SK15212000A3

SK15212000A3 - Prípravok zložený z hydroxidu vápenatého, dvojsýtneho alebo viacsýtneho alkoholu, netuhnúceho oleja rastlinného alebo živočíšneho pôvodu a jeho použitie na regeneráciu kolagénu

Info

Publication number: SK15212000A3
Application number: SK1521-2000A
Authority: SK
Inventors: Georg Dietz
Original assignee: Georg Dietz
Priority date: 1998-04-16
Filing date: 1999-04-16
Publication date: 2001-02-12
Also published as: AU3818099A; CA2320135A1; ES2184450T3; CN1297364A; JP2002512088A; EP1071481B1; AU745434B2; DE19980655D2; EP1071481A1; HK1035675A1; WO1999053969A1; IL138049A0; BR9909670A; TR200002962T2; PL192094B1; IL138049A; PL345210A1; CN1198659C; ATE225191T1

Description

Prípravok zložený z hydroxidu vápenatého, dvojsýtneho alebo viacsýtneho alkoholu a netuhnúceho oleja rastlinného alebo živočíšneho pôvodu a jeho použitie na regeneráciu kolagénu

Oblasť techniky

Vynález sa týka prípravku zloženého z netuhnúceho oleja rastlinného alebo živočíšneho pôvodu, hydroxidu vápenatého a dvojsýtneho alebo viacsýtneho alkoholu, a vhodných farmaceutický prijateľných excipientov na prípravu takej zmesi, použitia takej zmesi na regeneráciu kolagénu a použitia takej zmesi na produkciu lieku na vyvolanie regenerácie kolagénu in vivo.

Doterajší stav techniky

Kosť sa skladá z asi 60 % minerálnej substancie (hydroxyapatit, fosforečnan vápenatý) a asi 40 % organickej hmoty, hlavne kolagénu. Metabolizmus kosti je určovaný prevažne súhrou kosť tvoriacich buniek (osteoblasty) a kosť degradujúcich buniek (osteoklasty a osteocyty), ktorých pôsobenie je v zdravej kosti vo vyváženom pomere.

Tvorba kosti môže byť rozdelená do dvoch hlavných fáz (a) syntéza organického tkaniva (syntéza kolagénu) a (b) následná inkorporácia minerálnej substancie do vopred vytvorenej organickej matrice sprostredkovávaná takzvanými matricovými váčkami.

Spojovacie proteínové tkanivo kolagénu predstavuje v kosti väčšinu organických substancií. Proteín pozostáva z troch skrutkovito stočených polypeptidových reťazcov, v ktorých sa zloženie aminokyselín môže meniť, čo vedie k rôznosti jednotlivých typov kolagénu. Všetkým typom kolagénu je spoločné, že kolagénové vlákna majú výnimočne vysokú mechanickú pevnosť. Táto pevnosť je založená na multiplicite intramolekulárnych a intermolekulárnych väzieb kolagénových vlákien, ktoré týmto spôsobom z hustej siete kolagénových vlákien vy2 > ^μ.'

- t tvárajú spojovacie tkanivo. Ako už bolo uvedené, kostné tkanivo je tvorené inkorporáciou minerálnych substancií (hydroxyapatitu a fosforečnanu vápenatého) do tejto siete. Výstavba kosti ako výsledok rastových a regeneračných procesov je vždy predchádzaná biosyntézou kolagénu.

Až doposiaľ v akýchkoľvek prípadoch poškodenia kosti bol regeneračný proces kosti ponechávaný sám sebe, nanajvýš bol podporovaný antibiotikami a kortikoidmi, aby sa predišlo akémukoľvek riziku infekcie ohrozujúcemu liečebný proces.

Boli tiež opísané niektoré faktory schopné ovplyvňovať tvorbu kosti a regeneráciu. Sú to hlavne fyzikálne faktory (mechanické a elektrické sily), hormóny [napríklad paratyroidný hormón, kalcitonín, inzulín, glukokortikoidy, 1,25(OH)₂D3] a nie pevne definovaná skupina rastových faktorov s proteínovou charakteristikou (osteokalcín, osteonektín, inzulínu podobné rastové faktory) viď S. Wallach, L. V. Avioli, J. H. Carstens jun., Factors in Bone Formation, Calcified Tissue International 45: 4-6 (1989). Efekt koncentrácie vodíkových iónov (pH) na metabolické procesy pri regenerácii kosti nebol doposiaľ adekvátne skúmaný.

Dietz v DE-A-42 40 713 opisuje použitie zmesi hydroxidu vápenatého a paznehtového oleja na regeneráciu kolagénu po kostných úrazoch. Tento prípravok z hydroxidu vápenatého a paznehtového oleja však trpí tou skutočnosťou, že jeho stabilita je ako následok zmydelňovania veľmi obmedzená. To môže znehodnocovať účinok zmesi.

Podstata vynálezu

Vynález bol teda založený na zámere poskytnúť zlepšenú zmes s dlhodobou stabilitou na špecifické vonkajšie ovplyvňovanie regeneračných procesov kosti stimuláciou alebo iniciáciou regenerácie kolagénu.

Teraz bolo prekvapujúco zistené, že je možné použitím prípravku zloženého z hydroxidu vápenatého, dvojsýtneho alebo viacsýtneho alkoholu a netuhnú3 ceho oleja rastlinného alebo živočíšneho pôvodu a vhodných farmaceutický prijateľných excipientov, zlepšiť výrazne stabilitu prípravku a používaním tohto prípravku pri poškodení alebo v poranení kosti je teda in vivo zlepšovaná regenerácia kolagénu.

Predkladaný vynález sa teda týka prípravku, ktorý obsahuje hydroxid vápenatý, dvojsýtny alebo viacsýtny alkohol a netuhnúci olej rastlinného alebo živočíšneho pôvodu a vhodné farmaceutický prijateľné excipienty.

Predkladaný vynález sa ďalej týka spôsobu výroby takého prípravku vmiešaním hydroxidu vápenatého, dvojsýtneho alebo viacsýtneho alkoholu a vhodných farmaceutický prijateľných excipientov do netuhnúceho oleja rastlinného alebo živočíšneho pôvodu.

Predkladaný vynález sa ďalej týka použitia takého prípravku na regeneráciu kolagénu.

Ďalej sa predkladaný vynález týka použitia takého prípravku na výrobu liečiva na vyvolanie regenerácie kolagénu in vivo.

Síran bárnatý obsahujúci zmes hydroxidu vápenatého a paznehtového oleja bol použitý v zubnom lekárstve ako pasta na vypĺňanie zubných koreňov (DE-C 29 32 738). Zmesi karboxylátového cementu, hydroxidu vápenatého a paznehtového oleja boli podobne v zubnom lekárstve použité ako dočasné fixačné prostriedky na provizórne korunky (DE-C 34 13 864). Úloha hydroxidu vápenatého v predchádzajúcom prípade je zmeniť kyslé prostredie v kanáliku zubného koreňa na alkalické, ktoré spôsobuje elimináciu zápalov a postupnú tvorbu bariéry z tvrdého tkaniva. V posledne uvedenom prípade sa využíva profylaktický účinok hydroxidu vápenatého na zápal zubnej drene. Paznehtový olej slúži v oboch prípadoch ako mazacia pomôcka, aby zabezpečovala najprv jednoduché a úplné zaplnenie zubných kanálikov účinnou aktívnou ingredienciou, hydroxidom vápenatým (a kontrastným činidlom, síranom bárnatým) a po druhé spomalenie vytvrdzovania dočasných fixačných prostriedkov pre provizórne zubné korunky tak, že hydroxid vápenatý je tiež schopný prenikať cez jemné kanáliky zuboviny ku dreni a prejaviť tam svoj účinok. Žiadna z oboch referencií nedáva najmenší ná4 znak, že zmes podľa vynálezu je schopná vyvolávať extenzívnu regeneráciu kolagénu ako predpoklad na regeneráciu kosti.

Termín prípravok, ktorý je podľa vynálezu nový a je v nasledujúcom používaný, sa týka farmaceutického prípravku (niekedy v nasledujúcom sa týka tiež zmesi), ktorý obsahuje najmenej jednu z hore uvedených ingrediencií. Je vhodný predovšetkým na podávanie ľuďom alebo zvieratám na výskum regenerácie kolagénu ako predpokladu na regeneráciu kosti.

Ingrediencie zmesi podľa vynálezu sú podrobnejšie opísané nižšie;

Netuhnúce oleje rastlinného pôvodu, ktoré môžu byť použité, môžu obsahovať jednu alebo viac súčastí z nasledujúcich rastlinných olejov:

oleje sójový, slnečnicový, zo semien repky olejnej, z bavlníkových semien, z ľanových semien, ricínový, palmový, z palmových jadier, z kokosových orechov a olivový.

Netuhnúce rastlinné oleje, ktoré môžu byť použité sú prednostne netuhnúce ole}e s vysokou stálosťou pri zahrievaní ako sójový, slnečnicový a olivový olej a predovšetkým olivový olej.

Netuhnúce živočíšne oleje, ktoré môžu byť použité, môžu obsahovať jednu alebo viac súčastí z nasledujúcich živočíšnych olejov:

rybie oleje, oleje zo zvieracích nožičiek a loje.

Živočíšne oleje, ktoré môžu byť použité, sú prednostne oleje zo zvieracích nožičiek, predovšetkým paznehtový olej.

Dvojsýtne alebo viacsýtne alkoholy, ktoré môžu byť použité, môžu predstavovať dvojsýtne alkoholy ako etylénglykol, propylénglykol, butylénglykol, pentylénglykol, hexylénglykol a polyetylénglykoly ako dietylénglykol, trietylénglykol, polypropylénglykoly ako dipropylénglykol, trojsýtne alkoholy ako glycerol, štvorsýtne alkoholy ako treitol, erytritol, päťsýtne alkoholy ako arabitol, a5 donitol, xylitol, šesťsýtne alkoholy ako sorbitol, manitol, dulcitol, alebo vyššie viacsýtne alkoholy.

Prednosť sa dáva používaniu dvojsýtnych a trojsýtnych alkoholov ako je etylénglykol, propylénglykol, butylénglykol, pentylénglykol, hexylénglykol a polyetylénglykoly ako dietylénglykol, trietylénglykol, polypropylénglykoly ako dipropylénglykol, trojsýtne alkoholy ako glycerol, predovšetkým glycerol ako dvojsýtny alebo viacsýtny alkohol.

Bez toho, aby sme si priali držať sa teórie, predpokladáme, že dvojsýtny alebo viacsýtny alkohol zabraňuje zmydelňovaniu rastlinného alebo živočíšneho netuhnúceho oleja. To umožňuje udržovať zmes po dlhý čas v hnetení schopnej alebo krémovej konzistencii, takže biosyntéza kolagénu môže vzrastať a zlepšovať sa.

Krémový, hnetenia schopný prípravok sa vyrobí podľa vynálezu z jednotlivých ingrediencií. Hydroxid vápenatý sa k prípravku pridáva v množstvách 1 90 % hmotnostných, výhodnejšie 10-70 hm. %, respektíve najvýhodnejšie 20 60 hm. % vztiahnuté na celkovú hmotnosť prípravku.

Netuhnúci olej rastlinného alebo živočíšneho pôvodu sa pridáva do kompozície tak, aby vznikla krémová, hnetenia schopná konzistencia a to výhodne v množstvách 9-90 hm. %, vhodnejšie 10-60 hm. %, respektíve najvýhodnejšie 20 - 40 hm. % vztiahnuté na celkovú hmotnosť prípravku.

Dvojsýtny alebo viacsýtny alkohol sa pridáva do kompozície tak, aby vznikla krémová, hnetenia schopná konzistencia a to spravidla výhodne v množstvách 1 - 40 hm. %, vhodnejšie 10-40 hm. %, respektíve najvýhodnejšie 20 30 hm. % vztiahnuté na celkovú hmotnosť prípravku.

Preferované uskutočnenie predkladaného vynálezu sa týka hore uvedenej zmesi, ktorá okrem toho obsahuje MgO. Na tento účel môže byť MgO pridávaný v množstvách 1 - 90 hm. %, vhodnejšie 10-70 hm. %, respektíve najvýhodnejšie

- 60 hm. % vztiahnuté na celkovú hmotnosť prípravku. V súčasnosti sa predpokladá, že MgO je najlepšie pridávať v menších množstvách 10 - 20 hm. %.

MgO sa v kostnom materiále prejavuje ako antacid, aby pôsobil proti kyslému prostrediu v kosti.

Pomer hydroxidu vápenatého k rastlinnému alebo živočíšnemu netuhnúcemu oleju v zmesi môže podľa vynálezu byť 5/1 až 1/5, prednostne 5/1 alebo 1/1. Avšak vzhľadom k špecifickým okolnostiam traumy poranenia môže byť nutná odchýlka od uprednostňovaného pomeru miešania.

Ak má zmes podľa vynálezu mať zvlášť hebkú a jemnú konzistenciu, je tiež možné do nej vmiešať ropnú vazelínu. Obvykle je možné pridávať bielu vazelínu v množstvách 1 - 60 hm. %, vhodnejšie v množstvách 10 - 60 hm. %, respektíve najvýhodnejšie 20 - 40 hm. % vztiahnuté na celkovú hmotnosť prípravku.

Aj keď nie je obvykle nutné monitorovať liečebné alebo regeneračné procesy kosti rádiologický, napriek tomu to môže byť v určitých prípadoch indikované. V tomto prípade je tiež možné včleniť do zmesi podľa vynálezu síran bárnatý ako kontrastné činidlo pre rôntgenové lúče. Avšak pretože regenerácia kolagénu následkom síranu bárnatého-je o niečo menej dobrá, pridáva sa bárium sulfát do zmesi podľa vynálezu, pokiaľ je to nutné, v množstve postačujúcom len tak, aby zmes bola práve rádiograficky viditeľná.

Aplikácia zmesi podľa vynálezu na alebo pri poškodení kosti sa môže v závislosti od jej konzistencie vykonávať s použitím injekčných striekačiek, špachtlí alebo štetcov.

Existujú viaceré možnosti použitia zmesi podľa vynálezu vo všeobecnej chirurgii, ústnej chirurgii, ortopédii, implantológii, traumatológii a podobne, pretože zmes podľa vynálezu môže byť aplikovaná na alebo pri poškodení kostného tkaniva ako sú povrchy fraktúr, vŕtania, dutiny a podobne a na konkrétnom mieste aplikácie bezprostredne vyvoláva regeneráciu kolagénu

Vzhľadom na to, ako je dobre známe, že sa v niektorých relevantných lekárskych disciplínach používajú kovové fixačné prostriedky, je v tomto prípade vhodné odporučiť vyplňovať vyvŕtané otvory pripravené na zavedenie fixačných

Ί prostriedkov zmesou podľa vynálezu pred vložením fixačných prostriedkov a až potom zaviesť fixačný prostriedok. Týmto spôsobom je možné čeliť prvotnej osteolýze nevyhnutnej pri takých procedúrach a tak urýchliť uloženie alebo adaptáciu fixačného prostriedku do alebo k obklopujúcemu kostnému tkanivu a upevnenie samotných fixačných prostriedkov v kostnom tkanive.

Okrem toho prebytočná zmes v tomto prípade neinterferuje, pretože po zavedení fixačných prostriedkov do vyvŕtaných otvorov vyplnených zmesou je táto znovu vypudená alebo difunduje do spongiózy.

Malo by byť samozrejmé, že zmes podľa vynálezu a jej ingrediencie musia byť ako balené, tak aplikované v sterilných podmienkach.

Veľmi prekvapivým spôsobom- sa tiež ukázalo, že zmes podľa vynálezu pôsobí aj bez podpory antibiotík a/alebo kortikoidov proti zápalovej reakcii spôsobenej poranením kosti a rýchlo vyvoláva jej pokles. Jej jednoduché zloženie a výrazná účinnosť na regeneráciu kolagénu in vivo spolu so simultánnou inhibíciou zápalu, robí zmes podľa vynálezu kompozíciou, ktorá bude v kostnej traumatológii v budúcnosti nevyhnutná.

Nasledujúce príklady sú určené na podrobné opísanie vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Najprv je úmyslom objasniť interakciu medzi zmesou podľa vynálezu a tkanivom. Teda údaje o distribúcii zmesi podľa vynálezu v kostnom tkanive sú predpokladom na to, aby bolo možné navrhnúť teóriu o možnom mechanizme pôsobenia liečiva. Pokusy na tkanivových kultúrach sú preto citlivejšie než tie na kultúrach buniek, pretože iba v tkanivovej kultúre je možné študovať interakcie medzi bunkami.

1. Materiál a metódy

1.1. Tkanivový materiál

Ľudské kostné tkanivo pochádzajúce z osteotómie bolo získané z nemoc níc.

Embryonálne kostné tkanivo bola získané z kuracích embryí (Gallus domesticus) 10 až 17 dní starých.

1.2. Tkanivová kultúra

Tkanivo bolo bezprostredne po odstránení prenesené do transportného média. Kostné fragmenty veľkosti asi 2 mm³ boli pripravené v sterilných podmienkach a po stanovení hmotnosti boli priamo použité v pokusoch.

Pre tkanivové kultúry bolo použité Earlovo modifikované Eagleovo minimálne esenciálne médium (MEM) s 20 mM Hepes pufru.

Pred začiatkom pokusu boli k médiu pridané 4 % fetálneho teľacieho séra a 1 % antibiotického roztoku (penicilín/streptomycín/amfotericín B) a pre značkovacie pokusy dodatočne 1 mM beta-amínopropionitrilu, 2 mM askorbátu sodného a 2 až 10 pg izotopov (¹⁴C-prolín). Kultivácia sa vykonávala v 25 ml Erlenmeyerových bankách pri 37 °C vo vodnom kúpeli pri trepaní s najnižšou frekvenciou.

1.3. Stanovenie respiračnej aktivity

Respiračná aktivita je citlivým ukazovateľom metabolickej aktivity tkaniva. Aj malé zmeny fyziologických podmienok tkaniva sa odrážajú v merateľnej zmene respiračnej aktivity.

Na stanovenie respiračnej aktivity bol použitý Clarkov snímač (elektródy platina/striebro v nasýtenom roztoku chloridu draselného). Pri aplikácii napätia 0,8 V na elektródu je prúd redukcie kyslíku priamo úmerný parciálnemu tlaku kyslíku v meranom roztoku (médiu kultúry). Dodávanie kyslíkom nasýteného média, kde parciálny tlak kyslíku klesá pod určitú hodnotu a analytické údaje sa kontrolujú počítačom.

Kostné tkanivo má obvykle respiračnú aktivitu 2-3 μΐ O₂ x min'¹ x g'¹. Respiračná aktivita je teda v oblasti rádu veľkosti respiračnej aktivity zvyšného svalového tkaniva. Typická respiračná aktivita kostného tkaniva je uvedená na obr. 1. Pílovitý priebeh respiračnej krivky uvedený na obr. 1 pochádza z tej skutočnosti, že keď parciálny tlak kyslíku v meranom roztoku klesne pod určitú hodnotu, dodáva sa čerstvé kyslíkom nasýtené médium.

Obr. 2 ukazuje priemerné hodnoty spotreby kyslíku z troch meraní. Spotreba kyslíku embryonálnym kostným tkanivom (Gallus domesticus) bola stanovená v tkanivovej kultúre s použitím Clarkovho snímača. Spotreba kyslíku je medzi 3 a 5 μΙ O₂x min¹ x g'¹.

Respiračná aktivita klesá o asi 50 % počas doby, ktorá je úplne normálna pre tkanivové kultúry.

1.4. Enzýmové testy

Enzýmom, ktorý sa považuje za úzko spojený s mineralizáciou kostného tkaniva, je alkalická fosfatáza. Tento enzým bol charakterizovaný pred nejakým časom, avšak stále sa vedú diskusie o funkcii tohto enzýmu pri mineralizácii. Vzhľadom na to, že je úzka súvislosť medzi aktivitou osteoblastov a aktivitou alkalickej fosfatázy, je možné hľadieť na alkalickú fosfatázu ako na ukazovateľ aktivity osteoblastov. Zvýšené úrovne aktivity alkalické fosfatázy v krvnom sére boli zistené počas rastu kostry v detstve, počas regenerácie kosti a pri poruchách metabolizmu kosti.

Aktivita alkalickej fosfatázy bola stanovovaná v surovom extrakte. Na tento účel bolo 500 mg tkaniva zmiešaných s 1 ml rozkladného pufru a nožom rozrezaných. Na to potom bolo pridané 500 mg drviacich guliek a 20 minút bolo vykonávané rozdrobovanie. Po centrifugácii bol surový extrakt použitý na meranie.

Alkalická fosfatáza bola detegovaná na základe konverzie p-nitrofenylfosfátu na nitrofenol a fosfát. Nitrofenol, ktorý pri hydrolýze vzniká je žltý a teda môže byť detegovaný fotometrom pri vlnovej dĺžke 410 nm.

Obr. 3 ukazuje závislosť pH od aktivity alkalickej fosfatázy. Aktivita alkalickej fosfatázy z kosti bola stanovená na základe konverzie p-nitrofenylfosfátu. Maximum aktivity je pri pH 10,5. Pri fyziologickom pH 7 má alkalická fosfatáza iba 1 % maximálnej aktivity.

1.5 Stanovenie pH

Zmes podľa vynálezu obsahujúca hydroxid vápenatý, glycerol a paznehtový olej v hmotnostných pomeroch 30 hm. %, 30 hm. % respektíve 40 hm. % vztiahnuté na celkovú hmotnosť prípravku, alebo vodná suspenzia hydroxidu vápenatého bola prekrytá 30 ml pufru imidazol/HCl (1 mM, pH 7), po čom bolo pH roztoku kontinuálne sledované s použitím pH elektródy.

Z týchto meraní vyplynulo, že zmes hydroxidu vápenatého a glycerolu v paznehtovom oleji má zásadne rozdielne vlastnosti od vodnej suspenzie hydroxidu vápenatého. Obr. 4 ukazuje, že vodná suspenzia hydroxidu vápenatého spôsobuje okamžitý skok pH na pH 12, a že so zmesou glycerol/hydroxid vápenatý/paznehtový olej podľa vynálezu dochádza k pomalému vzostupu nad pH 10.

1.6. Stanovenie kolagénu

Ako už bolo uvedené, hlavná časť organickej substancie v kosti pozostáva z kolagénu, spojovacieho proteínu tkaniva. Rast kosti a regeneratívny proces sú spojené so syntézou nového kolagénu. Syntéza je nasledovaná ďalšími intracelulárnymi a extracelulárnymi pochodmi kolagénu. Rýchlosť syntézy kolagénu v tkanivovej kultúre je možné presne kvantifikovať s použitím rádioaktívneho prekurzoru kolagénu (^l4C-prolín). Tým je umožnené kvalitatívne a kvantitatívne zaznamenávanie účinku liečiv na syntézu kolagénu.

Celkový obsah kolagénu sa určuje takzvaným hydroxyprolínovým testom. V kolagéne sa vyskytuje hlavne aminokyselina hydroxyprolín a obsah hydroxyprolínu v iných proteínoch môže byť zanedbaný. Po uvoľnení aminokyselín z proteínov hydrolýzou (16 h pri 116 °C, 22 %-ná HCI) a po chemickej modifikácii (oxidácii 4-hydroxyprolínu na pyrol), sa celkový obsah hydroxyprolínu v zmesi testu kvantifikuje špecifickou farebnou reakciou s pdimetylaminobenzaldehydom.

1.7. Stanovenie rýchlosti syntézy kolagénu

Kolagén v tkanive a médiu sa získa Proffovou modifikáciou (1991) metódy Millera a Rhodesa [viď E. J. Miller a R. K. Rhodes Methods Enzymol. 82: 33 (1982)]. Cestou niekoľkých precipitačných krokov s následným centrifugovaním, bol kolagén kvantifikovaný SDS gélovou elektroforézou a následným meraním scintilácie (stanovenie špecifickej rádioaktivity). Na výpočet rýchlosti novej syntézy je obsah kolagénu, určený inkorporáciou ¹⁴C-prolínu, vztiahnutý na celkový obsah kolagénu určený hydroxyprolínovým testom

Kvantifikáciou biosyntézy kolagénu je možné skúmať efekt produktov hydroxidu vápenatého na tvorbu kosti.

Ako je uvedené v 1.7, biosyntéza kolagénu sa kvantifikuje technikou radiačného značkovania kolagénu. Jedným z konštituentov kolagénových vlákien je aminokyselina prolín. Ku kultivačnému médiu sa pridá presne definované množstvo značkovaného ^l4C-prolínu. Tento prolín sa počas inkubácie tkaniva inkor12 poruje do novo syntetizovaných proteínov. Po oddelení kolagénu od ostatných proteínov je po stanovení špecifickej rádioaktivity možné urobiť presnú výpoveď o stupni syntézy nového kolagénu.

Kolagén sa izoluje pomocou niekoľkých precipitačných krokov s nasledujúcim centrifugovaním a SDS gélovou elektroforézou. Pri špecifickej precipitácii kolagénu sú kolagénové vlákna oddelené od ostatných proteínov adjustáciou prídavkom chloridu sodného do príhodnej koncentrácie soli, pri ktorej nekolagénové proteíny zostávajú prevažne v roztoku, avšak kolagén sa z roztoku vylučuje ako precipitát. Nasledujúcim centrifugovaním sa kolagén sedimentuje. Pri SDS gélovej elektroforéze sa proteíny od seba oddeľujú na veľkosti závislým spôsobom. Proteíny migrujú v elektrickom poli v matrici z vysoko zosieťovaného polyméru (akrylamidu). Malé proteíny migrujú touto matricou rýchlo, pretože tá poskytuje menší odpor pre malé molekuly, zatiaľ čo veľké proteíny migrujú pomalšie, pretože ich mobilita je matricou značne bránená. Po vyfarbení sú proteíny v tomto géle viditeľné ako takzvané pásy. Týmto spôsobom, pri použití vnútorných štandardov veľkosti, je možné identifikovať proteíny na základe ich veľkosti.

Na ďalšiu analýzu, napríklad meranie rádioaktivity, je možné urobiť proteíny dostupné tým, že sa z gélu vykroja pásy, o ktoré je záujem.

Extrakcia kolagénu:

Kultivácia tkaniva (viď 1.2.) bola zastavená prídavkom 3 %-nej kyseliny octovej. Kolagén, ktorý sa rozpustil, bol vyzrážaný 2 M chloridom sodným pri 4 °C cez noc a potom znovu získaný centrifugovaním (1 h, 24.000 x g, 4 °C). Sediment bol vzatý do 10 ml 3 %-nej kyseliny octovej. Novo syntetizovaný kolagén prítomný v blokoch tkaniva bol zahrnutý do analýzy po mechanickej dezintegrácii tkanivových blokov. Zvyšky tkaniva boli znovu získané centrifugovaním (1 h, 45.000 x g, 4 °C). Po solubilizácii bol sediment frakcionovaný gélovou elektroforézou. Na kontrolu frakcionácie, boli proteíny v géle vyfarbované.

Po prebehnutí bol gél vykrájaný na 5 mm široké pásy kolmé na smer migrácie a fragmenty gélu boli prenesené do scintilačných nádobiek a bol uskutočnený odpočet na scintilačnom počítači.

Obr. 5 ukazuje porovnanie medzi vitálnym tkanivom a teplom denaturovaným tkanivom.

Toto porovnanie je zobrazené na obr. 5 na základe rozloženia rádioaktivity v géle. Kolagén, ako relatívne veľký proteín, sa nachádza v oblasti vzdialenej 2 cm od štartu.

Špecifický rádioaktívny pás môže byť priradený pásu kolagénu, ktorý je detegovateľný pomocou Coomassie - vyfarbenia.

Obr. 5, značkovanie 1, hlava stehennej kosti, spongióza, muž, 45 rokov;

rozdiel medzi výťažkom syntézy medzi vitálnym a teplom denaturovaným tkanivom (CPM; impulzy za minútu). Toto ukazuje distribúciu rádioaktivity v géle. Pás prislúchajúci kolagénu sa nachádza v oblasti vzdialenej asi 2 cm od štartu. Kolagénový pás sa nachádza iba u vitálneho tkaniva, čo značí, že detegovateľná rádioaktivita v géle zodpovedá syntéze nového kolagénu počas inkubácie.

Vitálne tkanivo vykazuje detegovateľný výťažok syntézy kolagénu, zatiaľ čo mŕtve tkanivo už ďalej žiadnu metabolickú aktivitu nevykazuje. To ukazuje, že detegovaný rádioaktívny kolagén je možné skutočne pričítať syntéze nového kolagénu v tkanivovej kultúre a nie nešpecifickej väzbe rádioaktívneho prolínu na proteíny kostného tkaniva. Pri všetkých experimentoch bola použité porovnateľné množstvá tkanivového materiálu (okolo 100 mg).

Môžu byť detegované iné radiačné značené pásy menšej veľkosti, ktoré eventuálne sú degradačnými produktami kolagénu. Degradácia kolagénu v tkanivovej kultúre sa pozoruje predovšetkým pri značkovacích pokusoch s inkubačnou dobou viac než 4 dni. Radiačné značený prolín je v géle tiež prítomný v malej miere, čo nebolo možné precipitáciami odstrániť úplne.

Tolerancia kostného tkaniva na slabo alkalické pH je zrejmá z experimentu paralelného experimentu znázorneného na obr. 5. V paralelnom experimente bol fyziologický Hepes pufer v kultivačnom médiu (pH 7,4) zamenený za bikarbonátový pufer (pH 8,0). Z toho vyplynulo, že alkalizácia kultivačného média na pH 8,0 mala za výsledok nemerateľný rozdiel v syntéze kolagénu proti pH 7,4. Nad pH 8,5 nemôže byť už zaznamenaný akýkoľvek vzrast regenerácie kolagénu vzťahujúci sa na spontánnu regeneráciu kolagénu.

Obrázky 6 až 9 ukazujú množstvo novo syntetizovaného kolagénu v testovaných násadách s rôznymi zmesami podľa vynálezu s kontrolnými násadami bez tejto zmesi alebo v neprítomnosti dvojsýtneho alebo viacsýtneho alkoholu. Rozdiel v množstve novo syntetizovaného kolagénu v kontrolnej násade a v testovanej násade je vyjadrený v percentách. 0 % znamená, že neexistuje vzrast množstva novo syntetizovaného kolagénu pri porovnaní s kontrolou; 100 % znamená, že regenerácia kolagénu vzrástla vplyvom zmesi podľa vynálezu dvakrát v porovnaní s kontrolou.

Z obr. 6 je zrejmé, že v štyroch pokusoch vzrástla syntéza kolagénu v porovnaní s kontrolou na medzi 100 % a 120 % pod vplyvom zmesi glycerol/hydroxid vápenatý/paznehtový olej (zloženie: 30 hm. % Ca(OH)₂, 30 hm. % glycerolu, 40 hm. % paznehtového oleja). Tento vzrast je signifikantný, pretože variácie experimentov vo výťažku syntézy kolagénu sú v rozsahu od 10 % do 20 %, zatiaľ čo nárasty zistené pod vplyvom zmesi glycerol/hydroxid vápenatý/paznehtový olej sú medzi 100 % a 120 %. Okrem toho evidentne nastáva tiež vzrast vo výťažku syntézy kolagénu v porovnaní so zmesou neobsahujúcou glycerol.

Z obr. 7 je zrejmé, že v štyroch pokusoch vzrástla syntéza kolagénu v porovnaní s kontrolou na medzi 100 % a 120 % pod vplyvom zmesi propylénglykol/hydroxid vápenatý/paznehtový olej (zloženie: 30 hm. % Ca(OH)₂, 30 hm. % propylénglykolu, 40 hm. % paznehtového oleja). Tento vzrast je signifikantný, pretože variácie experimentov vo výťažku syntézy kolagénu sú v rozsahu od 10 % do 20 %, zatiaľ čo nárasty zistené pod vplyvom zmesi propylénglykol/hydroxid vápenatý/paznehtový olej sú medzi 100 % a 120 %. Okrem toho e15 videntne nastáva tiež vzrast vo výťažku syntézy kolagénu v porovnaní so zmesou neobsahujúcou propylénglykol.

Z obr. 8 je zrejmé, že v štyroch pokusoch vzrástla syntéza kolagénu v porovnaní s kontrolou na medzi 100 % a 120 % pod vplyvom zmesi glycerol/hydroxid vápenatý/olivový olej (zloženie; 30 hm. % Ca(OH)₂, 30 hm. % glycerolu, 40 hm. % olivového oleja). Tento vzrast je signifíkantný, pretože variácie experimentov vo výťažku syntézy kolagénu sú v rozsahu od 10 % do 20 %, zatiaľ čo nárasty zistené pod vplyvom zmesi glycerol/hydroxid vápenatý/olivový olej sú medzi 100 % a 120 %. Okrem toho evidentne nastáva tiež vzrast vo výťažku syntézy kolagénu v porovnaní so zmesou neobsahujúcou glycerol.

Z obr. 9 je zrejmé, že v štyroch pokusoch vzrástla syntéza kolagénu v porovnaní s kontrolou na medzi 100 % a 140 % pod vplyvom zmesi glycerol/hydroxid vápenatý/oxid horečnatý/paznehtový olej (zloženie; 20 hm. % Ca(OH)2, 20 hm. % glycerolu, 20 hm. % oxidu horečnatého, 40 hm. % paznehtového oleja). Tento vzrast je signifíkantný, pretože variácie experimentov vo výťažku syntézy kolagénu sú v rozsahu od 10 % do 20 %, zatiaľ čo nárasty zistené pod vplyvom zmesi glycerol/hydroxid vápenatý/oxid horečnatý/paznehtový olej sú medzi 100 % a 140 %. Okrem toho evidentne nastáva tiež vzrast vo výťažku syntézy kolagénu v porovnaní so zmesou neobsahujúcou glycerol a MgO.

Príklad 2

Pri teste stability, pri ktorom nižšie uvedené zmesi boli po formulácii na hnetenia schopnú alebo krémovú hmotu skladované pri teplote miestnosti a vlhkosti okolia, bolo zistené, že zachovanie požadovanej konzistencie môže byť v prítomnosti dvojsýtneho alebo viacsýtneho alkoholu zväčšené najmenej o 50 % doby stálosti v porovnaní so vzorkami bez alkoholu.

Použité zmesi:

1) Zmes glycerol/hydroxid vápenatý/paznehtový olej (30 hm.%/30 hm.%/40 hm.

%) a

2) Zmes propylénglykol/hydroxid vápenatý/paznehtový olej (30 hm.%/30 hm.%/40 hm. %) a

3) Zmes glycerol/hydroxid vápenatý/olivový olej (30 hm.%/30 hm.%/40 hm. %)

zmes 1)	bez glycerolu	s glycerolom
hnetenia schopná konzistencia	6 mesiacov	12 mesiacov
krémová konzistencia	12 mesiacov	18 mesiacov

zmes 2)	bez propylénglykolu	s propylénglykolom
hnetenia schopná konzistencia krémová konzistencia	6 mesiacov 12 mesiacov	12 mesiacov 18 mesiacov

zmes 3)	bez olivového oleja-	s olivovým olejom
hnetenia schopná konzistencia	6 mesiacov	12 mesiacov
krémová konzistencia	12 mesiacov	18 mesiacov

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

Wfän-zooo

1. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje hydroxid vápenatý, netuhnúci olej rastlinného alebo živočíšneho pôvodu a prípadne farmaceutický prijateľné excipienty a okrem toho obsahuje dvojsýtny alebo viacsýtny alkohol.
2. Farmaceutický prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že pomer objemu hydroxidu vápenatého a objemu rastlinného alebo živočíšneho netuhnúceho oleja je 5/1 až 1/5.
3. Farmaceutický prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že pomer objemu hydroxidu vápenatého a objemu rastlinného alebo živočíšneho netuhnúceho oleja je 1/1.
4. Farmaceutický prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že pomer objemu hydroxidu vápenatého a objemu rastlinného alebo živočíšneho netuhnúceho oleja je 5/1.
5. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že obsahuje okrem toho síran bárnatý.
6. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že obsahuje okrem toho bielu vazelínu.
7. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že obsahuje okrem toho MgO.
8. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že dvojsýtny alebo viacsýtny alkohol je glycerol.
9. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že rastlinný alebo živočíšny netuhnúci olej je paznehtový olej.
10. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že v ňom rastlinný alebo živočíšny netuhnúci olej je olivový olej.
11. Spôsob výroby farmaceutického prípravku podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sa vmieša hydroxid vápenatý a dvojsýtny alebo viacsýtny alkohol do netuhnúceho oleja rastlinného alebo živočíšneho pôvodu.
12. Použitie farmaceutického prípravku, ktorý obsahuje hydroxid vápenatý, dvojsýtny alebo viacsýtny alkohol a netuhnúci olej rastlinného alebo živočíšneho pôvodu a prípadne farmaceutický prijateľné excipienty, na regeneráciu kolagénu.
13. Použitie farmaceutického prípravku, ktorý obsahuje hydroxid vápenatý dvojsýtny alebo viacsýtny alkohol a netuhnúci olej rastlinného alebo živočíš neho pôvodu a prípadne farmaceutický prijateľné excipienty, na výrobu liečiva podporujúceho regeneráciu kolagénu in vivo.