NO309966B1 - Anvendelse av rapamycin og derivater derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en forbindelse valgt fra gruppen som består av rapamycin, rapamycin-1,3-Diels Alder-addukt med fenyltriazolindion, rapamycin-42-ester med 4-[[4-(dimetylamino)fenyl]azo]benzen-sulfonsyre, rapamycin-1,3-Diels Alder-addukt med metyltriazolindion og rapamycin-O-benzyl-27-oksim til fremstilling av et farmasøsytisk preparat for inhibering av nevroncelldød , for å behandle slag, hodetraumer eller en nevrodegenerativ sykdom, eller for anvendelse som et nevrobeskyttende middel i et pattedyr.

Hypotesen er at glutamatindusert toksisitet er mekanismen bak nevroncelledød ved ischemi, slag og hodeskade. [Simon RP, Science 226:850

(1984), Benveniste H, J. Neurochem. 43:1369 (1984)]. Det inngår også ved andre nevrologiske forstyrrelser så som Alzheimers, ALS, epilepsi, Huntingtons og Parkinsons sykdom. [Beal F, Nature 321:168 (1986), Maragos WF, Trends Neurosci. 10:65 (1987), Greenamyre JT, Neurobiol. Aging 10:593 (1989), Koh JY, Brain Res. 533:315 (1990), Mattson MP, J. Neurosci. 12:376 (1992), Rothstein, JD, New England J. Med. 326:1464 (1992), Choi, DW, New England J. Med. 326(22): 1493-4 (1992)]. Under normale betingelser virker glutamat som en eksiterende nevrotransmitter i hjernen. Det frigjøres fra persynaptiske nerveender og aktiverer reseptorer på postsynaptiske nevroner. De aktiverte reseptorene tillater natrium- og kalsiumioner å strømme inn i cellen for å gi en eksiterende respons. Virkningen av disse eksiterende aminosyrene medieres ved flere distinkte reseptor-subtyper, hvorav den mest studerte er N-metyl-D-aspartat-(NMDA) reseptoren. Overaktivering av NMDA-reseptorkomplekset kan forårsake nevron-overstimulering med patologiske konsekvenser. Ved patologiske betingelser akkumuleres for høye nivåer av glutamat i det ekstracellulære rom, og fører til en overstimulering av glutamatreseptorer. Dette induserer større innstrømning av natrium og kalsium, noe som resulterer i høye nivåer av intracellulært kalsium, som setter igang hittil ukjente prosesser med celledød.

Det utvikles for tiden antagonister mot glutamatreseptorer for å hindre nevroncelledød som følge av slag eller hodetrauma. [Hirose K, Neurochem. Res. 18:479 (1993), Dugan LL, Annals of Neurology, bind 35, suppl. S17-19 (1994)]. Mange studier har påvist at en blokkering av NMDA-subklassereseptoreren signifikant reduserer nevronskade og -tap som oppstår i dyremodeller som etterligner mange forskjellige nevropatologiske situasjoner. Disse observasjonene indikerer sterkt at NMDA-antagonister gir nevrobeskyttelse ved flere kliniske tilfeller. Imidlertid er mange av disse medikamentene kun effektive når de gis innen 6 timer etter hendelsen eller skaden. Dette kan skyldes det faktum av intracellulære kalsiumnivåer også kan stige på grunn av kalsium som går inn i cellen gjennom spenningsstyrte kalsiumkanaler. Videre, siden aktivering av glutamatreseptorer kreves for normal synaptisk overføring og hjerneaktivitet, er forlenget behandling med glutamatreseptorblokkere ikke mulig. Dette begrenser bruken av dem som nevrobeskyttende midler ved kronisk nevrodegenerative sykdommer. Derfor er medikamenter som kan forhindre nevroncelledød som følge av stigningen av intracellulært kalsium egnet for den forsinkede behandling av slag og hodeskader, såvel som for kronisk behandling av nevrodegenerative sykdommer.

Det er blitt fremsatt flere hypoteser for å forklare hvordan høye nivåer av intracellulært kalsium fører til celledød. En er at det aktiverer kalsiumavhengige proteaser, så som calpain. En annen er at det aktiverer calcineurin, en kalsium/calmodulinavhengig fosfatase som defosforylerer nitrogenoksydsyntase

(NOS). Defosforylering av NOS gjør det istand til å produsere nitrogenoksyd, som er toksisk for celler. En tredje hypotese er at høye intracellulære nivåer av kalsium induserer apoptose, eller programmert celledød. Disse forskjellige hypotesene er ikke gjensidig utelukkende, og det er sannsynlig at alle disse hendelsene, såvel som andre som ennå ikke er oppdaget, trigges av høye nivåer av intracellulært kalsium og gir celledød.

Ved apoptose aktiveres noen gener som er nødvendig for celledeling, som om cellen forsøker å dele seg. [Heintz N, Trends-Biochem-Sci. 18:157 (1993)]. Mange sterkt differensierte celler, så som nevroner, har mistet evnen til å dele seg, og når de ikke gjør de, dør de. Derfor er det mulig at medikamenter som kan hindre celler i å dele seg også kan hindre dem i å gjennomgå apoptose.

Det er nå funnet at en forbindelse som er valgt fra gruppen av rapamycin,

rapamycin-1,3-Diels Alder-addukt med fenyltriazolindion, rapamycin-42-ester med 4-[[4-(dimetylamino)fenyl]azo]benzensulfonsyre, rapamycin-1,3-Diels Alder-addukt med metyltriazolindion og rapamycin-O-benzyl-27-oksim (kollektivt henvist til som forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen) kan anvendes som et nevrobeskyttende middel, idet en slik forbindelse gis til et pattedyr som har behov for det oralt,

parenteralt, intravaskulært, intranasalt, intrabronkialt, transdermalt eller rektalt. Særlig kan slag, hodetrauma og nevrodegenerative sykdommer, så som Alzheimers sykdom, amytrofisk lateral sklerose (ALS), epilepsi, Huntingtons sykdom eller Parkinsons sykdom hos et pattedyr som har behov for det, behandles ved å administrere en effektiv mengde av en forbindelse valgt fra gruppen av rapamycin, rapamycin-1,3-Diels Alder-addukt med fenyltriazolindion, rapamycin-42-ester med 4-[[4-(dimetylamino)fenyl]azo]benzensulfonsyre, rapamycin-1,3-Diels Alder-addukt med metyltriazolindion og rapamycin-O-benzyl-27-oksim til det nevnte pattedyr oralt, parenteralt, intravaskulært, intranasalt, intrabronkialt, transdermalt eller rektalt. Forbindelsene ovenfor er også nyttige for å hindre nevroncelledød relatert til de ovennevnte sykdomstilstander.

Sterkest foretrukket er rapamycin. En forbindelse valgt fra gruppen av rapamycin, rapamycin-1,3-Diels Alder-addukt med fenyltriazolindion, rapamycin-42-estermed 4-[[4-(dimetylamino)fenyl]azo]benzensulfonsyre, rapamycin, 1,3-Diels Alder-addukt med metyltriazolindion og rapamycin-O-benzyl-27-oksim kan også anvendes i kombinasjon med en NMDA- og/eller AMPA-antagonist som et nevrobeskyttende middel, og behandle slag, hodetrauma og nevrodegenerative forstyrrelser, så som Alzheimers sykdom, amytrofisk lateral sklerose (ALS), epilepsi, Huntingtons sykdom eller Parkinsons sykdom. Forbindelsene som anvendes i denne oppfinnelsen er også nyttige for å hindre nevroncelledød relatert til ovennevnte sykdomstilstander, når de benyttes i kombinasjon med en NMDA-og/eller AMPA-antagonist.

Når forbindelsene benyttes i kombinasjon med en NMDA- og/eller AMPA-antagonist, kan kombinasjonen administreres samtidig eller sekvensielt, uten hensyn til rekkefølen av administrasjonen.

Foretrukne NMDA-antagonister inkluderer [2-(8,9-diokso-2,6-diazabicyklo[5.2.0]non-1(7)-en-2-yl)etyl]fosfonsyre (beskrevet i US-PS 5.168.103, som herved er medtatt som referanse), D-amino-5-fosfonopentanoat (D-AP5), 4-fosfonmetyl-2-piperidinkarboksylsyre (CGS19755), D,L-(E)-2-amino-4-metylfosfono-3-pentansyre (CGP37849), 5,7-diklorkynurenat, trans-2-karboksy-5,7-diklor-4-fenylaminokarbonylamino-1,2,3,4-tetrahydrokinolin (L689560) og 5,7-dinitrokinoksolin-2,3-dion (MNQX), og foretrukne AMPA-antagonister innbefatter 6-(1H-imidazol-1-yl)-7-nitro-2,3(1H,4H)kinoksalindionhydroklorid (YM90K) (J. Med. Chem. 37:647 (1994), 1-(4-aminofenyl)-4-metyl-7,8-metylendioksy-5H-2,3-benzodiazepin-HCI (GYKI52466) og 6-nitro-7-sulfamobenzo(f)kinoksalin-2,3-dion (NBQX), 6-cyano-7-nitrokinoksalin-2,3-dion (CNQX) og 6,7-dinitrokinoksalin-2,3-dion (DNQX).

Behandling dekker det å behandle en eksisterende tilstand, å forhindre fremgang i eller utvikling av tilstanden, å bedre tilstanden og gi lindring av tilstanden.

Evnen som forbindelsene har til å virke som nevrobeskyttende midler ble vist ved følgende in vitro standard farmakologiske testprosedyrer som etterligner nevrotoksisitet hos pattedyr.

Den første standard farmakologiske testprosedyre viste evnen som forbindelsene anvendt i denne oppfinnelsen har til å hindre nevroncelledød som resultat av glutamatindusert toksisitet. Kort sagt ble hippocampus- og barkkulturer fra rotte fremstilt i henhold til fremgangsmåten til Furshpan og Potter, med noen modifikasjoner. [Neuron 3:199 (1989)]. Hjernen ble fjernet fra nyfødte Long Evans-avkom bedøvet med en injeksjon av 0,1 ml 20% kloralhydrat. Hippocampi ble dissekert ut og adskilt fra resten av barken. Begge vev ble enzymatisk nedbrutt i 5 ml Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) inneholdende 20 u/ml papain, 1 rtiM L-cystein og 0,5 mM EDTA i 30 min. ved 37°C med forsiktig bevegelse. Hippocampi- og barkvevene ble deretter vasket en gang med EBSS, og nedbrytningen ble stoppet med inkubering ved 37°C i 30 min. med 3-5 ml inhibitorløsning inneholdende 1 mg/ml ovomucoid og 1 mg/ml albumin i EBSS.

De nedbrutte hippocampi- og barkvev ble vasket to ganger med DME uten L-glutamin med 4,5 g/l dextrose før de ble gnidd i 2 ml DME supplert med 5% kalvefosterserum, 5% rotteserum, 50 u/ml penicillin, 0,05 mg/ml streptomycin og MITO+-serum-ekstensjonsmiddel [et mediumsupplement fra Collaborative Biomedical Products] (10% DME). Etter 50 gnidninger fikk ikke-dissosiert vev utfelles og den dissosierte cellesuspensjon ble fjernet. Nye 2 ml av 10% DME ble tilsatt til det gjenværende vev og gnidningen ble gjentatt. De to cellesuspensjonsalikvotene ble slått sammen og celletettheten ble bestemt med et hemacytometer.

30.000 hippocampusceller i 150 pl ble platet pr. brønn i 96-brønners plater og inkubert ved 37°C 5% C02. Barkceller ble platet med en tetthet på 500.000 celler pr. brønn i 24-brønners plater. Når glia-celler var sammenflytende (etter ca.

3 dager), ble 4-10 uM cytosin-B-D-arabinofuranosid tilsatt til hver brønn for å forhindre ytterligere proliferasjon. En uke etter plating ble mediet fjernet og erstattet med DME supplert med 2,5% kalvefosterserum, 2,5% rotteserum, 50 u/ml penicillin, 0,05 mg/ml streptomycin, MITO+, 1 mM kynurenat og 10 mM MgCI2 (5% DME + KM). Kynurenat er en ikke-spesifikk blokker av glutamatreseptorer og forhøyede nivåer av magnesium blokkerer kalsium- og natriuminnstrømning gjennom NMDA-reseptorkanaler. Tilsetning av KM forhindrer nevrotoksisitet som opptrer når glutamat finnes i serum, og tillater nevroner å opprettholdes i kulturen i opptil flere måneder. Cellene ble tilført næring ukentlig ved å bytte halve mediet med frisk 5% DME + KM.

Forbindelsen som skal vurderes ble oppløst i DMSO for å lage 10 mM stamløsninger og lagret i alikvoter ved -80°C. Like før hver prosedyre ble utført, ble alikvoter av stamløsningene tint og fortynnet i DME eller Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) inneholdende 44 mM natriumbikarbonat, 10 mM glukose og 30 uM glutamat for å oppnå testkonsentrasjoner fra 1 nM til 10 uM.

Etter 4-12 uker i kultur ble hippocampusceller vasket tre ganger og ernært med testforbindelse i HBSS, eller serumfritt DME (SF DME) og 30-150 pM glutamat. Minst tre brønner i hver testprosedyre ble behandlet med hver medikamentkonsentrasjon. 30 uM glutamat dreper 70-80% av nevronene i yngre kulturer, og flere i eldre kulturer. Toksisiteten indusert ved 30 uM glutamat ble blokkert med 1 mM kynurenat + 10 mM MgCI2 (KM).

Etter inkubering over natten ved 37°C ble antall levende hippocampusnevroner som var igjen i fem felter, som representerte nord-, sør-, øst- og vestekstremene og senteret i hver brønn, tellet. Hvert felt ble visualisert gjennom et 10x objektiv med et 15x "øyestykke", og var tilnærmet 1,54 mm<2> i areal. Forsøkene ble utført gjort in triplo. Det gjennomsnitlige antall nevoner pr. brønn og standard avvik for hver test ble beregnet. Det gjennomsnittlige antall nevroner som var igjen i det 30 uM glutamatkontrollforsøket reflekterer slike som ikke var sensitive overfor glutamattoksisitet.

Følgende tabell viser resultatene oppnådd for forbindelsen i eksempel 1.

Følgende tabell viser testresultatene oppnådd for forbindelsene ifølge denne oppfinnelse.

Resultatene av denne standard farmasøytiske testprosedyren viser at forbindelsene som anvendes i denne oppfinnelsen inhiberer glutamatindusert nevrotoksisitet, og er derfor nyttige som et nevrobeskyttende middel. Som vist i den første tabellen, viste lavere konsentrasjoner av forbindelsen fra eksempel 1 (10 og 100 nM) seg å være overlegen i forhold til høyere konsentrasjoner av forbindelsen fra eksempel 1 (1 og 10 pM), muligens på grunn av noen cytotoksiske effekter av forbindelsen fra eksempel 1 ved disse høyere konsentrasjonene. Evaluering av forbindelsene som anvendes i denne oppfinnelsen ved konsentrasjoner i området mellom 2 og 200 nM, viste nevrobeskyttende aktivitet mot glutamatindusert toksisitet, som etterligner nevrotoksisitet hos pattedyr. Ved høyere glutamatkonsentrasjoner (75 uM), forhindret forbindelsene ikke nevroncelledød. Forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen var mindre effektive som nevrobeskyttende midler mot glutamatindusert toksisitet i eldre hippocampus-kulturer (>8 uker), som er mer følsomme for glutamattoksisitet.

Den andre in vitra, standard farmakologiske testprosedyren viser evnen som forbindelsene anvendt i oppfinnelsen har til å forsterke de nevrobeskyttende effektene observert med NMDA- og AMPA-inhibitorer. I korthet ble barkkulturer dyrket i 8 uker i 24-brønners plater som beskrevet ovenfor. Barknevroner ble vasket seks ganger med DME uten glukose, som hadde blitt deoksygenert ved å boble mediet med 95% N2/5% CO2 i minst 10 min., for å indusere en ischemisk tilstand som vil forårsake nevroncelledød som kan observeres ved å måle laktatdehydrogenasenivåer, idet mengden av LDH-aktivitet i hver brønn korreleres direkte med antallet døde celler. 100 pM [2-(8,9-Diokso-2,6-diazabicyklo[5.2.0]non-1(7)-en-2-yl)etyl]fosfonsyre (beskrevet i US-PS 5.168.103, som herved er inntatt som referanse), og 10 uM YM90K ble tilsatt til visse brønner for å blokkere henholdsvis NMDA- og AMPA-glutamat-reseptorer. Til testbrønnene ble det tilsatt 1 uM av forbindelsen fra eksempel 1. Kontrollbrønner ble vasket med normal DME med glukose og 100 pM [2-(8,9-diokso-2,6-diazabicyklo[5.2.0]non-1(7)-en-2-yl)etyl]fosfonsyre. 5 pL prøver ble tatt fra hver brønn til forskjellige tidspunkter etter ischemi, og LDH-aktiviteten i disse prøvene ble bestemt ved å tilsette 250 pl av 2 mg NADH/25 ml fosfattbuffer til hver prøve. Etter inkubering i 20-30 min. ble 10 pl av 22,7 mM pyruvat tilsatt, og den optiske densitet (OD) ved 340 nm avlest. Endringen i optisk densitet med tid (mOD/min.) reflekterer mengden av LDH i prøven. Høyere optisk densitet betyr mer LDH-aktivitet, noe som indikerer mer celledød. Det ble tatt prøver fra 4-8 brønner pr. forsøk, og gjennomsnittet og standardavvik for hvert forsøk og for hvert tidspunkt ble bestemt. Resultatene som ble oppnådd er vist følgende tabell.

Forbindelsen som anvendes i denne oppfinnelse ble også evaluert i de standard testprosedyrene som etterligner ischemisk nevrotoksisitet, med det unntak at 1 uke gamle barkcellekulturer, som er mindre følsomme for ischemi-mediert nevrotoksisitet, ble benyttet. Testforbindelser ble administrert med NMDA- og AMPA-inhibitorer som beskrevet ovenfor. Cyklosporin ble også evaluert for sammenligning.

Disse resultatene oppnådd i denne standard farmasøytiske testprosedyren, viser at forbindelsene anvendt i denne oppfinnelsen forsterker de nevrobeskyttende effektene til NMDA- og AMPA-inhibitorene ved å inhibere ischemi-indusert nevrotoksisitet.

Forbindelsene anvendt i denne oppfinnelsen kan formuleres i ren form eller med en farmasøytisk bærer til et pattedyr som har behov for det. Den farmasøytiske bærer kan være i fast eller flytende form. Formulert for oral bruk er det funnet at 0,01% Tween 80 i PHOSAL PG-50 (fosfolipidkonsentrat med 1,2-propylenglykol, A. Nattermann & Cie. GmbH) giren akseptabel oral administrering.

En faststoffbærer kan innbefatte en eller flere substanser som også kan tjene som smakssettingsmiddel, smøremiddel, solubiliseringsmiddel, oppslemmingsmiddel, fyllstsoff, glidemiddel, kompresjonshjelpemiddel, bindemiddel eller tablett-sprengningsmiddel. Den kan også være et innkapslingsmateriale. I pulvere er bæreren et finfordelt faststoff i blanding med den finfordelte, aktive ingrediens. I tabletter er den aktive ingrediens blandet med en bærer som har de nødvendige kompresjonsegenskaper i egnet mengde og komprimert i den ønskede form og størrelse. Pulverene og tablettene inneholder fortrinnsvis opptil 99% av den aktive ingrediens. Egnede faststoffbærere innbefatter, f.eks., kalsiumfosfat, magnesiumstearat, talkum, sukker, laktose, dekstrin, stivelse, gelatin, cellulose, metylcellulose, natrium-karboksymetylcellulose, polyvinylpyrrolidin, lavtsmeltende voks og ionebytter-harpikser.

Flytende bærere benyttes ved fremstilling av løsninger, suspensjoner, emulsjoner, siruper, eliksirer og komprimerte preparater. Den aktive ingrediens kan oppløses eller oppslemmes i en farmasøytisk akseptabel, flytende bærer, så som vann, et organisk løsningsmiddel, en blanding av begge, eller farmasøytisk akseptable oljer og fett. Den flytende bærer kan inneholde andre egnede farmasøytiske additiver, så som solubiliseringsmidler, emulgeringsmidler, buffere, konserveringsmidler, søtemidler, smakssettende midler, oppslemmingsmidler, fortykningsmidler, farver, viskositetsregulerende midler, stabiliserende midler eller osmo-reguleringsmidler. Egnede eksempler på flytende bærere for oral og parenteral administrasjon innbefatter vann (delvis inneholdende additiver som ovenfor, f.eks. cellulosederivater, fortrinnsvis natriumkarboksymetyl-celluloseløsning), alkoholer (innbefattende enverdige alkoholer og flerverdige alkoholer, f.eks. glykol) og deres derivater, lethicin, og oljer (f.eks. fraksjonert kokosnøttolje og arachinolje). For parenteral administrering kan bæreren også være en oljeaktig ester, så som etyloleat og isopropylmyristat. Sterile, flytende bærere er nyttige i sterile preparater i flytende form for parenteral administrering. Den flytende bærer for komprimerte preparater kan være halogenert hydrokarbon eller annet farmasøytisk akseptabelt drivmiddel.

Flytende farmasøytiske preparater som er sterile løsninger eller suspensjoner, kan benyttes ved f.eks. intramuskulær, intraperitoneal eller subkutan injeksjon. Sterile løsninger kan også administrerer intravenøst. Forbindelsene som anvendes i denne oppfinnelse kan også administreres oralt, enten i flytende form eller i faststofform.

Forbindelsene anvendt i denne oppfinnelse kan administreres rektalt i form av en konvensjonell stikkpille. For administrering intranasalt eller intrabronkial inhalasjon eller insufflasjon, kan rapamycin formuleres i en vandig eller delvis vandig løsning, som deretter kan benyttes i form av en aerosol. Forbindelsene anvendt i denne oppfinnelse kan også administreres transdermalt ved anvendelse av en transdermal pute inneholdende den aktive forbindelse og en bærer som er inert til den aktive bestanddel, er ikke-toksisk for huden, og tillater frigivelse av midlet for systemisk absorpsjon over i blodstrømmen via huden. Bæreren kan anta mange former, så som kremer og salver, pastaer, geler og forsinkelsesmidler. Kremene og salvene kan være viskøse, flytende eller halvfaste emulsjoner av enten olje-i-vann- eller vann-i-olje-typen. Pastaer sammensatt av absorberende pulvere dispergert i petroleum eller hydrofil petroleum inneholdende den aktive ingrediens, kan også være egnet. Mange forskjellige forsinkelsesmidler kan anvendes til å frigi den aktive ingrediens over i blodstrømmen, så som en semipermeabel membran som dekker et reservoar som inneholder den aktive ingrediens med eller uten en bærer, eller et underlag som inneholder den aktive ingrediens. Andre forsinkelsesmidler er kjent fra litteraturen.

Doseringskravene varierer med de spesielle preparater som anvendes, måten å administrere på, hvor alvorlig symptomene er og det spesielle individ som behandles. Basert på resultatene oppnådd i de standard farmakologiske testprosedyrene, vil foreslåtte intravenøse, daglige doser aktiv forbindelse være fra 0,1 pg/kg til 100 mg/kg, fortrinnsvis mellom 0,001 og 25 mg/kg, og mer foretrukket mellom 0,01 og 5 mg/kg. Foreslåtte daglige orale doseringer vil være 0,005-50 mg/kg, fortrinnsvis 0,01-25 mg/kg, og mer foretrukket 0,05-10 mg/kg. Behandling vil generelt startes med små doser som er mindre enn den optimale dose av forbindelsen. Deretter økes doseringen inntil den optimale effekt under omstendighetene er nådd. Nøyaktige doser for oral, parenteral, nasal eller intrabronkial administrering vil bestemmes av den behandlende lege, basert på erfaring med det individet som behandles. Fortrinnsvis er det farmasøytiske preparatet i enhetsdoseform, f.eks. som tabletter eller kapsler. I en slik form inndeles preparatet i enhetsdoser som inneholder passende mengder av den aktive ingrediens. Enhetsdoseformen kan være pakkede preparater, f.eks. pakkede pulvere, små medisinflasker, ampuller, forhåndsfylte sprøyter eller poser inneholdende væsker. Enhetsdoseformen kan f.eks. være en kapsel eller en tablett, eller det kan være det passende antall av enhver type av slike preparater i pakket form.

Følgende eksempler illustrerer fremstillingen av forbindelsene i henhold til denne oppfinnelse.

Eksempel 1

Rapamycin.

Fremstillingen av rapamycin er blitt beskrevet I US-PS 3.929.992, som herved er tatt med som referanse.

Eksempel 2

Rapamvcin- 1. 3- Diels Alder- addukt med fenyltriazolindion.

Rapamycin (0,66 g, 721 mmol) ble oppløst i diklormetan (10 ml) og avkjølt til 0°C. Til dette ble det dråpevis tilsatt en løsning av fenyltriazolindion (0,133 g, 758 mmol) i diklormetan (10 ml). Løsningen ble omrørt over natten, TLC viste at omsetningen ikke var fullstendig. Ytterligere fenyltriazendion (0,025 g, 27 mmol) ble tilsatt. Reaksjonblandingen ble renset ved anvendelse av HPLC (4,1 x 31 cm, Si02) med etylacetat som elueringsmiddel, for å tilveiebringe tittelforbindelsen i form av et faststoff. Faststoffet ble gnidd med 30 ml heksan og 1 ml etylacetat, filtrert og lufttørket for å få tittelforbindelsen i form av et pulver (0,383 g).

Analyse beregnet for C59H84N4O15: C: 65,05, H: 7,77, N: 5,14. Funnet: C: 65,39, H: 7,98, N: 4,92.

IR (KBr, cm<1>) 3450, 1715.

NMR (DMSO) 8 7,50 (m, 3H), 7,40 (m, 2H), 3,11 (s, 3H), 3,00 (s, 3H), 2,95 (s, 3H), 0,8 (q, 1H).

MS (-FAB) 1088 (M").

Eksempel 3

Rapamvcin- 42- ester med 4- rf4-( dimetvlamino) fenvl1azolbenzensulfonsyre.

Fremstillingen av forbindelsen i eksempel 3 er blitt beskrevet i US-PS 5.177.203, som herved er tatt med som referanse.

Eksempel 4

Rapamvcin- 1. 3- Diels Alder- addukt med metyltriazolindion.

Tittelforbindelsen ble fremstilt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 2.

Eksempel 5

Rapamvcin- O- benzvl- 27- oksim.

Fremstillingen av forbindelsen i eksempel 5 er blitt beskrevet i US-PS 5.023.265, som herved er tatt med som referanse.

Claims (4)

1. Anvendelse av en forbindelse valgt fra gruppen som består av rapamycin, rapamycin-1,3-Diels Alder-addukt med fenyltriazolindion, rapamycin-42-ester med 4-[[4-(dimetylamino)fenyl]azo]benzensulfonsyre, rapamycin-1,3-Diels Alder-addukt med metyltriazolindion og rapamycin-O-benzyl-27-oksim til fremstilling av et farmasøsytisk preparat for inhibering av nevroncelldød , for å behandle slag, hodetraumer eller en nevrodegenerativ sykdom, eller for anvendelse som et nevrobeskyttende middel i et pattedyr.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvori forbindelsen er rapamycin.

3. Anvendelse ifølge krav 1 og 2, hvori det farmasøytiske preprat kan administreres oralt, parenteralt, intravaskulært, intranasalt, intrabronkialt, transdermalt eller rektalt.

4. Anvendelse ifølge krav 1-3, hvori den nevrodegenerative sykdommen er valgt fra gruppen som består av Alzheimers sykdom, amytrofisk lateral sklerose (ALS), epilepsi, Huntingtons sykdom og Parkinsons sykdom.