CZ20014150A3 - Prostředek obsahující vodný roztok, lyofilizovaný prostředek A beta peptidu, způsob přípravy sterilního prostředku, způsob prevence a léčby, způsob vyvolání protilátkové odpovědi a pouľití - Google Patents

Description

PROSTŘEDEK OBSAHUJÍCÍ VODNÝ ROZTOK, LYOFILIZOVANÝ PROSTŘEDEK Αβ PEPTIDU, ZPŮSOB PŘÍPRAVY STERILNÍHO PROSŘEDKU, ZPŮSOB PREVENCE A LÉČBY, ZPŮSOB VYVOLÁNÍ PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI A POUŽITÍ

Oblast techniky

Tento vynález se obecně vztahuje k farmaceutickému prostředku obsahujícímu proteiny, které je možné použít k vyvolání protilátkové odpovědi u savců. Specificky se tento vynález vztahuje k farmaceuticky akceptovatelným prostředkům, které obsahují množství beta-amyloidového peptidu dostatečné k vyvolání imunitní odpovědi u savců, a k farmaceuticky akceptovatelnému rozpouštědlu. Rozpouštědlem je přednostně sterilní parenterálně akceptovatelná vodná fáze.

Dosavadní stav techniky

Beta-amyloid peptid, označovaný také A-beta peptid nebo Αβ peptid, je štěpný produkt amyloidového prekurzorového proteinu (APP). Je základní složkou amyloidových plaků v mozku savců, jejichž výskyt je základní charakteristickou Alzheimerovi demence. Αβ je 39 až 43 aminokyselinový řetězec, který se liší délkou v závislosti na variabilitě svého vzniku z APP za účasti několika proteáz.

Několik mutací uvnitř APP proteinu se spojuje s přítomností Alzheimerovi demence. Viz, např., Goate et al., Nátuře 349, 704 (1991) (valin⁷¹⁷ za izoleucin); Chartier Harlan et al., Nátuře 353, 844 (1991) (valin⁷¹⁷ za glycin); Murrell et al., Science 254, 97 (1991) (valin⁷¹⁷ za fenylalanin); Mullan et al., Nátuře Genet. 1, 345 (1992) (dvojitá mutace záměny lysinu⁵⁹⁵methioninu⁵⁹⁶ za asparagin⁵⁹⁵-leucin⁵⁹⁶). Předpokládá se, že tyto mutace způsobují Alzheimerovu demenci zvýšením nebo alterací přeměny APP na Αβ peptid, zejména přeměnou APP na zvýšené množství Αβ42 a Αβ43. Mutace v jiných genech, jako jsou presenilinové geny, PSI a PS2, jsou považovány za nepřímou příčinu postižení přeměny APP vytvářející zvýšené množství Αβ42 a Αβ43 (viz Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Pozorování ukazují, že Αβ peptid a zejména Αβ42 je prvkem zapříčiňujícím vznik Alzheimerovi demence. V mozku se Αβ protein hromadí a vytváří amyloidová ložiska, ve kterých se peptid organizuje do fibril se strukturou β-skládaného listu.

Současný výzkum zabývajícího se léčbou nebo prevencí Alzheimerovy choroby se zaměřil na snahu zastavení nebo zpomalení tvorby Αβ peptidu v mozku nebo blokování jeho následné úpravy nebo hromadění v amyloidových plácích. Jeden z terapeutických postupů, který má ι·» «· • · » • · i .· • · · · · · zásadním významem pro aplikace tohoto vynálezu, je použití Αβ peptidu k vyvolání imunitní odpovědi proti tomuto proteinu. Viz, např., publikace PTC č. WO 99/27 944, která je takto odkazem začleněna v celém rozsahu.

Přítomný vynález se zaměřuje na nové a nečekané metody k uskutečnění vynálezu popsaného v publikaci PTC č. WO 99/27 944. Zejména zahrnuje podávání určitých podob dlouhých forem Αβ peptidu pacientovi k indukci imunitní odpovědi. Přesto, jako bylo v oboru popsáno, je obtížné rozpouštět dlouhé formy Αβ peptidu v běžně systémech.

Zvláště Hilbich et al., J. Mol. Biol., 218 (1), pp. 149-64, (1991) popisuje, že zatímco je Αβί43 peptid rozpustný do určitého stupně v čisté vodě, přidání ionických složek, jako jsou pufry nebo soli, nebo organických roztoků způsobuje precipitaci peptidu z roztoku ve formě amorfní sraženiny.

Hilbich například popisuje, že fosfátový pufr obsahující chlorid sodný (”PBS”, který v tomto případě obsahuje 137 mM NaCl, 3 mM KC1,8 mM Na₂HPO₄*2H₂O a 2 mM KH₂PO₄ , pH 7,5) dosáhl nerozpustnosti 90 až 94 % peptidu obsaženém v přípravku. PBS je běžný nosič pro parenterální prostředek o tonicitě a hodnotě pH odpovídajícím hodnotám živých systémů. 5 mM NaCl způsobuje precipitaci 42 až 50 % peptidu. (tamtéž, str. 153, tabulka 2). Roztok peptidu v čisté vodě by byl hypotonický a jeho pH by se podle Hilbicha blížilo hodnotě 5,5 (tamtéž/. Typická hodnota pH krve člověka je okolo 7,4. Dyrks, et al. také popsaly, že Αβ42 je za fyziologických podmínek nerozpustný. Dyrks, T., Weidemann, A., Multhaup, G., et al. EMBO J.l, pp. 949 až 57 (1988).

Struktura Αβ peptidu v roztoku může být určena za použití spektroskopie cirkulámího dichroismu (C.D.). Strukturní studie Αβ peptidu a fragmentů používající C.D. zaznamenal Hilbich, et al, idem. Viz také monografie od M. Manninga nazvaná: Protein Structure and Stability Assessment by Circular Dichroism Spectroscopy, z Biocatalyst design for Stability and Specificity; Himmel, Μ. E. a Georgiou, G., eds., ACS Symposium Series 516 (1993) na str. 36. Tento odkaz, který je dále uváděn jako odkaz na Manninga, je zde takto vložen v celém rozsahu.

Kline et al., Patent US č. 5 851 996 ('996 patent) a 5 753 624 ('624 patent) popisuje podávání velmi malého množství (10² mg nebo méně) Αβ peptidu nebo jeho fragmentu sublinguálně v kapalném nebo pevném nosiči, jako je fenylovaný roztok chloridu sodného. '996 patent uvádí, že amyloidový beta protein “existuje v různých strukturálních formách” (sloupec 2, řádek 31) a že tyto mohou být použity v léčbě Alzheimerovy demence. Není nikde definováno, co se míní různými strukturálními formami, ani není nikde více charakterizován 28-aminokyselinový • 9

999 9· 99

9 9 9 9 · · · · · 9 9 9

9999999 9 9 · · 9 9 9 • 9 9 99 ····

9 fragment použitý v příkladu. Velikost dávky Αβ peptidů je v '996 patentu ustanovena v rozmezí od 1O'¹⁰ do 10'² mg (sloupec 8, řádek 442 až 43).

Z hlediska výše popsaného bylo primární snahou ukázat, jak obtížné je rozpustit Αβ peptid a uchovat ho v tomto stavu. Navíc se i přes dobrou rozpustnost dlouhých forem Αβ peptidů objevily komplikace z hlediska sterilizace a standardizace. Většina standardních sterilizačních metod je nevhodných pro peptidový prostředek, včetně radiace, autoklávování, technik chemické sterilizace, jako jsou ethylenoxidové páry a glutaraldehyd, které všechny způsobují degradaci peptidů. Proto by metodou volby sterilizace Αβ peptidového prostředku byla filtrace peptidů. Překážkou je nerozpustnost Αβ peptidů, která způsobí ucpání filtrační membrány, což znemožňuje získání dostatečného množství Αβ peptidů pro komerční rozsah výroby.

Podstata vynálezu

Tento vynález se zaměřuje na překvapivý a neočekávaný objev, že vodný roztok obsahující vysokou koncentraci Αβ peptidů je možné připravit úpravou pH roztoku na acidické/bazické hodnoty, při kterých se Αβ peptid rozpouští. Preferují se hodnoty pH v rozmezí přibližně od 8,5 do 12, z nichž nejvíce hodnoty okolo pH 9 až 10.

Vynález se dále zaměřuje na objev, že vzniklé roztoky Αβ peptidů je možné podrobit sterilní filtraci přes vhodný mikroporový filtr se ziskem nejméně 50 % Αβ peptidů z filtrace. Je v přednostní zájmu získat aspoň 70 % Αβ peptidů, nejlépe aspoň 90 %. Takový sterilní roztok může být považován za farmaceutickou složku obsahující dostatečné množství Αβ peptidů k vyvolání imunogenní odpovědi po podání savcům. Upřednostňováno je parenterální podání ve formě suspenze.

Jedním aspektem vynalezeného prostředkuje úprava pH prostředku po sterilní filtraci na fyziologicky akceptovatelné hodnoty tak, aby peptidová suspenze obsahovala nejméně 0,1 mg/ml Αβ peptidů. Tento prostředek je potom vhodný pro parenterální podání. Hodnoty pH suspenze se pohybují v rozmezí od 5 do 7, přednostně mezi 5,5 až 6,5. Prostředek, který se nejvíce upřednostňuje obsahuje dostatečné množství QS-21 ve spojení s Αβ peptidem tak, že vytváří opticky čistou, sterilní suspenzi.

Tento vynález se dále zaměřuje na objev, že rozpuštěné a poté sterilní roztoky Αβ peptidů mohou být lyofilizovány, poskytující tak lyofilizovanou podobu obsahující Αβ peptid.

V okamžiku potřeby mohou byt z této podoby zpět převedeny na vodné prostředky obsahující Αβ peptid.

ft * ftft · · ftft ··· ftft·· ft · · ft ft · ·

Dále se tento vynález zaměřuje na vodný roztok s obsahem nejméně 0,01 mg/ml Αβ peptidu s pH odpovídajícím rozpuštěné formě Αβ peptidu. Roztok je udržován na optimální hodnotě pH pomocí dostatečného množství farmaceuticky akceptovatelného pufru.

Dále je tento vynález zaměřen na sterilní vodný roztok obsahující nejméně 0,01 mg/ml Αβ peptidu s pH odpovídajícím rozpuštěné formě Αβ peptidu. Roztok je udržován na optimální hodnotě pH pomocí dostatečného množství farmaceuticky akceptovatelného pufru.

Dalším zaměřením tohoto vynálezu jsou lyofylizované prostředky obsahující Αβ peptid připravené způsobem:

a) zmrazením sterilního vodného roztoku obsahujícího aspoň 0,01 mg/ml Αβ peptidu, kde daný vodný roztok je udržován při pH dostatečném k rozpuštění daného Αβ peptidu a

b) lyofilizací zmraženého prostředku připraveného podle kroku a).

S výhodou zahrnuje prostředek tohoto vynálezu dlouhou formu (definovanou níže) Αβ peptidu. Nejlépe potom prostředek zahrnuje farmaceuticky akceptovatelný pufr, vybíraný nejspíše ze skupiny tvořené aminokyselinami, jejich solemi a deriváty; farmakologicky akceptovatelnými alkaliemi, hydroxidy kovů a ammoniumhydroxidy, organickými a anorganickými kyselinami a jejich solemi; a smíšeninami zmíněných sloučenin.

Dále se tento vynález zaměřuje na prostředek zahrnující vodný roztok, který obsahuje aspoň 0,01 mg/ml Αβ peptidu, jehož pH je odpovídající pro zachování rozpuštěné formy Αβ peptidu a kde Αβ peptid je ve významné míře v náhodně svinuté konformaci.

Prostředek tohoto vynálezu může být upraveno na farmaceutický prostředek vhodný k podání savcům s Alzheímerovou demencí nebo v riziku rozvoje této demence.

Aspekty složení vynálezu se zaměřují na farmaceutické prostředky, které jsou vodnou suspenzí nejméně 0,01 mg/ml Αβ peptidu obsaženého v rozpustné náhodně svinuté konformaci nebo stabilní formě a nebo jsou lyofilizovány, kdy jakýkoliv z nich může být ve sterilní podobě parenterálně aplikován.

Jedním ze zaměření vynálezu je způsob přípravy sterilního prostředku dlouhé formy Αβ peptidu, který zahrnuje:

úprava pH vodného roztoku na hodnotu dostatečnou k rozpuštění Αβ peptidu; rozpuštění Αβ peptidu v roztoku v množství dostatečném na dosažení imonogenní koncentrace Αβ peptidu pro savce;

* · • · filtrace výsledného roztoku přes membránu s póry o stejné velikosti, která se pohybuje v rozmezí dostatečném k zachycení bakterií a zároveň umožňujícím průchod téměř veškerého množství Αβ peptidu; a úpravou pH roztoků obsahujících 0,1 mg/ml nebo více Αβ peptidu na hodnoty okolo pH 5 až 7 získat suspenzi peptidu.

Dalším zaměřením tohoto vynálezu je proces prevence a léčby Alzheimerovy demence u savců, jehož postup zahrnuje podávám dostatečného množství sterilního vodného prostředku obsahujícího aspoň 0,05 mg/ml Αβ peptidu savcům za účelem vyvolání imunitní odpovědi.

Tento vynález upřednostňuje filtraci Αβ peptidu, který se z většiny nachází v náhodně svinuté konformaci.

Tento vynález se zaměřuje na prostředky a metody, které používají vodné prostředky obsahující terapeuticky účinnou koncentraci Αβ peptidu. Dříve než přistoupíme k popisu vlastního vynálezu ve větších detailech, budou definovány následující termíny.

Definice:

Termín „významná identita“ znamená, že dvě peptidové sekvence, pokud jsou optimálně seřazeny, jako pomocí programů GAP nebo BESTFIT používajících trvale rozdílné hmotnosti, sdílejí aspoň 65 % sekvenční identity, s výhodou 80 nebo 90 %, nejlépe aspoň 95 % sekvenční identity nebo více (např. 99 % sekvenční identita nebo vyšší). Zbylé pozice, které nejsou identické, se liší konzervativní substitucí aminokyselin.

Pro srovnání sekvencí představuje typicky jedna sekvence referenční sekvenci, proti které se porovnává testovaná sekvence. Vhodnou referenční sekvencí by byla sekvence lidského Αβ peptidu, konkrétně 42-aminokyselinová sekvence popsaná níže. Další vhodné formy by byly zkrácené sekvence: jako je Αβ39, nebo prodloužená sekvence Αβ43 (s přidanou threoninovou skupinou na C-terminálním konci). Při použití srovnávacího algoritmu sekvencí, se referenční a testovaná sekvence zadá do počítače, pokud je to nutné zadají se shodné oblasti sekvencí, a nastaví se parametry programu sekvenovacího algoritmu. Srovnávací sekvenční algoritmus potom na základě zvolených parametrů procentuálně vyhodnotí sekvenční shodu testované sekvence vztažené k referenční sekvenci.

Optimální polohy sekvencí pro srovnání je možné dosáhnout např. pomocí algoritmu lokální homologie: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), algoritmu homologního postavení: Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), metodou hledání shodné oblasti: Pearson & Lipman, Proč. Naťl. Acad. Sci. USA 85:2 444 (1988), počítačovým provedením

9 9 «9 · · · · «9· 9 · · · 9 · 9 9

9999 9 · 9 99 ·

9999999 9 * 99 9 9 • 99 999 999 •9 9 99 9999 99 9999 těchto algoritmů (GAP, BESTFIT, FASTA a TFASTA z Wisconsin Genetic Software Package, Genetic Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) nebo visuální kontrolou (Ausubel et al., viz výše v celém rozsahu). Příkladem vhodného algoritmu pro procentuální určení sekvenční shody a sekvenční podobnosti je algoritmus BLAST, popsaný v Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Softwarové vybavení pro provedení BLAST analýzy je veřejně dostupné prostřednictvím National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

K provedení sekvenčního srovnání je možné použít trvalé parametry programu, aleje také možné tyto parametry upravit. Pro aminokyselinové sekvence používá program BLASTP jako stálé délku slova (W) 3, shoda (E = expectation) 10 a BLOSUM62 vyhodnocovací vzor (viz Henikoff & Henikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89,10 915 (1989)).

Za účelem klasifikace aminokyselinových substitucí na konzervativní a non-konzervativní, rozdělují se aminokyseliny do následujících skupin: skupina I (hydrofobní část řetězce): norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile; skupina II (neutrální hydrofilní část řetězce): Cys, Ser, Tthr; skupina III (kyselá část řetězce): Asp, Glu; skupina IV (zásaditá část řetězce): Asn, Gin, His, Lys, Arg; skupina V (zbytky ovlivňující orientaci řetězce): Trp, Tyr, Phe. Konzervativní substituce představují substituce mezi aminokyselinami v rámci jedné skupiny. U non-konzervativních dochází k výměně členů z jedné skupiny za členy skupiny jiné.

App⁶⁹⁵, APP⁷⁵¹ a APP⁷⁷⁰ označují 695, 751 a 770 aminokyselin dlouhé polypeptidy kódované lidským APP genem. Viz Kang et al., Nátuře 325, 773 (1987); Ponte et al., Nátuře 331, 525 (1988); a Kitaguchi et al., Nátuře 331, 530 (1988). Aminokyseliny lidského amyloidprekurzorového proteinu (APP) jsou očíslovány podle sekvence izoformy APP770.

V přítomném vynálezu a v literatuře představuje hmotnost vlastního Αβ peptidů asi 70 až 80 % celkové hmotnosti Αβ peptidů a zbylých asi 15 až 30 % je tvořeno solí a vodou. Toto bylo určeno aminokyselinovou analýzou a/nebo analýzou nitrogenových částic. Například v případě peptidů Αβ42 o hmotnosti 0,1 mg, po opravě podle vlastního obsahu peptidů, je 0,075 mg hmotnosti určeno vlastním peptidem Αβ42 a 0,025 mg tvoří voda a sůl; 0,6 mg peptidů Αβ40 tvoří 0,45 mg samotného peptidů Αβ40 a 0,15 mg vody a soli; a 2,0 mg peptidů Αβ42 tvoří 1,5 mg peptidů Αβ42 a 0,5 mg vody a soli.

Název Αβ peptid používaný v tomto vynálezu, označuje ty segmenty Αβ peptidů, schopné zaujímat β-strukturu skládaného listu a schopné vyvolat imunogenní odpověď po podání savcům, ať samostatně nebo vázané na nějakém adjuvans. Je v rámci běžných možností techniky určit β strukturu skládaného listu, například, jak je zde popsáno, za použití stanovení cirkulámího ·»« «* «♦ · · · · • · · · # · « · · · · ·»·· · · · · · · • ··«···· '► * <· · · ··· · · · ··· ·· » « ···· ·· ··«· dichroismu. Imunogenicita může být určena způsobem popsaným níže v Příkladech v části Biologická aktivita.

Termín „dlouhé formy Αβ peptidu“ označuje jakoukoliv z přirozeně se vyskytujících forem Αβ38, Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 a Αβ43 a s nimi významně shodné peptidové sekvence a přednostně lidské formy. Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 a Αβ43 označují Αβ peptid obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 38, 1 až 40, 1 až 41,1 až 42,1 až 43, respektive, kdy aminokyseliny jsou odebírány z C-terminálního konce peptidu. Αβ40, Αβ41 a Αβ39 se tak liší od Αβ42 absencí Ala, Ala-Ile a Ala-Ile-Val, respective, na C-konci, jak je možné vidět při srovnání s níže uvedenou sekvencí Αβ peptidu. Αβ42 se liší od Αβ43 přítomností threoninového zbytku na C-konci. Sekvence těchto peptidů a jejich vztah k APP ilustruje obrázek 1 v Hardy et al., TINS 20,155(1997).

Sekvence Αβ42 je: H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-GlnLys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-ValGly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH.

Termín „dlouhé formy Αβ peptidu“ také zahrnuje analogy těchto forem. Analogy jsou alelické, druhové a indukované varianty. Typicky se liší od přirozeně se vyskytujících peptidů v jedné nebo několika pozicích, často na základě konzervativních substitucí. A typicky vykazují aspoň 80% nebo 90% sekvenční identitu s přírodním peptidem. Některé analogy také obsahují aminokyseliny, které se normálně přírodně nevyskytují, nebo modifikace N- nebo C-terminálních aminokyselin. Příklady aminokyselin, které se v přírodě nevyskytují, jsou a, a-disubstituované aminokyseliny, N-alkyl aminokyseliny, kyselina mléčná, 4-hydroxyprolin, γ-karboxyglutamát, εΝ,Ν,Ν-trimethyllysin, ε-N-acetyllysin, O-fosfoserin, N-acetylserin, N-formylmethionin, 3methylhistidin, 5-hydroxylysin, ω-N-methylarginin.

Αβ může být využit v prostředcích nebo postupech tohoto vynálezu v koncentracích asi od 0,05 mg/ml do horní hranice jeho rozpustnosti asi 2,0 mg/ml (viz obr. 2). Upřednostňované rozmezí koncentrací peptidu je od 0,1 do 0,8 mg/ml, z něhož nejvíce od 0,3 do 0,6 mg/ml.

Bylo popsáno, že nerozpustná forma Αβ peptidu nalezené v amyloidových plácích má strukturu β-skládaného listu. Soto, C., et al., Neuroscience Letters, 186 (2-3), pp. 115-118, (1995). Také Simmons, L.K., et al. Molec. Pharmacol., 45 (3) pp. 373-379 (1994) popsal, že struktura β-skládaného listuje spojena s neurotoxickými účinky peptidu, zatímco náhodně svinutá forma je jen velmi málo toxická nebo neaktivní. Jak je zmíněno výše, metody a prostředky tohoto vynálezu mohou využívat náhodně svinutou konformaci Αβ peptidu. Žadatel • · · «« · * « · · » « · 6 • · · · · · » • ·····<· · 9 ·· ·»

·.» · »» ♦·»» zde ukazuje, že náhodně svinutá konformace je schopná vyvolat imunitní odpověď u testovaných savců. Náhodně svinutá struktura se upřednostňuje v mikrofiltraci u postupů vynálezu.

. Termín „náhodně svinutá“ označuje strukturu otevřeného řetězce Αβ peptidu. Náhodné svinutí je sekundární struktura peptidového řetězce a není uspořádaná pravidelně jako struktura α-helixu nebo β-skládaného listu. Spíše, jde u náhodného svinutí o porušení hydrofobního poskládání a vodíkových vazeb, které jsou charakteristické pro jiná, pravidelnější uspořádání. I tak může náhodné svinutí obsahovat určitá stočení peptidového řetězce nebo částečnou pravidelnost, tyto znaky jsou však náhodné a dynamické, a proto nejsou typické pro všechny náhodně svinuté konformace. Náhodně svinutá struktura peptidu vykazuje dobrou rozpustnost a fíltrabilitu. Struktura α-helixu nebo β-skládaného listu jsou v oboru dobře známé peptidové struktury. Jsou popsány například v Leninger‘s Biochemistry (2^nd Ed., Worth Publishers, 1975) na str. 128 až 129 pro α-helix a pro β-skládaný list na str. 133 až 134, která je zahrnuta v odkazech tohoto textu.

Náhodně svinutá struktura může být charakterizována svým spektrem cirkulámího dichroismu („CD“) a je snadno rozlišitelná od struktury β-skládaného listu. Jak ukazuje CD spektrum, pro náhodně svinutou strukturuje specifický silný negativní proužek mezi 190 a 200 nm a malý CD signál je vidět u vlnových délek delších než 215 nm. Pokud je vidět CD signál u vyšších vlnových je velmi slabě pozitivní v oblasti 220 až 225 nm. To ukazuje obrázek 1 v části Výkresy. Struktura β-skládaného listu naopak vykazuje ostrý a pozitivní proužek v oblasti okolo 200 nm. Na podrobný popis určení sekundární peptidové struktury prostřednictvím CD spektra odkazujeme na Manningovu monografii citovanou výše.

Αβ peptid je v podstatě v náhodně svinuté konformaci, pokud se více než 50 % Αβ peptidu nachází v této konformaci. Lépe potom, pokud více než 70 % až 80 %, nejlépe více než 85 % až 90 % Αβ peptidu je v náhodně svinuté konformaci.

„Parenterální prostředky“ jsou ty, které jsou sterilní a vhodné pro podání přímo do organismu, například injekčně nebo infuzí, tj. cestou, která má bezprostřední kontakt s krví a která je bez přirozených bariér a protekce imunitního systému spojené s podáním lékových forem vstupujících do organismu přes kůži, sliznici, trávicí nebo dýchací systém. Z těchto důvodů je sterilita parenterálních prostředků nezbytná.

„Infuze“, ve smyslu aplikace léku, je v podstatě kontinuální a pomalé přitékání roztoku léku do krevního řečiště během poměrně dlouhého časového úseku. Naproti tomu, „injekce“ je rychlé podání dávky roztoku nebo suspenze.

• * * «» · ··» · * · *··« · * » fcfcfcfcfcfcfc « ·» · fc * ♦··· fcfc fcfcfcfc

Intravaskulámí (nebo intravenózní nebo IV); intramuskulámí (IM); intraperitoneální (IP); subkutánní (SC); a intrastemální jsou vše různé způsoby podání parenterálního prostředku. Anatomicky popisují oblasti těla, kam je parenterálního prostředek vpraven injekčně nebo infuzí. Prostředky tohoto vynálezu, které mají fyziologicky akceptovatelné pH, mohou být aplikovány jakýmkoli výše popsaným způsobem, což závisí na individuálním pacientovy a rozhodnutí lékaře. Roztoky s vyšším pH (pH > 8) je nej výhodnější podávat formou pomalé IV infuze.

Pro pochopení výrazů „pufř“ a „pufrovací činidlo“ tak, jak jsou používány v tomto vynálezu, je dobré připomenout, že titrační křivka kyseliny nebo zásady má relativně horizontální oblast v rozsahu asi 1,0 pH jednotky na každé straně titračního optima. V titračním optimu se přítomné množství protonových donorů dané kyseliny nebo zásady rovná množství přítomných protonových akceptorů. V této oblasti se při malém zvýšení H⁺ nebo OH' iontů pH systému mění poměrně málo. Je to oblast, ve které konjugovaný pár kyselina-zásada funguje jako pufř, tedy systém bránící změnám pH při daném zvýšení H⁺ nebo OH' iontů. Při pH hodnotách ležících mimo tuto oblast má pufr menší kapacitu k zabránění změnám pH. Síla pufřu je nej vyšší při pH které odpovídá titračnímu optimu jeho titrační křivky, tj. stavu, kdy se koncentrace protonových donorů a akceptorů rovnají a pH je rovné pK (kyselá disociační konstanta). Přípravy pufru detailně popisuje Data for Biochemical Research, Rex, M.C., Oxford Science Publications, 1995.

Mnoho fyziologických mechanismů zajišťuje v organismu udržení pH v úzkém rozmezí od 7,35 do 7,45. Ačkoliv některé z hlavních puířovacích mechanismů jsou založeny na rovnováze kyseliny uhličité nebo fosforečné, mnoho jiných mechanismů představují aminokyseliny a proteiny. Například pH slz je udržováno na hodnotě 7,4 proteinovým pufrem. Samotné aminokyseliny jsou také vhodnými pufry, ačkoliv vykazují komplexnější titrační křivku tím, že mají donorový i akceptorový atom uvnitř jedné molekuly. Taková molekula se označuje jako zwiterion, tj. existuje ve formě, která nese jak pozitivně, tak i negativně nabité místo na jedné molekule. Aminokyseliny jsou schopné pufrovat přidání H⁺ i OH'iontů, jak je ukázáno níže.

neutrální zwitterion (dipolámí forma)

99 • · 9 « « · * • · » ♦ « · · • · · « · · · • 99999«· 9 * • · · 9 9 ··· ·»··

Z pohledu tohoto vynálezu, „farmaceuticky akceptovatelný pufř“ je definován tak, že zahrnuje konjugovaný pár kyselina -zásada, stejně jako kyselou nebo zásaditou sloučeninu se schopností upravit nebo udržet pH roztoku Αβ peptidu na požadované úrovni. Ve způsobech rozpuštění/filtrace tohoto vynálezu, je pH 8,5 nebo vyšší nebo jindy naopak nižší než pH 4.

Takové pufry jsou vybrány zejména ze skupiny tvořené aminokyselinami, solemi a jejich deriváty; farmakologicky akceptovatelnými alkalizátory, alkalickými hydroxidy kovů a ammoniumhydroxidy, organickými a anorganickými kyselinami a jejich solemi; a výběrem jejich směsí. Pufraění činidla se používají v koncentracích dostatečných k dosažení a udržení požadovaného pH, a tak jsou jejich koncentrace závislé na kyselosti/zásaditosti každého pufru nebo vybrané směsi. Výběr účinné koncentrace je otázkou standardních možností oboru používající např. pH metry nebo titrační techniky.

Příklady skupin sloučenin vhodných pro přítomný vynález jsou hydroxidy, včetně alkalických hydroxidů kovů a ammoniumhydroxidů, alkalizátory známé ve farmaceutickém průmyslu, zahrnující (ne však výlučně) Tris, boritan sodný (Τ^Ε^Ογ) a disodiumcitrát, aminokyseliny, soli, estery nebo aminy aminokyselin a jejich jednoduché deriváty, např. N-acetyl deriváty aminokyselin. Zvláště upřednostňovanými pufry jsou glycin (např. glycinát sodný), arginin a lysin, hydroxid sodný a ammoniumhydroxid.

Příklady farmaceuticky akceptovatelných kyselin, které je možné použít v metodách tohoto vynálezu jsou, bez omezení, chlorovodíková kyselina, fosforečná kyselina, citrónová kyselina, octová kyselina, maleinová kyselina, jablečná kyselina a jantarová kyselina, apod.. Navíc mohou být tyto kyseliny použity k titraci pH zásaditých roztoků na nižší, fyziologicky lépe akceptované hodnoty, kdy výsledkem je prostředek ve formě peptidové suspenze.

Opačně mohou být základní sloučeniny, jako jsou výše popsané, použity k titraci nízkých pH hodnot filtrovaného roztoku na fyziologicky akceptovatelnější pH, což také vede ke vzniku peptidové suspenze.

• · 0

0 0 · • 000 0

0000

Kombinace činidel upravujících pH jsou také zamýšleny. Konjugované páry kyselina-zásada popisované výše a dokládané na příkladě solí jako je acetát amonný jsou také předmětem zájmu jako pufrační činidla pro tento vynález. Takový konjugovaný pár může být vytvořen například titrací zásaditého roztoku hydroxid amonného kyselinou octovou na roztok acetátu amonného blízký neutrálním hodnotám.

Výraz „modifíkátor tonicity“, tak jak je používán v textu, zahrnuje činidla, která přispívají k osmolalitě roztoku. Příklady modifikátorů tonicity hodících se pro tento vynález zahrnují sacharidy (cukry), jako je mannitol, sacharóza a glukóza a soli jako je chlorid sodný, chlorid cínatý apod., nejsou však omezeny na vyjmenované. Přednostně budou ionizační činidla využita v množství zajišťujícím hodnotu výsledné tonicity menší než asi 350 mOsm/kg, lépe mezi asi 250 až 350 mOsm/kg, nejlépe potom mezi 280 až asi 320 mOsm/kg. Bude ještě popsáno, že nabité sloučeniny, které slouží v prostředku jako pufry, mohou také ovlivnit tonicitu. Tím je tonicita pufrováného roztoku Αβ peptidu poprvé určena dříve, než je upravována přidáním tonicitu modifikujících činidel.

Použití chelačního činidla v postupech a prostředcích vynálezu není nutné. Příklady preferovaných chelátů zahrnují ethylendiamintetraoctovou kyselinu (EDTA) a její soli (jako jsou sodné), které jsou normálně používány v koncentraci od 0,05 do 50 mM, přednostně v koncentracích od 0,05 do 10 mM nebo nejlépe okolo 0,1 až 5 mM. Jiná známá chelační (nebo izolační) činidla, jako některé polyvinylalkoholy, mohou být také použita.

Podle volby může prostředek obsahovat surfaktant nebo detergent jako sorbit (polysorbate) (např. Tween®) nebo 4-(1,1,4,4-tetramethylbutyl) fenyoxypolyethoxyethanoly (Triton®) nebo polymery polyethylenpolypropylenglykolů (Pluronics®). Surfaktanty se pohybují v rozmezí od asi 0,005 do 1 %, přednostně okolo 0,02 až 0,75 %. Preferovaný polysorbit je PS-80 komerčně dostupný jako Tween® 80.

Zvlhčovači činidla jsou také zamýšlenou inertní složkou vynálezu. Polyethylenglykoly, např. PEG 3350, jsou vhodné k modifikaci sdružování Αβ částic a jejich rozpustnosti asociací s povrchem polymeru a k uspořádání hydrofilních částí molekuly ve vodném prostředí. Zvlhčovači činidla mohou být přítomna v množství od 0,5 do 5 % (hmotnostních).

Farmaceuticky akceptovatelné cukry (např. sacharóza, dextróza, maltóza nebo laktóza) nebo farmaceuticky akceptovatelné cukerné alkoholy (např. mannitol, xylitol nebo sorbitol) nemají žádný vliv na léčebné efekty účinných složek. Z určitého aspektu tohoto vynálezu mohou být použity cukry nebo cukerné alkoholy, jejichž molekulová hmotnost je menší než 500 a které se snadno rozpouští a dispergují ve vodě. Příklady cukrů a cukerných alkoholů, které je možné * · ♦ 4· ♦ ♦ 4 · ♦ · ··» ♦« ·· ♦ » · · i? ···*···»·* ^ίΛ“ ···«····· · 4 · · · • 9 · 4· ···· 4· 4«·· použít v přítomném vynálezu, zahrnují xylitol, mannitol, sorbitol, arabinóza, ribóza, xylóza, glukóza, mannóza, galaktóza, sacharóza, laktóza apod..

apod.. Mohou být použity samostatně nebo jako směs dvou nebo více z těchto sloučenin. Nejvíce preferovaný cukr je mannitol, zejména v lyofílizovaných prostředcích; sacharóza se ještě upřednostňuje u prostředků ve formě roztoku.

Bylo zaznamenáno, že použití QS-21 jako adjuvans („nosiče“) v prostřeku vynálezu interaguje se suspendovaným proteinem takovým způsobem, že vznikne vizuálně průhledná suspenze. Toto je žádoucí interakce, kdy peptid je v konformaci β-skládaného listu, aleje suspendován ve fázi ve formě velmi malých částic a může poskytovat danému prostředku výhodnější vlastnosti, jako zvýšit stabilitu a imunogenicitu suspenze. DPPC (dipalmitoylfosfatidylcholin) je v oboru známý a očekává se, že interaguje s Αβ peptidem podobným způsobem jako QS-21 poskytující stejnou suspenzi malých částic aje zvažováno jeho užití jako dalšího adjuvans ve vynálezu, za poskytnutí vizuálně čiré suspenze. Případně mohou být použita další adjuvans v příměsi s QS-21.

Lyofílizace je technika dobře známá ve farmaceutických technikách, jako jsou postupy pro stabilizaci peptidů během a po lyofilizačním procesu. Stabilizace proteinu nebo peptidového lyofílizátu v aminokyselinové, sacharidové matrix je také známou možností v oboru. Viz, např.: Lueckel B., et al., Formulations of sugars with amino acids or mannitol - Influence of concentration ratio on the properties of the freeze-cocentrate and the lyofílizate, PHARM. DEV. TECHNOL. 3(3) pp. 325-336 (1998). The Royal Pharmaceutical Society of GB Symp: ‘New Analytical Approaches to the Charakterization of Biotechnology Products‘, červen 1996 Luckel B.; et al., představil: A stratégy for optimizing the lyofílization of biotechnological products, PHARM. SCI. (UK) 3(1) pp. 3-8 (1997). Oba tyto odkazy jsou tímto začleněny poznámkou v celém svém rozsahu.

Termín „farmakologicky akceptovatelný“ určuje jakékoliv prostředek v tom smyslu, že prostředek nenese žádné škodlivé nebo nečekané účinky pro subjekt, kterému je podán a v souvislosti, ve které je podán. Výrazy „farmakologicky akceptovatelné rozpouštědlo“ a „farmakologicky akceptovatelné inertní vehikulum“ se vztahuje k jakékoliv sloučenině, která chrání nebo nepoškozuje aktivitu účinných sloučenin(y) a nenese žádné škodlivé nebo nečekané účinky pro subjekt, kterému je podáno a v souvislosti, ve které je podáno, jako netoxické činidlo upravující pH, pufřační činidlo nebo tonicitu modifikující činidlo nebo chelační činidlo, apod..

Prostředek nebo postupy „zahrnující“ jednu nebo více zmíněných složek mohou zahrnovat další složky, které nebyly specificky popsány. Například prostředek, který obsahuje Αβ peptid • 9 99 ·· ' · · * · · 9 • · 9 9 » • · 9 9 9 9 · · · » 9 9 9999 zahrnuje jednak Αβ peptid v podobě popsaného prostředku a Αβ peptid jako součást prostředku s dalšími nezmiňovanými složkami.

Další definice jsou následující:

Zkratky

Definice °C

C.D.

PH pK

PS-80 pm min.

ml

M

N mM

DMSO

EDTA

Tris

RP-HPLC rpm

CFA/IFA

MPL

QS-21

FIO stupně Celsia cirkulámí dichroismus log [H⁺], stanovém obsahu vodíkových iontů a tím acidity nebo bazicity roztoku kyselá disociační konstanta související s pH podle vztahu: [akceptorů H⁺] pH = pK + log------------------[donorů H⁺] polysorbit 80 nebo směsný polymer polysorbitu 80 a ethylenoxidu Tween 80®; monograf. Merck Index č. 7559 (11. vydání) mikrometr minuta mililitr molarita, veličina určená moly/litr normalita-označení molarity roztoku milimol dimethylsulfoxid ethylendiamintetraacetát, obvykle ve formě disodné soli trimethamin, tris(hydroxymethyl)aminomethan; monograf. Merck Index ě. 9684 (11. vyd.) reverzní fáze vysoce účinné kapalinové chromatografie otáčky za minutu kompletní Freundovo adjuvans/nekompletní Fr. adjuvans (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32,173-186 (1998))

3-O-deacylovaný monofosforilovaný lipid A (MPL™) (viz např. GB 2220211) triterpenglykosid nebo saponin izolovaný z kůry stromu Quillaja Saponaria Molina původem z Jižní Ameriky (viz Kensil et al., z Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell & Newman, Plenům Press, NY, 1995); US Pat. No. 5,057,540). (Stimulon™ QS-21) pouze pro informaci

Filtrace je proces oddělování kontaminant z tekutiny na základě velikosti průchodem membránovým filtrem, jehož póry mají uniformní velikost. Ačkoliv částice velikosti mikrometrů mohu být odděleny za použití nemebránových nebo hustých materiálů, jako těch nalézaných ve • · ·· ·· *· * « · · *·· » · » · • · · · · · · * t · • · ···· »·· » · · · · ««« · · · · · · ·» · ·· ···· ·· ···» fibrózním mediu, pouze membránové filtry s přesně definovanou velikostí pórů mohou zajistit kvantitativní oddělení částic s menší velikostí. Tak je membránovou filtrací možné kvantitativně odstranit bakterie z roztoku, který projde mikrofiltrem, a tím ho sterilizovat. Dříve v souvislosti s purifikací Αβ peptidu, byl peptid natolik nerozpustný nebo zůstával agregován do té míry, že roztok nemohl být mikrofiltrován na komerčním zařízení, protože docházelo k ucpání membrány částicemi a/nebo nízkému zisku peptidu ve výsledném mikrofiltrátu.

Používané filtry jsou obecně definovány jako filtry, které mají schopnost oddělit částice o velikosti 0,2 mikrometru a více.

Membránový filtr jednotně přidělen substrátu a obecně umožňuje separaci na základě velikosti na povrchu membrány. I tak, mohou povrchové membránové filtry zachycovat částice jednak uvnitř své struktury i na povrchu membrány. Při separaci na základě velikosti, prochází částice menší než póry membrány filtrem, zatímco větší částice zůstávají na povrchu membrány. Protože se tyto filtry s definovanou velikostí „nevyprazdňují“ (tj. jak se filtr začíná plnit zachycovanými částicemi, může při rostoucím průtokovém tlaku dojít k průchodu malého množství zachycených částic) jsou podrobovány mikrobiologické kontrole. Sterilizační povrchové membránové filtiy jsou ve farmaceutickém průmyslu dobře známé.

U všech použití filtrace může být propustnost filtru narušena chemickými, molekulárními nebo elektrostatickými vlastnostmi filtru, avšak bylo popsáno, že hydrofílní filtry používané pro tento vynález jsou stabilní v prostředí vysokého nebo naopak nízkého pH, které závisí na použité metodě, a spolehlivě oddělují nežádoucí částice, aniž by se ucpávaly. Závisí na dovednostech standardně schopného pracovníka, aby byl schopen vybrat a použít hydrofílní mikrofiltr. Specifikace komerčně dostupných produktů nebo webové stránky jako: http://millispider.millipore.com/corporate/sitemap.nsf/catalogs (z května 1999) umožňuje výběr filtru s požadovanými vlastnostmi.

Příklady filtrů, které preferujeme, užívaných v přítomném vynálezu jsou Millipore Durapore®, také nazývaný Millex GV, (Millipore Corporation, hlavní sídlo Bedford, MA), hydrofílní polymer polyvinylidenfluorid, který má dobrou stabilitu a nízké protein-vazebné vlastnosti a poty s průměrem 0,22 pm; Millex GN™, hydrofílní nylonový materiál s póry o velikosti 0,2 pm; a Millex GP™, hydrofílní polyetersulfonový polymer s povrchovou úpravou a póry o velikosti 0,22 pm. Nejvíce se preferuje Durapore vzhledem k jeho stabilitě při pH 9 až 9,5.

4 4 »♦ 4 · 44 4 4 • · · 4 4 4 4 * 4 4 4

4444 44 · 44 ·

4444444 4 4 · 4 4 4

444 444 444

4 44 4444 44 «444

Ideálně, je prakticky všechen Αβ peptid znovu získán z filtrace. Získání prakticky celého Αβ peptidu je definováno tak, že více než asi 50 % peptidu je získáno ze sterilní filtrace. Přednostně více než 80 % Αβ peptidu a nejvíce se upřednostňuje získání více než 90 % Αβ peptidu z filtrace.

Metody

Metody tohoto vynálezu představují přípravu vodných prostředků s koncentracemi nejméně 0,01 mg/ml Αβ peptidu. Takové prostředky jsou připraveny úpravou pH roztoku tak, že se v něm Αβ peptid rozpustí za dosažení požadované koncentrace (např. v koncentraci v rozmezí od asi 0,1 mg/ml do asi 2,0 mg/ml).

Úpravy pH vodného roztoku se dosahuje běžnými postupy, které typicky ilustruje přidání buď kyseliny nebo zásady k získání požadovaného pH. Použitá kyselina nebo zásada je v užitém množství farmakologicky akceptovatelná. S cílem udržet pH roztoku během delšího skladování, je dobré použít v prostředku farmakologicky akceptovatelný pufr. Výběr vhodného pufru, vzhledem k požadovanému pH, je otázkou znalostí v oboru.

Doporučuje se, aby pH vodného roztoku bylo upraveno na hodnoty okolo pH 2 až pH 4 nebo okolo pH 8,5 až pH 12. Při takových pH je Αβ peptid překvapivě docela rozpustný.

Pokud je postup vynálezu prováděn při nízkém pH (okolo pH 2 a 4), potom mohou být k snížení pH na požadovanou hodnotu použity kyseliny jako jsou halogenvodíkové kyseliny (např. HCI, HBr), kyselina fosforečná, citrónová a octová a další farmakologicky akceptovatelné kyseliny. Výběr vhodných kyselin je otázkou znalostí v oboru.

Pokud je postup vynálezu prováděn při vysokém pH (okolo pH 8,5 až 12), potom mohou být k zvýšení pH na požadovanou hodnotu použity farmakologicky akceptovatelné zásady, jako jsou alkalické kovy, ammoniumhydroxidy (např. NaOH, NH4OH) apod.. U vysokých hodnot pH, je pH roztoku v daném pufru přednostně upraveno na rozmezí mezi 8,5 až 11. Nejlépe na pH pohybující se v rozmezí pH 9 až 10.

Před nebo následně po úpravě pH je do roztoku přidána požadovaná koncentrace Αβ peptidu. Preferuje se samozřejmě přidání Αβ peptidu po úpravě pH s cílem bezprostředního rozpuštění peptidu. Po jeho přidání, může být nezbytné pomoci rozpuštění jemným protřepámm a zahřátím.

Přidání jakékoliv z volitelných přísad, jako jsou farmakologicky akceptovatelné pufry, tonicitu modifikující činidla, nosiče, atd. do prostředkuje možné v jakémkoliv vhodném okamžiku před nebo po přidání Αβ peptid.

Jakmile je výše popsaný roztok připraven, je možné pokračovat sterilizační filtrací a/nebo lyofilizací podle postupů v oboru dobře známých, které jsou ilustrovány níže v Příkladech.

• · · · •···· · fc ·· ·· ♦ fcfc · • · · • fcfc · • fcfc •fc ····

Následující roztoky jsou pufrační systémy preferované k rozpuštění Αβ peptidu s dosažením cílové koncentrace v rozmezí od 0,6 do 2 mg/ml peptidu:

Upřednostněné aminokyselinové prostředky:

mM Glycinát sodný, pH 9,0, 9,5 nebo 10,0 a/nebo s 0,02 až 1,0% (hmotnostních) polysorbitem 80 (PS-80) podle volby obsahující jeden nebo více modifíkátorů tonicity tak, aby vyhovovalo parenterálnímu podání;

mM L-Arginin-Hcl nebo 10 mM L-Lysinát, oba s pH 9,0,10,0 a/nebo s 0,02 až 1,0% (hmotnostních) polysorbitem 80 (PS-80) podle volby obsahující jeden nebo více modifíkátorů tonicity tak, aby vyhovovalo parenterálnímu podání.

Prostředky přítomného vynálezu je optimální skladovat při nízké teplotě, aby se zabránilo degradaci nebo agregaci peptidových řetězců. Vhodné teplotní rozmezí pro skladování prostředků Αβ peptidu se pohybuje od 2 do 8 °C.

Následující příklady ilustrují uplatnění vynálezu. Tyto příklady jsou pouze ilustrativní a nesnaží se v jakémkoliv směru omezit rozsah nároků vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 je C.D. spektrum ukazující měření průměru zbytkové elipticity vyjádřené v závislosti na vlnové délce pro dva různé roztoky Αβ42. Přerušovaná čára ukazuje absorbanci při pH 6 a je možněji přiřadit k struktuře β skládaného listu. Plná čára vyjadřuje absorbanci roztoku Αβ42 při pH 9 a ukazuje na náhodně svinutou strukturu peptidu.

Obrázek 2 je vyjádření srovnání Αβ42 umístěného do roztoku a odhadu píkové plochy pro množství rozpuštěného peptidu určené pomocí reverzní fáze HPLC (high performance liquid chromatography) vyjadřující rozpustnost Αβ42.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Rozpustnost peptidu • 9

9 99 99

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

9999999 9 ·

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

99

Peptid a činidla

Αβ42 byl získán ve formě jeho trifluoroacetátové soli od American Peptide Co., Lot Numbers M05503T1, M10028T1 a byl použit bez další modifikace. Jiné soli jsou dostupné a byly úspěšně použity v postupech vynálezu. Na příklady iontů solí s opačným nábojem viz tabulka 2. Všechny kyseliny, zásady a pufry byly připraveny z kvalitních laboratorních reagencíí a byly pro snadné použití skladovány ve formě sterilních přefiltrovaných zásobních roztoků. Polysorbit 80 (Tween 80, PS-80): 4% zásobní roztok byl připraven zředěním (hmotnostním) slabého roztoku PS-80 peroxidu (10% roztoky slabého peroxidu polysorbitanmonooleátu je možné získat například u Aldrich-Sigma Chemicals).

Rozpustnost peptidu

Bylo naváženo přibližně 500 až 700 pg Αβ peptidu a poté rozpuštěno v odpovídajícím množství pufraěního roztoku za získání, hypoteticky, výsledné koncentrace 0,6, 0,8 nebo 1,0 mg/ml Αβ42. Peptid byl navážen přímo do 4 ml skleněných lahviček (Wheaton) se šroubovacím víčkem. Po přidání přiměřeného množství pufraěního roztoku byl peptid mírně promícháván po dobu 15 až 30 minut. Byla vizuálně hodnocena rozpustnost roztoků podle následující stupnice: (+) = nízká rozpustnost, zakalená suspenze; (++) = čistá suspenze s několika nerozpustnými shluky; (+++) = čistý roztok.

Tabulka 1. Vizuální hodnocení rozpustnosti roztoků

Pufr	Výsledná koncentrace Αβ42 (mg/ml)	Vizuální rozpustnost
0,01 N NaOH	1,0,0,8	+++
o,oinnh4oh	1,0,0,8	+++
50 mM glycinát sodný, pH 9,0	1,0	+++
10 mM glycinát sodný, pH 9,0	1,0, 0,8, 0,6	+++
10 mM glycinát sodný, pH 9,5	0,6	+++
10 mM glycinát sodný, pH 10	1,0, 0,8	+++
10 mM glycinát sodný, pH 9,0, 0,02% PS-80	1,0	+++
10 mM glycinát sodný, pH 9,5,0,01% PS-80, 5% sacharóza	0,6	+++
10 mM glycinát sodný, pH 9,5, 4% mannitol, 1% sacharóza	0,6	+++
10 mM glycinát sodný, pH 9,5, 4% mannitol	0,6	+++
10 mM glycinát sodný, pH 10,0, 0,02% PS-80	1,0	+++
10 mM L-arginin-HCl, pH 9,0	0,6	+++
10 mM L-arginin-HCl, pH 10,0	0,8	+++
10 mM L-lysinát sodný, pH 9,0	0,8, 0,6	+++
10 mM L-lysinát sodný, pH 10,0	0,8	+++

9

10 mM lysinát sodný, pH 9,5,4% mannitol	0,6	+++
10 mM acetát amonný, pH 9,0	1,0	+++
10 mM acetát amonný, pH 9,0, 0,02% PS-80	1,0	+++
50 mM Tris-HCl, pH 10,0, EDTA (0,5 mM), 0,02% PS-80	1,0	++
10 mM borát sodný, pH 9,0	1,0	+++
10 mM N-acetyl-D-glutamin sodný, pH 9,0	0,8	+++
10 mM glycin-HCl, pH 3,0	1,0	++
0,01 N HC1	1,0	+++
0,01 M kyselina fosforečná	1,0	+++
DMSO (čistý)	0,6	+++
10 mM glycinát sodný, pH 8,0	1,0	++
10 mM L-arginin-HCl, pH 9,0	1,0, 0,8	++
10 mM hydrogenuhličitan sodnoamonný, pH 9,0	0,8	++
10 mM uhličitan sodnoamonný, pH 9,0	0,8	++
50 mM Tris-HCl, pH 10,0, EDTA (0,5 mM)	1,0	++
10 mM borát sodný, pH 10,0	1,0	++
10 mM L-arginin-HCl, pH 8,0	1,0	+
10 mM acetát amonný, pH 8,0	1,0	+
10 mM acetát amonný, pH 8,0, 0,02% PS-80	1,0	+
50 mM Tris-HCl, pH 8,0, pH 9,0 nebo pH 10,0	1,0	+
50 mM Tris-HCl, pH 8,0 nebo pH 9,0, s 0,5 mM EDTA	1,0	+
50 mM Tris-HCl, pH 8,0 nebo pH 9,0, s 0,5 mM EDTA a 0,02% PS-80	1,0	+
50 mM nebo 100 mM NaCl, pH 9,0	1,0	+
50 mM fosforečnan sodný, pH 8,0, pH 9,0 nebo pH 10,0	1,0	+
50 mM glycinát sodný, pH 8,0 nebo pH 10,0	1,0	+
10 mM N-acetyl-D-glukosamin sodný, pH 9,0 nebo pH 10,0	0,8	+
10 mM N-acetyl-D-glutamin sodný, pH 10,0	0,8	+
10 mM citrát sodný, pH 3,0 nebo pH 4,0	1,0	+
10 mM acetát sodný, pH 4,0	1,0	+

Roztoky hodnocené jako +++ byly při dosažení zamýšlené koncentrace vizuálně ěisté. Rozsah pH pufraěních roztoků byl od pH 9 do pH 10. pH anorganických roztoků jako je NaOH a NH4OH bylo alkalické, zatímco HC1 a kyseliny fosforečné bylo silně kyselé. Rozpustnosti peptidů bylo dosaženo v koncentraci od 0,6 do 1 mg/ml při hodnotách pH přibližně > pH 9. Přísady jako je polysorbit 80, sacharóza, mannitol a EDTA neovlivňují rozpustnost peptidů a účastní se zvýšení tonicity a zisku po filtraci nebo působí jako chelační činidla. Kyselé roztoky (s pH přibližně 4 nebo nižší) také rozpouští Αβ42 peptid při koncentracích 0,6 až 1,0 mg/ml. Roztoky hodnocené jako ++ se při cílové koncentraci jevily jako částečně rozpustné. Peptid může být rozpustný při nižší koncentraci, než při jaké je zde testován. Roztoky, které byly hodnoceny jako +, nedosáhly po vizuální stránce při cílové koncentraci úplné rozpustnosti.

Příklad 2: Rozpustnost Αβ peptidu v pufřačních roztocích

Αβ42 (0,6,1,0,1,5,2,0, 3,0 a 3,5 mg/ml) bylo rozpuštěno v 10 mM pufru glycinátu sodného, pH 9. Každý roztok byl centrifugován na stolní centrifuze (>10 000 rpm, asi 10 min.) v případě vzniku zákalu u koncentrací 2,0 až 3,5 mg/ml (roztoky o koncentraci 0,6 -1,5 mg/ml byly vizuálně čisté).

Aliquot supematantu z každého roztoku byl poté analizován na RP-HPLC. Tabulka 2 představuje tabulované píkové oblasti peptidu a grafické znázornění rozpustnosti Αβ42 v pufru glycinátu sodném při pH 9.

Tabulka 2. Hranice rozpustnosti TFA soli peptidu Αβ42

Αβ42 mg/ml (10 mM glycin, pH 9,0)	HPLC píková oblast
0,6	3613553
1	5921792
1,5	8850393
2	9213446

Nakonec byl peptid Αβ42 purifíkován ve formě trifluoroacetátových, amonných, chloridových a sodných solí. Tyto sole byly rozpuštěním v několika pufrech, při koncentraci peptidu Αβ42 0,45 mg/ml, upraveny vzhledem k obsahu opačně nabitých iontů různých solí. Roztoky peptidu byly přefiltrovány a zisk peptidu byl určen pomocí srovnání RP-HPLC píkových ploch peptidu před a po filtraci. Všechny sole byly rozpustné a snadno filtrovatelné při koncentraci 0,45 mg/ml, což ukazuje tabulka 3.

ftft « ♦ ft • ft ftft • ftft · • ft······ · ft • ftft ftftft • ft · ftft ftftft • ftft ftftft ftft ftftft ·

Tabulka 3. Rozpustnost jiných solí Αβ42 peptidu

0,45 mg/ml Αβ42	Zisk (%)
Amonná sůl v 1 mM NH4OH	70
Amonná sůl v 2 mM NH4OH	106
Amonná sůl v 10 mM glycinátu sodném, pH 9,0	115
Amonná sůl v 10 mM glycinátu sodném, 5% sacharóza, pH 9,0	96
Amonná sůl v 10 mM glycinátu sodném, pH 9,5	101
Amonná sůl v 10 mM glycinátu sodném, pH 10,0	106
Trifluoracetátová sůl v 10 mM glycinátu sodném, pH 9,0	101
Chloridová sůl v 10 mM glycinátu sodném, pH 9,0	101
Sodná sůl v 10 mM glycinátu sodném, pH 9,0	100

Příklad 3: Získání rozpuštěného peptidu po užití představených hydrofilních filtrů

Testované stříkačkové filtry (poloměr filtru 25 mm, filtrační oblast 3,9 cm ): Millex GV, 0,22 pm: hydrofilní polyvinylidindifluoridová membrána (PVDF, Durapore) s nízkými proteinvazebnými vlastnostmi, Millex GN, 0,20 pm: hydrofilní nylonová membrána s nízkými proteinvazebnými vlastnostmi a Millex GP, 0,22 pm: hydrofilní povrchově modifikované polyethensulfonová membrána (PES) s nízkými protein-vazebnými vlastnostmi.

Výše popsané filtry byly použity jako zástupci komerčně dostupných typů hydrofilních mikrofiltrů. Filtrační studie, které byly uskutečněny, používaly následující solubilizační systém:

1. 0,6 mg/ml Αβ42 v 0,01 N NH₄OH

2. 0,6 mg/ml Αβ42 v 10 mM glycinátu sodném, pH 9,0

3. 0,6 mg/ml Αβ42 v 10 mM lysinátu sodném, pH 9,0

4. 0,6 mg/ml Αβ42 v 10 mM Arginin-HCl, pH 9,0

Přibližně 2 ml objem z každého Αβ42 roztoku byl přefiltrován přes každý filtr. Zisk z jednotlivých filtrů byl poté určen srovnáním píkových ploch peptidu před a po mikrofiltraci a výsledek ukazují tabulky 3 a 4.

4· 44 • 4 4 4

4 4 4 4 4 4

44444·· 4 4

4 4 4 4 4

4 44 4444

44

4 4

Tabulka 3. Filtrační zisky

Prostředek 0,6 mg/ml Αβ peptidu v:	Typ filtru (% zisk)
Millex GV	Millex GN	Millex GP
10 mM glycinátu sodném	99,1	97,2	98,0
10 mM arginin-HCl	91,9	86,6	92,5
10 mM lysinátu sodném	95,0	94,7	97,4
0,01 NNH4OH	102,2	104,8	105,1

Příklad 4: Filtrace Αβ42 v pufřech glycinátu sodném a lysinátu sodném s a bez přídatných inertních látek

V těchto studiích byl 0,6 mg/ml Αβ42 rozpuštěn v 10 mM glycinátu sodném obsahujícím buď 0,1% polysorbit 80 (PS-80), 0,9% chlorid sodný nebo kombinaci 0,1% PS-80, 0,9% NaCl, 5% sacharózy, 1% sacharózy a/nebo 4% mannitolu.

Přibližně 2 až 5 ml každého prostředku bylo přefiltrováno přes filtr Millex GV. Aliquot filtrátu byl zcentrifugován na stolní mikrocentrifuze při > 10 000 rpm po dobu 3 minut. Výtěžky z filtrace byly určeny srovnáním RP-HPLC píkových ploch peptidu před a po filtraci.

Tabulka 4. Filtrační zisk při různých složení pufřu

Složení ID 0,6 mg/ml Αβ42 v:	Zisk (%)
10 mM glycinát sodný, pH 9,0	104,5
10 mM glycinát sodný, pH 9,0, 0,1% PS-80	106,2
10 mM glycinát sodný, pH 9, 05% sacharóza	115,4
10 mM glycinát sodný, pH 9,5,4% mannitol	103,0
10 mM glycinát sodný, pH 9,5,4% mannitol, 1% sacharóza	98,0
10 mM glycinát sodný, pH 9,0, 0,9% NaCl	76,7
10 mM glycinát sodný, pH 9,0,0,1% PS-80, 0,9% NaCl	65,0
10 mM L-lysin/citrát, pH 9,5	93,2
10 mM L-lysin/citrát, pH 9,5,4% mannitol	80,0

Filtr Millex GV vybrán jako vhodný filtr pro prostředek Αβ, protože vykazuje uspokojivý zisk peptidu a přijatelnost pro užití v komerčních postupech. Prostředek peptidu obsahující 0,9%

NaCl byla vizuálně méně rozpustná, což vedlo k nižším ziskům z filtrace na RP-HPLC. Ke ·· *· ♦ ·

9 9 9 9 9

9 9 9

9 9 9 9

9 9 9

9999 99 9999 zvýšení rozpustnosti peptidu v přítomnosti anorganických solí jako je chlorid sodný, může být vhodné přidat po mikrofiltraci peptidu do pufru sterilní roztok činidla modifikujícího tonicitu.

Z jiného pohledu, činidla modifikující tonicitu jako jsou sacharidy (cukry) projevují odlišný typ aktivity roztoku a mohou zvýšit stabilitu suspenze. Tyto vlastnosti, známé jako uspořádání ve vodném prostředí, mají tendenci „hydratovat“ peptidový řetězec v roztoku tak, že získá termodynamicky stabilnější konformaci β-skládaného listu.

Αβ peptid může být filtrován při pH v rozsahu od asi 8,5 do 12, přednostně od pH 9 až pH 10, s dobrými výsledky. Filtrace může být uskutečněna za použití 0,2 pm Millex GV membrány (Millipore Durapore), která je vhodná pro výrobní postupy.

Pro stabilní, biologicky aktivní podobu Αβ peptidu, která je fyziologicky akceptovatelná a vhodná pro klinické použití, bude výchozí krok výrobních postupů přednostně zahrnovat sterilní filtraci peptidu při pH 8,5 až 10.

Příklad 5: Rozpustné kapalné prostředky

Metody kvantitativního rozboru

Tři skupiny Αβ42 peptidu byly vyrobeny u American Peptide Co. (APC). Standardní přípravky, výsledky chemického a biologického určení APC peptidu, byly popsány s Αβ42 vyrobeného Califomia Peptide Research.

Popisy přípravků jsou formulovány v částech 1, 2 a 3 níže v textu.

Analýzy stability

Popisy k jednotlivým přípravkům jsou poskytnuty v samostatných sekcích níže. Jednotlivé lahvičky se opakovaně analyzují během několikaměsíčního uskladnění při 2 až 8 °C. V průběhu studie stability se rutinně monitorují hodnoty pH, koncentrace a čistoty peptidu. Systém reverzní fáze HPLC (RP-HPLC) byl použit ke kvantifikaci koncentrace a plocha odpovídající čistému Αβ peptidu v procentech. RP-HPLC využívá polymemí kolonu reverzní fáze, s promýváním peptidu v amonniumbikarbonát (nebo tris)/acetonitrilovém gradientu a detekci při 220 nm. Koncentrace peptidu se měří proti referenci standardu; čistota se počítá jako plocha odpovídající čistému Αβ peptidu v procentech určená ve výsledně porovnaném chromatogramu.

Charakterizace

Charakterizace struktury Αβ42 v roztoku byla získána pomocí studií cirkulámího dichroismu jak ukazuje obr. 1.

• 0 0 • «0

0 · 0 ···»·« «0· »0 00 0 0 0 0 • 0 ·

0 0 0 0«

0000

Biologická aktivita

Myším z chovu Swiss Webster (4 až 8 myší ve skupině) byl injikován Αβ42 o různých složení a doplněn adjuvans CFA/IFA, MPL (Corixa Immunochemicals) nebo QS 21 (Aquila Pharmaceuticals) v poměru koncentrací antigen/adjuvans popsaných ve zvláštní studii. Injekce byly aplikovány rutinně po dvou týdnech v 0., 2. a 4. týdnu, pokud nebylo zaznamenáno jinak. Myši byly odebrány po 2 a 4 týdnech od injekce. Séra byla analyzována standardní sendvičovou ELISA metodou, kdy Αβ42 sloužil jako antigen a kozí proti-myší IgG konjugované s HRP jako značící protilátky. Titr protilátek byl zaznamenáván v jednotlivých diagramech nebo jako geometrické průměry hodnot každého zvířete v každé skupině a souhrnně byl srovnán s titry získanými použitím agregovaného Αβ42ΛΖΤΑ/ΙΡΑ jako kontrolního imunogenu. Výsledné titrace viz tabulky 8 a 10.

1. Přípravky

Αβ peptid byl rozpuštěn v koncentraci 0,6 mg/ml v 10 mM glycinátu sodném, pH pufřu 9,0 až 9,5, a přefiltrován přes filtr Millex GV, 0,2 pm. Suspenze o objemu 0,5 ml byla přenesena do 2 ml skleněných lahviček (Gensia P/N X34-113-002), zavíčkována šedými gumovými zátkami (Gensia P/N X66-113-030) a neprodyšně utěsněna. Lahvičky byly skladovány při 2 až 8 °C.

2. Testování stability

Koncentrace a čistota Αβ42 v suspenzi byly monitorovány pomocí RP-HPLC. Rozpuštěné vzorky byly analyzovány buď přímo nebo po mikrocentrifugaci.

Následující tabulka (tab. 5) ukazuje analytická data pro rozpustné kapalné přípravky. Nebyly pozorovány žádné rozdíly mezi vzorky centrifugovanými nebo necentrifiigovanými před analýzou, což svědčí o stálé rozpustnosti peptidu při zamýšlené koncentraci. Plocha odpovídající čistému proteinu v procentech je srovnatelná s referenčním standardem: nebyla zaznamenána žádná významná degradace peptidu. Rozpustný přípravek zůstal stabilní po dobu 3 měsíců, pokud byl skladován při 2 až 8 °C.

Tabulka 5. Výsledky po 3 měsíčním skladování

0,6 mg/ml Αβ42 v:	Vzhled	PH	Plocha čistého proteinu v %	Koncentrace Αβ (mg/ml)
Referenčním standardu	n/a	n/a	68%	n/a
10 mM glycinátu sodném, pH 9,0	čistý roztok	8,6	69%	0,65

9

9 9

9 9 «

9···· 9

9 9

99

9 · ·

9 9

9 9 9 • 9 9 •9 9999

9* 99

9 9 • 9 9

4« • 9 · »9 949·

3. Charakterizace

Charakterizace přípravku Αβ pomocí cirkulámího dichroismu ukazuje, že peptid nabývá v roztoku náhodně svinuté konformace s typickou absorbancí negativní elipticity v rozmezí 189 až 205 nm.

Biologická aktivita

Pokud je myší (Swiss Webster) injikován přípravek Αβ42 s pH 9 s adjuvans, dojde k nárůstu titru protilátek. Injekce 33 pg Αβ42 spolu s adjuvans jako 50 pg MPL nebo 25 pg QS 21 po dvoutýdenních intervalech (0, 2, 4 týd.) vyvolá adekvátní odpověď (ve smyslu zvýšení titru Ab) ve srovnání s kontrolami.

Příklad 6: Prostředky ve formě kapalných suspenzí

Prostředek glycin/acetát

Αβ peptid byl rozpuštěn v koncentraci 0,6 mg/ml v 10 mM glycinátu sodném, v pufru o pH 9,0 až 9,5 samotném nebo v kombinaci s různými inertními vehikuly (excipints). Roztoky peptidu byl přefiltrovány přes filtr Millex GV a poté titrovány 0,1 M kyselinou octovou na pH 6 za vzniku suspenzí peptidu v pufru. Suspenze o objemu 0,5 ml byly přeneseny do 2 ml skleněných lahviček (Gensia P/N X34-113-002), zavíčkovány šedými gumovými zátkami (Gensia P/N X66-113-030) a neprodyšně utěsněny. Suspenze byly skladovány při 2 až 8 °C.

Prostředek glycin/citrát

Prostředky o koncentraci 0,6 mg/ml Αβ42 byly připraveny do 10 mM glycinátu sodného obsahujícího 0,1% PS-80 samotný nebo v kombinaci s 5% sacharózou (25 ml). Roztoky peptidu byl přefiltrovány přes filtr Millex GV a poté titrovány 0,1 M kyselinou citrónovou přibližně na pH 6,0. Případně, je po titraci na pH 6 přidán ke glycinu/citrátu/PS-80 0,9% chlorid sodný. Suspenze o objemu 0,5 ml byly poté přeneseny do 2 ml skleněných lahviček (Gensia P/N X34113-002), zavíčkovány šedými gumovými zátkami (Gensia P/N X66-113-030) a neprodyšně utěsněny. Suspenze byly skladovány při 2 až 8 °C.

Glycin/citrátové prostředky byly dále vylepšovány tak, aby měli pufraění kapacitu při pH 6. Bylo připraveno několik 100 ml prostředků 0,6 mg/ml Αβ peptidu do 10 mM glycinátu sodného, pH 9, obsahujícího 5% sacharózu s nebo bez 0,1% PS-80. Navíc byla ještě připraveny prostředky 0,1 mg/ml Αβ42 v 10 mM glycinátu sodném obsahujícím 5% sacharózu s nebo bez 0,1% PS-80.

• · • · • · · ·

Peptidové roztoky byly před úpravou pH přefiltrovány přes filtr Millex GV. pH bylo poté upraveno na pH 6,0 pomocí 10 mM a 20 mM pufru citrátu sodného za užití zásobního roztoku 1 M citrátu sodného s pH 5,5. Suspenze o objemu 0,5 ml byly poté přeneseny do 2 ml skleněných lahviček (Gensia P/N X34-113-002), zavíčkovány šedými gumovými zátkami (Gensia P/N X66113-030) a utěsněny alobalem.

Testování stability

Koncentrace a čistota Αβ42 v prostředku byla sledována pomocí RP-HPLC. Absolutní peptidová koncentrace suspenze Αβ42 byla měřena rozpuštěním peptidu zředěním (obj.:obj.) 2% sodiumdodecylsulfátem (SDS) v 0,01 N NaOH a zahříváním při 100 °C po dobu 1 minuty před analýzou. Případně byla koncentrace rozpustného Αβ42 v suspenzi určena centrifugací testovaného vzorku na mikrocentrifuze při >_10 000 rpm po dobu 3 až 5 minut. Aliquoty rozpuštěného peptidu nebo supematantu byly potom analyzovány pomocí RP-HPLC. Je dobré si uvědomit, že v průběhu těchto studií byly učiněny pokroky v chromatografii v metodě RP-HPLC, což vedlo k lepšímu rozlišení a kvantitativnímu určení. Proto jsou procentuální hodnoty oblasti čistoty relativní k referenčnímu standardu v době prováděných analýz a chromatogramy jsou srovnávány v každém časovém okamžiku k určení míry degradace. V průběhu studií stability byly také sledovány pH a vzhled.

Tabulka 6 ukazuje data z několika kapalných suspenzí Αβ42. Všechny prostředky jsou vizuálně suspenze. Tyto prostředky jsou titrovány na pH 6 příslušnými kyselinami popsanými v tabulce. V závislosti na použitém inertním vehikulu může peptidová suspenze vzniknou bezprostředně nebo až v horizontu 2 týdnů i více. Vzniku suspenze je možné rychleji dosáhnout přidáním chloridu sodného nebo záměnou citrátu za acetát v peptidovém prostředku.

Všechna prostředky dosahují výsledné koncentrace 0,6 mg/ml peptidu. Procentuální oblast čistoty byla u všech prostředků srovnatelná s čistotou referenčního standardu. Během 3 měsíčního skladování při 2 až 8 °C nebyla zaznamenána žádná ztráta nebo degradace peptidu. Vzhled a pH zůstaly srovnatelné s daty uvedenými v tabulce 1.

0,9% NaCl i 5% sacharóza vytváří fyziologickou tonicitu pro parenterální podání. Stejně tak je suspenze s pH 6 v akceptovatelném rozmezí pH pro účely injekčního podání.

Tabulka 6. Prostředky ve formě kapalných suspenzí

Složení ID	Vzhled	pH	Čistota v	mg/ml Αβ42
0,6 mg/ml Αβ v:			/0	Celkový peptid	Supematant

fc · • · · ·

					T=0	T=2wks
10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0	suspenze	5,9	70%	0,54	0,23	0,04
10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 5% sacharóza	suspenze	5,9	68%	0,65	0,21	0,04
10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 0,1% PS-80, 5% sacharóza	suspenze	6,0	67%	0,62	0,43	0,08
10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 0,1% PS-80,0,9% NaCl	suspenze	5,9	68%	0,55	0,04	0,04
10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 0,9% NaCl	suspenze	6,0	70%	0,53	0,26	0,05
10 mM glycinát sodný/citrát, pH 6,0, 0,1% PS-80, 5% sacharóza	suspenze	nd	77%	0,63	<0,01	nd
10 mM glycinát sodný/citrát, pH 6,0, 0,1% PS-80, 0,9% NaCl	suspenze	nd	71 %	0,63	0,02	nd

nd: nebylo provedeno (not doně)

Prostředky, které ukazuje tabulka 7, byly připraveny pomocí 10 mM nebo 20 mM pufřační kapacity poskytnuté citrátovým pufrem, s cílem zajistit během výrobního postupu dosažení pH 6. Tyto prostředky vytvořily okamžitě suspenzi. Na základě vlastností Αβ peptidu, vedla změna konformace peptidu ke vzniku suspenze uvnitř sterilní zkumavky. Použití známé koncentrace pufřu, opačné k titrační, počítá se snadným zacházením a reproducibilitou během práce ve sterilní plnící soupravě.

Tabulka 7. Pufřované suspenze

0,6 mg/ml Αβ42 v:	Vzhled	PH	Čistota v %	Αβ peptid celková konc. mg/ml
10 mM citrát sodný, 10 mM glycin, pH 6,0, 0,1% PS-80, 5% sacharóza	suspenze	6,0	81 %	0,66
20 mM citrát sodný, 10 mM glycin, pH 6,0,0,1% PS-80, 5% sacharóza	suspenze	5,9	83%	0,69
20 mM citrát sodný, 10 mM glycin, pH 6,0, 5% sacharóza	suspenze	6,0	81 %	0,67
0,1 mg/ml Αβ42 v:
20 mM citrát sodný, 10 mM glycin, pH 6,0, 0,1% PS-80, 5% sacharóza	suspenze	5,9	82%	0,2
20 mM citrát sodný, 10 mM glycin,	suspenze	6,0	81 %	0,09

pH 6,0, 5% sacharóza

Tyto prostředky byly dále zmnoženy. Trifluoracetátové nebo chloridové sole Αβ peptidů byly rozpuštěny v 10 mM glycinátu sodném o pH 9 až 9,5. Jejich koncentrace byly upraveny podle obsahu sole s cílem dosáhnout koncentrace Αβ42 0,45 mg/ml. Před filtrací může být do peptidového roztoku přidán polysorbit 80, 0,02% až 0,5%. Stejně tak může být do prostředku před nebo po přidání kyseliny přidána sacharóza nebo chlorid sodný. pH peptidového roztoku bylo upraveno kyselinou citrónovou nebo chlorovodíkovou, jak je zmíněno výše. Všechny prostředky vytvořily suspenzi za vzniku požadované koncentrace peptidů Αβ42.

Tabulka 7b

Složení suspenzí _0,45 mg/ml Αβ42 v:_ mM glycinát sodný, 20 mM citrát, 0,1% PS-80, pH 6.0 mM glycinát sodný, 20 mM citrát, 0,5% PS-80, pH 6.0 mM glycinát sodný, 20 mM citrát, 154 mM NaCl, pH 6.0 mM glycinát sodný, 20 mM citrát, 154 mM NaCl 0,1% PS-80, pH 6.0 mM glycinát sodný, 154 mM NaCl, pH 6.0 (HC1) mM glycinát sodný, 154 mM NaCl, 0,1% PS-80, pH 6.0 (HC1) Charakterizace

Charakterizace suspenze Αβ42, pH 6 pomocí cirkulámího dichroismu a FT-IR ukázala, že peptid se vznikem suspenze zaujímá strukturu β-skládaného listu. Struktury β-skládaného listu jsou srovnatelné při koncentraci suspenze 0,6 mg/ml, bez ohledu na pufrující kyselinu (citrát, acetát, fosfát) a další inertní vehikula (sacharóza, NaCl) přidaná do prostředků. Zdá se přidání PS-80 vede ke vzniku homogenněji dispergované suspenze.

Biologická aktivita

Pokud je suspenze Αβ peptidů spolu s adjuvans injikována myším (Swiss Webster), dojde k nárůstu titru protilátek. Injekce ve dvoutýdenních intervalech (0., 2., 4. týdnu), jak ukazuje tabulka 8, vyvolají ve srovnání s kontrolami adekvátní protilátkovou odpověd.

Tabulka 8. Protilátková odpověď na suspenze prostředků

Peptidový prostředek 0,6 mg/ml Αβ v:	pg peptidů	pg adjuvans	Titr protilátek Geom. průměry z 2. odběru**
10 mM glycinát sodný/acetát,	33 pg	50 pg MPL*	-7 000

♦ · · fc · fcfc · · fcfc fcfc fc · · · · fcfc « ••••••fc · fc fcfc · · • fcfc fcfcfc· fcfc ····

pH 6,0, 5% sacharóza
10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 5% sacharóza	33 pg	25 pg QS-21	~ 10 000
10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 0,1% PS-80, 5% sacharóza	33 pg	50 pg MPL*	-10 000
10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0,0,1% PS-80, 5% sacharóza	33 pg	25 pg QS-21	-7 000
10 mM glycinát sodný/citrát, pH 6,0,0,1% PS-80, 5% sacharóza	33 pg	50 pg MPL*	- 10 000
10 mM glycinát sodný/citrát, pH6,0,0,1% PS-80, 5% sacharóza	33 pg	25 pg QS-21	-8 000
10 mM glycinát sodný/citrát, pH6,0,0,9% NaCl	33 pg	50 pg MPL*	- 12 000
10 mM glycinát sodný/citrát, pH 6,0, 0,9% NaCl	33 pg	25 pg QS-21	- 14 000
Kontrola: Calif. Peptide, část MF0639	33 pg	CFA/IFA	-1 200

* MPL obsahující triethanolamin ** Titry počítané jako jednotky při 50% maximální OD

Příklad 7: Lyofílizované přípravky

Přípravky

Byly připraveny čtyři kombinace 0,6 mg/ml Αβ42 v glycinátovém nebo lysinovém pufru, s mannitolem nebo mannitolem a sacharózou a poté sterilně filtrovány přes filtr Millex GV. Jeden přípravek (0,6 mg/ml Αβ42 v 10 mM glycinátu sodném o pH 9,5,4% mannitol) byl bez titrace na fyziologické pH přenesen do lahvičky a uzavřen. Zbývající tři roztoky (lysin/citrát/4% mannitol; glycinát/citrát/4% mannitol; glycinát/HCl/4% mannitol/1% sacharóza) byly titrovány kyselinou citrónovou nebo chlorovodíkovou na pH 7,5. Prostředky byly poté přeneseny v objemu 0,5 ml do 2 ml skleněných lahviček (Gensia P/N X34-113-002), netěsně zavíčkovány šedými gumovými lyofilizačními zátkami (Gensia P/N X66-113-030).

Lyofilizace

Přípravky byly lyofilizovány v programovatelném lyofilizéru Virtis (výrobce Gensia Sicor). Jako hlavní složka matrix byl zvolen mannitol. Aby došlo ke krystalizaci mannitolu, byly přípravky zmraženy během určité termální periody (chlazení) a následně došlo k primárnímu a sekundárnímu vysoušení zmražených shluků.

• ·· ·· · · • ·· · · ·· ·

Analýzy stability

Koncentrace a čistota lyofilizovaných přípravků byla sledována pomocí RP-HPLC. Každý přípravek byl rozpuštěn v 1,0 ml injekční vody (WFI). Byl analyzován bezprostředně po rozpuštění (po nebo bez centrifugace na stolní mikrocentrifuze při >10 000 rpm po dobu 3 až 5 minut) nebo bylo nově rozpuštěn, jak bylo popsáno dříve.

Následující tabulka (tab. 9) ukazuje koncentrace čtyř přípravků Αβ42 po proběhlé lyofilizací a následném rozpuštění. Jak je možné z dat vyčíst, tyto přípravky byly rozpustné. Vzorky byly analyzovány jednak jako přípravky rozpuštěné z lyofilizované formy a jako přípravky rozpuštěné z lyofilizované formy „resolubilizované“ tak, jako se popisuje pro peptidové suspenze. Nebyly pozorovány žádné významné rozdíly mezi přípravky rozpuštěnými z lyofilizátu a úplnou koncentrací peptidu (vzorky rozpuštěného peptidu). Jak ukázala metoda RP-HPLC, stejná jako u testování stability v př. 5, žádná významná degradace nebo ztráta peptidu nebyla pozorována v průběhu 3 měsíčního skladování v teplotním rozmezí 2 až 8 °C.

Tabulka 9. Lyofilizované prostředky

Přípravek 0,6 mg/ml Αβ42 v:	Vzhled	pH	Čistota v %	mg/ml Αβ42
Peptid v rozpuštěném lyofilizátu	Rozpuštěný peptid
10 mM glycinát sodný, pH 9,5,4% mannitol	čistý roztok	8,2	82%	0,59	0,61
10 mM citrát/glycinát sodný, pH 7,5, 4% mannitol	čistý roztok	7,4	82%	0,57	0,60
10 mM citrát/lysinát sodný, pH 7,5, 4% mannitol	čistý roztok	7,6	81 %	0,57	0,55
10 mM glycinát sodný/HCl, pH 7,5, 4% mannitol, 1% sacharóza	čistý roztok	7,4	81 %	0,56	0,59

Charakterizace

Charakterizace lyofilizovaného prostředku Αβ42, pH 7,5 pomocí cirkulámího dichroismu a FT-IR ukazuje, že peptid během lyofilizace a zpětného rozpuštění zůstává v náhodně svinuté konformaci. Toto zjištění zůstává stejné u prostředku Αβ42^^οΐηέί sodný, pH 9, který je také rozpustný, je možné jej filtrovat a v roztoku zaujímá náhodně svinutou konformaci.

Biologická aktivita

Lyofilizovaný prostředek Αβ42, 0,6 mg/ml Αβ42 v 10 mM glycinátu sodném/HCl/4% mannitol/1% sacharóza, pH 7,5, byl zvolen jako reprezentativní lyofilizovaný prostředek. Pokud byl smíchán s adjuvans MPL nebo QS-21, došlo u myší (Swiss Webster) ke zvýšení titru protilátek. Geometrický průměr titrů ve srovnání s kontrolami ukazuje tabulka 10.

Tabulka 10. Protilátková odpověď na lyofilizované preparáty

Peptidový přípravek 0,6 mg/ml Αβ42 v:	pg peptidu	pg adjuvans	Titr protilátek Geom. průměry z 2. odběru**
10 mM glycinát sodný/HCl, pH 7,5,4% mannitol, 1% sacharóza	33 pg	50 pg MPL*	~ 14 000
10 mM glycinát sodný/HCl, pH 7,5,4% mannitol, 1% sacharóza	33 pg	25 pg QS-21	~ 3 000
Kontrola: Calif. Peptid, část MF0639	33 pg	CFA/IFA	-1 200

* MPL obsahující triethanolamin ** Titry počítané jako jednotky při 50 % maximální OD

Příklad 8: Rozšíření používaní standardů vyráběných GMP

Peptidová suspenze byla dodána v 1,5-litrových bálem, vyrobených a plněných podle smlouvy s výrobcem léčiv GMP. Balení byla ve dvou koncentracích: 0,6 mg/ml a 0,1 mg/ml. Obě koncentrace byly úspěšně namnoženy, rozplněny a zůstaly stabilní při 2 až 8 °C a 25 °C po dobu 2 měsíců.

Αβ peptid byl rozpuštěn při výsledné koncentraci 0,6 mg/ml nebo 0,1 mg/ml v 10 mM pufru glycinátu sodném, pH 9, obsahujícím 5% sacharózu. Peptidový roztok byl sterilně filtrován přes sterilizační filtr Millipak 20 Millipore Durapore, 0,2 pm, do aseptické zkumavky. RP-HPLC analýza prokázala, že nedošlo k žádným významným ztrátám peptidu během filtrace. Poté byl vyroben 1 M pufr citrát sodný, pH 5,5, a rovněž přefiltrován přes 0,2 pm filtr Durapore do aseptické zkumavky. Peptidový roztok byl navážen a bylo k němu přidáno přiměřené množství pufru za vzniku 20 mM citrátu, pH výsledného přípravku 6.

Při koncentraci 0,6 mg/ml vytváří peptid bezprostředně před přidáním citrátového pufru suspenzi; pH měřené během postupu bylo 6,4. Peptidová suspenze, naplněná po 1,2 ml do 2 ml skleněných lahviček utěsněných zátkou (West 4416), byla stále promíchávána. Koncentrace 0,1 mg/ml zůstala rozpustná (a byla rozplněna jako rozpustná) několik hodin před vznikem suspenze v lahvičkách během dalšího dne.

Tabulka 11 ukazuje data vytvořená pro 0,6 mg/ml suspenzi Αβ42:

Tabulka 11

Suspenze Αβ peptidu 0,6 mg/ml v 10 mM glycinu, 20 mM citrátu, 5% sacharóze, pH 6

Test	Specifikace	Výsledek
Vzhled	Neurčitá bezbarvá suspenze, bez významné kontaminace	Akceptována
PH	5,5 až 6,5	6,3
Koncentrace	0,5 až 0,7 mg/ml	0,64 mg/ml
Plocha čistoty v % (HPLC)	FIO	84,4 %
Objem (ml)	FIO	1,13 ml
Míra sterility	FIO	Kultivace negativ.
Výsledná sterilita kontejneru	Kultivace negativní	Akceptována
Bakteriální endotoxiny	FIO	<2 EU/ml

Příklad 9: Pufro vaně suspenze Αβ1-42 s přidáným adjuvans QS-21

Za použití QS-21, triterpenglykosidu se stimulačními účinky na imunitní systém, byly vytvořeny ampule jednotlivých přípravků obsahujících Αβ1-42 a adjuvans, a bylo s překvapením zjištěno, že tvoří vizuálně čistou suspenzi peptidu.

1. Jednotlivé vzorky prostředků Αβ 1-42/QS-21

Rozpuštění lyofilizovaného QS-21 pomocí roztoku Αβ1-42 v 10 mM glycinátu sodném při pH 9,0. V každém z následujících příkladů byl lyofilizovaný QS-21 rozpuštěn pomocí roztoku Αβ1-42 (TFA soli, 0,45 mg/ml) v 10 mM glycinu (Gly), pH 9,0. pH přípravku obsahujícího rozpuštěný QS-21 bylo poté rychle upraveno na pH 6,0 přidáním citrátového pufru (Cit) za vzniku vizuálně čisté suspenze. Hodnocení zákalu bylo provedeno pomocí spektrofotometru při vlnové délce 405 nm s cílem určit čistotu vzniklých suspenzí. Výsledky ukázaly, že velikost částic suspendovaného peptidu je menší, než vlnová délka odraženého světla. Na základě provedených testů byla prokázána stabilitu těchto přípravků při 3 měsíčním uskladnění při 2 až 8 °C; všechny přípravky obsahovaly převážnou část Αβ1-42 v konformaci β-skládaného listu; žádný přípravek nevykazoval při analýze na spektrofotometru při 405 nm zákal. Přípravek 0,45 mg/ml Αβ1-42, 0,2 mg/ml QS-21,10 mM Gly, 20 mM Cit, 5% sacharóza, pH 6,0 byl kvantitativně testován na titr u myší s výsledkem vysokého titru protilátkové odpovědi.

··· · · · · « • · · · · · · · · · • ······ a « · « * >

• · · ··♦ ··· ·· · *· ♦ ·♦· ·· «···

Tabulka 12A

Přípravek	Vzhled
0,45 mg/ml Αβ1-42, 0,2 mg/ml QS-21,10 mM Gly, 20 mM Cit, 5% sacharóza, pH 6,0*	čistý
0,45 mg/ml Αβ1-42, 0,1 mg/ml QS-21,10 mM Gly, 20 mM Cit, 5% sacharóza, pH 6,0	čistý
0,225 mg/ml Αβ1-42, 0,3 mg/ml QS-21, 10 mM Gly, 20 mM Cit, 5% sacharóza, pH 6,0	čistý
0,225 mg/ml Αβ1-42, 0,15 mg/ml QS-21,10 mM Gly, 20 mM Cit, 5% sacharóza, pH 6,0	čistý

'Pro tento přípravek byl zjištěn vysoký titr protilátek u myší

2. Titrace Αβ42 za použití QS-21

Αβ42 (2 mg/ml) byl rozpuštěn v 10 mM glycinu, pH 9,5. pH bylo upraveno na 9,5 pomocí 1 N NaOH. Roztok Αβ42 byl poté přefiltrován přes filtr Millex GV. QS-21 (5 mg/ml) byl rozpuštěn v 10 mM citrátu, pH 6,0 a poté přefiltrován přes filtr Millex GV. Určité množství Αβ42 bylo smícháno s určitým množství QS-21 v požadovaném poměru a rozpuštěno v 10 mM glycinu, pH 9,5 a 1 M citrátu, pH 5,2, za vzniku výsledných koncentrací ukázaných v tabulce 12.

Tabulka 12B. Počáteční přípravky AN1792/QS-21

Přípravek V 10 mM glycinu, 20 mM citrátu, pH 6,0	Vzhled	OD405 nm
1.0 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21	čisté	0,018
1.0 mg/ml Αβ42, 0,5 mg/ml QS-21	zákal (+)	0,013
1.0 mg/ml Αβ42, 0,25 mg/ml QS-21	zákal (++)	0,030
1.0 mg/ml Αβ42, 0,125 mg/ml QS-21	zákal (+++)	0,175
1.0 mg/ml Αβ42, 0,063 mg/ml QS-21	zákal (+++)	0,308
1.0 mg/ml Αβ42, 0,031 mg/ml QS-21	zákal (+++)	0,315
1.0 mg/ml Αβ42, 0,016 mg/ml QS-21	zákal (+++)	0,268
1.0 mg/ml Αβ42, 0,0 mg/ml QS-21	zákal (+++)	0,213
0.5 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21	čisté	0,005
0.5 mg/ml Αβ42, 0,5 mg/ml QS-21	čisté	0,006
0.5 mg/ml Αβ42, 0,25 mg/ml QS-21	čisté	0,005
0.5 mg/ml Αβ42, 0,125 mg/ml QS-21	zákal (+)	0,021
0.5 mg/ml Αβ42, 0,063 mg/ml QS-21	zákal (++)	0,148
0.5 mg/ml Αβ42, 0,031 mg/ml QS-21	zákal (+++)	0,172
0.5 mg/ml Αβ42, 0,016 mg/ml QS-21	zákal (+++)	0,162
0.5 mg/ml Αβ42, 0,0 mg/ml QS-21	N/A	N/A
0.3 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21	čisté	0,004

• · · · · * · • ·····*· · * • · · · · · ·* · · · · · · ·

0.3 mg/ml Αβ42,0,5 mg/ml QS-21	čisté	0,004
0.3 mg/ml Αβ42,0,25 mg/ml QS-21	čisté	0,006
0.3 mg/ml Αβ42, 0,125 mg/ml QS-21	čisté	0,005
0.3 mg/ml Αβ42, 0,063 mg/ml QS-21	zákal (+)	0,013
0.3 mg/ml Αβ42, 0,031 mg/ml QS-21	zákal (+)	0,077
0.3 mg/ml Αβ42,0,016 mg/ml QS-21	zákal (+)	0,068
0.3 mg/ml Αβ42, 0,0 mg/ml QS-21	zákal (++)	0,046
0.1 mg/ml Αβ42,1,0 mg/ml QS-21	čisté	0,004
0.1 mg/ml Αβ42,0,5 mg/ml QS-21	čisté	0,002
0.1 mg/ml Αβ42,0,25 mg/ml QS-21	čisté	0,002
0.1 mg/ml Αβ42, 0,125 mg/ml QS-21	čisté	0,001
0.1 mg/ml Αβ42, 0,063 mg/ml QS-21	čisté	0,002
0.1 mg/ml Αβ42, 0,031 mg/ml QS-21	čisté	0,003
0.1 mg/ml Αβ42, 0,016 mg/ml QS-21	čisté	0,004
0.1 mg/ml Αβ42, 0,0 mg/ml QS-21	čisté	0,008

• · ♦ • · · • 9 9 9 • 9 99 99

3. Další přípravky Αβ42 a QS-21

Chloridová sůl Αβ42 byla rozpuštěna na 1 mg/ml v 10 mM glycinátu sodném, pH 9,0 až 9,5, s nebo bez 5% sacharózy, 0,1% nebo 0,4% PS-80. Peptidové roztoky byly sterilně filtrovány přes stříkačkový filtr Millex GV. Lyofilizované QS-21 bylo rozpuštěno na 5 mg/ml v 10 mM citrátu, pH 6,0 a sterilně filtrováno přes stříkačkový filtr Millex GV.

Přiměřené množství roztoku Αβ42 a roztoku QS-21 bylo smícháno za vzniku výsledných koncentrací Αβ42 a QS-21 popsaných níže v přípravcích v tabulce XX. Nakonec bylo pH sníženo za použití 1 M citrátového pufru, pH 5,4, za výsledného vzniku pH 6,0 ve 20 mM citrátovém pufru. Vzhled přípravků se pohyboval v rozmezí od čistého až po zakalený (+ až +++). Odlišnost koncentrací a poměru Αβ42 a QS-21 mohlo ovlivnit vizuální podobu prostředku. Navíc, dalšími akceptovatelnými přísadami prostředku jsou cukry a surfaktanty.

Tabulka 12C. Další přípravky Αβ42 a QS-21

Prostředek	Vzhled
QS-21 (mg/ml)	Αβ42 (mg/ml)	Poměr Αβ42^8-21	Bez přísady	5% sacharóza	0,1% PS-80	0,4% PS-80
0,05	0,05	1,0	čisté	čisté	čisté	čisté
0,1	0,1	1,0	čisté	čisté	čisté	čisté
0,2	0,2	1,0	čisté	čisté	čisté	zákal (+)
0,1	0,23	2,3	zákal (+)	zákal (+)	Zákal (+)	zákal (+)
0,2	0,23	1,1	čisté	čisté	čisté	zákal (+)
0,3	0,23	0,8	čisté	čisté	čisté	zákal (+)
0,1	0,45	4,5	zákal (++)	zákal (++)	čisté	zákal (++)
0,2	0,45	2,3	zákal (++)	zákal (++)	zákal (+)	zákal (++)
0,3	0,45	1,5	čisté	čisté	čisté	zákal (++)

Příklad 10: Stanovení a interpretace C.D. spektra u přípravku Αβ42

K shromáždění dat cirkulámího dichroismu byl použit spektropolarimetr, model Aviv 62-DS (Lakewood, NJ). Vzorky byly připraveny přibližně pro sběr signálů z oblasti blízké, respektive vzdálené UV spektru a vloženy do 1 mm podlouhlé skleněné komůrky bez napětí. Úchyt vzorků byl udržován při stabilní teplotě 25 °C. Data byla sbírána po 0,5 nm intervalech s dobou 4 sekundy na zprůměmění naměřených hodnot. V oblasti vzdálené UV spektru (λ ~ 180 až 250 • · · ft· ·· ·· ·· • ft· · · ftft ft • · · ft · · ftftft ft··· ft • ftft · · · ftft ···· ftft ···· nm) dominovaly signály vlastního peptidového řetězce a bylo tak možné získat odhad sekundární struktury přípravku. Zkoušky v oblasti blízké UV spektru (λ ~ 250 až 350) poskytovaly odlišné informace: v této oblasti primární signály vycházely z postranních aromatických řetězců (Phe,

Tyr a Trp). Charakter signálu ukazuje stupeň ohebnosti v každé oblasti peptidu a orientaci postranních řetězců vzhledem k hlavnímu řetězci. Tím, že počet těchto chromofor je menší než počet aminoskupin a tím, že chromofory jsou rozmístěny po celé molekule, je možné určité rozpoznání lokální struktury.

Dá se očekávat, s ohledem na znalosti v oboru, že se objeví množství modifikací a variací vynálezu popsaného výše v Příkladech, přičemž na ně mohou být uplatněny pouze ty nároky, které se vyskytují v připojené kapitole Nároky. V souvislosti s tím si připojené nároky kladou za cíl pokrýt všechny takové varianty, které se v rámci nárokovaného vynálezu objeví.

Claims (47)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Prostředek obsahující vodný roztok nejméně 0,01 mg/ml Αβ peptidů vyznačující se tím, že zmíněný vodný roztok je udržován při pH dostatečném k rozpuštění zmíněného Αβ peptidů.
2. 2. Prostředek podle nároku 1 vyznačující se tím, že roztok je udržován při takovém vhodném pH za použití účinného množství farmaceuticky akceptovatelného pufru.
3. 3. Prostředek obsahující sterilní vodný roztok obsahující nejméně 0,01 mg/ml Αβ peptidů vyznačující se tím, že zmíněný vodný roztok je udržován při pH dostatečném k rozpuštění zmíněného Αβ peptidů.
4. 4. Prostředek podle nároku 3 vyznačující se tím, že roztok je udržován při takovém pH za použití účinného množství farmaceuticky akceptovatelného pufru.
5. 5. Prostředek podle nároků 1 a 3 vyznačující se tím, že zmíněný Αβ peptid je dlouhou formou Αβ peptidů.
6. 6. Prostředek podle nároků 1 a 3 vyznačující se tím, že zmíněný Αβ peptid je Αβ42.
7. 7. Prostředek podle nároků 1 a 3 vyznačující se tím, že pH je okolo 8,5 až okolo 12.
8. 8. Prostředek podle nároku 7 vyznačující se tím, že pH je okolo 9 až okolo 10.
9. 9. Prostředek podle nároků 2 a 4 vyznačující se tím, že farmaceuticky akceptovatelný pufr je vybrán ze skupiny sestávající z aminokyselin, jejich solí a derivátů; farmaceuticky akceptovatelných zásad, alkalických hydroxidů kovů, ammoniumhydroxidů, organických a anorganických kyselin a jejich solí; a jejich směsí.
10. 10. Prostředek podle nároku 9 vyznačující se tím, že farmaceuticky akceptovatelný pufr je glycin (glycinát sodný) nebo arginin (arginin-chloro vodík).

    • · · ·· 44 44 44 • · · ···· ··· • 444 · 4 · 4 4 • ·····*· » 4 ·· * · • · · · · 4 444 •4 · ·· 4444 44 ···
11. 11. Lyofilizovaný prostředek Αβ peptidu, vyznačující se tím, že prostředek je připraven způsobem:

    a) zmražením sterilního vodného roztoku majícím nejméně 0,01 mg/ml Αβ peptidu, vyznačující se tím, že zmíněný vodný roztok je udržován při pH dostatečném k rozpuštění zmíněného Αβ peptidu; a

    b) lyofilizací zmraženého prostředku připraveného v kroku a) výše.
12. 12. Prostředek podle nároku 11 vyznačující se tím, že zmíněný Αβ peptid je dlouhou formou Αβ peptidu.
13. 13. Prostředek podle nároku 11 vyznačující se tím, že zmíněný Αβ peptid je Αβ42.
14. 14. Prostředek podle nároku 11 vyznačující se tím, že roztok je udržován při takovém pH za použití účinného množství farmaceuticky akceptovatelného pufru.
15. 15. Prostředek podle nároku 14 vyznačující se tím, že farmaceuticky akceptovatelný pufř je vybrán ze skupiny sestávající z aminokyselin, jejich solí a derivátů; farmaceuticky akceptovatelných zásad, alkalických hydroxidů kovů, ammoniumhydroxidů, organických a anorganických kyselin a jejich solí; a jejich směsí.
16. 16. Prostředek podle nároků 1, 3 nebo 11 vyznačující se tím, že Αβ peptid je v podstatě v náhodně svinuté konformaci.
17. 17. Prostředek podle nároků 1,3 nebo 11 vyznačující se tím, že Αβ peptid má koncentraci od okolo 0,05 mg/ml do okolo 2,0 mg/ml.
18. 18. Prostředek podle nároků 1,3 nebo 11 vyznačující se tím, že prostředek dále obsahuje farmaceuticky akceptovatelné adjuvans.
19. 19. Prostředek podle nároku 18 vyznačující se tím, že adjuvans je vybráno ze skupiny sestávající z nekompletního Freundova adjuvans; MPL; QS-21; a kamence.

    ··· · ·· · ·· ·· ·· • · · · · · · · « ···♦ ·· ♦ ·· • ······· · · · · · • 99 · · · « · • · · 9 9 9 99 9 9 9
20. 20. Prostředek obsahuje sterilní vodnou suspenzi peptidu o nejméně 0,1 mg/ml Αβ peptidu o pH okolo 5 až okolo 7.
21. 21. Prostředek podle nároku 20 vyznačující se tím, že vodná peptidová suspenze také obsahuje účinné množství farmaceuticky akceptovatelného pufru.
22. 22. Prostředek podle nároků 20 nebo 21 vyznačující se tím, že zmíněný Αβ peptid je dlouhou formou Αβ peptidu.
23. 23. Prostředek podle nároku 22 vyznačující se tím, že zmíněný Αβ peptid je Αβ42.
24. 24. Prostředek podle nároku 21 vyznačující se tím, že farmaceuticky akceptovatelný pufr je vybrán ze skupiny sestávající z aminokyselin, jejich solí a derivátů; farmaceuticky akceptovatelných zásad, alkalických hydroxidů kovů, ammoniumhydroxidů, organických a anorganických kyselin a jejich solí; a jejich směsí.
25. 25. Prostředek podle nároku 20 mající 0,1 až 0,8 mg/ml peptidu Αβ42,10 mM glycin a kyselinu dostatečnou k úpravě pH na okolo 5,5 až okolo 6,5.
26. 26. Prostředek podle nároků 24 nebo 25 obsahující dále jedno nebo více inertních vehikulí vybraných ze skupiny sestávající z modifikátorů tonicity, surfaktantů a zvlhčovačích činidel.
27. 27. Prostředek podle nároku 24 vyznačující se tím, že prostředek dále obsahuje farmaceuticky akceptovatelné adjuvans.
28. 28. Prostředek podle nároku 26, kde prostředek ještě dále obsahuje farmaceuticky akceptovatelná adjuvans.
29. 29. Prostředek podle nároku 28 vyznačující se tím, že adjuvans je vybráno ze skupiny sestávající z nekompletního Freundova adjuvans; MPL; QS-21; a kamence.

    ·· · ·· ·· ·· ·· • · · · · · · 9 9 9 · • · · · · · · · · · • ······· · · * · « « • · · 9 9 9 9 9 9

    99 9 99 9999 99 9999
30. 30. Prostředek podle nároku 28 mající okolo 0,1 až okolo 1,0 mg/ml peptidu Αβ42 v 10 mM glycinu a nejméně 0,1 mg/ml QS-21 v množství účinném k vytvoření vizuálně čisté suspenze s pH okolo 6.
31. 31. Způsob přípravy sterilního prostředku dlouhé formy Αβ peptidu zahrnuje:

    úpravu pH vodného roztoku dostatečně k rozpuštění Αβ peptidu v něm; rozpuštění dostatečného množství Αβ peptidu v roztoku s dosažením imunogenní koncentrace pro savce; a filtraci vzniklého roztoku přes membránu s póry o stejné velikosti, kdy velikost zmíněných pórů je v rozsahu umožňujícím oddělení bakterií a zároveň průchod téměř veškerého Αβ peptidu.
32. 32. Způsob podle nároku 31 vyznačující se tím, že filtrace je provedena přes hydrofilní polymerovou membrána s pórů o stejné velikosti okolo 0,22 mikrometrů.
33. 33. Způsob podle nároku 31 vyznačující se tím, že množství Αβ peptidu získané z filtrace je větší než 50 %.
34. 34. Způsob podle nároku 31 vyznačující se tím, že roztok před filtrací obsahuje nejméně jedno rozpouštědlo vybrané ze skupiny sestávající z farmakologicky akceptovatelných pufrů o koncentraci od okolo 5 mM do okolo 45 mM.
35. 35. Způsob podle nároku 34 vyznačující se tím, že roztok před filtrací obsahuje činidlo modifikující tonicitu od okolo 0,9 % do okolo 6,0 % (hmotnostních).
36. 36. Způsob podle nároku 34 vyznačující se tím, že roztok před filtrací obsahuje surfaktant od okolo 0,02 % do okolo 1,0 % (hmotnostních).
37. 37. Způsob podle nároku 34 vyznačující se tím, že roztok před filtrací obsahuje chelační činidlo od okolo 0,1 mM do okolo 1,0 mM.
38. 38. Způsob podle nároku 34, 35, 36 nebo 37 vyznačující se tím, že pH sterilního roztoku získaného z filtrace je upraveno na pH okolo 5 až okolo 7 za poskytnutí peptidové suspenze.

    «9 » «· 9* 99 99

    9 9 9 9 · · 9 9999 • 999 99 9 99 ·

    40 9999999*9 9999 9 *^v 99* 999 999 • 9 9 99 9999 99 9999
39. 39. Způsob prevence nebo léčby Alzheimerovi demence u savců vyznačující se tím, že je zmíněným savcům aplikováno dostatečné množství sterilního vodného prostředku obsahujícího nejméně 0,05 mg/ml Αβ peptidů s cílem vyvolat u zmíněných savců imunitní odpověď, a že zmíněné vodný prostředek je udržováno při pH dostatečném k rozpuštění Αβ peptidů.
40. 40. Způsob vyvolání protilátkové odpovědi proti Αβ peptidů u savců potřebujících takovou antigenní odpověď zahrnuje:

    parenterální podání imunogenního množství sterilního prostředku dlouhé formy Αβ peptidů.
41. 41. Způsob podle nároku 39 nebo 40 vyznačující se tím, že tento způsob dále zahrnuje podání farmaceuticky akceptovatelného adjuvans, samostatně nebo smíchaného se zmíněným sterilním prostředkem.
42. 42. Způsob podle nároku 39 nebo 40 vyznačující se tím, že sterilní prostředek je v souladu s nárokem 30.
43. 43. Prostředek obsahuje suspenzi nejméně 0,1 mg/ml Αβ peptidů a účinné množství QS-21 k vytvoření vizuálně čisté suspenze v rozmezí pH 5 až 7.
44. 44. Prostředek obsahuje suspenzi nejméně 0,1 mg/ml Αβ peptidů a účinné množství DPPC (dipalmitoylfosfatidylchlorid) k vytvoření vizuálně čisté suspenze v rozmezí pH 5 až 7.
45. 45. Použití sterilního prostředku dlouhé formy Αβ peptidů k výrobě léku k vyvolání protilátkové odpovědi proti Αβ peptidů.
46. 46. Použití sterilního vodného prostředku Αβ peptidů k výrobě léku vhodného k prevenci nebo léčbě Alzheimerovi demence.
47. 47. Použití podle nároku 45 nebo 46 vyznačující se tím, že zmíněný lék dále obsahuje farmaceuticky akceptovatelné adjuvans.