SK160096A3

SK160096A3 - Interleukin-5 specific recombinant antibodies

Info

Publication number: SK160096A3
Application number: SK1600-96A
Authority: SK
Inventors: John S Emtage; Mark W Bodmer; Diljeet S Athwal
Original assignee: Celltech Therapeutics Ltd
Priority date: 1994-06-17
Filing date: 1995-06-16
Publication date: 1997-06-04
Also published as: US6316227B1; CZ371296A3; HU9603183D0; NO964808D0; EP0765392A1; WO1995035375A1; DE69532889D1; AU2680395A; IL114179A; JP3973682B2; ZA954990B; ATE264389T1; IL114179A0; SK282625B6; ES2218546T3; US20020042089A1; CA2192543C; AU694783B2; CA2192543A1; JPH10501697A

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka rekombinantnej protilátkovej molekuly (RAM) a hlavne humanizovanej protilátkovej molekuly (HAM), majúcej špecifičnosť pre ľudský interleukín-5 (hlL-5), nukleových kyselín, ktoré kódujú variabilné domény ťažkého a ľahkého reťazca uvedenej rekombinantnej protilátky, spôsobu produkcie uvedenej protilátky za použitia rekombinantnej DNA technológie a terapeutického použitia rekombinantnej protilátky.

V predloženej prihláške výraz rekombinantné protilätková molekula (RAM) je použitý pre popis protilátky produkovanej spôsobom, zahrňujúcim použitie rekombinantnej DNA technológie. Výraz humanizovaná protilátková molekula (HAM) je použitý pre popis molekuly získanej z ľudského imunoglobulínu. Antigén viažuci miesto môže obsahovať buď kompletné variabilné domény fúzované ku konštantným doménam alebo jeden alebo viacero komplementárnych determinujúcich regiónov (CDR) naočkovaných k vhodným rámčekom regiónov vo variabilnej doméne. Skratka MAb je použitá na označenie monoklonálnej protilátky.

Výraz rekombinantné protilátková molekula zahrňuje nielen kompletné imunoglobulínové molekuly, ale tiež akékoľvek antigén viažuce imunoglobulínové fragmenty ako Fv, Fab a F(ab')2 fragmenty a akékoľvek ich deriváty ako sú jednoreťazcové Fv fragmenty.

Prírodné imunoglobulíny boli používané v esejách, diagnóze a v obmedzenom rozsahu v terapii. Použitiu imunoglobulínov v terapii sa bránilo tým, že väčšina protilátok potenciálneho použitia ako terapeutických činidiel sú MAb produkované fúziou buniek sleziny hlodavcov s bunkami myelómu hlodavcov. Tieto MAb sú tak v podstate hlodavčie proteiny. Použitie týchto MAb ako terapeutických činidiel u ľudí môže zvýšiť nežiaducu imunitnú odpoveď zvanú HAMA (z anglického Human Anti-mouse Antibody). Použitie hlodavčích MAb ako terapeutických činidiel u ľudí je inherentne obmedzené skutočnosťou, že ľudský subjekt bude poskytovať imunologickú odozvu k MAb, ktorá buď odstráni úplne alebo aspoň redukuje jej účinnosť.

Bolo vyvinutých veľa techník na zníženie antigenických charakteristík takýchto ľudských MAb. Tieto techniky všeobecne zahrňujú použitie rekombinantnej DNA technológie na zostavenie DNA sekvencií, kódujúcich polypeptidové reťazce protilátkovej molekuly. Tieto metódy sa všeobecne nazývajú humanizačné techniky.

Najnovšie metódy na humanizáciu MAb zahrňujú produkciu chimérnych protilátok, v ktorých antigén viažuci miesta, obsahujúce kompletné variabilné domény jednej protilátky, sú fúzované ku konštantným doménam získaným z inej protilátky. Metódy pre vykonávanie takýchto chimerizačných postupov sú popísané v EP 0120694 (Celltech Limited) a EP 0125023 (Genentech Inc. a City of Hope). Humanizované chimérne protilátky však ešte obsahujú významný podiel ne-humánnych aminokyselinových sekvencií a môžu ešte stále vyvolávať určitú HAMA odozvu, najmä ak sú podávané dlhšiu dobu (Begent a spol., Br. J. Cancer, 62, 487 (1990)).

Alternatívne riešenie, popísané v EP-A-0239400 (Winter), zahrňuje naočkovanie komplementaritu determinujúceho regiónu (CDR) myšou MAb na rámčeky regiónov variabilných domén ľudského imunoglobulínu za použitia rekombinantných DNA techník. Existujú tri CDR (CDR1, CDR2 a CDR3) v každých variabilných doménach ťažkého a ľahkého reťazca. Takéto CDR - štepené humanizované protilátky pravdepodobne oveľa menej zvyšujú HAMA odpoveď ako humanizované chimérne protilátky vzhľadom k oveľa nižšiemu podielu ne-humánnych aminokyselinových sekvencií, ktoré obsahujú. V Riechmann a spol. (Náture, 332, 323 - 324 (1988)) bolo zistené, že transfer CDR samotných, ako definuje Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (1987)) nebol dostatočný pre poskytnutie vyhovujúcej antigén viažucej aktivity v CDR-štepenom produkte. Riechmann a spol. zistili, že bolo nevyhnutné konvertovať mnoho zvyškov mimo CDR, hlavne v slučke /3 í 3 pripojenej k CDR1. Avšak väzobná afinita najlepších CDR - očkovaných získaných protilátok bola ešte významnejšia ako pôvodná MAb.

Vo WO 91/09967, Adair a spol., popisujú CDR - štepenú protilátku ťažkého a ľahkého reťazca a determinujú hierarchiu donorových zvyškov.

Vo WO 93/16184 Chou a spol. popisujú dezén, klonovanie a expresiu humanizovaných monoklonálnych protilátok proti ľudskému interleukínu-5. Je navrhnutý spôsob selekcie ľudských protilátkových sekvencii, ktoré sa majú použiť ako humánne rámčeky pre humanizáciu zvieracích protilátok, zahrňujúce stupne porovnania humánnych variabilných doménových sekvencii s variabilnými doménovými sekvenciami zo zvieracej MAb, ktorá sa humanizuje, na percentuálnu identitu, sekvenčné dvojznačnosti a podobné PIN - regiónové vzdialenosti. PIN - regiónová vzdialenosť je definovaná ako počet zvyškov medzi cysteínovými zvyškami, tvoriacimi intra doménové disulfidové mostíky. Vyberie sa ľudská protilátka, majúca najlepšiu kombináciu týchto rysov. Navrhne sa tiež metóda stanovenia, ktoré variabilné doménové zvyšky zvieracej MAb by sa mali vybrať pre humanizáciu, zahrňujúcu stanovenie potenciálneho minima zvyškov (zvyšky, ktoré obsahujú CDR štruktúrne slučky a zvyšky vyžadované pre podporu a/alebo orientáciu CDR štruktúrnych slučiek) a maximum zvyškov (zvyšky, ktoré obsahujú Kabatove CDR, CDR štruktúrne slučky, zvyšky vyžadované pre podporu a/alebo orientáciu CDR štruktúrnych slučiek a zvyšky, ktoré spadajú do asi 10 A CDR štruktúrnej slučky a vykazujú povrch prístupný pre vodné rozpúšťadlo asi 5 a2 alebo väčšie) zvieracej monoklonálnej protilátky. Ďalej sa vykonáva počítačové modelovanie na všetkých možných rekombinantných protilátkach, zahrňujúcich ľudskú protilátkovú rámčekovú sekvenciu, do ktorej bolo inzertované minimum a maximum zvyškov. Minimum a maximum zvyškov sa vyberie na základe kombinácie, ktorá produkuje rekombinantnú protilátku, majúcu štruktúru počítačového modelu najbližšiu štruktúre zvieracej monoklonálnej protilátky. Humanizovaná získaná anti-IL-protilátka sa javí ako bez podstatného množstva svojej afinity pre hlL-5 molekulu.

•4

Cieľom vynálezu je poskytnúť humanizovanú protilátkovú molekulu, majúcu zlepšenú afinitu pre hlL-5 molekulu.

Podstata vynálezu

Podľa predloženého vynálezu je poskytnutá RAM, majúca afinitu pre ľudský IL-5 a obsahujúca antigén väzobné regióny získané z ťažkého a/alebo ľahkého reťazca variabilných domén donor protilátky, majúcej afinitu pre ľudský IL-5, RAM majúcej väzobnú afinitu podobnú afinite donor protilátky.

RAM podľa vynálezu môže obsahovať antigén viažuci regióny z akejkoľvek vhodnej donor anti-IL-5 protilátky. Typicky je donor anti-IL-5 protilátka hlodavčej MAb. Výhodne je donor protilátka MAb 39D10.

Variabilné domény ťažkých a ľahkých reťazcov MAb 39D10 sú tu ďalej popísané u obrázkov 1 a 2.

Podľa preferovaného aspektu vynálezu je RAM podľa predloženého vynálezu anti-IL-5 protilátková molekula, majúca afinitu pre ľudský IL-5 antigén, obsahujúci kompozitný ťažký reťazec a komplementárny ľahký reťazec, kde uvedený kompozitný ťažký reťazec má variabilnú doménu, obsahujúcu prevažne zvyšky rámčeka ťažkého reťazca protilátkového akceptora a väzobné zvyšky pre ťažký reťazec antigénu donor protilátky, kde uvedená donor protilátka má afinitu pre ľudský IL-5, pričom uvedený kompozitný ťažký reťazec obsahuje donor zvyšky aspoň v polohách 31 až 35, 50 až 65 a 95 až 102 (podľa Kabatovho systému číslovania) (Kabat a spol., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Vol. I, 5. vydanie, 1991, US Department of Health and Human Services, National Inštitúte of Health).

Výhodne rámček kompozitného ťažkého reťazca ďalej obsahuje donor zvyšky v polohách 23, 24, 27 - 30, 37, 49, 73 a 76 - 78 alebo 24, 27 - 30, 37, 49, 72, 76 a 78.

Podľa druhého preferovaného aspektu predloženého vynálezu je poskytnutá anti-IL-5 protilátková molekula, majúca afinitu pre ľudský IL-5 antigén, obsahujúci kompozitný ľahký reťazec a komplementárny ťažký reťazec, kde uvedený kompozitný ľahký reťazec má variabilnú doménu, obsahujúcu prevažne zvyšky rámčeka ľahkého reťazca protilátkového akceptora a väzobné zvyšky pre ľahký reťazec antigénu donor protilátky, kde uvedená donor protilátka má afinitu pre ľudský IL-5, pričom uvedený kompozitný ľahký reťazec obsahuje donor zvyšky aspoň v polohách 24 až 34, 50 až 56 a 69 až 97 (podľa Kabatovho systému číslovania).

Výhodne rámček kompozitného ľahkého reťazca ďalej obsahuje donor zvyšky v polohách 22, 68 a 71 alebo v polohách 68 a 71.

Podľa tretieho preferovaného aspektu predloženého vynálezu je poskytnutá anti-IL-5 protilátková molekula, majúca afinitu pre ľudský IL-5 antigén, obsahujúca kompozitný ťažký reťazec podľa prvého aspektu vynálezu a kompozitný ľahký reťazec podľa druhého aspektu vynálezu.

Výhodne každá RAM podľa vynálezu má afinitnú konštantu pre ľudský IL-5 väčšiu ako 10’θ M.

Bude zrejmé, že vynález je v širokom rozsahu použiteľný pre produkciu anti-IL-5 RAM všeobecne. Donorová látka tak môže byť akákoľvek anti-IL-5 protilátka získaná z akéhokoľvek zvieraťa. Akceptorová protilátka môže byť získaná zo zvieraťa rovnakých druhov a môže to byť i rovnaká trieda alebo podtrieda protilátky. Bežnejšie však sú donorové a akceptorové protilátky získané zo zvierat iných druhov. Typicky donorová anti-IL-5 protilátka je neľudská protilátka, ako je hlodavčia MAb a akceptorovou protilátkou je ľudská protilátka.

Akákoľvek vhodná rámčeková sekvencia sa môže použiť, pokiaľ ide o triedu alebo typ donorovej protilátky, z ktorej sú antigén viažuce regióny získané. Výhodne typ použitého akceptorového rámčeka je rovnakej alebo podobnej triedy alebo typu ako donorová protilátka. Výhodne má zvolený rámček najvyššiu homológiu k donorovej protilátke. Výhodne sa použijú rámčeky ľudskej skupiny III gama zárodočnej línie pre kompozit ťažkého reťazca a rámčeky ľudskej skupiny I kappa zárodočnej línie sa použijú pre kompozitné ľahké reťazce.

Konštantné regiónové domény RAM podľa vynálezu môžu byť zvolené s ohľadom na navrhnuté funkcie protilátky, hlavne efektorové funkcie, ktoré sa môžu vyžadovať. Napríklad konštantné regiónové domény môžu byť ľudské IdA, IgE, IgG alebo IgM domény. Hlavne sa môžu použiť IgG ľudské konštantné regiónové domény najmä izotypu lgG1 a lgG3 ak je humanizovaná protilátka zamýšľaná pre terapeutické použitie a vyžadujú sa protilátkové efektorové funkcie. Alternatívne môžu byť použité lgG2 a lgG4 izotypy, ak je humanizovaná protilátková molekula zamýšľaná pre terapeutické účely a nevyžadujú sa protilátkové efektorové funkcie, napr. špecifická väzba k a neutralizácia biologickej aktivity ľudského IL-5. Môžu sa tiež použiť modifikované ľudské konštantné regiónové domény, v ktorých jeden alebo viacero aminokyselinových zvyškov bol zamenený alebo deletovaný kvôli zmene určitej efektorovej funkcie. Výhodne sú konštantné regiónové domény RAM ľudskej lgG4.

Označenie zvyškov uvedené vyššie a inde v predloženej prihláške sú vykonané podľa číslovania Kabata (Kabat a spol., Sequences of Proteins of Immunological Interest, diel I, 5. vydanie, 1991, US Department of Health and Human Service, National Inštitúte of Health). Označenie zvyškov tak vždy nezodpovedá priamo lineárnemu číslovaniu aminokyselinových zvyškov. Aktuálne lineárne aminokyselinové sekvencie môžu obsahovať menej alebo ďalšie aminokyseliny ako v Kabátovom číslovaní, zodpovedajúce skráteniu alebo inzercii do základnej variabilnej doménovej štruktúry.

Tiež anti-L-5 protilátkové molekuly podľa predloženého vynálezu môžu byť pripojené k efektorovým alebo reportérovým molekulám. Alternatívne môžu byť použité postupy technológie rekombinantnej DNA pre produkciu imunoglobulínových molekúl, v ktorých Fc fragment alebo CH3 doména kompletného imunoglobulínu boli nahradené, alebo boli k nemu pripojené peptidovou väzbou, funkčný ne-imunoglobulínový protein ako je enzým, cytokín, rastový faktor alebo toxínová molekula.

Preto zvyšok protilátkových molekúl nevyhnutne nemusí obsahovať iba sekvencie z imunoglobulínov. Napríklad môže byť konštruovaný gén, v ktorom DNA sekvencia, kódujúca časť ľudského imunoglobulínového reťazca je fúzovaná k DNA sekvencii, kódujúcej aminokyselinovú sekvenciu molekuly polypeptidového efektora alebo reportéra.

Ďalšie aspekty vynálezu zahrňujú DNA sekvencie, kódujúce kompozitný ťažký reťazec a kompozitný ľahký reťazec. Klonovacie a expresné vektory, obsahujúce DNA sekvencie, hostiteľské bunky transformované s DNA sekvenciami a spôsoby produkcie molekúl protilátok, obsahujúcich DNA sekvencie v transformovaných hostiteľských bunkách, sú tiež ďalšie aspekty vynálezu.

Všeobecne metódy, ktorými môžu byť vektory konštruované, transfekčné metódy a kultivačné metódy sú dobre v odbore známe a netvoria časť vynálezu.

DNA sekvencie, ktoré kódujú anti-IL-5 donor aminokyselinovej sekvencie, môžu byť získané metódami dobre známymi v odbore (pozri napríklad medzinárodná patentová prihláška č. WO 93/16184). Napríklad anti-IL-5 kódujúce sekvencie môžu byť získané genomickým klonovaním alebo cDNA klonovaním z vhodných hybridómových línií, napr. bunečnej línie 39D10. Pozitívne klony môžu by screenované za použitia vhodných sond pre požadované ťažké a ľahké reťazce. Tiež sa môže použiť PCR klonovanie.

DNA, kódujúca akceptorové aminokyselinové sekvencie, môže byť získaná akýmkoľvek vhodným spôsobom. Napríklad DNA sekvencie, kódujúce preferované ľudské akceptorové rámčeky ako je ľudská skupina I ľahkých reťazcov a ľudská skupina III ťažkých reťazcov, sú v širokom rozsahu dostupné pracovníkom v odbore.

Na prípravu požadovaných DNA sekvencií sa môžu použiť štandardné techniky molekulárnej biológie. Sekvencie môžu byť syntetizované kompletne alebo čiastočne za použitia techník oligonukleotidovej syntézy.Vhodné je použitie techniky miestne riadenej mutagenézy a polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) .Napríklad môže byť použitá oligonukleotidová riadená syntéza, ako popísal Jones a spol. (Náture 321, 522 (1986)). Tiež sa môže použiť oligonukleotidová riadená mutagenéza už existujúceho variabilného regiónu ako je napríklad popísaná Verhoeynom a spol. (Science, 239, 1534 1536 (1988)). Tiež sa môže použiť enzymatické plnenie prelomených (gapped) oligonukleotidov za použitia T4 DNA polymerázy, ako je napríklad popísané Queenom a spol. (Proc. Natl. Äcad. Sci USA, 86, 10029 - 10033 (1989) a vo WO 90/07861).

Pre expresiu DNA sekvencií, kódujúcich RAM môžu byť použité akékoľvek vhodné hostiteľské bunečné a vektorové systémy. Výhodne sa používajú eukaryotické, napr. cicavčie hostiteľské bunečné expresné systémy. Najviac vhodné cicavčie bunky zahrňujú CHO bunky a myelómové alebo hybridómové bunečné línie.

Podľa ďalšieho aspektu predloženého vynálezu je poskytnutý spôsob produkcie anti-IL-5 RAM, zahrňujúci:

(a) produkciu prvého expresného vektora prvého operónu, majúceho DNA sekvenciu, ktorá kóduje kompozitný ťažký reťazec, ako je definovaný podľa prvého preferovaného aspektu vynálezu, (b) pripadne v prvom alebo druhom expresnom vektore produkciu druhého operónu, majúceho DNA sekvenciu, ktorá kóduje komplementárny ľahký reťazec, ktorým môže byť kompozitný ľahký reťazec, ako je definovaný podľa druhého preferovaného aspektu vynálezu, (c) transfekciu hostiteľskej bunky vektorom alebo každým vektorom, a

(d) kultiváciu transfektovanej bunečnej línie pre produkciu RAM.

Alternatívne môže spôsob zahrňovať použitie sekvencií, kódujúcich kompozitný ľahký reťazec a komplementárny ťažký reťazec.

Pre produkciu RAM, obsahujúcich ako ťažký, tak ľahký reťazec, môžu byť bunečné línie transfektované dvoma vektormi. Prvý vektor môže obsahovať operón, kódujúci kompozitný alebo komplementárny ťažký reťazec a druhý vektor môže obsahovať operón kódujúci komplementárny alebo kompozitný ľahký reťazec. Výhodne sú vektory identické, pokiaľ sú kódujúce sekvencie a selektujúce markéry obsiahnuté tak, že umožňujú, ako je to len možné, že je rovnako exprimovaný každý polypeptidový reťazec. V preferovanej alternatíve sa môže použiť jediný vektor, vektor, obsahujúci sekvencie, kódujúce ako ťažký reťazec, tak ľahký reťazec.

DNA v kódujúcich sekvenciách pre ťažký a ľahký reťazec môže zahrňovať cDNA alebo genomickú DNA alebo obidve.

Predložený vynález tiež zahrňuje terapeutické a diagnostické kompozície, obsahujúce RAM a použitie takýchto kompozícií v terapii a diagnóze.

V súlade s tým v ďalšom aspekte vynález poskytuje terapeutickú alebo diagnostickú kompozíciu, obsahujúcu RAM podľa predchádzajúcich aspektov vynálezu v kombinácii s farmaceutický prijateľnou prísadou, riedidlom alebo nosičom.

Tieto kompozície môžu byť pripravené použitím RAM podľa predloženého vynálezu, napríklad ako celých protilátok, jedno reťazcových Fv fragmentov alebo protilátkových fragmentov, ako sú Fab alebo Fv fragmenty. Takéto kompozície majú IL-5 blokujúce alebo antagonistické účinky a môžu byť použité pre potlačenie IL-5 aktivity.

Kompozície podľa vynálezu môžu byť formulované v súlade s bežnou praxou pre podanie akýmkoľvek vhodným spôsobom a môžu všeobecne byť v kvapalnej forme (napr. roztok RAM v sterilnom fyziologicky prijateľnom pufre) na podanie napríklad intravenóznym, intraperitoneálnym alebo intramuskulárnym spôsobom, v sprejovej forme, napríklad na podanie nasálnym alebo bukálnym spôsobom, alebo vo forme vhodnej pre implantáciu.

Vynález tiež poskytuje spôsob terapie alebo diagnózy, zahrňujúci podanie účinného množstva, výhodne 0,1 až 10 mg/kg telesnej hmotnosti, RAM podľa predchádzajúcich aspektov vynálezu ľudskému alebo zvieracemu subjektu. Presná dávka a celková dávka sa budú meniť podľa zamýšľaného použitia RAM a veku a stavu liečeného pacienta. RAM môže byť podaná ako jediná dávka alebo kontinuálnym spôsobom po časový úsek. Dávky môžu byť podľa potreby opakované.

RAM podľa predchádzajúcich aspektov vynálezu môže byť použitá pre akékoľvek terapeutické použitia, pre ktoré boli použité alebo v budúcnosti budú použité anti-IL-5 protilátky, napr. 39D10.

IL-5 je primárny aktivátor eozinofilov a blokovanie funkcie týchto cytokínov s protilátkami bolo zistené ako brániace alebo redukujúce eozinofílii, ktorá je spojená s určitými alergickými chorobami. RAM podľa vynálezu tak môže byť použitá pre tento účel a hlavne môže byť použitá pre liečenie astmy, kedy je možné očakávať, že bude brániť akumulácii a aktivácii eozinofilov v astmatických pľúcach, a tým redukovať bronchiálny zápal a zúženie dýchacích ciest. Pre použitie pri liečení astmy môže RAM podľa vynálezu byť výhodne jednoreťazcový Fv fragment formulovaný ako sprej, na podanie napríklad nasálnou cestou.

Preferovaný protokol na získanie anti-IL-5 protilátkovej molekuly v súlade s predloženým vynálezom je uvedený ďalej. Tento protokol je uvedený kvôli zovšeobecneniu vynálezu, ako je tu popísaný a definovaný.

30D10 krysia monoklonálna protilátka pôsobiaca proti ľudskému L-5 je použitá ako donor protilátka. Variabilné domény ťažkého a ľahkého reťazca 30D10 boli už prv klonované (WO 93/16184) a nukleotidové a predpovedané aminokyselinové sekvencie týchto domén sú uvedené na obr. 1 a 2. Vhodné variabilné domény akceptora ťažkého a ľahkého reťazca musia byť stanovené a musia byť známe aminokyselinové sekvencie. RAM je potom číslovaná tak, že vychádza zo základu akceptorovej sekvencie.

1. CDR

V prvom stupni sú donorové zvyšky nahradené za akceptorové zvyšky v CDR. Pre tento účel sú CDR definované nasledovne:

I ťažký reťazec: CDR1: zvyšky 31 - 35 CDR2: zvyšky 50 - 65 CDR3: zvyšky 95-102 ľahký reťazec: CDR1: zvyšky 24-34 CDR2: zvyšky 50 - 56 CDR3: zvyšky 89 - 97

Polohy, v ktorých sú donorové zvyšky substituované za akceptorové zvyšky v rámčeku, sú potom zvolené nasledovne, najprv s ohľadom na ťažký reťazec a následne s ohľadom na ľahký reťazec.

2. Ťažký reťazec

2.1. Donorové zvyšky sú použité buď vo všetkých polohách 24, 27 až 30, 37, 49, 73, 76 a 78 alebo vo všetkých polohách 23, 24, 27 až 30, 37, 49, 73 a 76 až 78 ťažkého reťazca.

3. Ľahký reťazec

3.1. Donorové zvyšky sú použité buď vo všetkých polohách 22, 68 až 71 alebo vo všetkých polohách 68 a 71.

Predložený vynález sa týka rekombinantnej anti-IL-5 protilátkovej molekuly, majúcej väzobnú afinitu v podstate rovnakú ako je afinita donorovej protilátky. Predložený vynález bude teraz popísaný pomocou príkladov s odkazmi na pripojené obrázky.

Popis obrázkov na pripojených výkresoch

Obrázok 1 predstavuje nukleotidovú a aminokyselinovú sekvenciu 30D10 ťažkého reťazca.

Obrázok 2 predstavuje nukleotidovú a aminokyselinovú sekvenciu 30D10 ľahkého reťazca.

Obrázok 3 predstavuje porovnanie regiónov rámčeka variabilnej domény ťažkého reťazca s regiónmi rámčeka ťažkého reťazca súhlasnej sekvencie ľudskej skupiny III ťažkých reťazcov.

Obrázok 4 predstavuje porovnanie regiónov rámčeka variabilnej domény ľahkého reťazca s regiónmi rámčeka ťažkého reťazca súhlasnej sekvencie ľudskej skupiny III ľahkých reťazcov.

Obrázok 5 predstavuje nukleotidovú a aminokyselinovú sekvenciu CDR naštepeného anti-IL-5 ľahkého reťazca CTIL-5-gL.6.

Obrázok 6 predstavuje nukleotidovú a aminokyselinovú sekvenciu CDR naštepeného anti-IL-5 ťažkého reťazca CTIL-5-10gH.

Obrázok 7 predstavuje mapu plazmidu pMR14.

Obrázok 8 predstavuje mapu plazmidu pMR15.1.

Obrázok 9 predstavuje afinitné konštanty a asociačné a disociačné rýchlosti chimérnej 39D10 protilátky aCTIL-5-10gH/-gl_6 protilátky.

Obrázok 10 predstavuje graf neutralizácie IL-5 v TF1 eseji panelom protilátok.

Obrázok 11 predstavuje výsledky kompetičnej eseje pre krysiu 39D10, chimérnu 39D10 protilátku a CTIL-5-10gH/gL6 protilátku a

Obrázok 12 predstavuje účinok CTIL-5-10gH/gL6 na opičiu eozinofíliu.

Príklady vyhotovenia vynálezu

1. Materiál a metódy

39D10 je krysia monoklonálna protilátka pôsobiaca proti ľudskému IL-5.

Gény pre variabilné domény ťažkého a ľahkého reťazca 39D10 boli už prv klonované (WO 93/16184) a nukleotidové a predpovedané aminokyselinové sekvencie sú uvedené na obr. 1 a 2. Vďaka stratégii použitej pri klonovaní variabilnej domény 39D10 ťažkého reťazca nie je prvých päť aminokyselín rámčekových regiónov známych. Avšak bol dostupný ťažký reťazec, ktorý obsahuje leader sekvenciu a prvých päť aminokyselín rámčeka 1 z protilátky YTH 34.5HL, Riechmann a spol. (Náture, 332, 323 - 327 (1988)).

2. Molekulárne biologické postupy ’V

Použili sa postupy molekulárnej biológie, ako popísal Maniatis a spol. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydanie, zv. 1 až 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).

3. Konštrukcia génov rekombinačného ťažkého a ľahkého reťazca

Ťažký reťazec

Vh región ťažkého reťazca bol generovaný PCR za použitia oligonukleotidov R3601 a R2155. Ich sekvencie sú:

R3601 5 ’ GCGCGCAAGCTTGCCGCCACCATGAAG {A, T ) TGTGGTTAAACTGGGTTTT3 R2155 5 'GCAGATGGGCCCTTCGTTGAGGCTG (A,C) ( A,G)GAGAC(G,T,A,GTGA3

Reakčná zmes (100 pl), obsahujúca 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCI, 50 mM KCI, 0,01 hmot./objem. želatíny, 0,25 mM každého deoxyribonukleozid trifosfátu, 0,1 pg 39D10 DNA ťažkého reťazca, 6 pmól R3601 a R2155 a 0,25 jednotiek Taq polymerázy. Reakčná zmes bola zahrievaná na 94 °C 5 minút a potom cyklovaná pri 94 °C 1 minútu, 1 min. pri 55 °C a 1 min. pri 72 °C. Po 30 cykloch bola reakčná zmes extrahovaná s rovnakým objemom fenol/chloroformu (1 : 1 obj./obj.), potom s chloroformom pred tým, ako bola zrážaná prídavkom 2,5 objemu etanolu. PCR produkt bol rozpustený vo vhodnom pufre, očkovaný s HindlII a Apal, čistený na agarózovom geli a ligovaný do vektora pMR14 (obr. 7), ktorý potom bol tiež očkovaný s HindlII a Apal. Po transformácii do E. coli LM1035 rástli kolónie cez noc a plazmidová DNA bola analyzovaná na Vh inzerty. Nukleotidová sekvencia vH regiónu v plazmide, pARH1217 je uvedená na obr. 1.

Ľahký reťazec

Gén V1 ľahkého reťazca bol generovaný z pôvodného V1 ako je popísané vo WO 93/16184, klonu PCR s oligonukleotidmi R3585 a R3597. Ich sekvencie sú:

R3585 5'GGACTGTTCGAAGCCGCCACCATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCT3

R3 5 9 7 5'GGATACAGTTGGTGCAGCATCCGTACGTTT3

PCR bola vykonaná ako je popísané vyššie. PCR produkt bol štiepený enzýmami BstBI a Spil a po čistení ligovaný do pMR15.1 (obr. 8), ktorý už bol prv štiepený rovnakými enzýmami.

Boli identifikované kolónie, po transformácii E. coli LM1035, ktoré obsahujú plazmid (pARH1215) s V1 inzertom. Nukleotidové sekvencia V1 inzertu je uvedená na obr. 2.

CDR očkovanie 39D10

Za účelom zvolenia najvhodnejších ľudských akceptorových rámčekov pre CDR slučky 39D10 boli aminokyselinové sekvencie rámčekov 1 - 3 39D10 porovnané so sekvenciami známych ľudských kapa ľahkých reťazcov. 39D10 sa pokladá za najviac homológny k ľudskej skupine I ľahkých reťazcov. Na tomto základe bolo rozhodnuté použiť rámčeky ľudskej skupiny I zárodočnej línie pre CDR očkovanie. Homológie medzi sekvenciami sú uvedené na obr. 3. Uvedená je tiež homológia medzi rámčekom 4 regiónov 39D10 a súhlasná sekvencia známych ľahkých reťazcov ľudskej skupiny I. Zvyšky v 39D10, ktoré sa odlišujú od ľudskej súhlasnej sekvencie, sú podčiarknuté. Príspevok, ako by sa tieto zvyšky mohli podieľať na antigénovej väzbe, bol analyzovaný a dva gény boli konštruované pre CDR očkovaný ľahký reťazec. Boli to CTIL5-gL5 a CTIL-5-gL6, v ktorých, ako i v CDR zvyškoch, buď zvyšky 22, 68 a 71 alebo zvyšky 68 a 71 boli tiež z 39D10. Nukleotidové a aminokyselinové sekvencie CTIL-5-gL6 sú uvedené na obr. 5.

Ťažký reťazec

CDR očkovanie 39D10 ťažkého reťazca bolo vykonané ako je popísané pre ľahký reťazec. Rámčekové regióny 39D10 sa pokladajú za najviac homológne k regiónom ľudskej skupiny III protilátok, a následne súhlasná sekvencia rámčekov génov ľudskej skupiny III zárodočnej línie bola použitá na akceptovanie CDR 39D10 ťažkého reťazca. Ako prv bola tiež zvolená súhlasná sekvencia pre ľudskú skupinu III rámčeka 4 regiónov. Porovnanie týchto sekvencií je uvedené na obr. 4 s podčiarknutými zvyškami v 39D10, ktoré sa odlišujú od ľudskej súhlasnej sekvencie.

Vykonala sa analýza rámčekových zvyškov v 39D10, ktoré by mohli ovplyvniť aiitigénovú väzbu a boli konštruované dva gény, CTIL-5-9gH a CTIL-5-10gH, v ktorých buď zvyšky 23, 24, 27 až 30, 37, 49, 73 a 76 až 78 alebo zvyšky 24, 27 - 30, 37, 49, 73, 76 a 78 boli z 39D10. Nukleotidová a aminokyselinová sekvencia CTIL-5-10gH je uvedená na obr. 6.

Expresia a bioaktivita anti-IL-5 protilátok

Chimérne (krysie/ľudské) a CDR očkovaný 39D10 boli vyrobené pre biologické hodnotenie prechodnej expresie párov ťažkého a ľahkého reťazca po ko-transfekcii do buniek vaječníkov čínskeho škrečka (CHO) za použitia zrážania fosforečnanom vápenatým.

Deň po ko-transfekcii boli polo-konfluentné fľaše CHO-L761h buniek (Cockett a spol., Nucl. Acids. Res., 19, 319 - 325, 1991) trypzinizované, bunky boli spočítané a T75 fľaše boli každá naplnené 10? buňkami. Ďalší deň bolo kultivačné médium vymenené 3 hodiny pred transfekciou. Pre transfekciu bola pripravená zrazenina fosforečnanu vápenatého zmiešaním 1,25 ml 0,25M CaCl2, obsahujúca 50 pg každého z expresných vektorov ťažkého a ľahkého reťazca s 1,25 ml 2xHBS (16,36 g NaCl, 11,9 g HEPES a 0,4 g Na2HPO4 v 1 litri vody a pH upraveným na 7,1 pomocou NaOH) a ihneď pridané do média buniek. Po 3 hod. pri 37 °C v CO₂ inkubátore boli médium a zrazenina odstránené a bunky šokované prídavkom 15 ml 15 % glycerínu vo fosfátom pufrovanom salinickom roztoku (PBS) 1 minútu.

Glycerín bol odstránený, bunky boli raz premyté PBS a inkubované 48 - 96 hodín v 25 ml média, obsahujúceho 10 mM butyrátu sodného. Protilátka bola čistená z kultivačného média naviazaním k a eluáciou z proteín A Sepharosy. Koncentrácia protilátky bola stanovená za použitia ľudský Ig ELISA (pozri ďalej).

ELISA

Expresia protilátky bola hodnotená transfekciou párov génov ťažkého a ľahkého reťazca a po troch dňoch inkubácie, meraním množstva protilátky nahromadenej v kultivačnom médiu pomocou ELISA.

Pre ELISA boli Nunc ELISA platne potiahnuté cez noc pri 4 °C F(ab')2 fragmentom polyklonálnej kozej anti-ľudský Fc fragment špecifickej protilátky (Jackson Immunoresearch, kód 109-006-098) pri 5 pg/ml v poťahovacom pufre (15 mM uhličitan sodný, 35 mM hydrogénuhličitan sodný, pH 6,9). Nepotiahnutá protilátka bola odstránená premytím 5-krát destilovanou vodou. Vzorky a čistené štandardy pre kvantifikáciu boli zriedené na približne 1 pg/ml v konjugátovom pufre (0,1 Tris-HCI pH 7,0, 0,1 M NaCl, 0,2 % obj./obj. Tween 20, 0,2 % hmotn./obj. Hammersten kazeínu). Vzorky boli titrované v mikrotitračných jamkách v 2-násobnom zriedení kvôli poskytnutiu konečného objemu 0,1 ml v každej jamke a platne boli inkubované pri teplote miestnosti 1 hodinu za trepania. Po prvom inkubačnom stupni boli platne premyté 10 krát destilovanou vodou a potom inkubované 1 hodinu ako prv s 0,1 ml myšou monoklonálnej anti-ľudskej kapa (kloň GD12) peroxidáza konjugovanej protilátky (The Binding Site, kód MP135) pri riedení 1 v 700 v konjugátovom pufre. Platne boli opäť premyté a do každej jamky bol pridaný substrátový roztok (0,1 ml). Substrátový roztok obsahuje 150 pl Ν,Ν,Ν,Νtetrametylbenzidínu (10 mg/ml v DMSO), 150 pl peroxidu vodíka (30 % roztok) v 10 ml 0,1 M octanu sodného/citrátu sodného, pH 6,0. Platňa sa vyvíjala 5 až 10 minút, až absorbancia pri 630 nm bola približne 1,0 pre špičkový štandard. Absorbancia 630 nm bola meraná použitím platňovej čítačky a koncentrácia vzorky stanovená porovnaním titračných kriviek s krivkou štandardu.

Stanovenie afinitných konštánt pre anti-IL-5 protilátky

Afinity chimérnych a CDR očkovaných anti-IL-5 protilátok boli stanovené za použitia Biospecific ínteraction Analysis (BIA). Protilátky boli produkované v CHO bunkách transfekciou kombináciou génov ťažkého a ľahkého reťazca a čistené zo supernatantov kultúry na Proteín A Sepharose. Pre afinitné meranie bola polyklonálna anti-ľudská Fc protilátka naviazaná k Pharmacia Biosensor chip (12150 relatívnej odozvovej jednotky, RU) a použité na zachytenie anti-IL-5, ktorý prešiel nad čipom pri 5 pg/ml v 10 mM HEPES, 0,15M NaCI, 3,4 mM EDTA, pH 7,4. Množstvo anti-IL-5 zachytené pre každý beh bolo približne 1 600 RU. Rekombinantný ľudský IL-5 potom prešiel cez Sensorchip v rôznych koncentráciách (0,6 až 5 pg/ml) vo vyššie uvedenom pufre. Sensorchip bol čistený po každom behu pomocou 100 mM HCI a 100 mM kyseliny ortofosforečnej kvôli odstráneniu naviazaného IL-5 a protilátky. Generované sensogramy boli analyzované za použitia kinetického softwaru dostupného s prístrojom BIAcore.

Boli stanovené hodnoty pre afinitné konštanty a asociačné a disociačné rýchlosti dvoch protilátok, chimérnej 39D10 a CTIL-5-10gH/-gL6. Výsledky sú uvedené na obr. 9. Je možné vidieť, že chimérna 39D10 má vysokú afinitu pre ľudský IL-5 a že táto hodnota bola reprodukovaná v CTIL-5-10gH/-gL6.

Aktivita anti-IL-5 protilátok v in vitro bioeseji

Aktivity rôznych CDR očkovaných protilátok boli porovnané s aktivitami chimérnej 39D10 v in vitro bioeseji za použitia TF1 buniek. TF1 je erytroleukemická bunečná línia, ktorá sa vyžaduje pre rast GM-CSF. GM-CSF môže byť nahradený IL-5, ale v tomto prípade bunky iba prežívajú a nemnožia sa. Avšak závislosť od IL-5 pre prežitie znamená, že TF1 bunky môžu byť použité v bioeseji kvôli porovnaniu aktivít rôznych anti-IL-5 protilátok.

Neutralizácia anti-IL-5 protilátkami bola meraná za použitia konštantného množstva IL-5 (2 ng/ml) a premenných množstva protilátky inkubovanej s 5x1bunkami na jamku v 96 jamkových platniach s plochým dnom 3 dni. Počas posledných 4 hodín sú bunky kultivované za prítomnosti Thiazolyl blue (MIT). Toto farbivo sa konvertuje na nerozpustnú purpurovú formu mitochondriálnymi enzýmami v životaschopných bunkách. Nerozpustný materiál bol rozpustený inkubáciou cez noc po prídavku 100 pi 50 % dimetylformamidu, 20 % SDS pH 4,7 a množstva prijatého farbiva stanoveného spektrofotometricky. Hodnota bioaktívneho IL-5 zostávajúceho za prítomnosti protilátok sa extrapoluje zo štandardnej krivky, vyjadrujúcej príjem farbiva ku koncentrácii IL-5 koncentrácie.

Aktivity rôznej kombinácie ťažkého a ľahkého reťazca boli hodnotené za použitia TF1 bioeseje. Výsledky sú uvedené na obr. 10. Je možné vidieť, že všetky kombinácie CDR očkovaného ťažkého a ľahkého reťazca produkujú protilátky, ktoré sú ekvipotentné s chimérnym 39D10. Tieto výsledky indikujú, že ani zvyšok 22 v ľahkom reťazci ani zvyšky 23 alebo 78 v ťažkom reťazci sa nevyžadujú, aby 39D10 bol špecifický pre optimálne viazanie. Kombinácia s menej 39D10 špecifickými zvyškami je preto CTIL-5-10gH/-gL6.

Aktivita anti-IL-5 protilátok v kompetičných esejách

Rekombinantný ľudský IL-5 bol riedený na 1 pg/ml vo fosfátom pufrovanom salinickom roztoku (PBS) a 100 pl podiely boli pridané na mikrotitračné platne (Costar Amine Binding plates) a inkubované cez noc pri 4°C. Platne boli premyté trikrát s PBS, obsahujúcim 0,5 % Tweenu 20 a akékoľvek zvyšné aktívne miesta blokované s 2 % hovädzieho sérového albumínu (BSA) v PBS počas 30 minút. Platne boli potom odsaté a vyklepané do sucha. Kvôli porovnaniu relatívnej väzobnej aktivity rodičovskej krysej protilátky (39D10) s chimérnou a očkovanou protilátkou boli pripravené postupné riedenia každej anti-IL-5 protilátky v PBS/1 % BSA a 50 pl bolo pridaných k duplicitným jamkám a ihneď nasledované 50 pl 39D10-biotín konjugátu pri 0,125 pg/ml. Esej bola inkubovaná 2 hodiny pri teplote miestnosti za miešania a potom dvakrát premytá PBS. Do všetkých jamôk bola pridaná chrenová peroxidáza konjugovaná k streptavidínu (1 pg/ml) a inkubovaná ďalších 30 minút. Platne boli štyrikrát premyté a bolo pridaných

100 μΙ tetrametylbenzidínového (ΤΜΒ) substrátu. Vývoj farby bol odpočítaný pri 630 nm (referenčných 490 nm) a OD (630 - 490) bola vynesená proti log (10) koncentrácie protilátky.

Pri porovnaní aktivít krysieho 39D10, chimérneho 39D10 a CTIL-510gH/gL6 vo vyššie uvedenej kompetičnej eseji, boli získané výsledky uvedené na obr. 11. Všetky tri protilátky súťažia rovnako dobre s biotinylatovaným-39D1 kvôli naviazaniu k IL-5, čo indikuje, že CDR slučky 39D10 boli úspešne transferované do ľudských rámčekov.

Vplyv anti-IL-5 protilátky na opičiu eozinofíliu

Anti-IL-5 protilátka (CTIL-5-10gH/gL6) bola testovaná v opičom systéme, ktorý modeluje astmatické podmienky (pozri Mauser P. J. a spol., Ann. Rev. Respir. Dis., v tlači). Pri podaní, jednu hodinu pred podnetom s Ascaris, responzívnym opiciam, inhibuje CTIL-5-10gH/gL6 pľúcny výplach eozinofílie zo 75 % v dávke 0,3 mg/kg i.v. Táto sada opíc nie je hyperresponzívna k histamínu, takže účinky CTIL-5-10gH/gL6 na hyperresponzivitu nemohli byť stanovené. Tri mesiace po tejto jedinej dávke je akumulácia eozinofilu v odpovedi na podnet s Ascaris ešte inhibovaná zo 75 %.

U alergickej myši CTIL-5-10gH/gL6 inhibuje pľúcnu eozinofíliu pri 1 mg/kg i.p.

Zoznam sekvencií (1) Všeobecná informácia:

(1) Prihlasovateľ:

(A) Meno: CELLTECH LIMITED (B) Ulica: 216 ΒΑΤΗ ROAD (C) Mesto: SLOUGH (D) Štát: BERKSHIRE (E) Krajina: Veľká Británia (F) Poštový kód (ZIP): SLI 4EN (G) Telefón: 0753 534655 (H) Telefax: 0753 536632 (I) Telex: 848473 (ii) Názov vynálezu: lnterleukín-5 špecifické rekombinantné protilátky (iii) Počet sekvencií: 28 (iv) Počítačovo čítacia forma:

(A) Typ média: Floppy disk (B) počítač: IBM PC kompatibilný (C) Pracovný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (2) Informácia o SEQ ID NO. 1:

(1) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 48 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 1:

GCGCGCAAGC TTGCCGCCAC CATGAAGATT GTGGTTAAAC TGGGTTTT 4 (2) Informácia o SEQ ID NO. 2:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 41 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 2:

GCAGATGGGC CCTTCGTTGA GGCTGACAGG AGACGTAGTG A 41 (2) Informácia o SEQ ID NO. 3:

(1) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 44 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 3:

GGACTGTTCG AAGCCGCCAC CATGAGTGTG CTCACTCAGG TCCT 44 (2) Informácia o SEQ ID NO. 4:

(1) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 30 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 4:

GGATACAGTT GGTGCAGCAT CCGTAGGTTT 30 (2) Informácia o SEQ ID NO. 5:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 333 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Rysy:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Lokácia: 1..333 (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 5:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: S:

GAA Glu 1

TCT GGA

GGA Gly

GGC Gly S

TTG Leu

GTA CAG CCA

TCA Ser 10

CAG ACC

CTG Leu

TCT Ser

CTC Leu 15

ACC Thr

48

Ser

Gly

Val

Gin

Pro

Gin

Thr

TGC

ACT

GTC

TCT

GGG

TTA

TCA

TTA

ACC

AGC

AAT

AGT

GTG

AAC

TGG

ATT

96

Cys

Thr

Val

Ser

Gly

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Asn

Ser

Val

Asn

Trp

íle

20

25

30

CCG

CAG

CCT

CCA

GGA ’AAG

GGT

CTG

GAG

TGG

ATG

GGA

CTA

ATA

TGG

AGT

144

Arg

Gin

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Leu

íle

Trp

Ser

35

40

45

AAT

GGA

GAC

ACA

GAT

TAT

AAT

TCA

GCT

ATC

AAA

TCC

CGA

CTG

AGC

ATC

I⁹?

Asn

Gly

Asp

Thr

Asp

Tyr

Asn

Ser

Ala

íle

Lys

Ser

Arg

Leu

Ser

íle

50

55

60

AGT

AGG

GAC

ACC

TCG

AAG

AGC

CAG

GTT

TTC

TTA

AAG

ATG

AAC

AGT

CTG

240

Ser

Arg

Asp

Thr

Ser

Lys

Ser

Gin

Val

Phe

Leu

Lys

Met

Asn

Ser

Leu

65

70

75

80

CAA

AGT

GAA

GAC

ACA

GCC

ATG

TAC

TTC

TGT

GCC

AGA

GAG

TAC

GGC

288

Gin

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Phe

Cys

Ala

Arg

Glu

Tyr

Gly

85

90

95

TAC

TTT

GAT

TAC

TGG

GGC

CAA

GGA

GTC

ATG

GTC

ACA

GTC

TCC

TCA

333

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Val

Met

Val

Thr

Val

Ser

100

105

110

(2) Informácia o SEQ ID NO. 6:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 111 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 6:

Glu 1

Ser

Gly

Gly 5

Leu

Val

Gin

Pro

Ser 10

Gin

Thr

Leu

Ser

Leu 15

Thr

Cys

Thr

Val

Ser 20

Gly

Leu

Ser

Leu

Thr 25

Ser

Asn

Ser

Val

Asn 30

Trp

íle

Arg

Gin

Pro 35

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 40

Glu

Trp

Met

Gly

Leu 45

íle

Trp

Ser

Asn

Gly 50

Asp

Thr

Asp

Tyr

Asn 55

Ser

Ala

íle

Lys

Ser 60

Arg

Leu

Ser

íle

Ser 65

Arg

Asp

Thr

Ser

Lys 70

Ser

Gin

Val

Phe

Leu 75

Lys

Met

Asn

Ser

Leu 80

Gin

Ser

Glu

Asp

Thr 85

Ala

Met

Tyr

Phe

Cys 90

Ala

Arg

Glu

Tyr

Tyr 95

Gly

Tyr

Phe

Asp

Tyr 100

Trp

Gly

Gin

Gly

Val 105

Met

Val

Thr

Val

Ser 110

Ser

(2) Informácia o SEQ ID NO. 7:

Vi U (i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 384 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Rysy:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Lokácia: 1..384 (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 7:

ATG GCT

CTG Val

CCC Pro

ACT CAG

CTC Leu

CTG Leu

GGG Gly

TTG TTG TTG CTG TGG ATT

ACA Thr

48

Met 1

Ala

Thr 5

Gin

Leu 10

Leu

Trp

íle 15

GAT

GCC

ATA

TGT

GAC

ATC

CAG

ATG

ACA

CAG

TCT

CCA

GCT

TCC

CTC

TCT

96

Asp

Ala

íle

Cys

Asp

íle

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ser

20

25

30

GCA

TCT

CTG

GGA

GAA

ACT

ATC

TCC

ATC

GAA

TGT

CTA

GCA

AGT

GAG

GGC

144

Ala

Ser

Leu

Gly

Glu

Thr

íle

Ser

íle

Glu

Cys

Leu

Ala

Ser

Glu

Gly

35

40

45

ATT

TCC

AGT

TAT

TTA

GCG

TGG

TAT

CAG

AAG

CCA

GGG

AAA

TCT

CCT

192

íle

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ser

Pro

50

55

60

CAG

CTC

CTG

ATC

TAT

GGT

GCA

AAT

AGC

TTG

CAA

ACT

GGG

GTC

CCA

TCA

240

Gin

Leu

íle

Tyr

Gly

Ala

Asn

Ser

Leu

Gin

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

65

70

75

80

CGG

TTC

AGT

GGC

AGT

GGA

TCT

GCC

ACA

CAA

TAT

TCT

CTC

AAG

ATC

AGC

288

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Ala

Thr

Gin

Tyr

Ser

Leu

Lys

íle

Ser

85

90

95

AGC

ATG

CAA

CCT

GAA

GAT

GAA

GGG

GAT

TAT

TTC

TCT

CAA

CAG

AGT

TAC

336

Ser

Met

Gin

Pro

Glu

Asp

Glu

Gly

Asp

Tyr

Phe

Cys

Gin

Ser

Tyr

100

105

110

AAG

TTT

CCG

AAC

ACG

TTT

GGA

GCT

GGG

ACC

AAG

CTG

GAA

CTG

AAA

CGG

384

Lys

Phe

Pro

Asn

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Leu

Lys

Arg

115

120

125

(2) Informácia o SEQ ID NO. 8:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 128 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 8:

Met 1

Ala

Val

Pro Thr S

Gin Leu Leu Gly

Leu 10

Leu

Trp

íle 15

Thr

Asp

Ala

íle

Cys

Asp

íle

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ser

20

25

30

Ala

Ser

Leu

Gly

Glu

Thr

íle

Ser

Tie

Glu

Cys

Leu

Ala

Ser

Glu

Gly

35

40

45

íle

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ser

Pro

50

55

60

Gin

Leu

íle

Tyr

Gly

Ala

Asn

Ser

Leu

Gin

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

65

70

75

80

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Ala

Thr

Gin

Tyr

Ser

Leu

Lys

íle

Ser

85

90

95

Ser

Met

Gin

Pro

Glu

Asp

Glu

Gly

Asp

Tyr

Phe

Cys

Gin

Ser

Tyr

100

105

110

Lys

Phe

Pro

Asn

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Leu

Lys

Arg

115

120

125

(2) Informácia o SEQ ID NO. 9:

(1) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 23 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 9:

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr lle Thr Cys (2) Informácia o SEQ ID NO. 10:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 23 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 10:

Asp lle Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Thr lle Ser lle Glu Cys 20 (2) Informácia o SEQ ID NO. 11:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 15 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 11:

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lle Tyr 15 10 15 (2) Informácia o SEQ ID NO. 12:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 15 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 12:

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu lle Tyr 1 5 10 15 (2) Informácia o SEQ ID NO. 13:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 32 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 13:

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15

Leu Thr lle Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

25 30 (2) Informácia o SEQ ID NO. 14:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 32 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 14:

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gin Tyr Ser 1 5 10 15

Leu Lys lle Ser Ser Met Gin Pro Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Cys

25 30 (2) Informácia o SEQ ID NO. 15:

(1) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 11 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 15:

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lle Lys Arg 1 5 10 (2) Informácia o SEQ ID NO. 16:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 11 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 16:

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 1 5 10 (2) Informácia o SEQ ID NO. 17:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 30 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 17:

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

25 30 (2) Informácia o SEQ ID NO. 18:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 25 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 18:

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr 15 10 15

Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr

25 (2) Informácia o SEQ ID NO. 19:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 14 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 19:

Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 (2) Informácia o SEQ ID NO. 20:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 14 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 20:

Trp lle Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 (2) Informácia o SEQ ID NO. 21:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 32 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 21:

Arg Phe Thr lle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 15 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

25 30 (2) Informácia o SEQ ID NO. 22:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 32 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 22:

Arg Leu Ser lle Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gin Val Phe Leu Lys 15 10 15

Met Asn Ser Leu Gin Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala Arg

25 30 (2) Informácia o SEQ ID NO. 23:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 11 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 23:

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 (2) Informácia o SEQ ID NO. 24:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 11 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 24:

Trp Gly Gin Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 (2) Informácia o SEQ ID NO. 25:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 399 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Rysy:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Lokácia: 1..399 (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 25:

TTC

GAA

GCC

ACC

ATG

TCT

GTC

CCC

ACC

CAA

GTC

CTC

GGT

CTC

CTG

Phe 1

Glu

Ala

Thr S

Het

Ser

Val

Pro

Thr 10

Gin

Val

Leu

Gly

Leu 15

Leu

CTG

TGG

CTT

ACA

GAT

GCC

AGA

TGT

GAC

ATT

CAA

ATG

ACC

CAG

AGC

Leu

Trp

Leu 20

Thr

Asp

Ala

Arg

Cys 25

Asp

íle

Gin

Met

Thr 30

Gin

Ser

CCA

TCC

AGC

CTG

AGC

GCA

TCT

GTA

GGA

GAC

CGG

GTC

ACC

ATC

ACA

TGT

Pro

Ser

Ser 35

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 40

Gly

Asp

Arg

Val

Thr 45

íle

Thr

Cys

CTA

GCA

AGT

GAG

GGC

ATC

TCC

AGT

TAC

TTA

CCG

TGG

TAC

CAG

AAG

Leu

Ala 50

Ser

Glu

Gly

íle

Ser 55

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp 60

Tyr

Gin

Lys

CCC

GGG

AAA

GCT

CCT

AAG

CTC

CTG

ATC

TAT

GGT

GCG

AAT

AGC

TTG

CAG

Pro 65

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys 70

Leu

íle

Tyr

Gly 75

Ala

Asn

Ser

Leu

Gin 80

ACT

GGA

GTA

CCA

TCA

AGA

TTC

AGT

GGC

TCA

GGA

TCC

GCT

ACA

CAC

TAC

Thr

Gly

Val

Pro

Ser 85

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 90

Gly

Ser

Ala

Thr

Asp 95

Tyr

ACG

CTC

ACG

ATC

TCC

AGC

CTA

CAG

CCT

GAA

GAT

TTC

GCA

ACG

TAT

TAC

Thr

Leu

Thr

íle 100

Ser

Leu

Gin

Pro 105

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr 110

Tyr

TGT

CAA

CAG

TCG

TAT

AAG

TTC

CCG

AAC

ACA

TTC

GGT

CAA

GGC

ACC

AAG

Cys

Gin

Ser

Tyr

Lys

Phe

Pro

Asn

Thr

Phe

Gly

Gin

ciy

Thr

Lys

115 120 125

GTC GAA GTC AAA CGT Val Glu Val Lys Arg

130

144

192

240

288

336

384

399 (2) Informácia o SEQ ID NO. 26:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 133 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 26:

3Í

Phe Glu Ala Ala Thr Met

Ser

Val

Pro

Thr 10

Gin

Val

Leu Gly Leu 15

Leu

1

S

Leu

Trp

Leu

Thr

Asp

Ala

Arg

Cys

Asp

íle

Gin

Het

Thr ¹

Gin

Ser

20

25

30

Pro

Ser

Leu

Ser

>la

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

íle

Thr

Cys

3S

40

45

Leu

Ala

Ser

Glu

Gly

íle

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Lys

50

55

60

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

íle

Tyr

Gly

Ala

Asn

Ser

Leu

Gin

65

70

75

80

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Ala

Thr

Asp

Tyr

85

90

95

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

100

105

110

Cys

Gin

Ser

Tyr

Lys

Phe

Pro

Asn

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

115

120

125

Val

Glu

Val

Lys

Arg

130 (2) Informácia o SEQ ID NO. 27:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 420 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Rysy:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Lokácia: 1 ..420 (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 27:

AAG Lys 1

CTT Leu

GCC GCC

ACC ATG GGC

TGG Trp

AGC Ser

TGT Cys 10

ATC íle

CTC Leu

TTC Phe

TTA Leu 15

GTA Val

48

Ala

Thr 5

Met

Gly

CCA

ACA

GCT

ACA

GGT

GTC

CAC

TCC

GAG

GTC

CAA

CTG

GTA

GAA

TCT

GGA

96

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

Val

His

Ser

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

20

25

30

GGT

CTC

GTA

CAG

CCA

GGA

TCT

CTG

CGA

CTG

AGT

TCC

GCC

GTC

144

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

35

40

45

TCT

GGG

TTA

TCA

TTA

ACT

AGT

AAT

AGT

CTG

AAC

TGG

ATA

CGG

CAA

GCA

192

Ser

Gly

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Asn

Ser

Val

Asn

Trp

íle

Arg

Gin

Ala

50

55

60

CCT

GGC

AAG

GGT

CTC

GAG

TGG

GTT

GGA

CTA

ATA

TGG

ACT

AAT

GGA

GAC

240

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Gly

Leu

íle

Trp

Ser

Asn

Gly

Asp

65

70

75

80

ACA

GAT

TAT

AAT

TCA

GCT

ATC

AAA

TCT

CGA

TTC

ACA

ATC

TCT

AGA

GAC

288

Thr

Asp

Tyr

Asn

Ser

Ala

íle

Lys

Ser

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

85

90

95

ACT

TCG

AAG

AGC

ACC

GTA

TAC

CTG

CAG

ATG

AAC

AGT

CTG

ACA

GCT

GAA

336

Thr

Ser

Lys

Ser

Thr

Val

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

100

105

110

GAT

ACT

GCA

GTC

TAC

TGT

GCT

CGT

GAG

TAC

TAT

GGA

TAT

TTC

GAC

384

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

Ala

Arg

Glu

Tyr

Gly

Phe

Asp

115

120

125

TAT

TGG

GGT

CAA

GGT

ACC

CTA

CTC

ACA

GTC

TCC

TCA

420

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr_;

Val

Ser

130

13S

140

(2) Informácia o SEQ ID NO. 28:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 140 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO. 28:

Lys 1

Leu Ala Ala Thr Het Gly Trp Ser 5

Cys 10

íle

Leu

Phe

Leu 1S

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

Val

His

Ser

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

20

25

30

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

35

40

45

Ser

Gly

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Asn

Ser

Val

Asn

Trp

íle

Arg

Gin

Ala

50

5S

60

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

Gly

Leu

íle

Trp

Ser

Asn

Gly

Asp

65

70

75

80

Thr

Asp

Tyr

Asn

Ser

Ala

íle

Lys

Ser

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

85

90

95

Thr

Ser

Lys

Ser

Thr

Val

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

100

105

110

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

Ala

Arg

Glu

Tyr

Gly

Tyr

Phe

Asp

115

120

125

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

130

135

140

“W /G00-9C

Claims

1. RAM, majúca afinitu pre ľudský IL-5 antigén a obsahujúca antigén väzobné regióny získané z variabilných domén ťažkého a/alebo ľahkého reťazca donor protilátky, majúcej afinitu pre ľudský IL-5, RAM, majúca väzobnú afinitu podobnú afinite donor protilátky.

2. Anti-IL-5 protilátková molekula podľa nároku 1, obsahujúca kompozitný ťažký reťazec a komplementárny ľahký reťazec, kde uvedený kompozitný ťažký reťazec, majúci variabilnú doménu, obsahujúcu prevažne zvyšky rámčeka akceptora protilátky ťažkého reťazca a antigén-viažuce zvyšky protilátky donor ťažkého reťazca, kde uvedená donor protilátka má afinitu pre ľudský IL-5, pričom uvedený kompozitný ťažký reťazec obsahuje donor zvyšky aspoň v polohách 31 až 35, 50 až 65 a 95 až 102 (podľa Kabatovho číslovacieho systému).

3. Protilátková molekula podľa nároku 2, kde aminokyselinové zvyšky 24, 27 až 30, 37, 49, 73, 76 a 78 v uvedenom kompozitnom ťažkom reťazci sú naviac donor zvyšky.

4. Protilátková molekula podľa nároku 2, kde aminokyselinové zvyšky 23, 24, 27 až 30, 37, 49, 73 a 76 až 78 v uvedenom kompozitnom ťažkom reťazci sú naviac donor zvyšky.

5. Anti-IL-5 protilátková molekula podľa nároku 1, obsahujúca kompozitný ľahký reťazec a komplementárny ťažký reťazec, kde uvedený kompozitný ľahký reťazec má variabilnú doménu, obsahujúcu prevažne zvyšky rámčeka ľahkého reťazca protilátky a antigén-viažuce zvyšky ľahkého reťazca donor protilátky, kde uvedená donor protilátka má afinitu pre ľudský IL-5, pričom uvedený kompozitný ľahký reťazec obsahuje donor zvyšky aspoň v polohách 24 až 34, 50 až 56 a 89 až 97 (podľa Kabatovho číslovacieho systému) a kde uvedená anti-IL-5 protilátková molekula má väzobnú afinitu podobnú afinite donor protilátky.

6. Protilátková molekula podľa nároku 5, kde aminokyselinové zvyšky 68 a 71 v uvedenom kompozitnom ľahkom reťazci sú naviac donor zvyšky.

7. Protilátková molekula podľa nároku 5, kde aminokyselinové zvyšky 22, 68 a 71 v uvedenom kompozitnom ľahkom reťazci sú naviac donor zvyšky.

8. Anti-IL-5 protilátková molekula majúca afinitu pre ľudský IL-5, obsahujúca kompozitný ťažký reťazec podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 7.

9. Protilátková molekula podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 8, obsahujúca prevažne ľudské akceptorové zvyšky a ne-ľudské donor zvyšky.

10. Protilátková molekula podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 9, kde akceptorové zvyšky pre kompozitné ťažké a ľahké reťazce sú zvyšky ťažkého reťazca ľudskej skupiny III a ľahkého reťazca ľudskej skupiny I a donor zvyšky pre kompozitné ťažké a ľahké reťazce sú zvyšky krysieho 39D10 ťažkého a ľahkého reťazca.

11. DNA sekvencia, ktorá kóduje kompozitný ťažký reťazec alebo kompozitný ľahký reťazec protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 10.

12. Klonovací alebo expresný vektor, obsahujúci DNA sekvenciu podľa nároku 11.

13. Hostiteľská bunka transformovaná DNA sekvenciou podľa nároku

11.

14. Spôsob produkcie anti-IL-5 protilátky, zahrňujúcej expresiu aspoň jednej DNA sekvencie podľa nároku 11 v transformovanej hostiteľskej bunke.

15. Spôsob produkcie anti-IL-5 protilátkovej molekuly, zahrňujúci:

(a) produkciu operónu v expresnom vektore, majúceho DNA sekvenciu, ktorá kóduje kompozitný ťažký reťazec podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 4, (b) prípadne produkciu operónu v expresnom vektore, majúceho DNA sekvenciu, ktorá kóduje komplementárny ľahký reťazec, ktorým môže byť kompozitný ľahký reťazec podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 7, (c) transfekciu hostiteľskej bunky s vektorom alebo každým vektorom a (d) kultiváciu transfektovanej bunečnej línie pre produkciu protilátkového produktu.

16. Spôsob produkcie anti-IL-5 protilátkovej molekuly podľa nároku 15, kde DNA sekvencia kóduje kompozitný ľahký reťazec a komplementárny ťažký reťazec.

17. Terapeutická alebo diagnostická kompozícia, obsahujúca protilátkovú molekulu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10 v kombinácii s farmaceutický prijateľným nosičom, riedidlom alebo prísadou.

18. Spôsob terapie alebo diagnózy, zahrňujúci podanie účinného množstva protilátkovej molekuly podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10 ľudskému alebo zvieraciemu subjektu.