SK154796A3

SK154796A3 - Use of rapamycin for the inhibition of neuronal cells necrosis

Info

Publication number: SK154796A3
Application number: SK1547-96A
Authority: SK
Inventors: Stephen Shi-Hsun Lin; Katherine Lu Molnar-Kimber
Original assignee: American Home Prod
Priority date: 1995-12-07
Filing date: 1996-12-04
Publication date: 1997-09-10
Also published as: EP0778023B1; DE69626610T2; ZA9610245B; HUP9603370A3; CA2192298A1; SI0778023T1; IL119778A; ES2188730T3; HUP9603370A2; DK0778023T3; AU7417896A; NO309966B1; PT778023E; EP0778023A1; CN1159915A; NO965238L; KR970032856A; JPH09183727A; ATE234095T1; NO965238D0

Description

Toxicita indukovaná glutamátom sa považuje za mechanizmus usmrtenia neuronálnych buniek pri ischémii, mŕtvici a poranení hlavy. (Šimon RP, Science, 226:850 (1984); Benveniste H, J. Neurochem 43:1369(1984). Podieľa sa aj na ďalších neurologických ochoreniach, ako sú napríklad Alzheimerova choroba, ALS, epilepsia, Huntingtonova choroba a parkinzonizmus (Beal, F., Náture, 321:168 (1986); Maragos VF., Trends Neurosci., 10:65 (1987); Greenamyre, JT., Neurobiol.

Aging, 10:593 (1989); Koh, JY., Brain Res., 533:315 (1990); Mattson, MP. , J. Neurosci., 12:376 (1992);Rothstein, JD.,

New England J. Med., 326:1464 (1992); Choi, DV., New England J. Med., 326(22): 1493 až 1494 (1992). Za normálnych podmienok pôsobí glutamát na mozog ako excitačný neurotransmiter. Uvoľňuje sa z presynaptických zakončení a aktivuje receptory na postsynaptických neurónoch. Aktivované receptory umožňujú iónom sodíka a vápnika prejsť do bunky, aby došlo k excitačnej odpovedi. Účinok týchto excitačných aminokyselín je sprostredkovaný niekoľkými rozdielnymi subtypmi receptorov, z ktorých je najlepšie preskúmaný N-metyl-D-aspartát (NMDA) receptor. Nadbytočná aktivácia NMDA receptorového komplexu môže zapríčiňovať zvýšenú stimuláciu neurónov s patologickými dôsledkami. Za patologických podmienok sa zvýšené hladiny glutamátu akumulujú v mimobunkovom priestore, čo vedie k zvýšenej stimulácii glutamátových receptorov. Toto navodzuje vyšší prívod sodíka a vápnika, čo vyúsťuje do vysokých hladín intracelulárneho vápnika, čo iniciuje dosiaľ neznáme procesy usmrcovania buniek.

V súčasnosti sú vyvíjajú antagonisty glutamátových receptorov, aby sa zabránilo usmrteniu neurónových buniek následkom mŕtvice alebo poranenia (Hirose, K., Neurochem. Res., 18:479 (1993); Dugan, LL. , Annals of Neurology, Vol. 35 Supí. S17 až 19 (1994). Množstvo štúdii demonštrovalo, že blokáda receptoru NMDA podtriedy významne znižuje poškodenie neurónov a ich stratu, ktoré sa objavujú v modeloch na zvieratách, ktoré simulujú rôzne neuropatologické situácie. Tieto sledovania výrazne naznačujú, že antagonisty NMDA poskytujú ochranu neurónov v niekoľkých klinických situáciách. Napriek tomu je množstvo takýchto liečiv účinné, iba ak sa podajú do 6 hodín po objavení sa chorobného stavu alebo po poranení. Toto by mohlo byť spôsobené skutočnosťou, že hladiny intracelulárneho kalcia môžu byť zvýšené aj vďaka vápniku, ktorý vstupuje do bunky cez brány napätia kanálikov vápnika. Ďalej, keďže sa pre normálny synaptický prenos a aktivitu mozgu požaduje aktivácia glutamátových receptorov, prolongovaná liečba blokátormi glutamátových receptorov nie je vhodná. Toto ohraničuje ich použitie ako neuroprotektívnych látok pri chronických neurodegeneratívnych poruchách. Preto sú liečivá, ktoré môžu zabraňovať usmrteniu neurónových buniek po zvýšení intracelulárneho vápnika, vhodné tak na oneskorenú liečbu mŕtvice a poranení hlavy, ako aj pre dlhotrvajúcu liečbu neurodegeneratívnych ochorení .

Na objasnenie, ako vedú vysoké hladiny intracelulárneho vápnika k usmrteniu buniek bolo navrhnutých niekoľko hypotéz. Jednou z nich je, že tento aktivuje kalcium-dependentné proteázy, ako je kalpaín. Druhou je, že tento aktivuje kalcineurín, kalcium/kalmodulín dependentnú fosfatázu, ktorá defosforyluje syntázu oxidu dusíka (NOS). Defosforylácia NOS umožňuje produkciu kysličníka dusíka, ktorý je pre bunky toxický. Treťou hypotézou je, že vysoké hladiny intracelulárneho vápnika indukujú apoptózu, alebo naprogramovanú smrť buniek. Tieto rôzne hypotézy sa vzájomne nevylučujú a je pravdepodobné, že na všetkých týchto stupňoch, ako aj na ďalších, ktoré sú doposiaľ neobjavené, dochádza k aktivizácii vysokými hladinami intracelulárneho vápnika, aby došlo k usmrteniu buniek.

V apoptóze sú niektoré gény, ktoré sú potrebné pre delenie buniek, aktivované, ako by sa bunka pokúšala deliť. (Heintz, N., Trends-Biochem-Sci., 18:157 (1993). Množstvo vysoko diferencovaných buniek, ako sú neuróny, stráca schopnosť delenia, a keďže sa im to nedarí, umierajú. Preto j é možné, že liečivá, ktoré môžu zabraňovať deleniu buniek, môžu tiež chrániť pred apoptózou.

Podstata vynálezu

Predkladný vynález poskytuje spôsob použitia zlúčeniny vybranej zo skupiny rapamycínu, 1,3-Diels Adlerovho aduktu rapamycínu s fenyltriazolíndiónom, 42-esteru rapamycínu so

4-[4-(dimetylamino)-fenyl]-azo]-benzénsuliónovou kyselinou,

1,3-Diels Adlerovho aduktu rapamycínu s metyltriazolíndiónom a 0-benzyl-27-oxímu rapamycínu (spoločne nazvaných, ako zlúčeniny podľa vynálezu) ako neuroprotektívneho činidla, ktoré zahrnuje perorálne, parenterálne, intravaskulárne, intranazálne, intrabronchiálne, transdermálne alebo rektálne podávanie zlúčeniny cicavcovi v prípade indikácie. Podrobnejšie, tento vynález poskytuje spôsob liečby mŕtvice, poranenia hlavy a neurodegeneratívnych porúch, ako sú Alzheimerova choroba, amyotrofická laterálna skleróza (ALS), epilepsia, Huntingtonova choroba a parkinsonizmus cicavcovi v indikovanom prípade, pričom toto použitie zahrnuje podávanie účinného množstva zlúčeniny vybranej zo skupiny rapamycínu,

1,3-Diels Adlerovho aduktu rapamycínu s fenyltriazolíndiónom , 42-esteru rapamycínu so 4-[4-(dimetylamino)fenyl]azo]benzénsulfónovou kyselinou, 1,3-Diels Adlerovho aduktu rapamycínu s metyltriazolíndiónom a 0-benzyl-27-oxímu rapamycínu perorálne, parenterálne, intravaskulárne, intranazálne, intrabronchiálne, transdermálne alebo rektálne. Zlúčeníny podľa vynálezu sú tiež vhodné pri inhibícii smrti nervových buniek v súvislosti s vyššie spomenutými chorobnými stavmi.

Tento vynález poskytuje aj spôsob použitia zlúčeniny vybranej zo skupiny rapamycínu, 1,3-Diels Adlerovho aduktu rapamycínu s fenyltriazolíndiónom, 42-esteru rapamycínu so 4 - [4-(dimetylamino)fenyl]azo]benzénsulfónovou kyselinou,

1.3- Diels Adlerovho aduktu rapamycínu s metyltriazolíndiónom a 0-benzyl-27-oxímu rapamycínu v kombinácii s NMDA a/alebo AMPA antagonistom, ako neuroprotektívneho činidla pri liečby mŕtvice, poranenia hlavy a neurodegeneratívnych porúch, ako sú Alzheimerova choroba, amyotrofická laterálne skleróza (ALS), epilepsia, Huntingtonova choroba a parkinsonizmus. Zlúčeniny podľa tohto vynálezu sú tiež vhodné pri inhibícii smrti neuronálnych buniek súvisiacej s vyššie uvedenými chorobnými stavmi, pri ich použití spolu s NMDA a/alebo AMPA antagonistom.

Ak sa zlúčeniny podľa tohto vynálezu použijú v kombinácii s NMDA a/alebo AMPA antagonistom, kombináciu možno podávať súčasne alebo postupne, bez ohľadu na poradie podávania.

Výhodnými antagonistami NMDA sú kyselina [2-(8,9-dioxo2,6-diazabicyklo[5,2,0]non-1(7)-en-2-y1)etyl]fosfónová (objavená v US patente 5 168 103, ktorý je tu citovaný), kyselina D-amino-5-fosfónpentanoát (D-AP5), 4-fosfónmetyl-2-piperidínkarboxylová (CGS19755), kyselina D, L-(E)-2-amino-4metylfosfón-3-pentánová (CGP37849), 5,7-dichlórkynurenát, trans-2-karboxy-5,7-dichlór-4-fenylamino-l,2,3,4-tetrahydrochinolín (L689560) a 5,7-dinitrochinolín-2,3-dión (MNQX); a výhodné AMPA antagonisty zahrnujú hydrochlorid 6-(lH-imidazol-l-yl)-7-nitro-2,3(1H,4H)-chinolíndionu (YM90K) (J.Med. Chem., 37:647 (1994), hydrochlorid 1-(4-amino-fenyl)-4-metyl-7,8-metyléndioxy-5H-2,3-benzodiazepínu (GYK152466) a 6nitro-7-sulfamobenzo(f)chinoxalín-2,3-dión (NBQX), 6-kyano7-nitrochinoxalín-2,3-dión (CNQX) a 6,7-dinitrochinoxalín2.3- dión (DNQX).

Liečba predstavuje liečenie existujúceho stavu, inhibíciu jeho progredovania alebo rozvinutia, zlepšenie stavu a poskytnutie paliatívnej terapie.

Schopnosť zlúčenín podľa tohto vynálezu účinkovať ako neuroprotektívne činidlá bola demonštrovaná v nasledovných štandardných farmakologických testoch in vitro, ktoré emulujú neurotoxicitu u cicavcov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Prvým štandardným farmakologickým testom sa demonštrovala schopnosť zlúčenín podľa vynálezu inhibovať smrť neurónových buniek vyplývajúcu z toxicity indukovanej glutamátom. Stručne, potkanie hipokampálne a kortikálne kultúry boli pripravené podľa metódy Furshpana a Potiera, s niektorými modifikáciami. [Neurón, 3:199 (1989)]. Mozgy boli odstránené novorodeným Long Evans mláďatám anestezovaným injekciou 0,1 ml 20% chlóralhydrátu. Hipokampy boli vyrezané a oddelené od zvyšku kortexu. Obe tkanivá boli enzymaticky vyluhované v 5 ml Earlovho balancovaného roztoku soli (EBSS) obsahujúceho 20 μ/ml papaínu, 1 mM L-cysteínu a 0,5 mM EDTA 30 minút pri 37 °C jemným pretrepávaním. Hippokampálne a kortikálne tkanivá sa potom raz premyli EBSS a vyluhovanie bolo zastavené inkubáciou 3-5 ml inhibičného roztoku s obsahom 1 mg/ml ovomukoidu a 1 mg/ml albumínu v EBSS pri 37 °C po dobu 30 minút.

Vyluhované hipokampy a kortikálne tkanivá boli dvakrát premyté DME bez L-glutamínu s 4,5 g/1 dextrózy predtým, než boli triturované v 2 ml DME suplementovaných 5% fetálneho telacieho séra, 5% potkanieho séra, 50 μ/ml penicilínu, 0,05 mg/ml streptomycínu a MITO+sérového extendra (suplement média z Collaborative Biomedical Products) (10% DME). Po 50 trituráciách sa nedisociované tkanivo nechalo sadnúť a odstránila sa disociovaná bunková suspenzia. 2 ml čerstvého 10% DME sa pridali k zostávajúcemu tkanivu a triturácia sa zopakovala. Dve rovnaké množstvá bunkovej suspenzie sa rozdelili a stanovila sa hustota buniek pomocou hemacytometra.

000 hipokampálnych buniek v 150 μΐ sa umiestnilo na platne, do 96 jamiek na jednej platni a inkubovali sa pri °C v 5% CO2· Kortikálne bunky boli umiestnené na platne s hustotou 500 000 buniek na jednu jamku v 24 jamkových platniach. Keď boli gliálne bunky splývajúce (približne po 3 dňoch), pridal sa 4 až 10 μΜ cytozín β-D-arabinifuranizid do každej jamky, aby sa zabránilo ďalšej proliferácii. Týždeň po nanesení na platne sa odstránilo médium a nahradilo sa DME suplementovaným 2,5% fetálnym teľacím sérom, 5% potkaním sérom, 50 μ/ml penicilínu, 0,05 mg/ml streptomycínu MITO+,1 mM kynurenátu a 10 mM MgC^ (5% DME + KM). Kynurenát je nešpecifickým blokátorom glutamátových receptorov a zvýšené hladiny magnézia blokujú prívod vápnika a sodíka cez NMDA receptorové kanáliky. Pridanie KM zabraňuje neurotoxicite, ktorá sa objavuje pri zistení glutamátu v sére a umožňuje neurónom, aby boli udržiavané v kultúre až niekoľko mesiacov. Bunky boli vyživované týždenne výmenou polovice média za čerstvý 5% DME + KM.

Hodnotená zlúčenina bola rozpustená v DMSO, aby sa pripravili 10 mM zásobné roztoky a boli uložené v alikvotných množstvách pri -80 C. Tesne pred uskutočnením každého postupu sa podiely rozmrazili a zriedili v DME alebo v Hanksovom vyrovnanom slanom roztoku (HBSS) s obsahom 44 mM bikarbonátu sodného, 10 mM glukózy a 30 μπι glutamátu, aby sa získali testované koncentrácie od 1 nM do 10 μΜ.

Po 4 až 12 týždňoch v kultúre boli hipokampálne bunky trikrát premyté a bola pridaná testovaná zlúčenina v HBSS, alebo DME bez séra (SF DME) a 30 až 150 μΜ glutamátu. Najmenej tri jamky v každom testovacom postupe boli opracované každou koncentráciou liečiva. 30 μΜ glutamátu usmrcuje 70 až 80% neurónov v mladších kultúrach a viac v starších kultúrach. Toxicita indukovaná 30 μΜ glutamátu bola blokovaná 1 mM kynurenátu + 10 mM MgC^ÍKM).

Po inkubácii cez noc pri 37 °C sa spočítal počet živých hipokampálnych neurónov, ktoré zostali v piatich poliach, ktoré predstavovali severnú, južnú, východnú a západnú stranu a stred každej jamky. Každé pole bolo prezerané pomocou objektívu s 10 násobným zväčšením s okulárom s 15 násobným zväčšením a plošne predstavovalo približne 1,54 mm². Postup

- 7 sa opakoval vo všeobecnosti trikrát. Stredný počet neurónov na jamku a štandardná odchýlka boli prepočítané na každý postup. Stredný počet neurónov, ktorý zostal v kontrolnom postupe s 30 μπι glutamátu označuje tie, ktoré neboli citlivé voči toxicite glutamátu.

Nasledovná tabuľka vyjadruje výsledky získané pre zlúče ninu v príklade I.
Zlúčenina	Koncentrácia Počet	živých	neurónov	S.D
Príklad 1	10 nM	114		5
Príklad 1	100 nM	92		38
Príklad 1	1 μΜ	46		10
Príklad 1	10 μΜ	47		20
SF DME		28		4
Kynurenát	1 mM	82		17
Nasledovná tabuľka vyjadruje	výsledky	testov zí	skan<
pre zlúčeniny	podľa tohto vynálezu.
Zlúčenina	Koncentrácia Počet	živých	neurónov	S.D
Príklad 1	200 nM	229		30
Príklad 1	20 nM	71		3
Príklad 1	2 nM	63		4
Príklad 2	200 nM	127		38
Príklad 2	20 nM	180		64
Príklad 2	2 nM	110		36
Príklad 3	200 nM	241		46
Príklad 3	20 nM	285		40
Príklad 3	2 nM	98		21
Príklad 4	200 nM	157		56
Príklad 4	20 nM	130		29
Príklad 4	2 nM	117		32
Príklad 5	200 nM	135		11
Príklad 5	20 nM	96		12
Príklad 5	2 nM	131		19
Kynurenát	1 mM	202		40
HBSS		53		25

Výsledky tohto štandardného farmaceutického testu ukazujú, že zlúčeniny podľa tohto vynálezu inhibujú neurotoxicitu indukovanú glutamátom a sú preto vhodné ako neuroprotektívne činidlá. Ako je zrejmé z prvej tabuľky, nižšie koncentrácie zlúčeniny z príkladu 1 (10 a 100 nM) sa ukázali lepšími ako vyššie koncentrácie zlúčeniny z príkladu 1 (1 a 10 μΜ), pravdepodobne kvôli niektorým cytotoxickým účinkom zlúčeniny z príkladu 1 pri týchto vyšších koncentráciách. Hodnotenie zlúčenín podľa vynálezu v rozmedziach koncentrácií medzi 2 a 200 nM demonštrovalo neuroprotektívnu aktivitu proti toxicite indukovanej glutamátom, čo emuluje neurotoxicitu u cicavcov. Pri vyšších koncentráciách glutamátu (75μΜ) zlúčeniny nezabraňujú smrti neurónových buniek. Zlúčeniny podľa tohto vynálezu boli menej účinné ako neuroprotektívne činidlá proti toxicite indukovanej glutamátom v starších hipokampálnych kultúrach (> 8 týždňov), ktoré sú na toxicitu glutamátu viac citlivé.

Druhý štandardný.farmakologický test in vitro demonštruje schopnosť zlúčenín podľa vynálezu zvyšovať neuroprotektívne účinky zistené u NMDA a AMPA inhibítorov. Stručne, kortikálne kultúry rástli 8 týždňov v 24 jamkových platniach, ako bolo uvedené vyššie. Kortikálne neuróny sa 6 x premyli DME bez glukózy, ktorá bola deoxygenovaná prebublávaním média 95% ^/5% CO2 najmenej 10 minút, aby sa indukoval ischemický stav, ktorý spôsobí smrť neurónových buniek, ktorá môže byť sledovaná meraním hladín laktátdehydrogenázy, keďže množstvo LDH aktivity v každej jamke je priamo úmerné počtu mŕtvych buniek. 100 μΜ kyseliny [2-(8,9-dioxo-2,6-diazabicyklo[5,2,0]non-1(7)-en-2-yl)etyl]fosfónovej (obj avenej v US patente 5 168 103, ktorý je tu citovaný) a 10 μΜ YM90K boli pridané do určitých jamiek, aby blokovali NMDA a AMPA glutamátové receptory. Na testovanie jamiek sa pridal 1 μΜ zlúčeniny z príkladu 1. Kontrolné jamky boli premyté normálnym DME s glukózou a 100 μΜ kyseliny [2-(8,9-dioxo-2,6diazabicyklof5,2,0]non-l(7)-en-2-yl)-etyl]-fosfónovej. 5 μΐ vzorky boli odobrané z každej jamky v rôznych časových bodoch za sledovania ischémie a LDH aktivita v týchto vzorkách bola stanovená pridaním 250 μΐ .2 mg NADH/25 ml fosfátového pufra do každej vzorky. Po inkubácii 20 až 30 minút sa pridalo 10 μΐ 22,7 mM pyruvátu a odčítala sa optická hustota (OH) pri 340 nm. Zmena optickej hustoty s časom (mOH/min) odráža množstvo LDH vo vzorke. Väčšie zmeny optickej hustoty znamenajú väčšiu LDH aktivitu, čo naznačuje zvýšenie usmrcovania buniek. Vzorky boli odobrané zo 4 až 8 jamiek v každom teste a stanovil sa priemer a štandardná odchýlka pre každú podmienku a časový bod. Získané výsledky vyjadruje nasledovná tabulka.

Aktivita LDH (+ S.D.)
Čas(h)	Kontrola	Ischémia	AMPA/NMDA	AMPA/NMDA/Príkl.l
0	0,31+0,41	0,27+0,05	0,69+0,70	0,67+0,29
0,5	0,51+0,14	0,57+0,29	0,45+0,25	0,80+0,28
1	0,40±0,07	0,56+0,16	0,46+0,23	0,90+0,37
1,5	0,43+0,15	0,84+0,44	θ,38+0,30	1,03+0,32
4	0,64+0,01	9,11±1,63	2,29±0,50	2,09±0,58
5	0,68±0,20	31,65+5,76	16,07±2,9	4,21+1,02
6	0,78±0,22	40,52+6,43	29,99+9,11	9,11+7,04
7	1,28±0,41	50,30+6,96	44,56+7,73	15,77+4,68
8	1,15+0,28	60,05±8,66	61,77±13,96	24,43+7,87

Zlúčeniny podľa vynálezu sa tiež hodnotili štandardným testom emulujúcim ischemickú neurotoxicitu, s výnimkou, že boli použité l-týždňové kortikálne bunkové kultúry, ktoré sú menej citlivé voči neurotoxicite sprostredkovanej ischémiou. Testované zlúčeniny boli použité spolu s NMDA a AMPA inhibitormi, ako je uvedené vyššie. Z dôvodov porovnania bol hodnotený aj cyklosporin.

- ib Čas (hod.)

Aktivita LDH

Stredná odchýlka

Kontrola

8	0,30	0,54
13	1,37	1,58
24	2,97	2,67
30	4,44	2,50
Ischémia
8	0,49	0,36
13	6,17	1,10
24	16,40	4,29
30	21,49	3,35
Príklad 1
8	1,04	0,20
13	3,08	0,71
24	9,00	1,64
30	14,02	2,4
Príklad 2
8	1,08	0,34
13	2,31	1,41
24	7,69	3,13
30	12,43	3,85
Príklad 3
8	0,84	0,20
13	2,36	1,41
24	7,03	3,24
30	11,25	2,62
Príklad 4
8	0,91	0,34
13	2,54	1,02
24	8,21	4,14
30	13,31	3,41
Príklad 5
8	0,74	0,38
13	1,65	0,81
24	4,82	1,42
30	8,83	2,41
Cyklosporín
8	1,54	0,63
13	3,31	1,37
24	8,45	1,94
30	13,59	2,34

Výsledky získané v tomto štandardnom farmaceutickom teste demonštrujú, že zlúčeniny podľa vynálezu zvyšujú neuropro11 tektívne účinky NMDA a AMPA inhibítorov pri inhibícii neurotoxicity indukovanej ischémiou.

Zlúčeniny podlá tohto vynálezu môžu byť v prípravkoch určených pre cicavcov v čistej forme alebo spolu s farmaceutickým nosičom. Farmaceutickým nosičom môže byť tuhá látka alebo tekutina. Zistilo sa, že pri perorálnych prípravkoch je akceptovateľné, aby obsahovali 0,01% Tween 80 vo PHOSPHAL PG-50 (koncentrát fosfolipidu s 1,2-propylénglykolom, A. Nattermann & Cie. GmbH).

Tuhý nosič môže zahrňovať jednu alebo viac látok, ktoré môžu tiež účinkovať ako ochucovadlá, lubrikanty, solubilizátory, suspendačné činidlá, plnivá, klzné látky, činidlá napomáhajúce kompresii, väzbové alebo dezintegrujúce činidlá pre tablety; môže to byť aj enkapsulačná látka. V práškoch je nosič jemne rozdrobenou tuhou látkou, ktorá je zmiešaná s jemne rozdrobenou aktívnou látkou. V tabletách je aktívna zložka zmiešaná s nosičom, ktorý má potrebné kompresívne vlastnosti vo vhodných pomeroch a je tabletovaná do požadovaného tvaru a veľkosti. Prášky a tablety prednostne obsahujú až do 99% aktívnej zložky. Vhodnými tuhými nosičmi sú napríklad fosforečnan vápenatý, stearát horečnatý, mastenec, cukry, laktóza, dextrín, škrob, želatína, celulóza, metylcelulóza, sodná soľ karboxymetylcelulózy, polyvinylpyrolidon, vosky s nízkou teplotou topenia a ionomejiičové živice.

Tekuté nosiče sa používajú pri príprave roztokov, suspenzií, emulzií, sirupov, tinktúr a tlakových prípravkov. Aktívna zložka môže byť rozpustená alebo suspendovaná vo farmaceutický akceptovateľnom tekutom nosiči, ako sú voda, organické rozpúšťadlo, ich zmes, alebo farmaceutický akceptovateľné oleje alebo tuky. Tekutý nosič môže obsahovať ďalšie vhodné farmaceutické pomocné látky, ako solubilizátory, emulziíikátory, pufre, konzervačné látky, sladidlá, ochucovadlá, suspendačné činidlá, zmäkčovadlá, farbivá, regulátory viskozity, stabilizátory alebo osmoregulátory. Medzi vhodné príklady kvapalných nosičov pre perorálne a perenterálne podávanie patrí voda (čiastočne s obsahom aditív uvedených vyššie, ako napríklad deriváty celulózy, výhodne roztok sodnej soli karboxymetylcelulózy), alkoholy (vrátane monohydrických alkoholov a polyhydrických alkoholov, t.j. glykolov) a ich deriváty, lecitíny a oleje (napríklad frakcionovaný kokosový olej a arachidonový olej). Pre parenterálne podávanie môže byť nosičom olejový ester, ako napríklad etyloleát a izopropylmyristát. Sterilné kvapalné nosiče sú vhodné v prípade tekutých foriem určených na parenterálne použitie. Tekutým nosičom pre prípravky v tlakových obaloch môže byť halogenovaný uhľovodík alebo iný farmaceutický akceptovateľný hnací plyn.

Tekuté farmaceutické prípravky, ktoré sú sterilnými roztokmi alebo suspenziami, môžu byť napríklad použité v intramuskulárnych, intraperitoneálnych alebo subkutánnych injekciách. Sterilné prípravky možno podávať aj intravenózne. Zlúčeniny podľa vynálezu možno perorálne podávať v tekutej aj tuhej forme.

Zlúčeniny podľa vynálezu možno podávať rekrálne vo forme bežných čapíkov. Pre podávanie prostredníctvom intranazálnej alebo intrabronchiálnej inhalácie alebo insuflácie možno rapamycín podľa vynálezu použiť vo forme vodných alebo čiastočne vodných roztokov, ktoré môžu byť potom použité vo forme aerosólu. Zlúčeniny úodľa vynálezu možno podávať aj transdermálne za použitia transdermálnej náplaste s obsahom aktívnej zlúčeniny a nosiča, ktorý je vzhľadom na aktívnu látku inertný a je netoxický pre kožu a umožňuje uvoľňovanie činidla na systémovú absorpciu do krvného riečišťa cez kožu. Nosičom môže byť množstvo foriem, ako sú krémy a masti, pasty, gély a okluzíva. Krémy a masti môžu byť viskóznymi tekutinami alebo polotuhými emulziami typu olej/voda alebo voda/olej. Vhodné sú aj pasty tvorené absorpčnými práškami dispergovanými vo vazelíne alebo hydrofilnej vazelíne s obsahom aktívnej zložky. Na uvolňovanie aktívnej látky do krvného riečišťa možno použiť množstvo okluzív, ako napríklad semipermeabilnú membránu predstavujúcu rezervoár s obsahom aktívnej zložky, s alebo bez nosiča alebo matricu s obsahom aktívnej zložky. Ďalšie okluzíva sú známe z literatúry.

Požiadavky na dávkovanie sú rôzne podľa zloženia prípravku, spôsobu podávania, vážností sprievodných symptómov a najmä podľa individuálne liečeného jedinca.

Na základe výsledkov získaných v štandardných farmakologických testoch by navrhované intravenózne denné dávky aktívnej zlúčeniny predstavovali 0,1 pg/kg až 100 pg/kg, výhodne 0,001 až 25 mg/kg a ešte výhodnejšie 0,01 až 5 mg/kg. Navrhované perorálne denné dávky predstavujú 0,005 až 50 mg/kg, výhodne 0,01 až 25 mg/kg a výhodnejšie 0,05 až 10 mg/kg. Liečbu je vo všeobecnosti potrebné začal menšími dávkami, ako je optimálna dávka zlúčeniny. Potom sa dávka zvyšuje, až kým sa za daných podmienok nedosiahne optimálny účinok; presnejšie dávky pre perorálne, parenterálne, nazálne alebo intrabronchiálne podávanie budú stanovené ošetrujúcim lekárom na základe individuálneho prístupu k pacientovi. Výhodne je farmaceutický prípravok v jednodávkovej forme, t.j. vo forme tablety alebo kapsuly. V takejto forme je prípravok rozdelený do jednodávkovej formy s obsahom primeraných množstiev aktívnej zložky; jednodávkové prípravky môžu byť balenými prípravkami, napríklad balenými práškami, liekovkami, ampulami, predplnenými injekciami alebo sáčkami s obsahom tekutín. Jednodávkovou formou môže byť napríklad samotná kapsula alebo tableta, alebo to môže byl ich primeraný počet vo forme balenia.

Nasledovné príklady ilustrujú prípravu zlúčenín podľa tohto vynálezu.

Príklad 1

Rapamycín

Príprava rapamycínu je opísaná v US patente 3 929 992, ktorý je tu citovaný. i

Príklad 2

1,3, Diels Adlerov adukt rapamycínu s fenyltriazolíndiónom

Rapamycín (0,66 g, 721 mmol) bol rozpustený v dichlórme14 táne (10 ml) a bol ochladený na . 0 °C. K tomu sa po kvapkách pridal roztok fenytriazolíndiónu (0,133 g, 758 mmol) v dichlormetáne (10 ml). Roztok sa miešal cez noc, pomocou TLC sa ukázalo, že reakcia nie je ukončená. Pridal sa ďalší fenyltriazolíndion (0,025 g, 27 mmol). Reakčný produkt sa purifikoval HPLC (4,1 x 31 cm, SÍO2 za použitia etylacetátu ako elučného činidla, aby sa získaala hlavná zlúčenina ako tuhá látka. Tuhá látka bola triturovaná 30 ml hexánu a 1 ml etylacetátu, bola sfiltrovaná a vysušená vzduchom, aby sa získala hlavná zlúčenina vo forme prášku (0,383 g).

Analytický prepočet pre

C, 65,05; H, 7,77; N, 5,14;

zistené: C, 65,39; H, 7,98; N, 4,92.

IR (KBr, cm¹) 3450, 1715

NMR (DMSO) δ 7,50 (m, 3H), 7,40 (m, 2H), 3,11 (s, 3H), 3,00 (s, 3H) 2,95 (s, 3H), 0,8 (q, 1H)

MS (-FAB) 1088 (M)

Príklad 3

42-ester rapamycínu s kyselinou 4-[4-(dimetylamino)fenyl]azo]benzénsulfónovou

Príprava zlúčeniny v príklade 3 je opísaná v US patente 5 179 203, ktorý je tu citovaný.

Príklad 4

1,3-Diels Adlerov adukt rapamycínu s metyltriazolíndiónom Hlavná zlúčenina bola pripravená podľa spôsobu uvedeného v príklade 2.

Príklad 5

0-benzyl-27-oxím rapamycínu

Príprava zlúčeniny v príklade 5 je opísaná v US patente 5 023 265, ktorý je tu citovaný.

Claims

1. Použitie zlúčeniny vybranej zo skupiny rapamycínu,

1,3-Diels Adlerovho aduktu rapamycínu s fenyltriazolíndiónom , 42-esteru rapamycínu s 4-[4-(dimetylamino)fenyl]azo]benzénsulfónovou kyselinou, 1,3-Diels Adlerovho aduktu rapamycínu s metyltriazolíndiónom a 0-benzyl-27-oxímu rapamycínu na výrobu liečiva na inhibíciu odumierania neurónových buniek u cicavca pri liečení mŕtvice, poranenia hlavy alebo neurodegeneratívnej poruchy.

2. Použitie podľa nároku 1, kde neurodegeneratívnym ochorením je ochorenie vybrané zo skupiny Alzheimerovej choroby, amyotrófnej laterálnej sklerózy (ALS), epilepsie, Huntingtonovej choroby a parkinsonizmu.

3. Použitie podľa nároku 1, kde zlúčeninou je rapamycín.

4. Použitie zlúčeniny vybratej zo skupiny rapamycínu,

1,3-Diels Adlerovho aduktu rapamycínu s fenyltriazolíndiónom, 42-esteru rapamycínu s 4-[4-(dimetylamino)fenyl]azo]benzénsulfónovou kyselinou, 1,3-Diels Adlerovho aduktu rapamycínu s metyltriazolíndiónom a 0-benzyl-27-oxímu rapamycínu ako neuroprotektívneho činidla, ktorý zahrňuje perorálne, parenterálne, intravaskulárne, intranazálne, intrabronchiálne , transdermálne alebo rektálne podávanie účinného množstva uvedenej zlúčeniny.

5. Použitie podľa nároku 1, ktoré ďalej zahrňuje kombináciu s NMDA alebo AMPA antagonistom.

6. Použitie podľa nároku 1, ktoré ďalej zahrňuje kombináciu s NMDA a AMPA antagonistami.

7. Použitie podlá nároku 4, ktoré ďalej zahrňuje kombináciu s NMDA alebo AMPA antagonistom.

8. Použitie podlá nároku 4, ktoré ďalej zahrňuje kombi náciu s NMDA a AMPA antagonistami.