SK17012001A3 - Prostriedok obsahujúci vodný roztok, lyofilizovaný prostriedok Abeta peptidu, spôsob prípravy sterilného prostriedku, spôsob prevencie a liečby, spôsob vyvolania protilátkovej odpovede a použitie - Google Patents

Description

Tento vynález sa týka farmaceutického prostriedku obsahujúceho proteíny, ktoré je možné použiť na vyvolanie protilátkovej odpovede u cicavcov. Špecificky sa tento vynález vzťahuje na farmaceutický akceptovateľný prostriedok, ktorý obsahuje množstvo beta-amyloidného peptidu dostatočného na vyvolanie imunitnej odpovede u cicavcov, s farmaceutický akceptovateľným rozpúšťadlom. Rozpúšťadlom je najmä sterilná parenterálne akceptovateľná vodná fáza.

Doterajší stav techniky

Beta-amyloid peptid, označovaný tiež A-beta peptid alebo Αβ peptid, je štiepný produkt amyloidného prekurzorového proteínu (APP). Je základnou zložkou amyloidných plakov v mozgu cicavcov, ktorých výskyt je základnou charakteristikou Alzheimerovej demencie. Αβ je 39 až 43 aminokyselinový reťazec, ktorý sa líši dĺžkou v závislosti od variability svojho vzniku z APP s účasťou niekoľkých protéz.

Niekoľko mutácií vo vnútri APP proteínu sa spojuje s prítomnosťou Alzheimerovej demencie. Viď napr. Goate et al., Náture 349, 704 (1991) (valín⁷¹⁷ za izoleucín), Chartier.Harlan et al., Náture 353, 844 (1991) (valín⁷¹⁷ za glycín), Murell et al., Science 254, 97 (1991) (valín⁷¹⁷ za feriylalanín), Mullan et al., Náture Genet. 1,345 (1992) (dvojitá mutácia zámeny lyzínu⁵⁹⁵-metionínu⁵⁹⁶ za asparagín⁵⁹⁵leucín⁵⁹⁶). Predpokladá sa, že tieto mutácie spôsobujú Alzheimerovú demenciu zvýšením alebo alteráciou premeny APP na Αβ peptid, predovšetkým premenou APP na zvýšené množstvo Αβ42 a Αβ43. Mutácie v iných génoch, ako sú presenilínové gény, PS1 a PS2, sú považované za nepriamu príčinu postihnutia premeny APP vytvárajúce zvýšené množstvo Αβ42 a Αβ43 (viď Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Pozorovania ukazujú, že Αβ peptid a predovšetkým Αβ42 je prvkom spôsobujúcim vznik Alzheimerovej demencie. V mozgu sa Αβ proteín hromadí a vytvárajú sa amyloidné ložiská, v ktorých sa peptid organizuje do fibríl so štruktúrou β-skladaného listu.

Súčasný výskum zaoberajúci sa liečbou alebo prevenciou Alzheimerovej choroby sa zameral na snahu zastavenia alebo spomalenia tvorby Αβ peptidu v mozgu alebo blokovanie jeho následnej úpravy alebo hromadenia v amyloidných plakoch. Jeden z terapeutických postupov, ktorý má zásadný význam na aplikáciu tohto vynálezu, je použitie Αβ peptidu na vyvolanie imunitnej odpovede proti tomuto proteínu. Viď napr. publikácia PCT č. WO 99/27 944, ktorá je takto odkazom začlenená v celom rozsahu.

Prítomný vynález sa zameriava na nové a nečakané metódy na uskutočnenie vynálezu opísaného v publikácii PCT č. WO 99/27 944. Predovšetkým zahŕňa podávanie určitých podôb dlhých foriem Αβ peptidu pacientovi na indukciu imunitnej odpovede. Aj napriek tomu, ako bolo v odbore opísané, je ťažké rozpúšťať dlhé formy Αβ peptidov v bežných systémoch.

Zvlášť Hilbich et al., j. Mol. Biol., 218 (1), pp. 149-64, (1991) opisuje, že zatiaľ čo je Αβ1-43 peptid rozpustný do určitého stupňa v čistej vode, pridanie iónových zložiek ako sú pufry alebo soli, alebo organických roztokov spôsobuje precipitáciu z roztoku vo forme amorfnej zrazeniny.

Hilbich napríklad opisuje, že fosfátový pufor obsahujúci chlorid sodný („PBS“, ktorý v tomto prípade obsahuje 137 mM NaCI, 3 mM KCI, 8 mM Na₂HPO₄«2H₂O a 2 mM KH₂PO₄, pH 7,5) dosiahol nerozpustnosť 90 až 94 % peptidu obsiahnutého v prípravku. PBS je bežný nosič pre parenterálny prostriedok s tonicitou a hodnotou pH zodpovedajúcou hodnotám živých systémov. 5 mM NaCI spôsobuje precipitáciu 42 až 50 % peptidu (tak isto, str. 153, tabuľka 2). Roztok peptidu v čistej vode by bol hypotonícký a jeho pH by sa podľa Hilbucha priblížilo k hodnote 5,5. Typická hodnota pH krvi človeka je okolo 7,4. Dyrks, et al. tiež opísali, že Αβ42 je za fyziologických podmienok nerozpustný! Dyrks, T., Weidemann, A., Mulhaup, G., et al. EMBO J.7, pp. 949 až 57 (1988)).

Štruktúra Αβ peptidu v roztoku môže byť určená za použitia spektroskopie cirkulárneho dichroizmu (C.D.). Štruktúrne štúdie Αβ peptidu a fragmentov používajúcich C.D. zaznamenal Hilbich, et al, idem. Viď tiež monografiu od M. Manninga s názvom: Proteín Structure and Stability Assessment by Circular Dichroism Spectroscopy, z Biocatyst design for Stability and Specificity, Himmel, M.E. a Georgiou, G., eds., ACS Symposium Šerieš 516 (1993) na str. 36. Tento odkaz, ktorý je ďalej uvádzaný ako odkaz na Manninga, je tu takto vložený v celom rozsahu.

Kline et al., Patent US č. 5 851 996 ('996 patent) a 5 753 624 ('624 patent) opisujú podávanie veľmi malého množstva (10'² mg alebo menej) Αβ peptidu alebo jeho fragmentu sublinguálne v kvapalnom alebo pevnom nosiči, ako je fenylovaný roztok chloridu sodného. '996 patent uvádza, že amyloidný beta proteín „existuje v rôznych štrukturálnych formách“ (stĺpec 2, riadok 31) a že tieto môžu byť použité pri liečbe Alzheimerovej demencie. Nie je nikde definované, čo sa myslí rôznymi štrukturálnymi formami, ani nie je nikde viac charakterizovaný 28-aminokyselinový fragment použitý v príklade. Veľkosť dávky Αβ peptidu je v '996 patente ustanovená v rozmedzí od 1O'¹⁰ do 10'² mg (stĺpec 8, riadok 442 až 443).

Z hľadiska vyššie opísaného bolo primárnou snahou ukázať, ako ťažké je rozpustiť Αβ peptid a uchovať ho v tomto stave. Navyše sa i cez dobrú rozpustnosť dlhých foriem Αβ peptidu objavili komplikácie z hľadiska sterilizácie a štandardizácie. Väčšina štandardných sterilizačných metód je nevhodných pre peptidový prostriedok, vrátane radiácie, techník chemickej sterilizácie, ako sú etylénoxidové páry a glutaraldehyd, ktoré všetky spôsobujú degradáciu peptidu. Preto by metódou voľby sterilizácie Αβ peptidového prostriedku bola filtrácia peptidu. Prekážkou je nerozpustnosť Αβ peptidu, ktorá spôsobí upchatie filtračnej membrány, čo znemožňuje získať dostatočné množstvo Αβ peptidu na komerčný rozsah výroby.

Podstata vynálezu

Tento vynález sa zameriava na prekvapivé a neočakávané zistenie, že vodný roztok obsahujúci vysokú koncentráciu Αβ peptidu je možné pripraviť úpravou pH roztoku na acidické/bázické hodnoty, pri ktorých sa Αβ peptid rozpustí. Preferujú sa hodnoty v rozmedzí približne od 8,5 do 12, najmä hodnoty okolo pH 9 až 10.

Vynález sa ďalej zameriava na zistenie, že vzniknuté roztoky Αβ peptidu je možné podrobiť sterilnej filtrácii cez vhodný mikropórový filter so ziskom najmenej 50 % Αβ peptidu z filtrácie. Je v prednostnom záujme získať aspoň 70 % Αβ peptidu, najlepšie aspoň 90 %. Takýto sterilný roztok môže byť považovaný za farmaceutickú zložku obsahujúcu dostatočné množstvo Αβ peptidu na vyvolanie imunogénnej odpovede po pododaní cicavcom. Uprednostňované je parenterálne podanie vo forme suspenzie.

Jedným aspektom prostriedku podľa vynálezu je úprava pH prostriedku po sterilnej filtrácii na fyziologicky akceptovateľné hodnoty tak, aby peptidová suspenzia obsahovala najmenej 0,1 mg/ml Αβ peptidu. Tento prostriedok je potom vhodný na parenterálne podanie. Hodnoty pH suspenzie sa pohybujú v rozmedzí od 5 do 7, prednostne medzi 5,5 až 6,5. Prostriedok, ktorý sa najviac uprednostňuje, obsahuje dostatočné množstvo QS-21 v spojení s Αβ peptidom tak, že vytvára opticky čistú, sterilnú suspenziu.

Tento vynález sa ďalej zameriava na zistenie, že rozpustné a potom sterilné roztoky Αβ peptidu môžu byť lyofilizované, poskytujúce tak lyofilizovanú podobu obsahujúcu Αβ peptid.

V momente potreby môžu byť z tejto podoby späť prevedené na vodné prostriedky obsahujúce Αβ peptid.

Ďalej sa tento vynález zameriava na vodný roztok s obsahom najmenej 0,01 mg/ml Αβ peptidu s pH zodpovedajúcim rozpustenej forme Αβ peptidu. Roztok je udržovaný na optimálnej hodnote pH pomocou dostatočného množstva farmaceutický akceptovateľného pufru.

Ďalej je tento vynález zameraný na sterilný vodný roztok obsahujúci najmenej 0,01 mg/ml Αβ peptidu s pH zodpovedajúcom rozpustenej forme Αβ peptidu. Roztok je udržovaný na optimálnej hodnote pH pomocou dostatočného množstva farmaceutický akceptovateľného pufru.

Ďalším zameraním tohto vynálezu sú lyofylizované prostriedky obsahujúce Αβ peptid pripravené spôsobom:

a) zmrazením sterilného vodného roztoku obsahujúceho aspoň 0,01 mg/ml Αβ peptidu, kde daný vodný roztok je udržovaný pri pH dostatočnom na rozpustenie daného Αβ peptidu a

b) lyofilizáciou zmrazeného prostriedku pripraveného podľa kroku a).

S výhodou zahrňuje prostriedok tohto vynálezu dlhú formu (definovanú nižšie) Αβ peptidu. Najlepšie potom prostriedok zahŕňa farmaceutický akceptovateľný pufor, vybraný najskôr zo skupiny tvorenej aminokyselinami, ich solárni a derivátmi, farmakologicky akceptovateľnými alkáliami, hydroxidmi kovov a amóniumhydroxidmi, organickými a anorganickými kyselinami a ich solárni, a zmesami uvedených zlúčenín.

Ďalej sa tento vynález zameriava na prostriedok zahrňujúci vodný roztok, ktorý obsahuje aspoň 0,01 mg/ml Αβ peptidu, ktorého pH je zodpovedajúce na zachovanie rozpustenej formy Αβ peptidu a kde Αβ peptid je vo významnej miere v náhodne zvinutej konformácii.

Prostriedok tohto vynálezu môže byť upravený na farmaceutický prostriedok vhodný na podanie cicavcom s Alzheimorovou demenciou alebo v riziku rozvoja tejto demencie.

Aspekty zloženia vynálezu sa zameriavajú na farmaceutické prostriedky, ktoré sú vodnou suspenziou najmenej 0,01 mg/ml Αβ peptidu obsiahnutého v rozpustnej náhodne zvinutej konformácii alebo stabilnej forme a alebo sú lyofilizované, kedy akýkoľvek z nich môže byť v sterilnej podobe parenterálne aplikovaný.

Jedným zo zamerania vynálezu je spôsob prípravy sterilného prostriedku dlhej formy Αβ peptidu, ktorý zahrňuje:

- úpravu pH vodného roztoku na hodnotu dostatočnú na rozpustenie Αβ peptidu,

- rozpustenie Αβ peptidu v roztoku v množstve dostatočnom na dosiahnutie imonogénnej koncentrácie Αβ peptidu pre cicavce,

- filtrácie výsledného roztoku cez membránu s pórmi s rovnakou veľkosťou, ktorá sa pohybuje v rozmedzí dostatočnom na zachytenie baktérií a zároveň umožňujúcim priechod takmer všetkého množstva Αβ peptidu, a

- úpravou pH roztokov obsahujúcich 0,1 mg/ml alebo viac Αβ peptidu na hodnoty okolo pH 5 až 7 s cieľom získať suspenziu peptidu.

Ďalším zameraním tohto vynálezu je spôsob prevencie a liečby Alzheimerovej demencie u cicavcov, ktorého postup zahŕňa podávanie dostatočného množstva sterilného vodného prostriedku obsahujúceho aspoň 0,05 mg/ml Αβ peptidu cicavcov s cieľom imunitnej odpovede.

Tento vynález uprednostňuje filtráciu Αβ peptidu, ktorý sa väčšinou nachádza v náhodne zvinutej konformácii.

Tento vynález sa zameriava na prostriedky a metódy, ktoré používajú vodné prostriedky obsahujúce terapeuticky účinnú koncentráciu Αβ peptidu. Predtým ako pristúpime k opisu vlastného vynálezu vo väčších detailoch, budú definované nasledujúce termíny.

Definície:

Termín „významná identita“ znamená, že dve peptidové sekvencie, pokiaľ sú optimálne zoradené, ako pomocou programov GAP alebo BESTFIT používajúcich trvalo rozdielne hmotnosti, majú aspoň 65 % sekvenčnej identity, s výhodou 80 alebo 90 %, najlepšie aspoň 95 % sekvenčnej identity alebo viac (napr. 99 % sekvenčná identita alebo vyššia). Zvyšné pozície, ktoré nie sú identické, sa líšia konzervatívnou substitúciou aminokyselín.

Na porovnanie sekvencii predstavuje typicky jedna sekvencia referenčnú sekvenciu, proti ktorej sa porovnáva testovaná sekvencia. Vhodnou referenčnou sekvenciou by bola sekvencia ľudského Αβ peptidu, konkrétne 42-aminokyselinová sekvencia opísaná nižšie. Ďalšie vhodné formy by boli skrátené sekvencie: ako je Αβ39, alebo predĺžená sekvencia Αβ43 (s pridanou treonínovou skupinou na Cterminálnom konci). Pri použití porovnávajúceho algoritmu sekvencie, sa referenčná a testovacia sekvencia zadá do počítača, pokiaľ je to nutné zadajú sa zhodné oblasti sekvencii, a nastavia sa parametre programu sekvenovacieho algoritmu. Porovnávací sekvenčný algaritmus potom na základe zvolených parametrov percentuálne vyhodnotí sekvenčnú zhodu testovanej sekvencie vzťahovanej na referenčnú sekvenciu.

Optimálne polohy sekvencii na porovnanie je možné dosiahnuť napr. pomocou algoritmu lokálnej homológie: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), algoritmu homológneho postavenia: Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), metódou hľadania zhodnej oblasti: Pearson & Lipman, proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 85:2 444 (1988), počítačovým uskutočnením týchto algoritmov (GAP, BESTFIT, FASTA a TFASTA z Wisconsin Genetic Software Package, Genetic Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl) alebo vizuálnou kontrolou (Ausubelt et al., viď vyššie v celom rozsahu). Príkladom vhodného algoritmu na percentuálne určenie sekvenčnej zhody a sekvenčnej podobnosti je algoritmus BLAST, opísaný v Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990): Softvérové vybavenie na uskutočnenie BLAST analýzy je verejne dostupné prostredníctvom National Center for Biotechnology Information (http://www.nebi.nlm.nih.gov/). Na uskutočnenie sekvenčného porovnania je možné použiť trvalé parametre programu, ale je tiež možné tieto parametre upraviť. Pre aminokyselinové sekvencie používa program BLASTP ako stále dĺžku slova (W) 3, zhoda (E = expactation) 10 a BLOSUM62 vyhodnovací vzor (viď Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10 915 (1989)).

Za účelom klasifikácie aminokyselinových substitúcií na konzervatívne a nekonzervatívne, sa rozdeľujú aminokyseliny do nasledujúcich skupín: skupina I (hydrofóbna časť reťazca): norleucín, Met, Ala, Val, Leu, lle; skupina II (neutrálna hydrofóbna časť reťazca): Cys, Ser, Tthr; skupina III (kyslá časť reťazca): Asp, Glu; skupina IV (zásaditá časť reťazca: Asn, Gin, His, Lys, Arg; skupina V (zvyšky ovplyvňujúce orientáciu reťazca): Trp, Tyr, Phe. Konzervatívne substitúcie predstavujú substitúcie medzi aminokyselinami v rámci jednej skupiny. U nekonzervatívnych dochádza k výmene členov z jednej skupiny za členy skupiny inej.

APP⁶⁹⁵, APP⁷⁵¹ a APP⁷⁷⁰ označujú 695, 751 a 770 aminokyselín dlhé polypeptidy kódované ľudským APP génom. Viď Kang et al., Náture 325, 773 (1987); Ponte et al., Náture 331, 525 (1988); a Kitaguchi et al., Náture 331, 530 (1998). Aminokyseliny ľudského amyloid-prekurzorového proteínu (APP) sú očíslované podľa sekvencie izoformy APP770.

V prítomnom vynáleze a v literatúre predstavuje hmotnosť vlastného Αβ peptidu asi 70 až 80 % celkovej hmotnosti Αβ peptidu a zvyšných asi 15 až 30 % je tvorené soľou a vodou. Toto bolo určené aminokyselinovou analýzou a/alebo analýzou nitrogénových častíc. Napríklad v prípade peptidu Αβ42 s hmotnosťou 0,1 mg, po oprave podľa vlastného obsahu peptidu, je 0,075 mg hmotnosti určené vlastným peptidom Αβ42 a 0,025 mg tvorí voda a soľ; 0,6 mg peptidu Αβ40 tvorí 0,45 mg samotného peptidu Αβ40 a 0,15 mg vody a soli; a 2,0 mg peptidu Αβ42 tvorí 1,5 mg peptidu Αβ42 a 0,5 mg vody a soli.

Názov Αβ peptid používaný v tomto vynáleze, označuje tie segmenty Αβ peptidu, ktoré sú schopné zaujímať β-štruktúru skladaného listu a schopné vyvolať imunogénnu odpoveď po dodaní cicavcom, či už samostatne alebo viazané nejakým adjuvans. Je v rámci bežných možností techniky určiť β štruktúru skladaného listu, napríklad, ako je tu opísané, použitím stanovenia cirkulárneho dichroizmu. Imunogenicita môže byť určená spôsobom opísaným nižšie v príkladoch v časti biologická aktivita.

Termín „dlhé formy Αβ peptidu označuje akúkoľvek z prirodzene sa vyskytujúcich foriem Αβ38, Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 a Αβ43 a s nimi významne zhodné peptidové sekvencie a výhodne ľudské formy. Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 a Αβ43 označujú Αβ peptid obsahujúci aminokyselinové zvyšky 1 až 38, 1 až 40, 1 až 41, 1 až 42, 1 až 43, respektíve, kedy aminokyseliny sú odoberané z C-terminálneho konca peptidu. Αβ40, Αβ41 a Αβ39 sa tak líšia od Αβ42 absencií Ala, Ala-lle a AlaIle-Val, respektíve, na C-konci, ako je možné vidieť pri porovnaní s nižšie uvedenou sekvenciou Αβ peptidu. Αβ42 sa líši od Αβ43 prítomnosťou treonínového zvyšku na C-konci. Sekvencie týchto peptidov a ich vzťah k APP ilustruje obrázok 1 v Hardy et al., TINS 20, 155(1997).

Sekvencia Αβ42 je: H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-ValHis-His-GIn-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gyl-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-lle-lleGly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-lle-Ala-OH.

Termín „dlhé formy Αβ peptidu“ tiež zahŕňa analógy týchto foriem. Analógy sú alelické, druhové a indukované varianty. Typicky sa líšia od prirodzene sa vyskytujúcich peptidov v jednej alebo niekoľkých pozíciách, často na základe konzervatívnych substitúcií. Atypicky vykazujú aspoň 80 % alebo 90 % sekvenčnú identitu s prírodným peptidom. Niektoré analógy tiež obsahujú aminokyseliny, ktoré sa normálne prírodné nevyskytujú, alebo modifikácie N- alebo C-terminálnych aminokyselín. Príklady aminokyselín, ktoré sa v prírode nevyskytujú sú a, adisubstituované aminokyseliny, N-alkyl aminokyseliny, kyselina mliečna, 4hydroxyprolín, γ-karboxyglutamát, ε-Ν,Ν,Ν-trimetyllyzín, ε-Ν-acetyllyzín, O-fosfoserín, N-acetylserín, N-formylmetionín, 3-metylhistidín, 5-hydroxylyzín, ω-Ν-metylarginín.

Αβ môže byť využitý v prostriedkoch alebo postupoch tohto vynálezu v koncentráciách asi od 0,05 mg/ml do hornej hranice jeho rozpustnosti asi 2,0 mg/ml (viď obr. 2). Uprednostňované rozmedzie koncentrácií peptidu je od 0,1 do 0,8 mg/ml, z ktorého najviac od 0,3 do 0,6 mg/ml.

Bolo opísané, že nerozpustná forma Αβ peptidú nájdená v amyloidných miestach má štruktúru β-skladaného listu. Soto, C., et al., Neuroscience Letters, 186 (2-3), pp. 115-118, (1995). Tiež Simmons, L.K., et al. Molec. Pharmacol., 45 (3) pp. 373-379 (1994) opísal, že štruktúra β-skladaného listu je spojená s neurotoxickými účinkami peptidú, zatiaľ čo náhodne zvinutá forma je len málo toxická alebo neaktívna. Ako sa spomína vyššie, metódy a prostriedky tohto vynálezu môžu využívať zvinutú konformáciu Αβ peptidú. Žiadateľ tu ukazuje, že náhodne zvinutá konformácia je schopná vyvolať imunitnú odpoveď u testovaných cicavcov. Náhodne zvinutá štruktúra sa uprednostňuje v mikrofiltrácii v postupoch vynálezu.

Termín „náhodne zvinutá“ označuje štruktúru otvoreného reťazca Αβ peptidú. Náhodné zvinutie je sekundárna štruktúra peptidového reťazca a nie je usporiadaná pravidelne ako štruktúra α-helixu alebo β-skladaného listu. U náhodného zvinutia ide skôr o porušenie hydrofóbneho poskladania a vodíkových väzieb, ktoré sú charakteristické pre iné, pravidelnejšie usporiadania. Aj tak môže náhodné zvinutie obsahovať určité stočenie peptidového reťazca alebo čiastočnú pravidelnosť, tieto znaky sú však náhodné a dynamické, a preto nie sú typické pre všetky náhodne zvinuté konformácie. Náhodne zvinutá štruktúra peptidú vykazuje dobrú rozpustnosť a filtrabilitu. Štruktúra α-helixu alebo β-skladaného listu sú v odbore dobre známe peptidové štruktúry. Sú opísané napríklad v Leninger's Biochemistry (2^nd Ed., Worth Publishers, 1975) na str. 128 až 129 pre α-helix a β-skladaný list na str. 133 až 134, ktoré sú zahrnuté v odkazoch tohto textu.

Náhodne zvinutá štruktúra môže byť charakterizovaná svojím spektrom cirkulárneho dichroizmu („CD“) a je ľahko rozlíšiteľná od štruktúry β-skladaného listu. Ako ukazuje CD spektrum, pre náhodne zvinutú štruktúru je špecifický silný negatívny prúžok medzi 19 a 200 nm a malý CD signál je vidieť vo vlnových dĺžkach dlhších ako 215 nm. Pokiaľ je vidieť CD signál vo vyšších vlnových dĺžkach, je veľmi slabo pozitívny v oblasti 220 až 225 nm. To ukazuje obrázok 1 časti „výkresy“. Štruktúra β-skladaného listu naopak vykazuje ostrý a pozitívny prúžok v oblasti okolo 200 nm. Na podrobný opis určenia sekundárnej peptidovej štruktúry prostredníctvom CD spektra odkazujeme na Manningovu monografiu citovanú vyššie.

Αβ peptid je v podstate v náhodne zvinutej konformácii, pokiaľ sa viac ako 50 % Αβ peptidú nachádza v tejto konformácii. Lepšie potom, pokiaľ viac ako 70 % až 80 %, najlepšie viac ako 85 % až 90 % Αβ peptidú je v náhodne zvinutej konformácii.

„Parenterálne prostriedky“ sú tie, ktoré sú sterilné a vhodné na podanie priamo do organizmu, napríklad injekčné alebo infúziou, tj. cestou, ktorá má bezprostredný kontakt s krvou a ktorá je bez prirodzených bariér a protekcie imunitného systému spojená s podaním liekových foriem vstupujúcich do organizmu cez kožu, sliznicu, tráviaci alebo dýchací systém. Z týchto dôvodov je sterilita parenterálnych prostriedkov nevyhnutná.

„Infúzia“, v zmysle aplikácie lieku, je v podstate kontinuálne a pomalé pritekanie roztoku lieku do krvného riečišťa počas dlhého časového úseku. Oproti tomu „injekcia“ je rýchle podanie dávky roztoku alebo suspenzie.

„Intravaskulárne (alebo intravenózne alebo IV), intramuskulárne (IM), intraperitoneálne (IP), subkutánne (SC), a intrastemálne“ sú všetky rôzne spôsoby podania parenterálneho prostriedku. Anatomicky opisujú oblasti tela, kam je parenterálny prostriedok vpravený injekčné alebo infúziou. Prostriedky tohto vynálezu, ktoré majú fyziologicky akceptovateľné pH, môžu byť aplikované akýmkoľvek vyššie opísaným spôsobom, čo závisí od individuálneho rozhodnutia pacienta a lekára. Roztoky s vyšším pH (pH > 8) je najvýhodnejšie podávať formou pomalej IV infúzie.

Na pochopenie výrazu „pufor“ a „pufrovacie činidlo“ tak, ako sú používané v tomto vynáleze, je dobré pripomenúť, že titračná krivka kyseliny alebo zásady má relatívne horizontálnu oblasť v rozsahu asi 1,0 pH jednotky na každej strane titračného optima. V Mračnom optime sa prítomné množstvo protónových donorov danej kyseliny alebo zásady rovná množstvu prítomných protónových akceptorov. V tejto oblasti sa pri malom zvýšení H⁺ alebo OH' iónov pH systému mení pomerne málo. Je to oblasť, v ktorej konjugovaný pár kyselina-zásada funguje ako pufor, teda systém brániaci zmenám pH pri danom zvýšení H⁺ alebo OH' iónov. Pri pH hodnotách ležiacich mimo túto oblasť má pufor menšiu kapacitu na zabránenie zmenám pH. Sila pufru je najvyššia pri pH, ktoré zodpovedá titračnému optimu jeho titračnej krivky, tj. stavu, kedy sa koncentrácie protónových donorov a akceptorov rovnajú a pH je rovné pK (kyslá disocíačná konštanta). Prípravy pufru detailne opisuje Data for Biochemical Research, rex, M.C., Oxford Science Publications, 1995.

Mnoho fyziologických mechanizmov zaisťuje v organizme udržanie pH v úzkom rozmedzí od 7,35 do 7,45. Aj keď niektoré z hlavných pufrovacích mechanizmov sú založené na rovnováhe kyseliny uhličitej alebo fosforečnej, mnoho iných mechanizmov predstavujú aminokyseliny a proteíny. Napríklad pH sĺz je udržované na hodnote 7,4 proteínovým pufrom. Samotné aminokyseliny sú tiež vhodnými puframi, aj keď vykazujú komplexnejšiu titračnú krivku tým, že majú donorový aj akceptorový atóm vo vnútri jednej molekuly. Takáto molekula sa označuje ako zwiterion, tj. existuje vo forme, ktorá nesie ako pozitívne, tak i negatívne nabité miesto na jednej molekule. Aminokyseliny sú schopné pufrovať pridanie H+ aj OH- iónov, ako je ukázané nižšie.

zwitterion

zwitterion (dipolárna forma)

OH

Z pohľadu toho vynálezu, „farmaceutický akceptovateľný pufor“ je definovaný tak, že zahrňuje konjugovaný pár kyselina-zásada, rovnako ako kyslú alebo zásaditú zlúčeninu so schopnosťou upraviť alebo udržať pH roztoku Αβ peptidu na požadovanej úrovni. V spôsoboch rozpustenia/filtrácie tohto vynálezu, je pH 8,5 alebo vyššie, alebo inokedy nižšie, ako pH 4.

Takéto pufry sú vybrané predovšetkým zo skupiny tvorenej aminokyselinami, soľami a ich derivátmi, farmakologicky akceptovateľnými alkalizátormi, alkalickými hydroxidmi kovov a amóniumhydroxidmi, organickými a anorganickými kyselinami a ich soľami, a výberom ich zmesí. Pufračné činidlá sa používajú v koncentráciách dostatočných na dosiahnutie a udržanie požadovaného pH, a tak sú ich koncentrácie závislé od kyslosti/zásaditosti každého pufru alebo vybranej zmesi. Výber účinnej koncentrácie je otázkou štandardných možností odboru používajúceho napr. pH metre alebo titračnú techniku.

Príklady skupín zlúčenín vhodných pre prítomný vynález sú hydroxidy, vrátane alkalických hydroxidov kovov a amóniumhydroxidov, alkalizátory známe vo farmaceutickom priemysle, zahrňujúce (nie však výlučne) Tris, boritan sodný (Na2B₄O?) a disodiumcitrát, aminokyseliny, soli, estery alebo amíny aminokyselín a ich jednoduché deriváty, napr. N-acetyl deriváty aminokyselín. Zvlášť uprednostňovanými puframi sú glycín (napr. glycinát sodný), arginín a lyzín, hydroxid sodný a amóniumhydroxid.

Príklady farmaceutický akceptovateľných kyselín, ktoré je možné použiť v metódach tohto vynálezu sú, bez obmedzenia, chlorovodíková kyselina, fosforečná kyselina, citrónová kyselina, octová kyselina, maleínová kyselina, jablčná kyselina a jantárová kyselina, apod. Navyše môžu byť tieto kyseliny použité na titráciu pH zásaditých roztokov na nižšie, fyziologicky lepšie akceptované hodnoty, kedy výsledkom je prostriedok vo forme peptidovej suspenzie.

Opačne môžu byť základné zlúčeniny, ako sú vyššie opísané, použité na titráciu nízkych pH hodnôt filtrovaného roztoku na fyziologicky akceptovateľnejšie pH, čo tiež vedie k vzniku peptidovej suspenzie.

Zamýšľa sa tiež nad kombináciami činidiel upravujúcimi pH. Konjugované páry kyselina-zásada opisované vyššie a dokladané na príklade solí ako je acetát amónny sú tiež predmetom záujmu ako pufračné činidlá pre tento vynález. Takýto konjugovaný pár môže byť vytvorený napríklad titráciou zásaditého roztoku hydroxidu amónneho kyselinou octovou na roztok acetátu amónneho blízko neutrálnym hodnotám.

Výraz „modifikátor tonicity“, tak, ako je používaný v texte, zahrňuje činidlá, ktoré prispievajú na osmolalitu roztoku. Príklady modifikátorov tonicity vhodných pre tento vynález predstavujú sacharidy (cukry), ako je manitol, sacharóza a glukóza a soli ako je chlorid sodný, chlorid cínatý apod., neobmedzujú sa však len na vymenované. Prednostne budú tonizačné činidlá využité v množstve zaisťujúcom hodnotu výslednej tonicity nižšiu ako asi 350 mOsm/kg, lepšie medzi asi 250 až 350 mOsm/kg, najlepšie potom medzi 280 až asi 320 mOsm/kg. Bude ešte opísané, že nabité zlúčeniny, ktoré slúžia v prostriedku ako pufry, môžu tiež ovplyvniť tonicitu. Tým je tonicita pufrovaného roztoku Αβ peptidu prvýkrát určená skôr, ako je upravovaná pridaním činidiel modifikujúcich tonicitu.

Použitie chelačného činidla v postupoch a prostriedkoch vynálezu nie je nutné. Príklady preferovaných chelátov zahrňujú etyléndiamíntetraoctovú kyselinu (EDTA) a jej soli (ako sú sodné), ktoré sú normálne používané v koncentrácii od 0,05 do 50 mM, prednostne v koncentráciách od 0,05 do 10 mM alebo najlepšie okolo 0,1 až 5 mM. Iné známe chelačné (alebo izolačné) činidlá, ako niektoré polyvinylalkoholy, môžu byť tiež použité.

Podľa voľby môže prostriedok obsahovať surfaktant alebo detergent, ako je sorbit (polysorbáte) (napr. Tween®) alebo 4-(1,1,4,4-tetrametylbutyl) fenyloxypolyeto xyetanol (Triton®) alebo polyméry polyetylénpolypropylénglykolov (Pluronics®). Surfaktanty sa pohybujú v rozmedzí od asi 0,005 do 1 %, prednostne okolo 0,02 až 0,75 %. Preferovaný polysorbit je PS-80 komerčne dostupný ako Tween® 80.

Zvlhčovacie činidlá sú tiež zamýšľanou inertnou zložkou vynálezu. Polyetylénglykoly, napr. PEG 3350, sú vhodné na modifikáciu združovania Αβ častíc a ich asociácií s povrchom polyméru a na usporiadanie hydrofilných častí molekuly vo vodnom prostredí. Zvlhčovacie činidlá môžu byť prítomné v množstve od 0,5 do 5 % (hmotnostných).

Farmaceutický akceptovateľné cukry (napr. sacharóza, dextróza, maltóza alebo laktóza) alebo farmaceutický akceptovateľné cukrové alkoholy (napr. manitol, xylitol alebo sorbitol) nemajú žiadny vplyv na liečebné efekty účinných zložiek. Z určitého aspektu tohto vynálezu môžu byť použité cukry alebo cukrové alkoholy, ktorých molekulová hmotnosť je menšia ako 500 a ktoré sa ľahko rozpustia a dispergujú vo vode. Príklady cukrov a cukrových alkoholov, ktoré je možné použiť v prítomnom vynáleze, zahrňujú xylitol, manitol, sorbitol, arabinózu, ribózu, xylózu, glukózu, manózu, galaktózu, sacharózu, laktózu apod. Môžu byť použité samostatne alebo ako zmes dvoch alebo viacerých z týchto zlúčenín. Navyše preferovaným cukrom je manitol, predovšetkým v lyofilizovaných prostriedkoch, sacharóza sa ešte uprednostňuje v prostriedkoch vo forme roztoku.

Bolo zaznamenané, že použitie QS-21 ako adjuvans („nosiča“) v prostriedku vynálezu interaguje so suspendovaným proteínom takým spôsobom, že vznikne vizuálne priehľadná suspenzia. Toto je žiaduca interakcia, kedy je peptid v konformácii β-skladaného listu, aleje suspendovaný vo fáze vo forme veľmi malých častíc a môže poskytovať danému prostriedku výhodnejšie vlastnosti, ako zvýšenie stability suspenzie. DPPC (dipalmitoylfosfatidylcholín) je v odbore známy a očakáva sa, že interaguje s Αβ peptidom podobným spôsobom ako QS-21 poskytujúcim rovnakú suspenziu malých častíc a zvažuje sa jeho použitie ako ďalšieho adjuvans vo vynáleze pri poskytnutí vizuálne čírej suspenzie. Prípadne môžu byť použité ďalšie adjuvans v prímesi s QS-21.

Lyofilizácia je technika dobre známa vo farmaceutických technikách, ako sú postupy na stabilizáciu peptidov počas a po lyofilizačnom procese. Stabilizácia proteínu alebo peptidového lyofilizátu v aminokyselinovej, sacharidovej matrici je tiež známou možnosťou v odbore. Viď napr. : Lueckel B., et al., Formulations of sugars with amino acids or mannitol - Influence of concentration ratio on the properties of the freeze-concentrate and the lyofilisate, PHARM. DEV. TECHNOL. 3(3) pp. 325336 (1998). The Royal Pharmaceutical Society of GB Symp: „New Analytical Approaches to the Charakterisation of Biotechnology Products, jún 1996 Luckel B., et al., predstavil: A strategy for optimizing the lyofilisation of biotechnological Products, PHARM. SCI. (UK) 3(1) pp. 3-8 (1997). Obidva tieto odkazy sú týmto začlenené poznámkou v celom svojom rozsahu.

Termín „farmakologicky akceptovateľný určuje akýkoľvek prostriedok v tom zmysle, že prostriedok nenesie žiadne škodlivé alebo nečakané účinky pre subjekt, ktorému je podaný a v súvislosti, v ktorej je podaný. Výrazy „farmakologicky akceptovateľné rozpúšťadlo“ a „farmakologicky akceptovateľné inertné vehikulum“ sa vzťahuje na akúkoľvek zlúčeninu, ktorá chráni alebo nepoškodzuje aktivitu účinných zlúčenín(y) a nemá žiadne škodlivé alebo nečakané účinky pre subjekt, ktorému je podaná a v súvislosti, v ktorej je podaná, ako netoxické činidlo upravujúce pH, pufračné činidlo alebo tonicitu modifikujúce činidlo alebo chelačné činidlo, apod..

Prostriedok alebo postupy „zahrňujúce“ jednu alebo viac spomínaných zložiek môžu zahrňovať ďalšie zložky, ktoré neboli špecificky opísané. Napríklad prostriedok, ktorý obsahuje Αβ peptid zahrňuje jednak Αβ peptid v podobe opísaného prostriedku a Αβ peptid ako súčasť prostriedku s ďalšími nespomínanými zložkami.

Ďalšie definície sú nasledujúce:

Skratky °C

C.D.

PH

Definícia stupne Celzia cirkulárny dichroizmus log [H⁺], stanovenie obsahu vodíkových pK

PS-80 μιτι min.

ml

M

N mM

DMSO

EDTA

Tris

RP-HPLC rpm

CFA/IFA

MPL

QS-21 iónov a tým acidity alebo bazicity roztoku kyslá disociačná konštanta súvisiaca s pH podľa vzťahu:

[akceptorov H⁺] pH = pK + log--------------------[donorov H⁺] polysorbit 80 alebo zmesný polymér polysorbitu 80 a etylénoxidu Tween 80®; monografia Merck Index č. 7559 (11 .vydanie) mikrometer minúta mililiter molarita, veličina určená mólmi/liter normalita-označenie molarity roztoku milimól dimetylsulfoxid etyléndiamíntetraacetát, obvykle vo forme disodnej soli trimetamín, tris(hydroxymetyl)aminometán, monograf. Merck Index č. 9684 (11.vyd.) rezervná fáza vysoko účinnej kvapalinovej chromatografie otáčky za minútu kompletné Freundovo adjuvans/nekompletné Fr. adjuvans (Chang et al., Advances Drug Delivery Reviews 32, 173-186(1998))

3-O-deacylovaný monofosforylovaný lipid A (MPL™) (viď napr. GB 2220211) triterpénglykozid alebo saponín izolovaný z kôry stromu Qiullaja Saponaria Molina pôvodom z Južnej Ameriky (viď Kensil et al., z Vaccine design: The Subunit and adjuvant Approach (Powell & Newman, Plénum Press, NY, 1995); US Pat. No. 5,057,540). (Stimulon™ QS-21)

FIO len pre informáciu

Filtrácia je proces oddeľovania kontaminant z tekutiny na základe veľkosti priechodu membránovým filtrom, ktorého póry majú jednotnú veľkosť. Aj keď častice veľkosti mikrometrov môžu byť oddelené použitím nemembránových alebo hustých materiálov, ako tých nájdených vo fibróznom médiu, len membránové filtre s presne definovanou veľkosťou pórov môžu zaistiť kvantitatívne oddelenie častíc s menšou veľkosťou. Tak je membránovou filtráciou možné kvantitatívne odstrániť baktérie z roztoku, ktoré prejdú mikrofiltrom, a tým ho sterilizovať. Predtým v súvislosti s purifikáciou Αβ peptidu bol peptid natoľko nerozpustný, alebo zostával agregovaný do tej miery, že roztok nemohol byť mikrofiltrovaný na komerčnom zariadení, pretože dochádzalo k upchatiu membrány časticami, a/alebo nízkemu zisku peptidu vo výslednom mikrofiltráte.

Používané filtre sú všeobecne definované ako filtre, ktoré majú schopnosť oddeliť častice s veľkosťou 0,2 mikrometrov a viac.

Membránový filter jednotne pridelený substrátu všeobecne umožňuje separáciu na základe veľkosti na povrchu membrány. Aj tak, môžu povrchové membránové filtre zachycovať častice jednak vo vnútri svojej štruktúry, aj na povrchu membrány. Pri separácii na základe veľkosti, prechádzajú častice menšie ako póry membrány filtrom, zatiaľ čo väčšie častice zostávajú na povrchu membrány. Pretože sa tieto filtre s definovanou veľkosťou „nevyprázdňujú“ (tj. ako sa filter začína plniť zachycovanými časticami, môže pri rastúcom prietokovom tlaku dôjsť k priechodu malého množstva zachytených častíc) sú podrobované mikrobiologickej kontrole. Sterílizačné povrchové membránové filtre sú vo farmaceutickom priemysle dobre známe.

Vo všetkých použitiach filtrácie môže byť priepustnosť filtra narušená chemickými, molekulárnymi alebo elektrostatickými vlastnosťami filtra, avšak bolo opísané, že hydrofilné filtre používané na tento vynález sú stabilné v prostredí vysokého alebo naopak nízkeho pH, ktoré závisí od použitej metódy, a spoľahlivo oddeľujú nežiaduce častice bez toho, aby sa upchávali. Závisí od znalostí štandardne schopného pracovníka, aby bol schopný vybrať a použiť hydrofilný mikrofilter. Špecifikácia komerčne dostupných produktov alebo webovej stránky ako:

http://millispider.millipore.com/corporate/sitemap.nsf/catalogd ( mája 1999) umožňuje výber filtra s požadovanými vlastnosťami.

Príklady filtrov, ktoré sú preferované a používané v prítomnom vynáleze, sú Millipore Durapore®, tiež nazývaný Millex GV, (Millipore Corporation, hlavné sídlo Bedford, MA), hydrofilný polymér polyvinylidénfluorid, ktorý má dobrú stabilitu a nízke proteín-väzbové vlastnosti a póry s priemerom 0,22 pm; Millex GN™, hydrofilný nylonový materiál s pórmi s veľkosťou 0,2 pm; a Millex GP™, hydrofilný polyétersulfónový polymér s povrchovou úpravou a pórmi s veľkosťou 0,22 pm. Navyše sa preferuje Durapore vzhľadom na jeho stabilitu pri pH 9 až 9,5.

Ideálne je prakticky celý Αβ peptid znovu získaný z filtrácie. Získanie prakticky celého Αβ peptidu je definované tak, že viac ako asi 50 % peptidu je získané zo sterilnej filtrácie. Prednostne viac ako 80 % Αβ peptidu a viac sa uprednostňuje získaním viac ako 90 % Αβ peptidu z filtrácie.

Metódy

Metódy tohto vynálezu predstavujú prípravu vodných prostriedkov s koncentráciami najmenej 0,01 mg/ml Αβ peptidu. Také prostriedky sú pripravené úpravou pH roztoku tak, že sa v ňom Αβ peptid rozpustí pri dosiahnutí požadovanej koncentrácie v rozmedzí od asi 0,1 mg/ml do asi 2,0 mg/ml).

Úprava pH vodného roztoku sa dosahuje bežnými postupmi, ktoré typicky ilustrujú pridanie buď kyseliny alebo zásady na získanie požadovaného pH. Použitá kyselina alebo zásada je v použitom množstve farmakologicky akceptovateľná. S cieľom udržať pH roztoku počas dlhšieho skladovania je dobré použiť v prostriedku farmakologicky akceptovateľný pufor. Výber vhodného pufru, vzhľadom na požadované pH, je otázkou znalostí v odbore.

Odporúča sa, aby pH vodného roztoku bolo upravené na hodnotu okolo pH 2 až pH 4 alebo okolo pH 8,5 až pH 12. Pri takých pH je Αβ peptid prekvapivo rozpustný.

Pokiaľ je postup vynálezu uskutočňovaný pri nízkom pH (okolo pH 2 a 4), potom môžu byť na zníženie pH na požadovanú hodnotu použité kyseliny ako sú halogénvodíkové kyseliny (napr. HCI, HBr), kyselina fosforečná, citrónová a octová a ďalšie farmakologicky akceptovateľné kyseliny. Výber vhodných kyselín je otázkou znalostí v odbore.

Pokiaľ je postup vynálezu uskutočňovaný pri vysokom pH (okolo pH 8,5 až 12), potom môžu byť na zvýšenie pH na požadovanú hodnotu použité farmakologicky akceptovateľné zásady, ako sú alkalické kovy, amóniumhydroxidy (napr. NaOH, NH4OH) apod.. Pri vysokých hodnotách pH, je pH roztoku v danom pufri prednostne upravené na rozmedzie medzi 8,5 až 11. Najlepšie je pH pohybujúce sa v rozmedzí pH 9 až 10.

Pred alebo následne po úprave pH je do roztoku pridaná požadovaná koncentrácia Αβ peptidu. Preferuje sa samozrejme pridanie Αβ peptidu po úprave pH s cieľom bezprostredného rozpustenia peptidu. Po jeho pridaní môže byť nevyhnutné rozpustenie pomocou jemného trepania a zahriatia.

Pridanie akejkoľvek z voliteľných prísad, ako sú farmakologicky akceptovateľné pufry, tonicitu modifikujúce činidlá, nosiče, atď. do prostriedku je možné v akomkoľvek vhodnom okamžiku pred alebo po pridaní Αβ peptidu.

Akonáhle je vyššie opísaný roztok pripravený, je možné pokračovať sterilizačnou filtráciou a/alebo lyofilizáciou podľa postupov v odbore dobre známych, ktoré sú ilustrované nižšie v Príkladoch.

Nasledujúce roztoky sú pufračné systémy preferované na rozpustenie Αβ peptidu s dosiahnutím cieľovej koncentrácie v rozmedzí od 0,6 do 2 mg/ml peptidu:

Uprednostňované aminokyselinové prostriedky:

mM glycinát sodný, pH 9,0, 9,5 alebo 10,0 a/alebo s 0,02 až 1,0 % (hmotnostných) polysorbitom 80 (PS-80) podľa voľby, obsahujúce jeden alebo viac modifikátorov tonicity tak, aby vyhovovalo parenterálnemu podaniu;

mM L-arginín-HCI alebo 10 mM L-Lyzinát, obidva s pH 9,0, 10,0 a/alebo s 0,02 až 1,0 % (hmotnostných) polysorbitom 80 (PS-80) podľa voľby obsahujúce jeden alebo viac modifikátorov tonicity tak, aby vyhovovalo parenterálnemu podaniu.

Prostriedky prítomného vynálezu je optimálne skladovať pri nízkej teplote, aby sa zabránilo degradácii alebo agregácii peptidových reťazcov. Vhodné teplotné rozmedzie na skladovanie prostriedkov Αβ peptidu sa pohybuje od 2 do 8 °C.

Nasledujúce príklady ilustrujú uplatnenie vynálezu. Tieto príklady sú len ilustratívne a nesnažia sa v akomkoľvek smere obmedziť rozsah nárokov vynálezu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 je C.D. spektrum ukazujúce meranie priemeru zvyškovej elipticity vyjadrenej v závislosti od vlnovej dĺžky pre dva rôzne roztoky Αβ42. Prerušovaná čiara ukazuje absorbanciu pri pH 6 a je možné ju priradiť k štruktúre β skladaného listu. Plná čiara vyjadruje absorbanciu roztoku Αβ42 pri pH 9 a ukazuje na náhodne zvinutú štruktúru peptidu.

Obrázok 2 je vyjadrenie porovnania Αβ42 umiestneného do roztoku a odhadu pikovej plochy na množstvo rozpusteného peptidu určené pomocou reverznej fázy HPLC (high performance liquid chromatography) vyjadrujúce rozpustnosť Αβ42.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1: Rozpustnosť peptidu

Peptid a činidlá

Αβ42 bol získaný vo forme jeho trifluóracetátovej soli od American Peptide Co., Lot Numbers M05503T1, M10028T1 a bol použitý bez ďalšej modifikácie. Iné soli sú dostupné a boli úspešne použité v postupoch vynálezu. Na príklady iónov solí s opačným nábojom viď tabuľku 2. Všetky kyseliny, zásady a pufry boli pripravené z kvalitných laboratórnych reagencií a boli pre ľahké použitie skladované vo forme sterilných prefiitrovaných zásobných roztokov. Polysorbit 80 (Tween 80, PS-80): 40 % zásobný roztok bol pripravený zriedením (hmotnostným) slabého roztoku PS-80 peroxidu (10 % roztoky slabého peroxidu polysorbitanmonooleátu je možné získať napríklad od Aldrich-Sigma Chemicals).

Rozpustnosť peptidu

Navážené bolo približne 500 až 700 pg Αβ peptidu a potom rozpustené v zodpovedajúcom množstve pufrového roztoku za získania, hypoteticky, výslednej koncentrácie 0,6, 0,8 alebo 1,0 mg/ml Αβ42. Peptid bol navážený priamo do 4 ml sklenených fľaštičiek (Wheaton) so závitovým vrchnákom. Po pridaní primeraného množstva pufrového roztoku bol peptid mierne premiešavaný v čase 15 až 60 minút. Bola vizuálne hodnotená rozpustnosť roztokov podľa nasledujúcej stupnice:

(+) = nízka rozpustnosť, zakalená suspenzia, (++) = čistá suspenzia s niekoľkými nerozpustnými zhlukmi, (+++) = čistý roztok.

Tabuľka 1. Vizuálne hodnotenie rozpustnosti roztokov

I Pufor	Výsledná koncentrácia Αβ42 (mg/ml)	Vizuálna Rozpustnos ť
0,01 N NaOH	1,0, 0,8	+++
0,01 N NH4OH	1,0, 0,8	+++
50 mM glycinát sodný, pH 9,0	1,0	+++
10 mM glycinát sodný, pH 9,0	1,0, 0,8, 0,6	+++
10 mM glycinát sodný, pH 9,5	0,6	+++
10 mM glycinát sodný, pH 10	1,0, 0,8	+++
10 mM glycinát sodný, pH 9,0, 0,02% PS-80	1,0	+++
10 mM glycinát sodný, pH 9,5, 0,01% PS-80, 5% sacharóza	0,6	+++
10 mM glycinát sodný, pH 9,5, 4% manitol, 1 % sacharóza	0,6	++4*
10 mM glycinát sodný, pH 9,5, 4% manitol	0,6	+++
10 mM glycinát sodný, pH 10,0, 0,02% PS-80	1,0	+++
10 mM L-arginín-HCI, pH 9,0	0,6	+++
10 mM L-arginín-HCI, pH 10,0	0,8	+++
10 mM L-lyzinát sodný, pH 9,0	0,8, 0,6	+++
10 mM L-lyzinát sodný, pH 10,0	0,8	+++
10 mM L-lyzinát sodný, pH 9,0	0,6	+++
10 mM acetát amónny, pH 9,0	1,0	+++
10 mM acetát amónny, pH 9,0, 0,02% PS-80	1,0	+++
50 mM tris-HCI, pH 10,0, EDTA (0,5 mM), 0,02% PS-80	1,0	++
10 mM borát sodný, pH 9,0	1,0	+++

10 mM A-acetyl-D-glutamín sodný, pH 9,0	0,8	+ + +
10 mM glycín-HCI, pH 3,0	1,0	++
0,01 A HCI	1,0	+++
0,01 M kyselina fosforečná	1,0	+++
; DMSO (čistý)	0,6	+++
10 mM glycinát sodný, pH 8,0	1,0	++
10 mM L-arginín-HCI, pH 9,0	1,0, 0,8	++
;10 mM hydrogénuhličitan sodnoamónny, pH 9,0	0,8	++
10 mM uhličitan sodnoamónny, pH 9,0	0,8	++
50 mM Tris-HCl, pH 10,0, EDTA (0,5 mM)	1,0	++
10 mM borát sodný, pH 10,0	1,0	+-+
10 mM L-arginín-HCI, pH 8,0	1,o	+
10 mM acetát amónny, pH 8,0	1,0	+
10 mM acetát amónny, pH 8,0, 0,02 % PS-80	1,0	+
50 mM Tris-HCl, pH 8,0, pH 9,0 alebo pH 10,0	1,0	+
50 mM Tris-HCl, pH 8,0 alebo pH 9,0 s 0,5 mM EDTA	1,0	+
50 mM Tris-HCl, pH 8,0 alebo pH 9,0 s 0,5 mM EDTA a 0,02 % PS-80	1,0	+
50 mM alebo 100 mM NaCl, pH 9,0	1,0	+
50 mM fosforečnan sodný, pH 8,0, pH 9,0 alebo pH 10,0	1,0	+
50 mM glycinát sodný, pH 8,0 alebo pH 10,0	1,0	+
10 mM N-acetyl-D-glukózamín sodný, pH 10,0	0,8	+
10 mM N-acetyl-D-glutamín sodný, pH 10,0	0,8	+
10 mM citrát sodný, pH 3,0 alebo pH 4,0	1,0	+
10 mM acetát sodný, pH 4,0	1,0	+

Roztoky hodnotené ako +++ boli pri dosadení zamýšľanej koncentrácie vizuálne čisté. Rozsah pH pufrových roztokov bol od pH 9 do pH 10. pH anorganických roztokov ako je NaOH a NH₄0H bolo alkalické, zatiaľ čo HCI a kyseliny fosforečnej bolo silne kyslé. Rozpustnosť peptidu sa dosiahla v koncentrácii od 0,6 do 1 mg/ml pri hodnotách približne > pH 9. Prísady ako je polysorbit 80, sacharóza, manitol a EDTA neovplyvňujú rozpustnosť peptidu a zúčastňujú sa zvýšenia tonicity a zisku po filtrácii alebo pôsobia ako chelačné činidlá. Kyslé roztoky (s pH približne 4 alebo nižšie) tiež rozpúšťajú Αβ42 peptid pri koncentráciách 0,6 až 1,0 mg/ml. Roztoky hodnotené ako ++ sa pri cieľovej koncentrácii javili ako čiastočne rozpustné. Peptid môže byť rozpustný pri nižšej koncentrácii, pri akej je tu testovaný. Roztoky, ktoré boli hodnotené ako +, nedosiahli po vizuálnej stránke pri cieľovej koncentrácii úplnú rozpustnosť.

Príklad 2: Rozpustnosť Αβ peptidu v pufrových roztokoch

Αβ42 (0,6, 1,0, 1,5, 2,0, 3,0 a 3,5 mg/ml) bol rozpustený v 10 mM pufru glycinátu sodného, pH 9. Každý roztok bol centrifugovaný na stolovej centrifúge (>10 000 rpm, asi 10 min.) v prípade vzniku zákalu pri koncentráciách 2,0 až 3,5 mg/ml (roztoky s koncentráciou 0,6 - 1,5 mg/ml boli vizuálne čisté).

Alikvot supernatantu z každého roztoku bol potom analyzovaný na RP-HPLC. Tabuľka 2 predstavuje tabuľkové pikové oblasti peptidu a grafické znázornenie rozpustnosti Αβ42 v pufri glycinátu sodného s pH 9.

Tabuľka 2. Hranica rozpustnosti TFA soli peptidu Αβ42

Αβ42 mg/ml (10 mM glycín, pH 9,0)	HPLC piková oblasť
0,6	3613553
1	5921792
1,5	8850393
2	9213446

Nakoniec bol peptid Αβ42 purifikovaný vo forme trifluóracetátových, amónnych, chloridových a sodných solí. Tieto soli boli rozpustením v niekoľkých pufroch, s koncentráciou peptidu Αβ42 0,45 mg/ml, upravené vzhľadom na obsah opačne nabitých iónov rôznych solí. Roztoky peptidu boli prefiltrované a zisk bol určený pomocou porovnania RP-HPLC pikových plôch peptidu pred a po filtrácií. Všetky soli boli rozpustné a ľahko filtrovateľné s koncentráciou 0,45 mg/ml, čo ukazuje tabuľka 3.

Tabuľka 3. Rozpustnosť iných solí Αβ42 peptidu

0,45 mg/ml Αβ42 -	Zisk (%)
Amónna soľ v 1 mM NH4OH	70
Amónna soľ v 2 mM NH4OH	106
Amónna soľ v 10 mM glycináte sodnom, pH 9,0	115
Amónna soľ v 10 mM glycináte sodnom, 5 % sacharóza, pH 9,0	96
Amónna soľ v 10 mM glycináte sodnom, pH 9,5	101
Amónna soľ v 10 mM glycináte sodnom, pH 10,0	106
Trifluóracetátová soľ v 10 mM glycináte sodnom, pH 9,0	101
Chloridová soľ v 10 mM glycináte sodnom, pH 9,0	101
Sodná soľ v 10 mM glycináte sodnom, pH 9,0	100

Príklad 3: Získanie'rozpusteného peptidu po použití predstavených hydrofilných filtrov

Testované striekačkové filtre (polomer filtra 25 mm, filtračná oblasť 3,9 cm²): Millex GV, 0,22 pm: hydrofilná polyvinylidíndifluoridová membrána (PVDF, Durapore) s nízkymi proteín-väzbovými vlastnosťami, Millex GN, 0,20 pm: hydrofilná nylonová membrána s nízkymi proteín-väzbovými vlastnosťami a Millex GP, 0,22 pm hydrofilná povrchovo modifikovaná polyeténsulfónová membrána (PES) s nízkymi proteínväzbovými vlastnosťami.

Vyššie opísané filtre boli použité ako zástupcovia komerčne dostupných typov hydrofilných mikrofilmov. Filtračné štúdie, ktoré boli uskutočnené, používali nasledujúci solubilizačný systém:

1. 0,6 mg/ml Αβ42 v 0,01 N NH₄OH

2. 0,6 mg/ml Αβ42 v 10 mM glycináte sodnom, pH 9,0

3. 0,6 mg/ml Αβ42 v 10 mM lyzináte sodnom, pH 9,0

4. 0,6 mg/ml Αβ42 v 10 mM arginín-HCI, pH 9,0

Približne 2 ml objem z každého Αβ42 roztoku bol prefiltrovaný cez každý filter. Zisk z jednotlivých filtrov bol potom určený porovnaním pikových plôch peptidov pred a po mikrofiltrácii a výsledok ukazujú tabuľky 3a a 4.

Tabuľka 3a. Filtračné zisky

Prostriedok 0,6 mg/ml Αβ peptidu v:	Typ filtra (% zisk)
Millex GV	Millex GN	Millex GP
10 mM glycináte sodnom	99,1	97,2	98,0
10 mM arginín-HCI	91,9	86,6	92,5
10 mM lyzináte sodnom	95,0	94,7	97,4
0,01 N NH4OH	102,2	104,8	105,1

Príklad 4: Filtrácia Αβ42 v pufroch glycinátu sodného a lyzinátu sodného s a bez prídavkových inertných látok

V týchto štúdiách bol 0,6 mg/ml Αβ42 rozpustený v 10 mM glycináte sodnom obsahujúcim buď 0,1 % polysorbit 80 (PS-80), 0,9 % chlorid sodný alebo kombináciu 0,1 % PS-80, 0,9 % NaCl, 5 % sacharózy, 1 % sacharózy a/alebo 4 % manitolu.

Približne 2 až 5 ml každého prostriedku bolo prefiltrované cez filter Millex GV. Alikvot filtrátu bol scentrifugovaný na stolovej mikrocentrifúge s > 10 000 rpm v čase 3 minút. Výťažky z filtrácie boli určené porovnaním RP-HPLC pikových plôch peptidu pred a po filtrácii.

Tabuľka 4. Filtračný zisk pri rôznych zloženiach pufru

Zloženie ID 0,6 mg/ml Αβ42 v:	Zisk (%)
10 mM glycinát sodný, pH 9,0	104,5
10 mM glycinát sodný, pH 9,0, 0,1 % PS-80	106,2
10 mM glycinát sodný, pH 9, 0,5 % sacharóza	115,4
10 mM glycinát sodný, pH 9,5, 4 % manitol	103,0
10 mM glycinát sodný, pH 9,5, 4 % manitol, 1 % sacharóza	98,0
10 mM glycinát sodný, pH 9,0, 0,9 % NaCl	76,7
10 mM glycinát sodný, pH 9,0, 0,1 % PS-80, 0,9 % NaCl	65,0
10 mM L-lyzín/citrát, pH 9,5	93,2
10 mM L-lyzín/citrát, pH 9,5, 4 % manitol	80,0

Filter Millex GV bol vybraný ako vhodný filter pre prostriedok Αβ, pretože vykazuje uspokojivý zisk peptidu a prijateľnosť na použitie v komerčných postupoch. Prostriedok peptidu obsahujúci 0,9 % NaCl bol vizuálne menej rozpustný, čo viedlo k nižším ziskom z filtrácie na RP-HPLC. Na zvýšenie rozpustnosti peptidu v prítomnosti anorganických solí ako je chlorid sodný, môže byť vhodné pridať po mikrofiltrácii peptidu do pufru roztok činidla modifikujúci tonicitu.

Z iného pohľadu, činidlá modifikujúce tonicitu, ako sú sacharidy (cukry) prejavujú odlišný typ aktivity roztoku a môžu zvýšiť stabilitu suspenzie. Tieto vlastnosti, známe ako usporiadanie vo vodnom prostredí, majú tendenciu „hydratovať“ peptidový reťazec v roztoku tak, že získa termodynamicky stabilnejšiu konformáciu β-skladaného listu.

Αβ peptid môže byť filtrovaný pri pH v rozsahu od asi 8,5 do 12, prednostne od pH 9 až pH 10, s dobrými výsledkami. Filtrácia môže byť uskutočnená použitím 0,2 pm Milelx GV membrány (Millipore Durapore), ktorá je vhodná na výrobné postupy.

Na stabilnú, biologicky aktívnu podobu Αβ peptidu, ktorá je fyziologicky akceptovateľná a vhodná na klinické použitie, bude počiatočný krok výrobných postupov prednostne zahrňovať sterilnú filtráciu peptidu pri pH 8,5 až 10.

Príklad 5: Rozpustné kvapalné prostriedky

Metódy kvantitatívneho rozboru

Tri skupiny Αβ peptidu boli vyrobené v American Peptide Co. (APC). Štandardné prípravy, výsledky chemického a biologického určenia APC peptidu, boli opísané s Αβ42 vyrobeného California Peptide Research.

Opisy prípravkov sú formulované v častiach 1,2 a 3 nižšie v texte.

Analýzy stability

Opisy k jednotlivým prípravkom sú poskytnuté v samostatných sekciách nižšie. Jednotlivé fľaštičky sa opakovane analyzujú počas niekoľkomesačného uskladnenia pri 2 až 8 °C. Počas štúdie stability sa rutinne monitorujú hodnoty pH, koncentrácie a čistoty peptidu. Systém reverznej fázy HPLC (RP-HPLC) bol použitý na kvalifikáciu koncentrácie a plocha zodpovedajúca čistému Αβ peptidu v percentách. RP-HPLC využíva polymérnu kolónu reverznej fázy, s premývaním peptidu v amóniumbikarbonáte (alebo tris) /acetonitrilovom gradiente a detekciou pri 220 nm. Koncentrácia peptidu sa meria proti referencii štandardu; čistota sa počíta ako plocha zodpovedajúca čistému Αβ peptidu v percentách určená vo výsledné porovnanom chromatograme.

Charakterizácia

Charakterizácia štruktúry Αβ42 v roztoku bola získaná štúdiou cirkulárneho dichroizmu ako ukazuje obr. 1.

Biologická aktivita

Myšiam z chovu Swiss Webster (4 až 8 myší v skupine) bol injikovaný Αβ42 s rôznymi zloženiami adjuvans CFA/IFA, MPL (Corixa Immunochemicals) alebo QS 21 (Aquila Pharmaceuticals) v pomere koncentrácií antigén/adjuvans opísaných vo zvláštnej štúdii. Injekcie boli aplikované rutinne po dvoch týždňoch v 0., 2. a 4. týždni, pokiaľ nebolo zaznamenané inak. Myši boli odobraté po 2 a 4 týždňoch od injekcie. Séra boli analyzované štandardnou sendvičovou ELISA metódou, kedy Αβ42 slúžil ako antigén a kozie protimyšie IgG konjugované s HRP ako značiace protilátky. Titer protilátok bol zaznamenaný v jednotlivých diagramoch alebo ako geometrické priemery hodnôt každého zvieraťa v každej skupine a súhrnne bol porovnaný s titrami získanými použitím agregovaného Ap42/CFA/IFA ako kontrolného imunogénu. Výsledné titrácie sú v tabuľkách 8 a 10.

1. Prípravky

Αβ peptid bol rozpustený v koncentrácii 0,6 mg/ml v 10 mM glycinátu sodného, pH pufru 9,0 až 9,5, a prefiltrovaný cez filter Millex GV, 0,2 pm. Suspenzia s objemom 0,5 ml bola prenesená do 2 ml sklenených fľaštičiek (Gensia P/N X34113-002), zatvorená sivými gumovými zátkami (Gensia P/N X66-113-030) a vzduchotesne uzavretá. Fľaštičky boli skladované pri 2 až 8 °C.

2. Testovanie stability

Koncentrácia a čistota Αβ42 v suspenzii boli monitorované pomocou RPHPLC. Rozpustené vzorky boli analyzované buď priamo alebo po mikrocentrifugácii.

Nasledujúca tabuľka (tab. 5) ukazuje analytické dáta pre rozpustné kvapalné prípravky. Neboli pozorované žiadne rozdiely medzi vzorkami centrifugovanými alebo necentrifugovanými pred analýzou, čo svedčí o stálej rozpustnosti peptidu so zamýšľanou koncentráciou. Plocha zodpovedajúca čistému proteínu v percentách je porovnateľná s referenčným štandardom: nebola zaznamenaná žiadna významná degradácia peptidu. Rozpustný prípravok zostal stabilný v čase 3 mesiacov, pokiaľ bol skladovaný pri 2 až 8 °C.

Tabuľka 5. Výsledky po 3 mesačnom skladovaní

0,6 mg/ml Αβ42 v:	Vzhľad	pH	Plocha čistého proteínu v %	Koncentrácia Αβ (mg/ml)
Referenčnom štandarde	n/a	n/a	68%	n/a
10 mM glycinátu sodného, pH 9,0	Čistý roztok	8,6	69 %	0,65

3. Charakterizácia

Charakterizácia prípravku Αβ pomocou cirkulárneho dichroizmu ukazuje, že peptid nebýva v roztoku náhodne zvinutej konformácie s typickou absorbanciou elipticity v rozmedzí 189 až 205 nm.

Biologická aktivita

Pokiaľ je myši (Swiss Webster) injikovaný prípravok Αβ42 s pH 9 s adjuvans, dôjde k nárastu titru protilátok. Injekcia 33 μς Αβ42 spolu s adjuvans ako 50 MPL alebo 25 pg QS 21 v dvojtýždňových intervaloch (0, 2, 4 týž.) vyvoláva adekvátnu odpoveď (v zmysle zvýšenia titru Ab) v porovnaní s kontrolami.

Príklad 6: Prostriedky vo forme kvapalných suspenzií

Prostriedok glycín/acetát

Αβ peptid bol rozpustený v koncentrácii 0,6 mg/ml v 10 mM glycinátu sodného, v pufri s pH 9,0 až 9,5 samotnom alebo v kombinácii s rôznymi inertnými vehikulami (excipients). Roztoky peptidu boli prefiltrované cez filter Millex GV a potom titrované 0,1 M kyselinou octovou na pH 6 za vzniku suspenzie peptidu v pufri. Suspenzie s objemom 0,5 ml boli prenesené do 2 ml sklenených fľaštičiek (Gensia P/N X34113-002), zatvorené sivými gumovými zátkami (Gensia P/N X66-113-030) a vzduchotesne uzavreté. Suspenzie boli skladované pri 2 až 8 °C.

Prostriedok glycín/citrát

Prostriedky s koncentráciou 0,6 mg/ml Αβ42 boli pripravené do 10 mM glycinátu sodného obsahujúceho 0,1 % PS-80 samotný alebo v kombinácii s 5 % sacharózou (25 ml). Roztoky peptidu boli prefiltrované cez filter Millex GV a potom titrované 0,1 M kyselinou citrónovou približne na pH 6,0. Prípadne, je po titrácii na pH 6 pridaný ku glycinátu/citrátu/PS-80 0,9 % chlorid sodný. Suspenzie s objemom 0,5 ml boli potom prenesené do 2 ml sklenených fľaštičiek (Gensia P/N X34-113-002), zatvorené sivými gumovými zátkami (Gensia P/N X66-113-030) a vzduchotesne uzavreté. Suspenzie boli skladované pri 2 až 8 °C.

Glycín/citrátové prostriedky boli ďalej vylepšované tak, aby mali pufrovú kapacitu pri pH 6. Bolo pripravených niekoľko 100 ml prostriedkov 0,6 mg/ml Αβ peptidu do 10 mM glycinátu sodného, pH 9, obsahujúceho 5 % sacharózu s alebo bez 0,1 % PS-80. Navyše boli ešte pripravené prostriedky 0,1 mg/ml Αβ42 v 10 mM glycináte sodnom obsahujúcom 5 % sacharózu s alebo bez 0,1 % PS-80.

Peptidové roztoky boli pred úpravou pH prefiltrované cez filter Milelx GV. pH bolo potom upravené na pH 6,0 pomocou 10 mM a 20 mM pufru citrátu sodného použitím zásobného roztoku 1 M citrátu sodného s pH 5,5. Suspenzie s objemom 0,5 ml boli potom prenesené do 2 ml sklenených fľaštičiek (Gensia P/N X34-113-002), zatvorené sivými gumovými zátkami (Gensia P/N X66-113-030) a utesnené alobalom.

Testovanie stability

Koncentrácie a čistota Αβ42 v prostriedku boli sledované pomocou RP-HPLC. Absolútna peptidová koncentrácia suspenzie Αβ42 bola meraná rozpustením peptidu zriedeného (obj.:obj.) 2 % sódiumdodecylsulfátom (SDS) v 0,01 N NaOH a zahrievaním pri 100 °C v čase 1 minúty pred analýzou. Prípadne bola koncentrácia Αβ42 v suspenzii určená centrifugáciou testovanej vzorky na mikrocentifúge pri > 10 000 rpm v čase 3 až 5 minút. Alikvoty rozpusteného peptidu alebo supernatantu boli potom analyzované pomocou RP-HPLC. Je dobré si uvedomiť, že počas týchto štúdií boli vykonané pokroky v chromatografii v metóde RP-HPLC, čo viedlo k lepšiemu rozlíšeniu a kvantitatívnemu určeniu. Preto sú percentuálne hodnoty oblasti čistoty relatívne k referenčnému štandardu v čase vykonávaných analýz a chromatogramy sú porovnávané v každom časovom okamžiku na určenie miery degradácie. Počas štúdií stability bolo tiež sledované pH a vzhľad.

Tabuľka 6 ukazuje dáta z niekoľko kvapalných suspenzií Αβ42. Všetky prostriedky sú vizuálne suspenzie. Tieto prostriedky sú titrované na pH 6 príslušnými kyselinami opísanými v tabuľke. V závislosti od použitého inertného vehikula môže peptidová suspenzia vzniknúť bezprostredne alebo až v horizonte 2 týždňov aj viac. Vznik suspenzie je možné rýchlejšie dosiahnuť pridaním chloridu sodného alebo zámenou citrátu za acetát v peptidovom prostriedku.

Všetky prostriedky dosahujú výsledné koncentrácie 0,6 mg/ml peptidu. Percentuálna oblasť čistoty bola vo všetkých prostriedkoch porovnateľná s čistotou referenčného štandardu. Počas 3 mesačného skladovania pri 2 až 8 °C nebola zaznamenaná žiadna strata alebo degradácia peptidu. Vzhľad a pH zostali porovnateľné s dátami uvedenými v tabuľke 1.

0,9 % NaCl aj 5 % sacharóza vytvára fyziologickú tonicitu na parenterálne podanie. Rovnako tak suspenzia s pH 6 v akceptovateľnom rozmedzí pH na účely injekčného podania.

Tabuľka 6. Prostriedky vo forme kvapalných suspenzií

i Zloženie ID	Vzhľad	pH	Čistota	mg/ml Αβ42
: 0,6 mg/ml Αβ v:			v %	Celkový peptid	Supernatant

					T=0	T=2wks
10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0	Suspenzia	5,9	70 %	0,54	0,23	0,04
10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 5 % sacharóza	Suspenzia	5,9	68 %	0,65	0,21	0,04
10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 0,1 % PS-80, 5 % sacharóza	Suspenzia	6,0	67%	0,62	0,43	0,08
10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 0,1 % PS-80, 0,9 % NaCl	Suspenzia	5,9	68%	0,55	0,04	0,04
10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 0,9 % NaCl	Suspenzia	6,0	70 %	0,53	0,26	0,05
10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 0,1 % PS-80, 5 % sacharóza	Suspenzia	nd	77 %	0,63	<0,01	nd
10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 0,1 % PS-80, 0,9 % NaCl	Suspenzia	nd	71 %	0,63	0,02	nd

nd: nebolo uskutočnené (not done)

Prostriedky, ktoré ukazuje tabuľka 7, boli pripravené pomocou 10 mM alebo 20 mM pufrovej kapacity poskytnutej citrátovým pufrom, s cieľom zaistiť počas výrobného postupu dosiahnutie pH 6. Tieto prostriedky vytvorili okamžite suspenziu. Na základe vlastností Αβ peptidu, viedla zmena konformácie peptidu k vzniku suspenzie vo vnútri sterilnej skúmavky. Použitie známej koncentrácie pufru, opačnej k titračnej, počíta s ľahkým zaobchádzaním a reprodukciou počas práce v sterilnej plniacej súprave.

Tabuľka 7. Pufrované suspenzie

0,6 mg/ml Αβ42 v:	Vzhľad	pH	Čistota v%	Αβ peptid celková kone. mg/ml
10 mM citrát sodný, 10 mM glycín, pH 6,0, 0,1 % PS-80, 5 % sacharóza	Suspenzia	6,0	81 %	0,66
20 mM citrát sodný, 10 mM glycín, pH 6,0, 0,1 % PS-80, 5 % sacharóza	Suspenzia	5,9	83 %	0,69
20 mM citrát sodný, 10 mM glycín, pH 6,0, 5 % sacharóza	Suspenzia	6,0	81 %	0,67
0,1 mg/ml Αβ42 v:
20 mM citrát sodný, 10 mM glycín, pH 6,0, 0,1 % PS-80, 5 % sacharóza	Suspenzia	5,9	82 %	0,2
20 mM citrát sodný, 10 mM glycín, pH 6,0, 5 % sacharóza	Suspenzia	6,0	81 %	0,09

Tieto prostriedky boli ďalej rozmnožené. Trifluóracetátové alebo chloridové soli Αβ peptidu boli rozpustené v 10 mM glycinátu sodného s pH 9 až 9,5. Ich koncentrácie boli upravené podľa obsahu soli s cieľom dosiahnuť koncentráciu Αβ42 0,45 mg/ml. Pred filtráciou môže byť do peptidového roztoku pridaný polysorbit 80, 0,02 % až 0,5 %. Rovnako tak môže byť do prostriedku pred alebo po pridaní kyseliny pridaná sacharóza alebo chlorid sodný. pH peptidového roztoku bolo upravené kyselinou citrónovou alebo chlorovodíkovou, ako je vyššie spomínané. Všetky prostriedky vytvorili suspenziu za vzniku požadovanej koncentrácie peptidu Αβ42.

Tabuľka 7b

Zloženie suspenzií 0,45 mg/ml Αβ42 v:

mM glycinát sodný, 20 mM citrát, 0,1 % PS-80, pH 6,0 mM glycinát sodný, 20 mM citrát, 0,5 % PS-80, pH 6,0 mM glycinát sodný, 20 mM citrát, 154 mM NaCl, pH 6,0 mM glycinát sodný, 20 mM citrát, 154 mM NaCl 0,1 % PS-80, pH 6,0 mM glycinát sodný, 154 mM NaCl, pH 6,0 (HCI) mM glycinát sodný, 154 mM NaCl, 0,1 % PS-80, pH 6,0 (HCI)

Charakterizácia

Charakterizácia suspenzie Αβ42, pH 6 pomocou cirkulárneho dichroizmu a FT-IR ukázala, že peptid so vznikom suspenzie zaujíma štruktúru β-skladaného listu. Štruktúry β-skladaného listu sú porovnateľné pri koncentrácii suspenzie 0,6 mg/ml, bez ohľadu na pufrujúcu kyselinu (citrát, acetát, fosfát) a ďalšie inertné vehikulá (sacharóza, NaCl) pridané do prostriedkov. Zdá sa, že pridanie PS-80 vedie k vzniku homogénnejšie dispergovanej suspenzie.

Biologická aktivita

Pokiaľ je suspenzia Αβ peptidu s adjuvans injikovaná myšiam (Swiss Webster), dôjde k nárastu titru protilátok. Injekcie v dvojtýždňových intervaloch (0., 2., 4. týždni), ako ukazuje tabuľka 8, vyvolajú v porovnaní s kontrolami adekvátnu protilátkovú odpoveď.

Tabuľka 8. Protilátková odpoveď na suspenzie prostriedkov

! Peptidový prostriedok ; 0,6 mg/ml Αβ v:	pg peptidu	— pg adjuvans	Titer protilátok geom. priemery z 2. Odberu**
10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 5 % sacharóza	33 pg	50 pgMPL*	-7 000
10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 5 % sacharóza	33 pg	25 pg QS-21	-10 000
10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 0,1 % PS-80, 5 % sacharóza	33 pg	50 pg MPL*	-10 000
10 ŕriM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 0,1 % PS-80, 5 % sacharóza	33 pg	25 pg QS-21	-7 000
10 mM glycinát sodný/citrát, pH 6,0, 0,1 % PS-80, 5 % sacharóza	33 pg	50 pg MPL*	-10 000
10 mM glycinát sodný/citrát, pH 6,0, 0,1 % PS-80, 5 % sacharóza	33 pg	25 pg QS-21	-8 000
10 mM glycinát sodný/citrát, pH 6,0, 0,9 % NaCl	33 pg	50 pg MPL*	-12 000
10 mM glycinát sodný/citrát, pH 6,0, 0,9 % NaCl	33 pg	25 pg QS-21	-14 000
Kontrola: Calif. Peptide, časť MF0639	33 pg	CFA/IFA	-1 200

* MPL obsahujúci trietanolamín ** Titre počítané ako jednotky pri 50 % maximálnej OD

Príklad 7: Lyofilizované prípravky Prípravky

Boli pripravené štyri kombinácie 0,6 mg/ml Αβ42 v glycinátovom alebo lyzínovom pufri, s manitolom alebo manitolom a sacharózou a potom sterilné filtrované cez filter Millex GV. Jeden prípravok (0,6 mg/ml Αβ42 v 10 mM glycináte sodnom s pH 9,5, 4 % manitol) bol bez titrácie na fyziologické pH prenesený do fľaštičky a uzavretý. Zvyšné tri roztoky (lyzín/citrát/4 % manitol; glycinát/citrát/4 % manitol; glycinát/HCI/4 % manitol/1 % sacharóza) boli titrované kyselinou citrónovou alebo chlorovodíkovou na pH 7,5. Prostriedky boli potom prenesené v objeme 0,5 ml do 2 ml sklenených fľaštičiek (Gensia P/N X34-113-002), netesne zatvorené sivými gumovými lyofilizačnými zátkami (Gensia P/N X66-113-030).

Lyofilizácia

Prípravky boli lyofilizované v programovateľnom lyofilizéri Virtis (výrobca Gensia Sicor). Ako hlavná zložka matrice bol zvolený manitol. Aby došlo ku kryštalizácii manitolu, boli prípravky zmrazené počas určitej termálnej periódy (chladenia) a následne došlo k primárnemu a sekundárnemu vysušeniu zmrazených zhlukov.

Analýza stability

Koncentrácia a čistota lyofilizovaných prípravkov bola sledovaná pomocou RP-HPLC. Každý prípravok bol rozpustený v 1,0 ml injekčnej vody (WFI). Bol analyzovaný bezprostredne po rozpustení (po alebo bez centrifugácie na stolovej mikrocentrige pri > 10 000 rpm v čase 3 až 5 minút) alebo bol znova rozpustený, ako bolo opísané vyššie.

Nasledujúca tabuľka (tab. 9) ukazuje koncentráciu štyroch prípravkov Αβ42 po uskutočnenej lyofilizácii a následnom rozpustení. Ako je možné vyčítať z dát, tieto prípravky boli rozpustné. Vzorky boli analyzované jednak ako prípravky rozpustené z lyofilizovanej formy a ako prípravy rozpustené z lyofilizovanej formy „resolubilizované“ tak, ako sa opisuje pre peptidové suspenzie. Neboli pozorované žiadne významné rozdiely medzi prípravkami rozpustenými z lyofilizátu a úplnou koncentráciou peptidu (vzorky rozpusteného peptidu). Ako ukázala metóda RPHPLC, rovnaká ako pri testovaní stability v príklade 5, žiadna významná degradácia alebo strata peptidu nebola pozorovaná v priebehu 3 mesačného skladovania v tepelnom rozmedzí 2 až 8 °C.

Tabuľka 9. Lyofilizované prostriedky

Prípravok 0,6 mg/ml Αβ42 v:	Vzhľad	pH	Čistota v %	mg/ml Αβ42
Peptid v rozpustenom lyofilizáte	Rozpustený peptid
10 mM glycinát sodný, pH 9,5, 4 % manitol	Čistý roztok	8,2	82 %	0,59	0,61
10 mM citrát/glycinát sodný, pH 7,5, 4 % manitol	Čistý roztok	7,4	82 %	0,57	0,60
10 mM citrát/lyzinát sodný, pH 7,5, 4 % manitol	Čistý roztok	7,6	81 %	0,57	0,55
10 mM glycinát sodný/HCI, pH 7,5, 4 % manitol, 1 % sacharóza	Čistý roztok	7,4	81 %	0,56	0,59

Charakterizácia

Charakterizácia lyofilizovaného prostriedku Αβ42, pH 7,5 pomocou cirkulárneho dichroizmu a FT-IR ukazuje, že peptid počas lyofilizácie a spätného rozpustenia zostáva v náhodne zvinutej konformácii. Toto zistenie zostáva rovnaké pri prostriedku Αβ42/9^οίηόί sodný, pH 9, ktorý je tiež rozpustný, je možné ho filtrovať a v roztoku zaujíma náhodne zvinutú konformáciu.

Biologická aktivita

Lyofilizovaný prostriedok Αβ42, 0,6 mg/ml Αβ42 v 10 mM glycináte sodnom/HCI/4 % manitol/1 % sacharóza, pH 7,5, bol zvolený ako reprezentatívny lyofilizovaný prostriedok. Pokiaľ bol miešaný s adjuvans MPL alebo QS-21, došlo u myší (Swiss Webster) k zvýšeniu titru protilátok. Geometrický priemer titrov v porovnaní s kontrolami ukazuje tabuľka 10.

Tabuľka 10. Protilátková odpoveď na lyofilizované preparáty

Peptidový prípravok 0,6 mg/ml Αβ42 v:	pg peptidú	pg adjuvans	Titer protilátok, geom. priemery z 2.odberu**
10 mM glycinát sodný/HCI, pH 7,5, 4 % manitol, 1 % sacharóza	33 pg	50 pg MPL* **	~14 000
10 mM glycinát sodný/HCI, pH 7,5, 4 % manitol, 1 % sacharóza	33 pg	25 pg QS-21	~3 000
Kontrola: Calif. Peptid, časť MF0639	33 pg	CFA/IFA	~1 200

*MPL obsahujúci trietanolamín **Titre počítané ako jednotky pri 50 % maximálnej OD

Príklad 8: Rozšírenie používania štandardov vyrábaných GMP

Peptidová suspenzia bola dodaná v 1,5-litrových baleniach, vyrobených a plnených podlá zmluvy s výrobcom liečiv GMP. Balenia boli v dvoch koncentráciách: 0,6 mg/ml a 0,1 mg/ml. Obidve koncentrácie boli úspešne namnožené, rozplnené a zostali stabilné pri 2 až 8 °C a 25 °C v čase 2 mesiacov.

Αβ peptid bol rozpustený pri výslednej koncentrácii 0,6 mg/ml alebo 0,1 mg/ml v 10 mM pufru glycinát sodný, pH 9, obsahujúcim 5 % sacharózu. Peptidový roztok bol sterilné filtrovaný cez sterilizačný filter Milipak 20 Millipore Durapore, 0,2 pm, do aseptickej skúmavky. RP-HPLC analýza preukázala, že nedošlo k žiadnym významným stratám peptidú počas filtrácie. Potom bol vyrobený 1M pufor citrátu sodného, pH 5,5, a rovnako prefiltrovaný cez 0,2 pm filter Durapore do aseptickej skúmavky. Peptídový roztok bol navážený a pridalo sa k nemu primerané množstvo pufru za vzniku 20 mM citrátu, pH výsledného prípravku 6.

Pri koncentrácii 0,6 mg/ml vytvára peptid bezprostredne pred pridaním citrátového pufru suspenziu; pH merané počas postupu bolo 6,4. Peptidová suspenzia, naplnená po 1,2 ml do 2 ml sklenených fľaštičiek utesnených zátkou (West 4416), bola stále premiešavaná. Koncentrácia 0,1 mg/ml zostala rozpustná (a bola rozplnená ako rozpustná) niekoľko hodín pred vznikom suspenzie vo fľaštičkách počas ďalšieho dňa.

Tabuľka 11 ukazuje dáta vytvorené pre 0,6 mg/ml suspenziu Αβ42;

Tabuľka 11

Suspenzia Αβ peptidu 0,6 mg/ml v 10 mM glycíne, 20 mM citrátu, 5 % sacharóze, pH 6

Test	Špecifikácia	Výsledek
Vzhľad	Neurčitá bezfarebná suspenzia, bez významnej kontaminácie	Akceptovaná
pH	5,5 až 6,5	6,3
koncentrácia	0,5 až 0,7 mg/ml	0,64 mg/ml
plocha čistoty v % (HPLC)	FIO	84,4 %
objem (ml)	FIO	1,13 ml
miera sterility	FIO	kultivácia negatívna
výsledná sterilita kontajneru	kultivácia negatívna	akceptovaná
bakteriálne endotoxíny	FIO	<2 EU/ml

Príklad 9; Pufrované suspenzie Αβ1-42 s pridaným adjuvans QS-21

S použitím QS-21, triterpénglykozidu so stimulačnými účinkami na imunitný systém, boli vytvorené ampulky jednotlivých prípravkov obsahujúcich Αβ1-42 a adjuvans, a s prekvapením sa zistilo, že tvoria vizuálne čistú suspenziu peptidu.

1. Jednotlivé vzorky prostriedkov Αβ1 -42/QS-21

Rozpustenie lyofilizovaného QS-21 pomocou roztoku Αβ1-42 v 10 mM glycináte sodnom pri pH 9,0. V každom z nasledujúcich príkladov bol lyofilizovaný QS-21 rozpustený pomocou roztoku Αβ1-42 (TFA soli, 0,45 mg/ml) v 10 mM glycíne (Gly), pH 9,0. pH prípravku obsahujúceho rozpustený QS-21 bolo potom upravené na pH 6,0 pridaním citrátového pufru (Cit) za vzniku vizuálne čistej suspenzie. Hodnotenie zákalu bolo uskutočnené pomocou spektrofometra pri vlnovej dĺžke 405 nm s cieľom určiť čistotu vzniknutých suspenzií. Výsledky ukázali, že veľkosť častíc suspendovaného peptidu je menšia ako vlnová dĺžka odrazeného svetla. Na základe uskutočnených testov bola preukázaná stabilita týchto prípravkov pri 3 mesačnom uskladnení pri 2 až 8 °C; všetky prípravky obsahovali prevažnú časť Αβ1-42 v konformácii β-skladaného listu; žiadny prípravok nevykazoval pri analýze na spektrofotometri pri 405 nm zákal. Prípravok 0,45 mg/ml Αβ1-42, 0,2 mg/ml QS-21, 10 mM Gíy, 20 mM Cit, 5 % sacharóza, pH 6,0 bol kvantitatívne testovaný na titer v myšiach s výsledkom vysokého titru protilátkovej odpovede.

Tabuľka 12A

Prípravok	Vzhľad
0,45 mg/ml Αβ1-42, 0,2 mg/ml QS-21, 10 mM Gly, 20 mM Cit, 5 % sacharóza, pH 6,01	čistý
0,45 mg/ml Αβ1-42, 0,2 mg/ml QS-21, 10 mM Gly, 20 mM Cit, 5 % sacharóza, pH 6,0	čistý
0,225 mg/ml Αβ1-42, 0,3 mg/ml QS-21, 10 mM Gly, 20 mM Cit, 5 % sacharóza, pH 6,0	čistý
0,225 mg/ml Αβ1-42, 0,15 mg/ml QS-21, 10 mM Gly, 20 mM Cit, 5 % sacharóza, pH 6,0	čistý

¹ Pre tento prípravok bol zistený vysoký titer protilátok u myší

2. Titrácia Αβ42 s použitím QS-21

Αβ42 (2 mg/ml) bol rozpustený v 10 mM glycíne, pH 9,5. pH bolo upravené na

9,5 pomocou 1N NaOH. Roztok Αβ42 bol potom prefiltrovaný cez filter Millex GV. QS-21 (5 mg/ml) bol rozpustený v 10 mM citráte, pH 6,0 a potom prefiltrovaný cez filter Millex GV. Určité množstvo Αβ42 bolo zmiešané s určitým množstvom QS-21 v požadovanom pomere a rozpustené v 10 mM glycíne, pH 9,5 a 1M citráte, pH 5,2, za vzniku výsledných koncentrácií ukázaných v tabuľke 12.

Tabuľka 12B. Počiatočné prípravky AN1792/QS-21

Prípravok V 10 mM glycíne, 20 mM citrátu, pH 6,0	Vzhľad	OD405 nm
1.0 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21	čisté	0,018
1.0 mg/ml Αβ42, 0,5 mg/ml QS-21	zákal (+)	0,013
1.0 mg/ml Αβ42, 0,25 mg/ml QS-21	zákal (++)	0,030
1.0 mg/ml Αβ42, 0,125 mg/ml QS-21	zákal (+++)	0,175
1.0 mg/ml Αβ42, 0,063 mg/ml QS-21	zákal (+++)	0,308
1.0 mg/ml Αβ42, 0,031 mg/ml QS-21	zákal (+++)	0,315
1.0 mg/ml Αβ42, 0,016 mg/ml QS-21	zákal (+++)	0,268
1.0 mg/ml Αβ42, 0,0 mg/ml QS-21	zákal (+++)	0,213
0.5 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21	čisté	0,005
0.5 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21	čisté	0,006
0.5 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21	čisté	0,005
0.5 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21	zákal (+)	0,021
0.5 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21	zákal (++)	0,148
0.5 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21	zákal (+++)	0,172
0.5 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21	zákal (+++)	0,162
0.5 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21	N/A	N/A
0.3 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21	čisté	0,004
0.3 mg/ml Αβ42, 0,5 mg/ml QS-21	čisté	0,004
0.3 mg/ml Αβ42, 0,25 mg/ml QS-21	čisté	0,006

0.3 mg/ml Αβ42, 0,125 mg/ml QS-21	čisté	0,005
0.3 mg/ml Αβ42, 0,063 mg/ml QS-21	zákal(+)	0,013
0.3 mg/ml Αβ42, 0,031 mg/ml QS-21	zákal(+)	0,077
0.3 mg/ml Αβ42, 0,016 mg/ml QS-21	zákal(+)	0,068
0.3 mg/ml Αβ42, 0,0 mg/ml QS-21	zákal (++)	0,046
0.1 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21	čisté	0,004
0.1 mg/ml Αβ42, 0,5 mg/ml QS-21	čisté	0,002
0.1 mg/ml Αβ42, 0,25 mg/ml QS-21	čisté	0,002
0.1 mg/ml Αβ42, 0,125 mg/ml QS-21	čisté	0,001
0.1 mg/ml Αβ42, 0,063 mg/ml QS-21	čisté	0,002
0.1 mg/ml Αβ42, 0,031 mg/ml QS-21	čisté	0,003
0.1 mg/ml Αβ42, 0,016 mg/ml QS-21	čisté	0,004
0.1 mg/ml Αβ42, 0,0 mg/ml QS-21	čisté	0,008

3. Ďalšie prípravky Αβ42 a QS-21

Chloridová soľ Αβ42 bola rozpustená na 1 mg/ml v 10 mM glycináte sodnom, pH 9,0 až 9,5, s alebo bez 5 % sacharózy, 0,1 % alebo 0,4 % PS-80. Peptidové roztoky boli sterilné filtrované cez striekačkový filter Millex GV. Lyofilizované QS-21 bolo rozpustené na 5 mg/ml v 10 mM citráte, pH 6,0 a sterilné filtrované cez striekačkový filter Millex GV.

Primerané množstvo roztoku Αβ42 a roztoku QS-21 bolo zmiešané za vzniku výsledných koncentrácií Αβ42 a QS-21 opísaných nižšie v prípravkoch v tabuľke XX. Nakoniec bolo pH znížené použitím 1M citrátového pufru, pH 5,4, za výsledného vzniku pH 6,0 v 20 mM citrátového pufru. Vzhľad prípravkov sa pohyboval v rozmedzí od čistého až po zakalený (+ až +++). Odlišnosť koncentrácií a pomeru Αβ42 a QS-21 mohlo ovplyvniť vizuálnu podobu prostriedku. Navyše, ďalšími akceptovateľnými prísadami prostriedku sú cukry a surfaktanty.

Tabuľka 12C. Ďalšie prípravky Αβ42 a QS-21

Prostriedky	Vzhľad
QS-21 (mg/ml)	Αβ42 (mg/ml)	Pomer Αβ42/Ο5-21	Bez prísady	5% sacharóza	0,1 % PS-80	0,4 % PS-80
0,05	0,05	1,0	čisté	čisté	čisté	čisté
0,1	0,1	1,0	čisté	čisté	čisté	čisté
0.2	0,2	1,0	čisté	čisté	čisté	zákal (+)
0,1	0,23	2,3	zákal(+)	zákal(+)	zákal (+)	zákal (+)
0,2	0,23	1,1	čisté	čisté	čisté	zákal (+)
0,3	0,23	0,8	čisté	čisté	čisté	zákal (+)
0,1	0,45	4,5	zákal (++)	zákal (++)	čisté	zákal (++)
0,2	0,45	2,3	zákal (++)	zákal (++)	zákal(+)	zákal (++)
0,3	0,45	1,5	čisté	čisté	čisté	zákal (++)

Príklad 10: Stanovenie a interpretácia C.D. spektra v prípravku Αβ42 Na zhromaždenie dát cirkulárneho dichroizmu bol použitý spektropolarimeter, model Aviv 62-DS (Lakewood, NJ). Vzorky boli pripravené približne na zber signálov z oblasti blízkej, respektíve vzdialenej UV spektru a vložené do 1 mn pozdĺžnej sklenenej komôrky bez napätia. Vzorky boli udržované pri stabilnej teplote 25 °C. Dáta boli zbierané po 0,5 nm intervaloch s časom 4 sekundy na spriemerovanie nameraných hodnôt. V oblasti vzdialenej UV spektru (λ - 180 až 250 nm) dominovali signály vlastného peptidového reťazca a bolo tak možné získať odhad sekundárnej štruktúry prípravku. Skúšky v oblasti blízkej UV spektru (λ ~ 250 až 350 nm) poskytovali odlišné informácie: v tejto oblasti primárne signály vychádzali z postranných aromatických reťazcov (Phe, Tyr a Trp). Charakter signálu ukazuje stupeň ohybnosti v každej oblasti peptidu a orientácii postranných reťazcov vzhľadom k hlavnému reťazcu. Tým, že počet týchto chromofórov je menší ako počet aminoskupin a tým, že chromofóry sú rozmiestnené po celej molekule, je možné určité rozpoznanie lokálnej štruktúry.

Dá sa očakávať, s ohľadom na znalosti v odbore, že sa objaví množstvo modifikácií a variácií vynálezu opísaného vyššie v príkladoch. V súvislosti s tým si pripojené nároky kladú za cieľ pokryť všetky také varianty, ktoré sa v rámci nárokovaného vynálezu objavia.

Claims (47)

1. Prostriedok obsahujúci vodný roztok najmenej 0,01 mg/ml Αβ peptidu, vyznačujúci sa tým, že vodný roztok je udržovaný pri pH dostatočnom na rozpustenie spomínaného Αβ peptidu.

2. Prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že roztok je udržovaný pri takomto vhodnom pH za použitia účinného množstva farmaceutický akceptovateľného pufru.

3. Prostriedok obsahujúci sterilný vodný roztok obsahujúci najmenej 0,01 mg/ml Αβ peptidu, vyznačujúci sa tým, že vodný roztok je udržovaný pri pH dostatočnom na rozpustenie spomínaného Αβ peptidu.

4. Prostriedok podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že roztok je udržovaný pri takomto vhodnom pH za použitia účinného množstva farmaceutický akceptovateľného pufru.

5. Prostriedok podľa nárokov 1 a 3, vyznačujúci sa tým, že Αβ peptid je dlhou formou Αβ peptidu.

6.. Prostriedok podľa nárokov 1 a 3, vyznačujúci sa tým, že Αβ peptid je Αβ42.

7. Prostriedok podľa nárokov 1 a 3, vyznačujúci sa tým, že pH je okolo 8,5 až okolo 12.

8. Prostriedok podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že pH je okolo 9 až okolo 10.

9. Prostriedok podľa nárokov 2 a 4, vyznačujúci sa tým, že farmaceutický akceptovateľný pufor je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z aminokyselín, ich solí a derivátov, farmaceutický akceptovateľných zásad, alkalických hydroxidov kovov, amóniumhydroxidov, organických a anorganických kyselín a ich solí a ich zmesí.

10. Prostriedok podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že farmaceutický akceptovateľný pufor je glycín (glycinát sodný) alebo arginín (arginínchlorovodík).

11. Lyofilizovaný prostriedok Αβ peptidu, vyznačujúci sa tým, že je pripravený

a) zmrazením sterilného vodného roztoku obsahujúceho najmenej 0,01 mg/ml Αβ peptidu, pričom vodný roztok je udržovaný pri pH dostatočnom na rozpustenie Αβ peptidu, a

b) lyofilizáciou zmrazeného prostriedku pripraveného v kroku a) vyššie.

12. Prostriedok podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že Αβ peptid je dlhou formou Αβ peptidu.

13. Prostriedok podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že Αβ peptid je Αβ42.

14. Prostriedok podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že roztok je udržovaný pri takomto pH za použitia účinného množstva farmaceutický akceptovateľného pufru.

15. Prostriedok podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že farmaceutický akceptovateľný pufor je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z aminokyselín, ich solí a derivátov; farmaceutický akceptovateľných zásad, alkalických hydroxidov kovov, amóniumhydroxidov, organických a anorganických kyselín a ich solí a ich zmesí.

16. Prostriedok podľa nárokov 1, 3 alebo 11, vyznačujúci sa tým, že Αβ peptid je v podstate v náhodne zvinutej konformácii.

17. Prostriedok podľa nárokov 1, 3 alebo 11, vyznačujúci sa tým, že Αβ peptid má koncentráciu od asi 0,05 mg/ml do asi 2,0 mg/ml.

18. Prostriedok podľa nárokov 1, 3 alebo 11, vyznačujúci sa tým, že prostriedok ďalej obsahuje farmaceutický akceptovateľné adjuvans.

19. Prostriedok podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že adjuvans je vybrané zo skupiny pozostávajúcej z nekompletného Freundovho adjuvans; MPL; QS-21; a kamenca.

20. Prostriedok obsahujúci sterilnú vodnú suspenziu s najmenej 0,1 mg/ml Αβ peptidu s pH okolo 5 až okolo 7.

21. Prostriedok podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že vodná suspenzia tiež obsahuje účinné množstvo farmaceutický akceptovateľného pufru.

22. Prostriedok podľa nárokov 20 alebo 21, vyznačujúci sa tým, že Αβ peptid je dlhou formou Αβ peptidu.

23. Prostriedok podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že Αβ peptid je Αβ42..

24. Prostriedok podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že farmaceutický akceptovateľný pufor je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z aminokyselín, ich solí a derivátov; farmaceutický akceptovateľných zásad, alkalických hydroxidov kovov, amóniumhydroxidov, organických a anorganických kyselín a ich solí a ich zmesí.

25. Prostriedok podľa nároku 20 obahujúci 0,1 až 0,8 mg/ml peptidu Αβ42, 10 mM glycínu a kyselinu dostatočnú na úpravu pH na okolo 5,5 až okolo 6,5.

26. Prostriedok podľa nárokov 24 alebo 25 obsahujúci ďalej jedno alebo viac inertných vehikúl vybraných zo skupiny pozostávajúcej z modifikátorov tonicity, surfaktantov a zvlhčovacích činidiel.

27. Prostriedok podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že prostriedok ďalej obsahuje farmaceutický akceptovateľné adjuvans.

28. ' Prostriedok podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ešte ďalšie farmaceutický akceptovateľné adjuvans.

29. Prostriedok podľa nároku 28, vyznačujúci sa tým, že adjuvans je vybrané zo skupiny pozostávajúcej z nekompletného Freundovho adjuvans; MPL; QS-21; a kamenca.

30. Prostriedok podľa nároku 28 obsahujúci okolo 0,1 až okolo 1,0 mg/ml peptidu Αβ42 v 10 mM glycínu a najmenej 0,1 mg/ml QS-21 v množstve účinnom na vytvorenie vizuálne čistej suspenzie s pH okolo 6.

31. Spôsob prípravy sterilného prostriedku dlhej formy Αβ peptidu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

úpravu pH vodného roztoku dostatočnú na rozpustenie Αβ peptidu v ňom; rozpustenie dostatočného množstva Αβ peptidu v roztoku s dosiahnutím imunogénnej koncentrácie pre cicavce; a filtráciu vzniknutého roztoku cez membránu s pórmi s rovnakou veľkosťou, kedy veľkosť pórov je v rozsahu umožňujúcom oddelenie baktérií a zároveň priechod takmer všetkého Αβ peptidu.

32. Spôsob podľa nároku 31, vyznačujúci sa tým, že filtrácia je uskutočnená cez hydrofilnú polymérnu membránu s pórmi s rovnakou veľkosťou okolo 0,22 mikrometrov.

33. Spôsob podľa nároku 31, vyznačujúci sa tým, že množstvo Αβ peptidu získané z filtrácie je väčšie ako 50 %.

34. Spôsob podľa nároku 31, vyznačujúci sa tým, že roztok pred filtráciou obsahuje najmenej jedno rozpúšťadlo vybrané zo skupiny pozostávajúcej z farmakologicky akceptovateľných pufrov s koncentráciou od okolo 5 mM do okolo 45 mM.

35. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že roztok pred filtráciou obsahuje činidlo modifikujúce tonicitu od okolo 0,9 % do okolo 6,0 % hmotnostných.

36. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že roztok pred filtráciou obsahuje surfaktant od okolo 0,02 % do okolo 1,0 % hmotnostných.

37. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že roztok pred filtráciou obsahuje chelačné činidlo od okolo 0,1 mM do okolo 1,0 mM.

38. Spôsob podľa nároku 34, 35, 36 alebo 37, vyznačujúci sa tým, že pH sterilného roztoku získaného z filtrácie je upravené na pH okolo 5 až okolo 7 za poskytnutia peptidovej suspenzie.

39. Spôsob prevencie alebo liečby Alzheimerovej demencie u cicavcov, vyznačujúci sa tým, že cicavcom je aplikované množstvo sterilného vodného prostriedku obsahujúceho najmenej 0,05 mg/ml Αβ peptidu s cieľom vyvolať u cicavcov imunitnú odpoveď, a že vodný prostriedok je udržovaný pri pH dodatočnom na rozpustenie Αβ peptidu.

40. Spôsob vyvolania protilátkovej odpovede proti Αβ peptidu u cicavcov potrebujúcich takú antigénnu odpoveď, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa parenterálne podanie imunogénneho množstva sterilného prostriedku dlhej formy Αβ peptidu.

41. Spôsob podľa nároku 39 alebo 40, vyznačujúci sa tým, že tento spôsob ďalej zahŕňa podanie farmaceutický akceptovateľného adjuvans, samostatne alebo zmiešaného so sterilným prostriedkom.

42. Spôsob podľa nároku 39 alebo 40, vyznačujúci sa tým, že sterilný prostriedok je v súlade s nárokom 30.

43. Prostriedok obsahuje suspenziu najmenej 0,1 mg/ml Αβ peptidu a účinné množstvo QS-21 na vytvorenie vizuálne čistej suspenzie v rozmedzí pH 5 až 7.

44. Prostriedok obsahuje suspenziu najmenej 0,1 mg/ml Αβ peptidu a účinné množstvo dipalmitoylfosfatidylchloridu (DPPC) na vytvorenie vizuálne čistej suspenzie v rozmedzí pH 5 až 7.

45. Použitie sterilného prostriedku dlhej formy Αβ peptidu na výrobu lieku na vyvolanie protilátkovej odpovede proti Αβ peptidu.

46. Použitie sterilného vodného prostriedku Αβ peptidu na výrobu lieku vhodného na prevenciu alebo liečbu Alzheimerovej demencie.

47. Použitie podľa nároku 45 alebo 46, kde liek ďalej obsahuje farmaceutický akceptovateľné adjuvans.

Jf ftot '2.001

1/2

Vlnová dĺžka (nm)

Obr. 1 f?

2/2

Hranice rozpustností Αβ42 v lOntMpufru glycinátu sodnom, pH 9,0

RP-HPLC pikovej plochy peptidu

I. E+07

8.E+06

5.E+06

J. E+06

O. E+00

O 0.5 1 1.5 2 2.5 5

AB42 (mg/mL)