CZ20003828A3 - Přípravek složený z hydroxidu vápenatého, dvojmocného nebo vícemocného alkoholu a netuhnoucího oleje rostlinného nebo živočišného původu a jeho použití pro regeneraci kolagenu - Google Patents

Abstract

Popisuje se přípravek, který obsahuje hydroxid vápenatý, dvojmocný nebo vícemocný alkohol a netuhnoucí olej rostlinného nebo živočišného původu a popřípadě farmaceuticky přijatelné excipienty; výroba takového přípravku, použití takového přípravku pro regeneraci kolagenu a použití takového přípravku pro podporu regenerace kolagenu in vivo.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká přípravku složeného z netuhnoucího oleje rostlinného nebo živočišného původu, hydroxidu vápenatého a dvojmocného nebo vícemocného alkoholu, a vhodných farmaceuticky přijatelných excipientů pro přípravu takové směsi, užití takové směsi pro regeneraci kolagenu a užití takové směsi pro produkci léku pro vyvolání regenerace kolagenu in vivo.

Dosavadní stav techniky . - · r

Kost se skládá z kolem 60 % minerální substance (hydroxyapatit, fosforečnan vápenatý) a kolem 40 % organické hmoty, hlavně kolagenu. Metabolismus kosti je určován převážně souhrou kost tvořících buněk (osteoblasty/ a kost degradujících buněk (osteoklasty a osteocyty), jejichž působení je ve zdravé kosti ve vyváženém poměru.

Tvorba kosti může být rozdělena do dvou hlavních fází (a) syntéza organické tkáně (syntéza kolagenu) a (b) následná inkorporace minerální substance do předem vytvořené organické matrice zprostředkovávaná tak zvanými matricovými váčky.

Spojovací proteinová tkáň kolagenu představuje v kosti většinu organických substancí. Protein sestává ze tří šroubovité stočených polypeptidových řetězců, u nichž se složení aminokyselin může měnit, což vede k různosti jednotlivých typů kolagenu. Všem typům kolagenu je společné, že kolagenová vlákna mají výjimečně vysokou mechanickou pevnost. Tato pevnost-je založena na multiplicitě intramolekulárních a intermolekulárních vazeb kolagenových vláken, která tímto způsobem z husté sítě kolagenových vláken vytvářejí spojovací tkáň. Jak už bylo zmíněno, kostní tkáň je tvořena inkorporací minerálních substancí (hydroxyapatitu a fosforečnanu vápenatého) do této sítě. Výstavba kosti jako výsledek růstových a regeneračních procesů je vždy předcházena biosyntézou kolagenu.

Až dosud, v jakýchkoli případech poškození kosti byl regenerační proces kosti ·· * ·· ·O · ·

9999 ···« ··· ··· · · · ♦ • ·· · · ··· ·· ·

ponecháván sám sobě, nanejvýš byl podporován antibiotiky a kortikoidy, aby se předešlo jakémukoli risiku infekce ohrožujícímu léčebný proces.

Byly rovněž popsány některé faktory schopné ovlivňovat tvorbu kosti a regeneraci. Jsou to hlavně fýsikální faktory (mechanické a elektrické síly), hormony [na příklad parathyroidní hormon, kalcitonin, insulin, glukokortikoidy, 1,25-(OH)₂D3] a ne pevně definovaná skupina růstových faktorů s proteinovou charakteristikou (osteokalcin, osteonektin, insulinu podobné růstové faktory) - viz S. Wallach, L. V. Avioli, J. H. Carstens jun., Factors in Bone Formation, Calcified Tissue International 45: 4-6 (1989). Efekt koncentrace vodíkových iontů (pH) na metabolické procesy při regeneraci kosti nebyl dosud adekvátně zkoumán.

Dietz v DE-A-42 40 713 popisuje použití směsi hydroxidu vápenatého a paznehtového oleje pro regeneraci kolagenu po kostních úrazech. Tento přípravek z hydroxidu vápenatého a paznehtového oleje však trpí tou skutečností, že jeho stabilita je jako následek zmýdelňování velmi omezená. To může znehodnocovat účinek směsi.

Podstata vynálezu

Vynález byl tudíž založen na -záměru poskytnout zlepšenou směs s dlouhodobou stabilitou pro specifické zevní ovlivňování regeneračních procesů kosti stimulací nebo iniciací regenerace kolagenu.

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že je možné použitím přípravku složeného z hydroxidu vápenatého, dvojmocného nebo vícemocného alkoholu a netuhnoucího oleje rostlinného nebo živočišného původu a vhodných farmaceuticky přijatelných excipientů, zlepšit výrazně stabilitu přípravku a používáním tohoto přípravku při poškození nebo v poranění kosti je tedy in vivo zlepšována regenerace kolagenu.

Předkládaný vynález se tedy týká přípravku, který obsahuje hydroxid vápenatý, dvojmocný nebo vícemocný alkohol a netuhnoucí olej rostlinného nebo živočišného původu a vhodné farmaceuticky přijatelné excipienty.

Předkládaný vynález se dále týká způsobu výroby takového přípravku vmíšením hydroxidu vápenatého, dvojmocného nebo vícemocného alkoholu a vhodných farmaceuticky přijatelných excipientů do netuhnoucího oleje rostlinného nebo živočišného původu.

J

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99999 999 9 9 99 99

Předkládaný vynález se dále týká použití takového přípravku pro regeneraci kolagenu.

Dále se předkládaný vynález týká použití takového přípravku pro výrobu léčiva pro vyvolávání regenerace kolagenu in vivo.

Síran barnatý obsahující směsi hydroxidu vápenatého a paznehtového oleje byly užity v zubním lékařství jako pasta pro vyplňování zubních kořenů (DE-C 29 32 738). Směsi karboxylátového cementu, hydroxidu vápenatého a paznehtového oleje byly podobně v zubním lékařství použity jako dočasné fixační prostředky pro provisorní korunky (DE-C 34 13 864). Úloha hydroxidu vápenatého v předchozím případě je změnit kyselé prostředí v kanálku zubního kořene na alkalické, které způsobuje eliminaci zánětů a postupnou tvorbu bariery z tvrdé tkáně. V posledně zmíněném případě se využívá profylaktického účinku hydroxidu vápenatého na zánět zubní dřeně. Paznehtový olej slouží v obou případech jako mazací pomůcka, aby zabezpečovala nejprve jednoduché a úplné zaplnění zubních kanálků účinnou aktivní ingrediencí, hydroxidem vápenatým (a kontrastním činidlem, síranem barnatým) a za druhé zpomalení vytvrzování dočasných fixačních prostředků pro provisorní zubní korunky tak, že hydroxid vápenatý je rovněž schopen pronikat skrze jemné kanálky zuboviny ke dřeni a projevit tam svůj účinek. Žádná z obou referencí nedává nejmenší náznak, že směs podle vynálezu je schopná vyvolávat extensivní regeneraci kolagenu jako předpoklad pro regeneraci kosti. Termín přípravek , který je podle vynálezu nový a je v' následujícím používán, se týká farmaceutického přípravku (někdy v následujícím se týká také směsi), který obsahuje nejméně jednu ze shora zmíněných ingrediencí. Je vhodný zejména pro podávání lidem nebo zvířatům pro výzkum regenerace kolagenu jako předpokladu pro regeneraci kosti.

Ingredience směsi podle vynálezu jsou podrobněji popsány níže: ~

Netuhnoucí oleje rostlinného původu, které mohou být použity, mohou obsahovat jednu nebo více součástí z následujících rostlinných olejů:

oleje sojový, slunečnicový, ze semen řepky olejky, z bavlníkových semen, ze lněných semen, ricinový, palmový, z palmových jader, z kokosových ořechů a olivový.

Netuhnoucí rostlinné oleje, které mohou být použity jsou přednostně netuhnoucí oleje s vysokou stálostí při zahřívání jako sojový, slunečnicový a olivový olej a zejména olivový olej.

• ·* · ·» · · · · « · « « · · · · ·· * ···· ·· · · · · · ·· · » · · · · · · · · • · · · · · ···· • e · β» ··· ·· ·· «·

Netuhnoucí živočišné oleje, které mohou být použity, mohou obsahovat jednu nebo více součástí z následujících živočišných olejů:

rybí oleje, oleje ze zvířecích nožek a loje.

Živočišné oleje, které mohou být použity, jsou přednostně oleje ze zvířecích nožek, zejména paznehtový olej.

Dvojmocné nebo vícemocné alkoholy, které mohou být použity, mohou představovat dvojmocné alkoholy jako ethylenglykol, propylenglykol, butylenglykol, pentylenglykol, hexylenglykol a polyethylenglykoly jako diethylenglykol, triethylenglykol, polypropylenglykoly jako dipropylenglykol, trojmocné alkoholy jako glycerol, čtyřmocné alkoholy jako threitol, erythritol, pětimocné alkoholy jako arabitol, adonitol, xylitol, šestimocné alkoholy jako sorbitol, mannitol, dulcitol, nebo vyšší vícemocné alkoholy.

Přednost se dává používání dvojmocných a trojmocných alkoholů- jako je ethylenglykol, propylenglykol, butylenglykol, pentylenglykol, hexylenglykol a polyethylenglykoly jako diethylenglykol, triethylenglykol, polypropylenglykoly jako dipropylenglykol, trojmocné alkoholy jako glycerol, zejména glycerol jako dvojmocný nebo vícemocný alkohol.

Aniž bychom si přáli lpět na teorii, předpokládáme, že dvojmocný nebo vícemocný alkohol zabraňuje zmýdelňování rostlinného nebo živočišného netuhnoucíhooleje. To činí možné udržovat směs po dlouhý čas v hnětení schopné nebo-krémové konsistenci, takže biosyntéza kolagenu může vzrůstat a zlepšovat se.

Krémový, hnětení schopný přípravek se vyrobí podle vynálezu z jednotlivých ingrediencí. Hydroxid vápenatý se k přípravku přidává v množstvích 1-90 % hmotnostních, doporučení vhodnější je 10-70 hm. %, respektive nejlépe 20-60 hm. % vztaženo na celkovou hmotnost přípravku.

Netuhnoucí olej rostlinného nebo živočišného původu se přidává do komposice tak, aby vznikla krémová, hnětení-schopná konsistence a to s výhodou v množstvích 9-90 hm. %, vhodněji 10-60 hm. %, respektive 20-40 hm. % vztaženo na celkovou hmotnost přípravku.

Dvojmocný nebo vícemocný alkohol se přidává do komposice tak, aby vznikla krémová, hnětení schopná konsistence a to zpravidla výhodně v množstvích 1-40 hm. %, vhodněji 10-40 hm. %, respektive 20-30 hm. % vztaženo na celkovou hmotnost přípravku.

Preferované provedení předkládaného vynálezu se týká shora zmíněné směsi, která mimo to obsahuje MgO. Pro tento účel může být MgO přidáván v množstvích 190 hm. %, vhodněji 10-70 hm. %, respektive 20-60 hm. % vztaženo na celkovou hmotnost přípravku. V současnosti se má za to, že MgO je nejlépe přidávat v menších množstvích 10-20 hm. %. MgO se v kostním materiálu projevuje jako antacid, aby působil proti kyselému prostředí v kosti.

Poměr hydroxidu vápenatého k rostlinnému nebo živočišnému netuhnoucímu oleji ve směsi může podle vynálezu být 5/1 až 1/5, přednostně 5/1 nebo 1/1. Avšak vzhledem k specifickým okolnostem traumatu poranění může být nutná odchylka od upřednostňovaného poměru míšení.

Jestliže směs podle vynálezu má mít zvlášť hebkou a jemnou konsistenci, je také možné do ní vmíchat ropnou vaselinu. Obvykle je možné přidávat bílou vaselinu v množstvích 1-60 hm. %, vhodněji v množstvích 10-60 hm. %, respektive 20-40 hm. % vztaženo na celkovou hmotnost přípravku.

Třebaže není obvykle nutné monitorovat léčebné nebo regenerační procesy kosti radiologicky, přesto to může být u určitých případů indikováno. V tomto případě je také možné včlenit do směsi podle vynálezu síran barnatý jako kontrastní činidlo pro rentgenové paprsky. Avšak protože regenerace kolagenu následkem síranu barnatého je poněkud méně dobrá, přidává se barium sulfát do směsi podle vynálezu - pokud je to nutné v množství dostačujícím jen tak, aby směs byla právě radiograficky _ viditelná. '

Aplikace směsi podle vynálezu na nebo při poškození kosti se může v závislosti na její konsistenci provádět za použití injekčních stříkaček, špachtlí nebo štětců.

Existují četné možnosti použití směsi podle vynálezu v obecné chirurgii, ústní chirurgii, ortopedii, implantologii, traumatologii a podobně, protože směs podle vynálezu může být aplikována na nebo při poškození kostní tkáně jako jsou povrchy fraktur, vrtání, dutiny a podobně a na konkrétním místě aplikace bezprostředně vyvolává regeneraci kolagenu.

Vzhledem k tomu, jak je dobře známo, že se v některých relevantních lékařských disciplinách používají kovové fixační prostředky, je v tomto případě doporučenívhodné vyplňovat vyvrtané otvory připravené pro zavedení fixačních prostředků směsí podle vynálezu před vložením fixačních prostředků a teprve pak zavést fixační prostředek. Tímto způsobem je možné čelit prvotní osteolyze • · · β · 4 · * · · * · ···« • · · · 4 · · · 4 · • · · 44 · · · · · · • · · 4 · · · · · • · · · 4 · · 4 · » 4 · nevyhnutelné při takových procedurách a tak urychlit uložení nebo adaptaci fixačního prostředku do nebo k obklopující kostní tkáni a upevnění samotných fixačních prostředků v kostní tkáni.

Navíc přebytečná směs v tomto případě neinterferuje, protože po zavedení fixačních prostředků do vyvrtaných otvorů vyplněných směsí je tato znovu vypuzena nebo difunduje do spongiozy.

Mělo by být samozřejmé, že směs podle vynálezu a její ingredience musí být jak baleny, tak aplikovány za sterilních podmínek.

Velice překvapivým způsobem se také ukázalo, že směs podle vynálezu působí i bez podpory antibiotik a/nebo kortikoidů proti zánětlivé reakci způsobené poraněním kosti a rychle vyvolává její pokles. Její jednoduché složení a výrazná účinnost pro regeneraci kolagenu in vivo spolu se simultánní inhibicí zánětu, činí směs podle vynálezu komposicí, která bude v kostní traumatologii v budoucnosti nepostradatelná.

Následující příklady jsou určeny pro podrobné popsání vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Nejprve^- je úmyslem objasnit interakci mezi směsí podře vynálezu a tkání. Tudíž data o distribuci směsi podle vynálezu v kostní tkáni jsou předpokladem pro to aby bylo možné navrhnout teorie o možném mechanismu působení léčiva. Pokusy na tkáňových kulturách jsou proto citlivější než ty na kulturách buněk, protože pouze v tkáňové kultuře je možné studovat interakce mezi buňkami.

1. Mater iála metody

1.1. Tkáňový materiál

Lidská kostní tkáň pocházející z osteotomie se stala dostupnou z nemocnic.

Embryonální kostní tkáň byla získána z kuřecích embryí (Gallus domesticus) 10 ai17 dní starých.

1.2. Tkáňová kultura

Tkáň byla bezprostředně po odstranění přenesena do transportního media. Kostní fragmenty o velikosti kolem 2 mm³ byly připraveny za sterilních podmínek a po stanovení hmotnosti byly přímo použity do pokusů.

Pro tkáňové kultury bylo použito Earl-ovo modifikované Eagle-ovo minimální esenciální medium (MEM) s 20 mM Hepes pufru.

Před začátkem pokusu byly k mediu přidány 4 % fetálního telecího séra a 1 % antibiotického roztoku (penicillin / streptomycin / amfotericin B) a pro značkovací pokusy dodatečně 1 mM β-aminopropionitrilu, 2 mM askorbátu sodného a 2 až 10 pg isotopů (¹⁴C-prolin). Kultivace se prováděla v 25 ml Erlenmeyerových oňkách při 37°C ve vodní lázni za třepání s nejnižší frekvencí.

1.3. Stanovení respiračni- aktivity ^r

Respiračni aktivita je citlivým ukazatelem metabolické aktivity tkáně. I malé změny fysiologických podmínek tkáně se odrážejí v měřitelné změně respiračni aktivity. .

Pro stanovení respiračni aktivity byl použit Clarkův sensor ( elektrody platina/stříbro v nasyceném roztoku chloridu draselného). Při aplikaci napětí 0,8 V na elektrodu je proud redukce kyslíku přímo úměrný parciálnímu tlaku kyslíku v měřeném roztoku (mediu kultury). Dodávání kyslíkem nasyceného média, kde parciální tlak kyslíku klesá pod určitou hodnotu a analytická data se kontrolují počítačem.

Kostní tkáň má obvykle respiračni aktivitu 2-3 μΙ O₂ x min'¹ x g'¹. Respiračni aktivita je tedy v oblasti řádu velikosti respiračni aktivity zbývající svalové tkáně. Typická respiračni aktivita kostní tkáně je uvedena na obr. 1. Pilovitý průběh respiračni křivky uvedený na obr. 1 pochází z té skutečnosti, že když parciální tlak kyslíku“v měřeném roztoku klesne pod určitou hodnotu, člodává se čerstvé kyslíkem nasycené medium.

Obr. 2 ukazuje průměrné hodnoty spotřeby kyslíku ze tří měření. Spotřeba kyslíku embryonální kostní tkání (Gallus domesticus) byla stanovena ve tkáňové kultuře za použití Clarkova sensoru. Spotřeba kyslíku je mezi 3 a 5 μΙ O₂ x min'¹ x g'¹. Respiračni aktivita klesá o kolem 50 % v průběhu doby, která je zcela normální pro tkáňové kultury.

♦ φφφ • · · · · • φ φ φ ♦ φ φ ♦ • φ φ φ φ φ · φφ φφφ φφ φ • φ φ φφφφ φφφ · φ ·» φ »

1.4. Enzymové eseje

Enzymem, který se považuje za úzce spojený s mineralisací kostní tkáně, je alkalická fosfatáza. Tento enzym byl charaterisován před nějakým časem, avšak stále se vedou diskuse o funkci tohoto enzymu při mineralisaci. Vzhledem k tomu, že je úzká souvislost mezi aktivitou osteoblastů a aktivitou alkalické fosfatázy, je možné pohlížet na alkalickou fosfatázu jako na ukazatele aktivity osteoblastů. Zvýšené úrovně aktivity alkalické fosfatázy v krevním séru byly nalezeny během růstu kostry v dětství, během regenerace kosti a při poruchách metabolismu kosti.

Aktivita alkalické fosfatázy byla stanovována v surovém extraktu. Pro tento účel bylo 500 mg tkáně smíseno s 1 ml rozkladného pufru a nožem rozřezáno. Na to potom bylo přidáno 500 mg mlecích perel a 20 minut bylo prováděno rozmělňování. Po centrifugaci byl surový extrakt použit pro měření.

Alkalická fosfatáza byla dětegována na základě konveise p-nitrofenylfosfátu na nitrofenol a fosfát. Nitrofenol, který při hydrolýze vzniká je žlutý a tudíž může být detegován fotometrem při vlnové délce 410 nm.

Obr. 3 ukazuje závislost pH na aktivitě alkalické fosfatázy. Aktivita alkalické fosfatázy z kosti byla stanovena na základě konverse p-nitrofenylfosfátu. Maximum aktivity je při pH 10,5. Při fýsiologickém pH 7 má alkalická fosfatáza pouze 1 % maximální aktivity.

1.5. S t a n o v e n i pH

Směs podle vynálezu obsahující hydroxid vápenatý, glycerol a paznehtový olej v hmotnostních poměrech 30 hm. %, 30 hm. % respektive 40 hm. % vztaženo na celkovou hmotnost přípravku, anebo vodná suspense hydroxidu vápenatého byla překryta 30 ml pufru imidazol / HCI (1 mM, pH 7), po čemž bylo pH roztoku kontinuálně sledováno za použití pH elektrody.

Z těchto měření vyplynulo, že směs hydroxidu vápenatého a glycerolu v paznehtovém oleji má zásadně rozdílné vlastnosti od vodné suspense hydroxidu vápenatého. Obr. 4 ukazuje, že vodná suspense hydroxidu vápenatého způsobuje okamžitý skok pH na pH 12, a že se směsí glycerol/hydroxid vápenatý/paznehtový olej podle vynálezu dochází k pomalému vzestupu nad pH 10.

• ·

1.6. Stanovení kolagenu

Jak již bylo zmíněno, hlavní část organické substance v kosti sestává z kolagenu, spojovacího proteinu tkáně. Růst kosti a regenerativní proces jsou spojeny se syntézou nového kolagenu. Syntéza je následována dalšími intracelulárními a extracelulárními pochody kolagenu. Rychlost syntézy kolagenu ve tkáňové kultuře je možné přesně kvantifikovat za použití radioaktivního prekursoru kolagenu (¹⁴Cprolin). Tím je umožněno kvalitativní a kvantitativní zaznamenávání účinku léčiv na syntézu kolagenu.

Celkový obsah kolagenu se určuje tak zvaným hydroxyprolinovým esejem. V kolagenu se vyskytuje hlavně aminokyselina hydroxyprolin a obsah hydroxyprolinu v jiných proteinech může být zanedbán. Po uvolnění aminokyselin z proteinů hydrolýzou (16 h při 116°C, 22 %-ní HCI) a po chemické modifikaci (oxidaci 4hydroxyprolinu na pyrrol), se celkový obsah hydraxyprolinu ve směsi eseje kvantifikuje specifickou barevnou reakcí s p-dimethylaminobenzaldehydem.

1.7. Stanovení rychlosti syntézy kolagenu

Kolagen ve tkáni a mediu se získá Proff-ovou modifikací (1991) metody Millera a Rhodese [ viz E. J. Miller a R. K. Rhodes Methods Enzymof. 82: 33 (1982)]. Cestou několika precipitačních. kroků s následným centrifugováním, byl kolagen kvantifikován SDS gelovou elektroforesou a následným měřením scintilace (stanovení specifické radioaktivity). Pro výpočet rychlosti nové syntézy, je obsah kolagenu určený inkorporací ¹⁴C-prolinu vztažen na celkový obsah kolagenu určený hydroxyprolinovým esejem.

Kvantifikací biosyntézy kolagenu je možné zkoumat efekt produktů hydroxidu vápenatého na tvorbu kostí.

Jak uvedeno v 1.7,’biosyntéza kolagenu se kvantifikuje technikou radiačního značkování kolagenu. Jedním z konstituentů kolagenových vláken je aminokyselina prolin. Ke kultivačnímu mediu se přidá přesně definované množství značkovaného ¹⁴C-prolinu. Tento prolin se během inkubace tkáně inkorporuje do nově syntetizovaných proteinů. Po oddělení kolagenu od ostatních proteinů, je po stanovení specifické radioaktivity možné, učinit přesnou výpověď o stupni syntézy nového kolagenu.

Kolagen se isoluje pomocí několika precipitačních kroků s následujícím centrifugováním a SDS gelovou elektroforesou. Při specifické precipitaci kolagenu • · 4

tt · * • » · · » · · · jsou kolagenová vlákna oddělena od ostatních proteinů adjustací přídavkem chloridu sodného do příhodné koncentrace soli, při které nekolagenové proteiny zůstávají převážně v roztoku, avšak kolagen se z roztoku vylučuje jako precipitát. Následujícím centrifugováním se kolagen sedimentuje. Při SDS gelové elektroforese se proteiny od sebe oddělují na velikosti závislým způsobem. Proteiny migrují v elektrickém poli v matrici z vysoce zesíťovaného polymeru (akrylamidu). Malé proteiny migrují touto matricí rychle, protože ta poskytuje menší odpor pro malé molekuly, zatímco velké proteiny migrují pomaleji, protože jejich mobilita je matricí značně bráněna. Po vybarvení jsou proteiny v tomto gelu viditelné jako tak zvané pásy. Tímto způsobem, při použití vnitřních standardů velikosti, je možné identifikovat proteiny na základě jejich velikosti.

Pro další analýzu, na příklad měření radioaktivity, lze učinit proteiny dostupné tím, že se z gelu vykrojí pásy, o které je zájem. r

Extrakce kolagenu:

Kultivace tkáně (viz 1.2.) byla zastavena příd_avkem 3 %-ní kyseliny octové. Kolagen, který se rozpustil, byl vysrážen 2 M chloridem sodným při 4°C přes noc a potom znovu získán centrifugováním (1 h, 24.000 x g, 4°C). Sediment byl vzat do 10 ml 3 %-ní kyseliny octové. Nově syntetizovaný kolagen přítomný v blocích tkáně byl zahrnut do analýzy po mechanické desintegraci tkáňových bloků. Zbytky tkáně byly znovu získány centrifugováním (1 h, 45.000 x g, 4°C). Po solubilizaci byl sediment frakcionován gelovou elektroforesou. Pro kontrolu frakcionace, byly proteiny v gelu vybarvovány.

Po proběhnutí byl gel vykrájen na 5 mm široké pásky kolmé ke směru migrace a fragmenty gelu byly přeneseny do scintilačních nádobek a byl proveden odečet na scintilačním počítači.

Obr. 5 ukazuje srovnání mezi vitální tkání a-teplem denaturovanou tkání.

Toto srovnání je zobrazeno na obr. 5 za základě rozložení radioaktivity v gelu. Kolagen jako relativně velký protein se nalézá v oblasti vzdálené 2 cm od startu.

Specifický radioaktivní pás může být přiřazen pásu kolagenu, který je detegovatelný pomocí Coomassie-vybarvení.

Obr. 5, značkování I, hlava stehenní kosti, spongiosa, muž, 45 let: rozdíl mezi výtěžkem syntézy mezi vitální a teplem denaturovanou tkání (CPM: impulsy za minutu). Toto u_kazuje distribuci radioaktivity v gelu. Pás příslušející • · · · ·· • · · · · ♦ · « ··· · · · • · · · · · «·· ·· 999 99 kolagenu se nalézá v oblasti vzdálenosti kolem 2 cm od startu. Kolagenový pás se nachází pouze u vitální tkáně, což značí, že detegovatelná radioaktivita v gelu odpovídá syntéze nového kolagenu během inkubace.

Vitální tkáň vykazuje detegovatelný výtěžek syntézy kolagenu, zatímco mrtvá tkáň už dále žádnou metabolickou aktivitu nevykazuje. To ukazuje, že detegovaný radioaktivní kolagen lze skutečně přičítat syntéze nového kolagenu v tkáňové kultuře a nikoliv nespecifické vazbě radioaktivního prolinu na proteiny kostní tkáně. Při všech experimentech byla použita srovnatelná množství tkáňového materiálu (kolem 100 mg).

Mohou být detegovány jiné radiačně značené pásy menší velikosti, které eventuálně jsou degradačními produkty kolagenu. Degradace kolagenu v tkáňové kultuře se pozoruje zejména při značkovacích pokusech s inkubační dobou více než 4 dny. Radiačně značený prolin je v gelu rovněž přítomen v malé míře, což nebylo možné precipitacemi odstranit úplně.

Tolerance kostní tkáně na slabě alkalické pH je zřejmá z experimentu paralelním experimentu ilustrovanému na obr. 5. V paralelním experimentu byl fysiologicky Hepes pufr v kultivačním mediu (pH 7,4) zaměněn za bikarbonátový pufr (pH 8,0). Z toho vyplynulo, že alkalisace kultivačního media na pH 8,0 měla za výsledek neměřitelný rozdíl v syntéze kolagenu proti pH 7,4. Nad pH 8,5 nemůže být už zaznamenán jakýkoli vzrůst regenerace kolagenu vztahující se ke spontánní regeneraci kolagenu.

Obrázky 6 až 9 ukazují množství nově syntetizovaného kolagenu v testovaných násadách s různými směsemi podle vynálezu s kontrolními násadami bez této směsi nebo v nepřítomnosti dvojmocného nebo vícemocného alkoholu. Rozdíl v množství nově syntetizovaného kolagenu v kontrolní násadě a v testované násadě je vyjádřen v procentech. 0 % znamená, že neexistuje vzrůst množství nově syntetizovaného kolagenu při srovnání s kontrolou; 100 % znamená, že regenerace kolagenu vzrostla vlivem směsi podle vynálezu dvakrát ve srovnání s kontrolou.

Z obr. 6 je zřejmé, že ve čtyřech pokusech vzrostla syntéza kolagenu ve srovnání s kontrolou na mezi 100 % a 120 % pod vlivem směsi glycerol / hydroxid vápenatý / paznehtový olej (složení: 30 hm. % Ca(OH)2, 30 hm. % glycerolu, 40 hm. % paznehtového oleje). Tento vzrůst je signifikantní, protože variace experimentů ve výtěžku syntézy kolagenu jsou v rozsahu od 10 % do 20 %, zatímco nárůsty zjištěné pod vlivem směsi glycerol / hydroxid vápenatý / paznehtový olej jsou mezi

4 4 4	β	44	»4	4 4
» 4 *	4 4 4	•	•	4	•
♦ 4«·	4 4	4	4	4	•	»
						♦
4 4 »	4 4	•	4	4	4	4
444 44	4 4 4	• 4	4 ♦		4 4

100 % a 120 %. Vedle toho evidentně nastává také vzrůst ve výtěžku syntézy kolagenu ve srovnání se směsí neobsahující glycerol.

Z obr. 7 je zřejmé, že ve čtyřech pokusech vzrostla syntéza kolagenu ve srovnání s kontrolou na mezi 100 % a 120 % pod vlivem směsi propylenglykol / hydroxid vápenatý / paznehtový olej (složení: 30 hm. % Ca(OH)₂, 30 hm. % propylenglykolu, 40 hm. % paznehtového oleje). Tento vzrůst je signifikantní, protože variace experimentů ve výtěžku syntézy kolagenu jsou v rozsahu od 10 % do 20 %, zatímco nárůsty zjištěné pod vlivem směsi propylenglykol / hydroxid vápenatý / paznehtový olej jsou mezi 100 % a 120 %. Vedle toho evidentně nastává také vzrůst ve výtěžku syntézy kolagenu ve srovnání se směsí neobsahující propylenglykol.

Z obr. 8 je zřejmé, že ve čtyřech pokusech vzrostla syntéza kolagenu ve srovnání s kontrolou na mezi 100 % a 120 % pod vlivem směsi glycerol / hydroxid vápenatý / olivový olej (složení: 30 hm. % Ca(OH)₂, 30 hm. % glycerolu, 40 hm. % olivového oleje). Tento vzrůst je signifikantní, protože variace experimentů ve výtěžku syntézy kolagenu jsou v rozsahu od 10 %_do 20 %, zatímco nárůsty zjištěné pod vlivem směsi glycerol / hydroxid vápenatý / olivový olej jsou mezř 100 % a 120 %. Vedle toho evidentně nastává také vzrůst ve výtěžku syntézy kolagenu ve srovnání se směsí neobsahující glycerol.

Z obr. 9 je zřejmé, že ve čtyřech pokusech vzrostla syntéza kolagenu ve srovnání s kontrolou na mezi 100 % a 140 % pod vlivem směsi glycerol / hydroxid vápenatý / oxid hořečnatý / paznehtový olej (složení: 20 hm. % Ca(OH)₂, 20 hm. % glycerolu, 20 hm. % oxidu hořečnatého, 40 hm. % paznehtového oleje). Tento vzrůst je signifikantní, protože variace experimentů ve výtěžku syntézy kolagenu jsou v rozsahu od 10 % do 20 %, zatímco nárůsty zjištěné pod vlivem směsi glycerol / hydroxid vápenatý / oxid hořečnatý / paznehtový olej jsou mezi 100 % a 140 %. Vedle toho evidentně nastává také vzrůst ve výtěžku syntézy kolagenu ve srovnání se směsí neobsahující glycerol a MgO.

Příklad 2

Při testu stability, při kterém níže uvedené směsi byly po formulaci na hnětení schopnou nebo krémovou hmotu skladovány při teplotě místnosti a vlhkosti okolí, bylo zjištěno, že zachování požadované konsistence může být v přítomnosti dvojmocného nebo vícemocného alkoholu zvětšeno nejméně o 50 % doby stálosti ve srovnání se vzorky bez alkoholu.

*

Použité směsi:

1) Směs glycerol / hydroxid vápenatý / paznehtový olej (30 hm.% / 30 hm.% / 40 hm. %) a

2) Směs propylenglykol / hydroxid vápenatý / paznehtový olej (30 hm.% / 30 hm.% / 40 hm. %) a

3) Směs glycerol / hydroxid vápenatý / olivový olej (30 hm.% / 30 hm.% / 40 hm. %)

Směs 1)	bez glycerolu	s glycerolem
hnětení schopná konsistence	6 měsíců	12 měsíců
krémová konsistence	12 měsíců	r 18 měsíců

Směs 2)	bez propylenglykolu	s propylenglykolem
hnětení schopná konsistence	6 měsíců	12 měsíců
krémová konsistence	12 měsíců	18 měsíců

Směs 3) -	bez olivového oleje	’ s olivovým olejem
hnětení schopná konsistence	6 měsíců	12 měsíců
krémová konsistence	12 měsíců	18 měsíců

•» · # · · » · * · *

Claims (13)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutický přípravek vyznačený tím, že obsahuje hydroxid vápenatý, netuhnoucí olej rostlinného nebo živočišného původu a popřípadě farmaceuticky přijatelné excipienty a navíc obsahuje dvojmocný nebo vícemocný alkohol.
2. 2. Farmaceutický přípravek podle nároku 1 vyznačený tím, že poměr objemu hydroxidu vápenatého a objemu rostlinného nebo živočišného netuhnoucího oleje je 5/1 až 1/5.
3. 3. Farmaceutický přípravek podle nároku 1 vyznačený tím, že poměr objemu -hydroxidu vápenatého a objemu rostlinného nebo živočišného netuhnoucího oleje je 1/1.
4. 4. Farmaceutický přípravek podle nároku 1 vyznačený tím, že poměr objemu hydroxidu vápenatého a objemu rostlinného nebo živočišného netuhnoucího oleje je 5/1.
5. 5. Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 vyznačený tím, že obsahuje navíc síran barnatý.
6. 6. Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 vyznačený tím, ž e obsahuje navíc bílou vaselinu.
7. 7. Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků vyznačený tím,- že obsahuje navíc MgO.
8. 8. Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 vyznačený tím, že dvojmocný nebo vícemocný alkohol je glycerol.
9. 9. Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 vyznačený tím, že rostlinný nebo živočišný netuhnoucí olej je paznehtový olej.

   ΰο ~ Wf
10. 10.

    • · »·· • * ·· • »t 99 ·*

    9 9 9 9 · »· · • · · 4 ♦ · ♦ ·· · · · 9 9 9

    9 9 9 9 9 9 9

    99 9 ♦· 9 9

    Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 vyznačený tím, že v něm rostlinný nebo živočišný netuhnoucí olej je olivový olej.
11. 11. Způsob výroby farmaceutického přípravku podle kteréhokoliv z předcházejících nároků vyznačený tím, že se vmísí hydroxid vápenatý a dvojmocný nebo vícemocný alkohol do netuhnoucího oleje rostlinného nebo živočišného původu.
12. 12. Použití farmaceutického přípravku, který obsahuje hydroxid vápenatý, dvojmocný nebo vícemocný alkohol a netuhnoucí olej rostlinného nebo živočišného původu a popřípadě farmaceuticky přijatelné excipienty, pro regeneraci kolagenu.
13. 13. Použití farmaceutického přípravku, který obsahuje hydroxid vápenatý, dvojmocný nebo vícemocný alkohol a netuhnoucí olej rostlinného nebo živočišného původu a popřípadě farmaceuticky přijatelné excipienty, pro výrobu léčiva podporujícího regeneraci kolagenu in vívo.