 이후 랫트의 40% 치사율은 약물 투여후 0 내지 2 시간 후에 발생하였다. 대조군 동물은 일관되게 생기가 없는것으로 보였다. 라파마이신 마이셀 제형은 치사율이 전혀 없었다. 랫트를 신진대사 케이지에 배치하고 소변을 24 시간 간격으로 수집하고, 부피를 측정하였다. 군들 간의 신유출에서 차이가 없었다.

라파마이신 약력동력학을 랫트, 원숭이, 토끼, 및 인간을 포함하는 상이한 종에서 광범위하게 연구하였다. 이들 연구는 라파마이신이 5 시간 초과의 비교적 긴 반감기를 지니고 혈관 밖으로 잔류하는 약물의 실질적 비율을 지시하고 신체에 빠르게 흡수되는 분포부피 값을 갖는 약물인 것으로 특정되었다[2-5]. 라파마이신은 5.773의 분배 계수(XLogP)를 갖는 친유성 화합물이고 높은 분포부피 값으로서 증명된 바와 같이 조직내에 고도로 분포된다. 또한, 라파마이신은 이의 제거 값에 의해 제안된 바와 같이 고도로 추출된다.

연구된 상이한 제형은 라파마이신의 약력동력학 파라미터의 변화를 나타낸다. 대조군 제형 중 20.94 L/kg에서 토코페롤 제형 중 17.75 L/kg으로 라파마이신 분포 부피(Vd)의 변화를 나타낸다. 유사하게는, 두개의 제형은 PEG-PCL 및 PEG-PCL+토코페롤에 대해 11.52 시간(대조군)에서 각각 15.55 및 14.63 시간으로의 증가를 제공한다. 또한 대조군과 비교하여 두개의 제형의 AUC 값이 증가하고, 제거 값이 감소한다. 이러한 모든 약력동력학 파라미터 변화는 신체에 실제 보다 높은 라파마이신의 잔류 시간을 나타내었으며, 혈장 잔류의 증가는 가능한 타겟 부위에 보다 양호한 분포를 촉진할 수 있는 RBC내로의 보다 적은 분포를 제시하며, 이는 모든 제형이 동일한 용량(10 mg/kg)으로 적용되는 것으로 간주되는 경우 대조군 제형 보다 실제적으로 높은 약리학적 효과를 나타낼 것이다. 따라서, 이들 제형의 약물동력학 및 약력학 효과는 보증된다.

라파마이신의 혈액 분포를 또한 생체내에서 연구하였으며, 혈장/RBC 비율을 상이한 파라마이신 제형의 정맥내 투약 후 두 시점(1 분 및 12 시간)에서 계산하였다. 이들 결과는 모든 제형에서 1분에 적혈구 보다 혈장에서 보다 높은 파라마이신의 분포를 나타낸다. 그러나, 12 시간 후에 라파마이신은 혈장 보다 적혈구에서 보다 높은 분포를 갖는다. 시간에 대한 이러한 혈액 분포의 변화는 라파마이신이 적혈구에서 FKBP[FK506 결합 단백질]에 결합된다는 사실로 설명될 수 있다[6]. 이러한 단백질 결합은 혈장으로부터의 제거 보다 느린 적혈구로부터 라파마이신을 제거하여, 이러한 생분포 변화를 제공할 수 있다. 둘 모두의 시점(1분 및 12시간)에서 두개의 제형(PEG-PCL 및 PEG-PCL+토코페롤)은 대조군 제형 보다 높은 혈장/RBC 비율을 나타낸다. 이는 보다 높은 농도의 라파마이신이 이의 약리학적 효과를 나타내기에 더욱 이용가능한 RBC 단백질에 결합되지 않음을 나타낸다.

표 26. 랫트 전혈에서 라파마이신 제형의 약물동력학적 파라미터

실시예 18

마이셀 중 겔다나마이신 전구약물의 방출 데이타

표 4에 나타낸 바와 같이, 마이셀에 로딩된 겔다나마이신 전구약물은 매우 안정하다. 17-아미노에틸-팔미테이트-17-데메톡시겔다나마이신 또는 17-아미노에틸-도데코네이트-17-데메톡시겔다나마이신이 로딩된 마이셀은 약 8일 후에 거의 모든 약물을 방출한다. 17-아미노에틸-브로모도데코네이트-17-데메톡시겔다나마이신 또는 17-아미노-헥실데실-17-데메톡시겔다나마이신이 로딩된 마이셀은 약 12일 후에 실질적으로 모든 약물을 방출한다. 17-아미노에틸-브로모헥소네이트-17-데메톡시겔다나마이신 또는 17-아미노에틸-브로모팔미테이트-17-데메톡시겔다나마이신이 로딩된 마이셀은 약 14일 후에 실질적으로 모든 약물을 방출한다.

실시예 19

파클리탁셀 전구약물 제형

실시예 19

파클라탁셀 전구약물 제형

표 28. 파클리탁셀 전구약물

7-팔미테이트-파클리탁셀(4c)의 합성. 2-팔미테이트-파클리탁셀(4c)의 합성방법은 하기에 기술된다. (4a) 및 (4b)는 적절한 지방산 무수물로 대체하면서 동일한 과정에 따랐다.

2-TBS-파클리탁셀(2). 1.2 ml 건조된 DMF 중 파클라탁셀 1(300 mg, 0.35 mmol)의 용액에 TBDMSCI(158.84 mg, 1.053 mmol) 및 이미다졸(59.80 mg, 0.8783 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 얻어진 용액을 진공 중에서 건조상태로 감소시키고, 2 ml CH₂Cl₂에 다시 용해시키고, 포화된 NH₄Cl(5 ml×1) 이후 물(5 ml×1)로 세척하고, 유기층을 Na₂SO₄로 건조시켰다. 용매를 제거하고, 실리카겔 상 예비 TLC(1:1 EtOAc:헥산) 후에 백색 고형물(310.42 mg, 95% 수율)로서 2를 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 0.5 (s, 9H, 3차-부틸), 1.10 (s, 3H, H17), 1.22 (s, 3H, H16), 1.76 (s, 3H, H19), 1.93 (s, 3H, H18), 1.92-2.14 (m, 2H, H6), 2.3 및 2.56 (m, 2H, H14), 2.58 (s, 3H, 4-Ac), 3.91 (d, J=6.9 Hz, 1H, H3), 4.23 (d, J=8.1 Hz, H=1, H20), 4.30 (d, J=1.8 Hz, 1H, 10-OH), 4.35 (d, J=8.1 Hz, 1H, H20), 4.42 (dd, J=6.6 및 10.8 Hz, 1H, H7), 4.68 (d, J=2.1 Hz, 1H, H2'), 4.98 (dd, J=1.5 및 9.3 Hz, 1H, H5), 5,13 (d, J=1.8 Hz, 1H, H10), 5.69 (d, J=6.9 Hz, 1H, H2), 5.73 (dd, J=1.8 및 9 Hz, 1H, H3'), 6.34 (t, J=8.7 Hz, 1H, H13), 7.11 (d, J=9 Hz, 1H, NH), 7.33-8.16 (m, 15H).

2-TBS-7-팔미테이트-파클리탁셀(3). 1 ml 건조된 톨루엔 중 2(50 mg, 0.053 mmol)의 용액에 팔미트산 무수물(38.3 mg, 0.0774 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 90℃에서 18 시간 동안 교반하였다. 얻어진 용액을 1M HCl(5 ml×1) 이후 물(5 ml×1)로 세척하고, 유기층을 Na₂SO₄로 건조하였다. 용매를 제거한 후 실리카 상에서 제조용 TLC(1:1 EtOAc:헥산)로 화합물 (3)을 백색 고형물로서 수득하였다(25 mg, 41% 수율).

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 0.5 (s, 9H, 3차-부틸), 0.88 (t, 3H, CH3), 1.10 (s, 3H, H17), 1.22 (s, 3H, H16), 1.76 (s, 3H, H19), 1.93 (s, 3H, H18), 1.92-2.14 (m, 2H, H6), 2.3 및 2.56 (m, 2H, H14), 2.58 (s, 3H, 4-Ac), 3.91 (d, J=6.9 Hz, 1H, H3), 4.23 (d, J=8.1 Hz, 1H, H20), 4.30 (d, J=1.8 Hz, 1H, 10-OH), 4.35 (d, J=8.1 Hz, 1H, H20), 4.42 (dd, J=6.6 및 10.8 Hz, 1H, H7), 4.68 (d, J=2.1 Hz, 1H, H2'), 4.98 (dd, J=1.5 및 9.3 Hz, 1H, H5), 5.13 (d, J=1.8 Hz, 1H, H10), 5.69 (d, J=6.9 Hz, 1H, H2), 5.73 (dd, J=1.8 및 9 Hz, 1H, H3'), 6.34 (t, J=8.7 Hz, 1H, H13), 7.11 (d, J=9 Hz, 1H, NH), 7.33-8.16 (m, 15H).

7-팔미테이트-파클리탁셀(4c). 1 ml의 THF 중 화합물 (3)(25 mg, 0.211 mmol)의 용액에 THF 중 1M TBAF(테트라부틸암모늄플루오라이드) 5 방울을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 얻어진 용액을 진공 중에 건조상태로 감소시키고, 2 ml CH₂Cl₂에 다시 용해시키고, 물(5 ml×1)로 세척하고, 유기층을 Na₂SO₄로 건조하였다. 용매를 제거한 후 실리카 상에서 제조용 TLC(1:1 EtOAc:헥산)로 화합물 (4c)를 백색 고형물로서 수득하였다(20 mg, 90% 수율). ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 0.88 (t, 3H, CH3), 1.10 (s, 3H, H17), 1.22 (s, 3H, H16), 1.76 (s, 3H, H19), 1.93 (s, 3H, H18), 1.92-2.14 (m, 2H, H6), 2.3 및 2.56 (m, 2H, H14), 2.58 (s, 3H, 4-Ac), 3.91 (d, J=6.9 Hz, 1H, H3), 4.23 (d, J=8.1 Hz, 1H, H20), 4.30 (d, J=1.8 Hz, 1H, 10-OH), 4.35 (d, J=8.1 Hz, 1H, H20), 4.42 (dd, J=6.6 및 10.8 Hz, 1H, H7), 4.68 (d, J=2.1 Hz, 1H, H2'), 4.98 (dd, J=1.5 및 9.3 Hz, 1H, H5), 5.13 (d, J=1.8 Hz, 1H, H10), 5.69 (d, J=6.9 Hz, 1H, H2), 5.73 (dd, J=1.8 및 9 Hz, 1H, H3'), 6.34 (t, J=8.7 Hz, 1H, H13), 7.11 (d, J=9 Hz, 1H, NH), 7.33-8.16 (m, 15H).

2-팔미테이트-파클리탁셀 (5c)의 합성

2-팔미테이트-파클리탁셀 (5c)의 합성 방법을 하기에 기술하였다. 화합물 (5a-b)의 합성은 적절한 지방산 무수물로 대체하면서 동일한 과정에 따랐다.

2-팔미테이트-파클리탁셀 (5c). 1.5 ml 무수 톨루엔 중 파클리탁셀 (1)(100 mg, 0.117 mmol)의 용액에 팔미트산 무수물(115.79 mg, 0.234 mmol) 및 DMAP(11.435 mg, 0.0936 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 얻어진 용액을 1M HCl(5 ml×1) 및 물(5 ml×1)로 세척하고, 유기층을 Na₂SO₄로 건조하였다. 용매를 제거한 후 실리카 상에서 제조용 TLC(1:1 EtOAc:헥산)로 화합물 (5c)를 백색 고형물로서 수득하였다(60 mg, 47% 수율). ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 0.87 (t, 3H, CH3), 1.10 (s, 3H, H17), 1.22 (s, 3H, H16), 1.76 (s, 3H, H19), 1.93 (s, 3H, H18), 1.92-2.14 (m, 2H, H6), 2.3 및 2.56 (m, 2H, H14), 2.58 (s, 3H, 4-Ac), 3.91 (d, J=6.9 Hz, 1H, H3), 4.23 (d, J=8.1 Hz, 1H, H20), 4.30 (d, J=1.8 Hz, 1H, 10-OH), 4.35 (d, J=8.1 Hz, 1H, H20), 4.42 (dd, J=6.6 및 10.8 Hz, 1H, H7), 4.68 (d, J=2.1 Hz, 1H, H2'), 4.98 (dd, J=1.5 및 9.3 Hz, 1H, H5), 5.13 (d, J=1.8 Hz, 1H, H10), 5.69 (d, J=6.9 Hz, 1H, H2), 5.73 (dd, J=1.8 및 9 Hz, 1H, H3'), 6.34 (t, J=8.7 Hz, 1H, H13), 7.11 (d, J=9 Hz, 1H, NH), 7.33-8.16 (m, 15H).

전구약물 로딩된 PEG-b-PCL 마이셀의 제조 및 특성평가

PEG-b-PCL(5000:10500, M_W/M_n 1.11, JCS Biopolytech Inc., Toronto, Ontario Canada) 및 전구약물을 최소량의 아세톤에 용해시키고 시린지 펌프를 사용하여 격렬하게 교반된 ddH₂O에 적가하여 파클리탁셀 전구약물 로딩된 PEG-b-PCL 마이셀을 제조하였다. 유기용매를 공기 퍼징하에서 교반하면서 제거하였다. 제시되는 경우, 샘플을 공기 퍼징 하에서 연장된 증발로 추가 농축하였다. 유기 용매를 제거한 후, PEG-b-PCL 마이셀을 0.22 ㎛ 폴리에스테르설폰 필터를 통과시켜 불용성 물질 및 도입되지 않은 약물을 제거하였다[1]. 통상적인 실험에서, 1 μM의 PEG-b-PCL을 0.75 ml의 건조된 아세톤에 용해시키고, 2 ml의 ddH₂O에 적가하고(50 ㎕/ml), 휘발성 유기 용매를 제거한 후에 0.5 mM PEG-b-PCL 마이셀을 수득하였다.

PEG-b-PCL에 전구약물의 도입을 겔 투과 크로마토그래피로부터의 UV 및 RI 크로마토그래프의 균등한 머무름 시간으로 입증하였다. PEG-b-PCL 마이셀을 OHpak SB-806M GPC 컬럼(20 ㎕ 주입, 0.5 mM PEG-b-PCL, 0.75 ml/분의 ddH₂O, 10℃)(Shodex, Kawasaki, Japan) 상에 주입하고, 굴절지수(RI) 및 UV 흡광도(232 nm)로 탐지하였다. PEG-b-PCL 마이셀에 전구약물 로딩을 0.01% (v/v) 트리플루오로아세트산-ACN 구배(40 내지 100% ACN, 50℃, 232 nm 검출)를 사용하여 역상 HPLC(Alltech Econosphere 3 ㎛ 4.6×50 mm)로 측정하였다. PEG-b-PCL 마이셀의 유체동력학적 직경을 동적 광산란기(DLS)(NICOMP 380 ZLS, Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA)로 측정하였다. 데이타를 세기-가중된 가우시안 분포 피팅(NICOMP 버젼 1.76)으로 분석하였다. 채널 1에서 최소 10분 또는 적어도 100×10⁵ 카운트 동안 측정하였다.

PEG-b-PCL 마이셀 전구약물 방출 연구. 방출 실험을 온도 및 pH 조절을 변경하면서 아이젠버그(Eisenberg) 및 공동연구자의 방법(Soo, P.L., et al., 2002)을 기초로 하였다. 마이셀 전구약물 용액을 상술된 20% w/w 전구약물과 함께 0.5 mM(PEG-b-PCL 기재)로 제조하고, 0.5 ml의 각각의 용액을 ddH₂O로 2.5 ml까지 희석시키고, 10000MWCO 투석 카셋트(Pierce, Rockford, IL)(n=4)에 주입하였다. 투석 카셋트를 37℃에서 잘 혼합된 온도 조절된 수욕에 배치시키고, ddH₂O를 넘치게 하여 욕 부피를 15 내지 20분 마다 다시 새롭게 하였다. 컴퓨터 조절하의 튜브연동식 펌프는 별도로 50 g/L의 3염기 및 1염기 포스페이트의 용액을 주입하여 pH를 7.4±0.05로 유지시켰다(실험실내 구비된 장치). 고정된 시점에서, 투석 카셋트 부피를 ddH₂O로 2.5 ml까지 만들고, 100 ㎕ 분취액을 회수하고, 전구약물 농도를 역상 HPLC로 결정하였다(상술됨).

확산 계수 및 방출 반감기를 짧은 기간 동안 크랭크(Crank) 용액을 사용하여 침투가능한 구로부터 픽키안 확산(Fickian diffusion)과 같은 모델링 방출로 전술된 바와 같이 결정하였다. 방출 데이타의 선형 회귀법을 시그마 플롯 9.0(Sysstat Software, Inc.)에서 수행하였다. 확산 계수를 독립 샘플(n≥3)에 대해 결정하였고, 평균±표준편차로 기재하였다. 방출 반감기를 50% 약물 방출에 대해 크랭크 용액 중 계산된 확산 계수를 사용하여 결정하였다.

옥탄올-물 분별 계수. 파클리탁셀 전구약물의 옥탄올-물 분별 계수(log P_o/w)를 클로츠 등(Klotz et al.)의 기술을 기초로 한 마이크로에멀젼 동전기 크로마토그래피(MEEKC)로 간접적으로 결정하였다(22). 전개 완충액(running buffer)을 25 mM 나트륨 포스페이트 1염기를 50 mM 나트륨 테트라보레이트로 pH 7.00까지 적정하여 제조하고, 1.44 g의 나트륨 도데실 설페이트, 6.49 g의 1-부탄올, 및 0.82 g의 헵탄을 포스페이트-보레이트 완충액과 함께 100 ml로 만들었다. 전개 완충액을 얼음물 중 밀폐된 250 ml 플라스크에서 30 분 동안 초음파처리하였다(G112SP1 Special Ultrasonic Cleaner, Laboratory Supplies Company Inc., Hicksville, NY). 보다 낮은 힘의 초음파처리기로 안정한 에멀젼을 수득하기 위해서는 보다 긴 시간이 요구될 수 있다. 화합물 및 표준물질(n=3)을 밀폐된 튜브에서 초음파 처리하면서(10 분) 0.5 ㎕/ml의 니트로메탄 및 0.5 ㎕/ml의 1-페닐도데칸과 함께 전개 완충액(0.05 mg/ml)에 용해시키고 원심분리(16000×g, 3분)하여 탈기시켰다. 50 ㎛ ID×37 cm 비코팅된 발연-실리카 컬럼(Polymicron Technologies LLC, Phoenix, AZ)이 장착된 바이오포커스 3000 모세관 전기영동 시스템(Bio-Rad, Hercules, CA)을 MEEKC 실험을 위해 사용하였다. 컬럼을 1M NaOH로 5분 동안 사전세척하고, 전개 전에 0.1M NaOH로 1 분 동안, ddH₂O로 1 분 동안, 100 psi(690 kPa)에서 전개 완충액으로 1 분 동안 사전세척하였다. 전개 조건은 20℃에서 10 kV(ca. 30 내지 35 μA, 30 분/전개)이었으며, 1 psi.s(6.9 kPa.s)로 주입하고 210 nm 및 232 nm에서 검출하였다. Log P_o/w 및 머무름 인자, k'를 하기 수학식을 사용하여 계산하였다:

상기 식에서, t_r, t₀, 및 t_me는 각각 전구약물, 니트로메탄 및 1-페닐도데칸의 머무름 시간이다. 피팅 파라미터 a 및 b를 공지된 표준물질의 선형 회귀법으로 결정하였다: 피리딘, 페놀, 벤조산, 아니솔, 벤젠, 톨루엔, 도데칸산, 벤조피렌 및 피렌(R²=0.996, Excel® 2003, Microsoft Corp.).

세포독성 결정.

10% 소태아 혈청, 100 IU 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 2 mM _L-글루타민이 보충된 90 ㎕의 RMPI 1640 (MCF-7) 또는 DMEM(MDA-MB-231) 중 MCF-7 및 MDA-MB-231 인간 유방암 세포(American Tissue Type Collection)를 96-웰 플레이트에 웰 당 5000개 세포의 초기 밀도로 플레이팅하고, 5% CO₂ 분위기, 37℃로 유지시켰다. 24 시간 후에, DMSO 중 시험 화합물을 성장 매질로 10 배 희석시키고, 10 ㎕ 분취액(1% v/v 최종 DMSO 농도)으로서 웰(삼중배의 2웰, n=6)에 첨가하였다. 세포를 96 시간 동안 화합물과 함께 인큐베이션하고 신진대사 속도를 XTT 검정법을 사용하여 결정하였다. 간단하게는, 20 ㎕의 새롭게 제조된 검정 용액(1 mg/ml XTT 및 0.1 mg/ml PBS 중 N-메틸펜아조늄 메틸 설페이트)을 각 웰에 첨가하고, 세포를 4 시간 동안 인큐베이션하고, 흡광도를 630 nm에서 바탕값을 삭감하면서 550 nm에서 측정하였다. 세포 성장을 50%를 억제하는 농도(IC₅₀)를 Sigma Plot 2004(Systat Software, Inc.)로 고정된 Hill 기울기 회귀법으로 결정하고, 별도의 측정값의 평균±표준편차로서 기재하였다.

표 29. 파클리탁셀 전구약물이 로딩된 PEG-PCL 마이셀의 크기

^a 20% w/w 약물로 제조된 약물 로딩된 마이셀의 가우시안 세기 가중된 DLS로부터의 유체역학적 직경. 실제 로딩은 하기 표 2에 나타내었다. 표 2: 파클리탁셀 전구약물의 용해도 파라미터 및 PEG-b-PCL 용해도.

표 30. 파클리탁셀 및 전구약물 특성평가

^a 0.5 mM PEG-b-PCL 마이셀 중 20% w/w 전구약물 로딩을 기초로 한 용해도 및 캡슐화. 수득된 결과±표준편차(n=3). ^b 괄호의 결과는 본래 부피의 25%로 증발시키고 재여과(0.22 ㎛)한 후의 결과이다.

Claims

양쪽성 중합체, 약 3.5 초과의 log Po/w 및 약 1000 Da 미만의 분자량을 갖는 소수성 부형제, 및 소수성 패신저(passenger) 약물을 포함하는 마이셀 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 양쪽성 중합체가 페길화된 인지질 및 페길화된 블록 공중합체로 구성된 군으로부터 선택된 마이셀 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 소수성 부형제가 비타민 E를 포함하는 마이셀 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 소수성 패신저 약물이 라파마이신, 파클리탁셀, 파클리탁셀 전구약물, 겔다나마이신 및 겔다나마이신 전구약물로 구성된 군으로부터 선택된 마이셀 조성물.
라파마이신, 파클리탁셀, 파클리탁셀 전구약물, 겔다나마이신 및 겔다나마이신 전구약물로 구성된 군으로부터 선택된 소수성 패신저 약물 및 양쪽성 중합체를 포함하는 마이셀 조성물.
제 5항에 있어서, 소수성 부형제를 추가로 포함하는 마이셀 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 양쪽성 중합체가 PEG-DSPE, PEG-PCL, 및 PEG-폴리아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된 마이셀 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 소수성 부형제가 비타민 E인 마이셀 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 양쪽성 중합체에 대한 상기 비타민 E의 비율이 약 0.2 내지 약 50인 마이셀 조성물.
양쪽성 중합체, 소수성 부형제 및 소수성 약물을 유기 용매에서 혼합하여 용액을 형성하는 단계; 및

상기 용액으로부터 실질적으로 모든 상기 유기 용매를 제거하여 실질적으로 용매-부재 혼합물을 잔류시키는 단계를 포함하여, 마이셀 조성물을 형성시키는 방법.
제 10항에 있어서, 물 또는 완충액 중에 상기 실질적으로 용매-부재 혼합물을 재현탁시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 용액으로부터 실질적으로 모든 상기 용매를 제거하여 실질적으로 용매-부재 혼합물을 잔류시키는 단계 전에, 상기 용액을 실질적으로 수용액에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 양쪽성 중합체의 농도가 약 0.1 mM 내지 약 60 mM이며, 상기 소수성 부형제의 농도가 약 0.1 mM 내지 약 600 mM이며, 상기 약물의 농도가 약 0.1 mg/ml 내지 약 10.0 mg/ml인 방법.
제 11항에 있어서, 상기 소수성 약물이 라파마이신, 파클리탁셀, 파클리탁셀 전구약물, 겔다나마이신 및 겔다나마이신 전구약물로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
제 12항에 있어서, 상기 소수성 약물이 라파마이신, 파클리탁셀, 파클리탁셀 전구약물, 겔다나마이신 및 겔다나마이신 전구약물로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
겔다나마이신 및 파클리탁셀로 구성된 군으로부터 선택된 약 3.5 이상의 log Po/w를 갖는 전구약물 조성물.
제 16항에 있어서, 상기 겔다나마이신이 C17 위치에 아미노 스페이서 기, 및 상기 스페이서 기에 인접한 R 기를 지니는 전구약물 조성물.
제 17항에 있어서, 상기 R기가 약 4 내지 약 24개 탄소의 탄소 사슬을 포함하는 전구약물 조성물.
제 16항에 있어서, 상기 파클리탁셀이 아미노 링커기, 및 상기 아미노 링커기에 인접한 R 기를 지니는 전구약물 조성물.
제 19항에 있어서, 상기 파클리탁셀이 C7 위치에 아미노 링커기를 지니는 전구약물 조성물.
제 16항에 있어서, 상기 R기가 에스테르, 히드라존, 및 디설파이드로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 갖는 R기를 포함하는 전구약물 조성물.
제 19항에 있어서, 상기 R기가 약 4 내지 약 24개 탄소의 탄소 사슬을 포함하는 전구약물 조성물.