CN1198659C

CN1198659C - 药物制剂,其制法和在制备促进胶原再生的药物中的应用

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Publication number: CN1198659C
Application number: CNB998050725A
Authority: CN
Inventors: 乔治·迪茨
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-04-16
Filing date: 1999-04-16
Publication date: 2005-04-27
Anticipated expiration: 2019-04-16
Also published as: AU3818099A; CA2320135A1; ES2184450T3; CN1297364A; JP2002512088A; EP1071481B1; AU745434B2; DE19980655D2; EP1071481A1; HK1035675A1; WO1999053969A1; IL138049A0; BR9909670A; TR200002962T2; PL192094B1; IL138049A; PL345210A1; ATE225191T1; SK15212000A3

Abstract

本发明公开了一种制剂，它包含氢氧化钙、二元醇或多元醇、植物或动物来源的固定油以及可适当加入的可药用赋形剂；还公开了这种制剂的制备方法，该制剂用于胶原再生的用途，以及该制剂在制备用于促进体内胶原再生的药物中的用途。

Description

药物制剂，其制法和在制备促进胶原再生的药物中的应用

本发明涉及一种由植物或动物来源的固定油、氢氧化钙、二元醇或多元醇以及可适当加入的可药用赋形剂组成的制剂。还涉及这种混合物的制备，这种混合物用于胶原再生的用途，以及这种混合物在制备用于促进体内胶原再生的药物中的用途。

骨由大约60％矿物质(羟基磷灰石、磷酸钙)和大约40％有机物组成，其中有机物主要是胶原。骨代谢主要由构造骨的细胞(成骨细胞)和降解骨的细胞(破骨细胞和骨细胞)的相互作用决定，它们在健康骨中的活性处于平衡关系。

骨的形成可以分为两个主要阶段：(a)合成有机组织(胶原合成)和(b)随后由所谓的基质囊泡介导在先前提供的有机基质中引入矿物质。

结缔组织蛋白胶原构成了骨中有机物的绝大部分。该蛋白质由三个螺旋状盘旋的多肽链组成，这些多肽链中的氨基酸组成可能不同，这导致了各种类型胶原的多样性。胶原纤维具有特别大的机械强度是所有类型的胶原共有的特性。此强度是基于胶原纤维的分子内和分子间键的多重性，以这种方式，它们形成了结缔组织的紧凑的胶原纤维网状结构。正如已提到过的那样，骨组织是通过在该网状结构中引入矿物质(羟基磷灰石和磷酸钙)而形成的。对于骨的构建来说，生长或再生过程的作用优先于胶原生物合成的作用。

迄今为止，如果发生任何原因的骨损伤，骨的再生过程都只能听其自然，最多借助抗生素和肾上腺皮质激素来防止发生任何可能危害愈合过程的感染。

现已公开了几种能影响骨的形成和再生的因子。这主要是物理因子(机械力和电力)、激素(例如甲状旁腺激素、降钙素、胰岛素、糖皮质激素、1，25-(OH)₂D3)和一组没有严格定义的、具有蛋白质特性的生长因子(骨钙蛋白、骨粘连蛋白、“胰岛素样生长因子”)-参见S.Wallach，L.V.Avioli，J.H.Carstensjun.“骨形成中的因子”，Calcified Tissue International(《国际钙化组织杂志》)45：4-6(1989)。在骨的再生中，氢离子浓度(pH)对代谢过程的影响至今仍未得到充分的研究。

Dietz在DE-A-42 40 713中描述了将氢氧化钙和牛脚油的混合物用于骨损伤后的胶原再生。但是，这种氢氧化钙和牛脚油的制剂因皂化作用的结果使得其稳定性非常有限。这可能削弱该混合物的作用。

因此，本发明是基于这样一个目的，即提供一种具有长时间稳定性的改良混合物，它通过刺激或引发胶原再生而对骨再生过程产生特定的外部影响。

现在我们已令人惊奇地发现，有可能通过使用一种由氢氧化钙、二元醇或多元醇、植物或动物来源的固定油以及可适当加入的可药用赋形剂组成的制剂来显著提高该制剂的稳定性，并因此通过在骨损伤中使用此制剂而提高体内胶原再生的程度。

因此，本发明涉及包含氢氧化钙、二元醇或多元醇和植物或动物来源的固定油的制剂，其中还可适当地包含可药用赋形剂。

本发明还涉及一种制备该制剂的方法，所述方法是：将氢氧化钙和二元醇或多元醇，适当时还包括可药用赋形剂，混合到植物或动物来源的固定油中。

本发明还涉及将这种制剂用于胶原再生。

本发明还涉及这种制剂在制备用于促进体内胶原再生的药物中的用途。

现已在牙科学中将氢氧化钙和牛脚油的含有硫酸钡的混合物用作牙根填充糊剂(DE-C 29 32 738)。羧化粘固粉、氢氧化钙和牛脚油的混合物同样也已在牙科学中作为临时固定剂用于临时顶盖(DE-C 3413 864)。在前一种情形下，氢氧化钙的任务是将牙根管中的酸性环境转换为碱性，从而消除炎症和硬组织屏障的逐渐形成。在后一种情形下，利用的是氢氧化钙的牙髓炎预防作用。在这两种情形下，牛脚油均充当糊化辅助剂，首先是为了确保用实际活性成分氢氧化钙(和造影剂硫酸钡)简单而又完全地填充牙根管，其次是为了减慢用于临时顶盖的临时固定剂的凝固，以使氢氧化钙也能通过细小的牙本质小管渗透到牙髓中并在此处发挥其作用。这两篇参考文献都没有给出丝毫暗示：按照本发明的混合物能够诱导广泛的、作为骨再生先决条件的胶原再生。

术语“制剂”按照本发明是新的并在下文中使用，指的是至少含有上面所提到的成分的药物制剂(下文中有时也称作混合物)。它特别适于对人或动物给药，用于研究作为骨再生先决条件的胶原再生。

下面将更详细地描述按照本发明的混合物的成分：

可以使用的植物来源的固定油包括下列植物油中的一种或几种成分：大豆油、向日葵油、菜子油、棉子油、亚麻子油、蓖麻油、棕榈油、棕榈仁油、椰子油和橄榄油。

可以使用的植物固定油优选对热具有高稳定性的植物固定油，诸如大豆油、向日葵油和橄榄油，特别是橄榄油。

可以使用的动物固定油包括下列动物油中的一种或几种成分：鱼油、动物脚油和牛油。

可以使用的动物油优选动物脚油，特别是牛脚油。

可以使用的二元醇或多元醇包括二元醇，诸如乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇；和聚乙二醇，诸如二甘醇、三甘醇；聚丙二醇，诸如一缩二丙二醇；三元醇，诸如甘油；四元醇，诸如苏糖醇、赤藓糖醇；五元醇，诸如阿糖醇、福寿糖醇、木糖醇；六元醇，诸如山梨糖醇、甘露糖醇、半乳糖醇；或高级多元醇。

优选使用二元醇和三元醇，诸如乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇，和聚乙二醇，诸如二甘醇、三甘醇，聚丙二醇，诸如一缩二丙二醇，和三元醇，诸如甘油。特别优选用甘油作为“二元醇或多元醇”。

不希望受到理论的束缚，我们假定该二元醇或多元醇阻止了植物或动物固定油的皂化。这使得有可能使该混合物保持长时间的可揉捏或乳脂状稠度，从而可增加和改善胶原的生物合成。

按照本发明，从单独的成分制备乳脂状、可揉捏的制剂。将氢氧化钙加入该制剂中，以该制剂的总重量计，加入量优选为1-90重量％，更方便地优选为10-70重量％，首选为20-60重量％。

将植物或动物来源的固定油加入到该组合物中，使得产生乳脂状、可揉捏的稠度，以该制剂的总重量计，加入量优选为9-90重量％，更优选为10-60重量％，首选为20-40重量％。

将二元醇或多元醇加入到该组合物中，使得产生乳脂状、可揉捏的稠度，以该制剂的总重量计，加入量通常优选为1-40重量％，更优选为10-40重量％，首选为20-30重量％。

本发明的一个优选实施方案涉及上面所提到的混合物，它另外还包含MgO。出于此目的加入的MgO的量，以该制剂的总重量计，可以是1-90重量％，优选为10-70重量％，更优选为20-60重量％。不过，现在假定MgO将优选以小于10-20重量％的量加入。MgO在骨物质中充当抗酸剂，以中和骨中的酸性环境。

在按照本发明的混合物中，氢氧化钙与植物或动物固定油的比为5/1-1/5，优选为5/1或1/1。但是，由于创伤的具体情况，可能需要偏离优选混合比。

如果本发明的混合物要具有特别柔软和光滑的稠度，也有可能向其中加入白凡士林。以该制剂的总重量计，白凡士林的加入量通常可能是1-60重量％，优选为10-60重量％，更优选为20-40重量％。

尽管一般不需要对骨的愈合或再生过程进行放射学监测，但在有些情况下也可能需要它。在这种情况下，也可能在本发明的混合物中加入硫酸钡作为X射线造影剂。不过，由于用硫酸钡导致的胶原再生不是很好，因此如果需要的话，硫酸钡仅以刚好足够的量加入本发明的混合物中(例如基于该制剂总重量的10-20重量％)，使得该混合物刚好能被放射照相显现出来。

本发明的混合物可以根据其稠度，借助于注射器、软膏刀或刷子应用到骨损伤上或骨损伤中。

本发明的混合物在普通外科和矫形外科、矫形术、植入学、创伤学等中有很多可能的用途，因为本发明的混合物可以应用到骨组织损伤上或其中，诸如折断面、钻孔、空洞等，并立即在体内在特定的应用部位诱导胶原再生。

众所周知，在一些相关的医学学科中使用金属固定剂，但在这种情况下，最好还是在将固定剂插入预备插入固定剂的钻孔中之前，先向其中填充本发明的混合物，然后再加入固定剂。以这种方式有可能对抗用这类方法难免造成的初期骨质溶解，由此加速固定剂在周围的骨组织中或对周围骨组织的拟合或适应，加速骨组织对固定剂自身的固定。

而且，在这种情况下，过量的混合物不会造成干扰，因为随着在用该混合物填充的钻孔中加入固定剂，它就既不会再被压出来，也不会扩散到骨松质中。

不言而喻，本发明的混合物及其各成分必须在无菌条件下包装和应用。

还以非常令人惊奇的方式呈现出一个事实，即，本发明的混合物即使没有抗生素和/或肾上腺皮质激素的帮助也能对抗骨损伤引起的炎症反应，并迅速地使炎症平息。本发明混合物的这种简单的组合和显著的体内胶原再生效力，同时又能抑制炎症，都使得它将成为一种在未来的骨创伤学中不可缺少的组合物。

以下实施例是为了更详细地阐述本发明。

实施例1

首先想要说明的是本发明的混合物与组织之间的相互作用。因此，有关本发明的混合物在骨组织中的分布的数据，是有可能提出关于药物的适当作用机理的理论的先决条件。因此，有关组织培养物的实验比对细胞培养物的实验更切合实际，因为只有在组织培养物中才有可能研究细胞与细胞间的相互作用。

1、材料与方法

1.1组织材料

通过医院可获得由骨切开术产生的人骨组织。

从10-17日大的鸡胚(家庭原鸡Gallus domesticus)得到胚性骨组织。

1.2组织培养物

将组织切除后立即转移到转运培养基中。在无菌条件下制得大约2mm3的骨片段，确定其重量后，直接用于实验。

将带有20mM Hepes缓冲剂的Earl修饰的Eagle极限必需培养基(MEM)用于该组织培养物。

在开始实验之前，向培养基中加入4％胎牛血清和1％抗生素溶液(青霉素/链霉素/两性霉素B)，对于标记实验来说，还要加入1mMβ-氨基丙腈、2mM抗坏血酸钠和2-10μg同位素(¹⁴C-脯氨酸)。在以最低频率振摇的水浴中，在37℃下25ml锥形瓶中进行培养。

1.3确定呼吸活性

呼吸活性是组织代谢活性的一个敏感标志。组织生理状况的变化即使非常小，也能由可测得的呼吸活性变化反映出来。

用克拉克传感器(铂/银电极在饱和氯化钾溶液中)测定呼吸活性。在电极上施加0.8V的电压，氧还原电流立即成比例地在所测量的溶液(培养基)中产生氧分压。当氧分压下降到特定值以下时提供氧气饱和的培养基，用计算机进行控制，并对数据进行分析。

一般骨组织的呼吸活性为2-3μl O₂×min^-1×g^-1。因此该呼吸活性在静止肌肉组织的呼吸活性的数量级范围内。图1显示了骨组织的典型呼吸曲线。图1中显示的齿形呼吸曲线源于下列事实：当所测量溶液中的氧分压下降到特别值以下时，就提供新鲜的氧气饱和的培养基。

图2显示了来自三次测量实验的平均O₂消耗值。使用克拉克传感器测定组织培养物中的胚性骨组织(家庭原鸡Gallus domesticus)的耗氧量。耗氧量在3-5μl O₂×min^-1×g^-1之间。经过一段时间后，呼吸活性下降大约50％，这对组织培养物来说是完全正常的。

1.4酶测定

被认为与骨组织的矿化最密切相关的一种酶是碱性磷酸酶。在一段时间以前已描绘了此酶的特性，但是关于该酶在矿化中的功能仍在讨论之中。既然成骨细胞活性与碱性磷酸酶的活性之间有紧密关联，就有可能把碱性磷酸酶看作成骨细胞活性的一个标志。在儿童期骨骼的生长过程中、骨再生的过程中和骨代谢紊乱中，都已发现血清中碱性磷酸酶活性的水平升高。

用粗提物测定碱性磷酸酶的活性。为此，将500mg组织与1ml裂解缓冲液混合，并用小刀将其切碎。随后加入500mg研磨珠，裂解20分钟。离心后，将该粗提物用于测量。

在对硝基苯磷酸转化为硝基苯酚和磷酸盐的基础上检测碱性磷酸酶。该水解中产生的硝基苯酚是黄色的，因此可以用光度计在410nm波长下进行检测。

图3显示了碱性磷酸酶活性的pH依赖性。在对硝基苯磷酸转化的基础上测定骨的碱性磷酸酶活性。在pH10.5时活性最大。在生理pH7下，碱性磷酸酶仅具有大约1％的最大活性。

1.5pH测定

将含有氢氧化钙、甘油和牛脚油(以该制剂的总重量计，重量比分别为30％、30％和40％)的本发明的混合物或氢氧化钙的含水悬浮液用咪唑/HCl缓冲液(1mM，pH7)覆盖，之后使用一个pH电极连续跟踪该溶液中的pH。

从这些测量的结果显示，氢氧化钙和甘油在牛脚油中的混合物具有与氢氧化钙的含水悬浮液根本不同的性能。图4显示，氢氧化钙的含水悬浮液立即使pH突升至pH12，而本发明的甘油/氢氧化钙/牛脚油混合物则使pH缓慢升至pH10以上。

1.6胶原测定

正如已提到过的那样，骨中有机物的主要部分由胶原组成，胶原是一种结缔组织蛋白。骨的生长和再生过程与新胶原的合成有关。合成后是进一步的细胞内和细胞外胶原加工。通过使用放射性胶原前体(¹⁴C-脯氨酸)有可能精确地定量测量组织培养物中胶原合成的速率。这使得有可能定性和定量记录药物对胶原合成的作用。

利用所谓的羟脯氨酸测定法测定总的胶原含量。氨基酸羟脯氨酸主要存在于胶原中，羟脯氨酸在其它蛋白质中的含量可以忽略不计。当氨基酸通过水解从蛋白质中释放出来以后(116℃，22％HCl，16小时)，以及化学修饰后(4-羟基脯氨酸氧化为吡咯)，通过与对二甲氨基苯甲醛的特定颜色反应定量测量测试混合物中羟脯氨酸的总含量。

1.7测定胶原合成的速率

利用Proff(1991)对Miller和Rhodes方法的改进方法得到在组织和培养基中的胶原(参见E.J.Miller和R.K.Rhodes，“酶学方法”82：33(1982))。经过几次沉淀、离心步骤，借助于SDS凝胶电泳和随后的闪烁测量对胶原定量(测定比放射性)。为了计算新合成的速率，将通过加入¹⁴C-脯氨酸测得的胶原含量与利用羟脯氨酸测定法测得的总胶原含量联系起来。

通过定量测量胶原的生物合成，可以研究氢氧化钙产物对骨形成的作用。

如1.7中所示，利用胶原放射性标记技术对胶原的生物合成进行定量。胶原纤维的一种成分是氨基酸脯氨酸。将精确定量的¹⁴C标记的脯氨酸加入培养基中。此脯氨酸被结合到组织培养过程中重新合成的蛋白质中。将胶原与其它蛋白质分离开后，通过测定比放射性，可能得到关于新胶原合成速率的准确定量报告。

借助于数次沉淀、离心步骤以及SDS凝胶电泳分离胶原。在胶原的特定沉淀中，通过加入氯化钠调节至适宜的盐浓度，在该浓度下，非胶原蛋白大部分保留在溶液中，而胶原则从溶液中作为沉淀分离出来，由此使胶原纤维与其它蛋白质分离。随后胶原通过离心沉淀。在SDS凝胶电泳中，蛋白质以尺寸依赖方式彼此分离。蛋白质在电场中通过一个高度交联的聚合物(丙烯酰胺)基层移动。因为基层对小分子的抗性小，所以小的蛋白质迅速移动通过该基层，而大的蛋白质移动更缓慢，因为它们的移动性受到基层的极大阻滞。染色后，在此凝胶中可以看到蛋白质的所谓的“带”。以这种方式，可能在蛋白质尺寸的基础上利用内在尺寸标准识别蛋白质。

从凝胶中切下感兴趣的蛋白质带，将蛋白质用于进一步的分析，例如放射性测量。

胶原的提取：

通过加入3％醋酸使组织培养(参见1.2)终止。已经溶解的胶原在4℃下利用2M氯化钠沉淀过夜，然后通过离心回收(1小时，24000×g，4℃)。将沉淀物溶于10ml 3％醋酸。通过将组织块机械破碎，使分析中包括组织块里面存在的重新合成的胶原。通过离心回收组织残渣(1小时，45000×g，4℃)。沉淀物溶解后利用凝胶电泳分离。为了检查蛋白质的分离情况，将它们在凝胶中染色。

上述操作后将凝胶垂直于移动方向切成5mm宽的长条，然后将这些凝胶片段转移到闪烁瓶中，并用闪烁计数器计数。

图5显示了活组织与热变性组织之间的对比。

图5中显示了以凝胶中的放射性分布为基础的对比情况。胶原作为相对较大的蛋白质，在距离起始2cm的地方出现。

比放射性带可以赋值为t，胶原带可以通过考马斯染色检测。

图5标记I，股骨头，骨松质，男性，45岁：活组织与热变性组织之间的胶原合成量的差异(CPM：每分钟的数目)。它显示了凝胶中放射性的分布。在距离起始约2cm处发现了胶原带。只有活组织中出现胶原带，这意味着在凝胶中可检测到的放射性相当于培养过程中新的胶原合成。

活组织显示了可检测的胶原合成量，而死组织则不再显示任何代谢活性。这表明，检测出的放射性胶原事实上可归因于组织培养物中新的胶原合成，而不是放射性脯氨酸与骨组织中蛋白质的非特异性结合引起的。将可比量的组织材料用于所有实验(大约100mg)。

可以检测出其它较小尺寸的放射性标记带，它们可能是胶原降解产物。特别是在标记实验中，当培养时间超过4天时，可以观察到胶原在组织培养物中的降解。凝胶中还存在少量的放射性标记的脯氨酸，它们不可能通过沉淀完全除去。

从与图5中所示的实验平行的实验来看，骨组织对弱碱性pH的耐受性是明显的。在平行实验中，用碳酸氢盐缓冲液(pH8.0)替换培养基中的Hepes生理缓冲液(pH7.4)。结果显示，培养基碱化至pH8.0没有导致与pH7.4条件下有关胶原合成的可测量的差异。在pH8.5以上，不再能看到任何相对于自发胶原再生的增加的胶原再生。

图6-9显示了在具有各种本发明混合物的实验组中新合成的胶原量与在没有该混合物或不存在二元醇或多元醇的对照组中新合成的胶原量的对比。对照组和实验组中新合成的胶原量的差异用百分数表示。0％表示与对照相比，新合成的胶原量没有增加；100％表示在本发明混合物的影响下，胶原再生比对照增加两倍。

从图6可以明显看出，四个实验中，在甘油/氢氧化钙/牛脚油混合物(组成：30重量％的氢氧化钙，30重量％的甘油，40重量％的牛脚油)的影响下，与对照相比，胶原合成增加到100％-120％之间。这种增加是显著的，因为胶原合成量的试探性变化在10-20％范围内，而在甘油/氢氧化钙/牛脚油混合物的影响下测得的增加在100-120％范围内。此外，与不含甘油的混合物相比，胶原合成量也有明显的增加。

从图7可以明显看出，四个实验中，在丙二醇/氢氧化钙/牛脚油混合物(组成：30重量％的氢氧化钙，30重量％的丙二醇，40重量％的牛脚油)的影响下，与对照相比，胶原合成增加到100％-120％之间。这种增加是显著的，因为胶原合成量的试探性变化在10-20％范围内，而在丙二醇/氢氧化钙/牛脚油混合物的影响下测得的增加在100-120％范围内。此外，与不含丙二醇的混合物相比，胶原合成量也有明显的增加。

从图8可以明显看出，四个实验中，在甘油/氢氧化钙/橄榄油混合物(组成：30重量％的氢氧化钙，30重量％的甘油，40重量％的橄榄油)的影响下，与对照相比，胶原合成增加到100％-120％之间。这种增加是显著的，因为胶原合成量的试探性变化在10-20％范围内，而在甘油/氢氧化钙/橄榄油混合物的影响下测得的增加在100-120％范围内。此外，与不含甘油的混合物相比，胶原合成量也有明显的增加。

从图9可以明显看出，四个实验中，在甘油/氢氧化钙/氧化镁/牛脚油混合物(组成：20重量％的氢氧化钙，20重量％的甘油，20重量％的氧化镁，40重量％的牛脚油)的影响下，与对照相比，胶原合成增加到100％-140％之间。这种增加是显著的，因为胶原合成量的试探性变化在10-20％范围内，而在甘油/氢氧化钙/氧化镁/牛脚油混合物的影响下测得的增加在100-140％范围内。此外，与不含甘油和氧化镁的混合物相比，胶原合成也有明显的增加。

实施例2

在稳定性实验中，将下列混合物配制成可揉捏或乳脂状团块后在室温和环境湿度下储存，结果发现，与不含醇的样品相比，在二元醇或多元醇的存在下，保持所需稠度的混合物可以延长至少50％稳定期。

所使用的混合物：

1)甘油/氢氧化钙/牛脚油混合物(30重量％/30重量％/40重量％)

2)丙二醇/氢氧化钙/牛脚油混合物(30重量％/30重量％/40重量％)和

3)甘油/氢氧化钙/橄榄油混合物(30重量％/30重量％/40重量％)

第一种混合物没有甘油有甘油

可揉捏稠度 6个月 12个月

乳脂状稠度 12个月 18个月

第二种混合物没有丙二醇有丙二醇

可揉捏稠度 6个月 12个月

乳脂状稠度 12个月 18个月

第三种混合物没有橄榄油有橄榄油

可揉捏稠度 6个月 12个月

乳脂状稠度 12个月 18个月

Claims

1、一种药物制剂，它包含氢氧化钙、植物或动物来源的固定油以及可适当加入的可药用赋形剂，它还包含一种二元醇或多元醇，其中以药物制剂的重量计，所述氢氧化钙的含量为1-90重量％。

2、如权利要求1所述的药物制剂，其中另外还含有硫酸钡。

3、如权利要求1所述的药物制剂，其中另外还含有白凡士林。

4、如上述权利要求1中所述的药物制剂，其中另外还含有氧化镁。

5、如权利要求1中所述的药物制剂，其中的二元醇或多元醇是甘油。

6、如权利要求1所述的药物制剂，其中的植物或动物固定油是牛脚油。

7、如权利要求1-6任一项所述的药物制剂，其中的植物或动物固定油是橄榄油。

8、上述权利要求中任一项所述的药物制剂的制备方法，该方法包括将氢氧化钙和二元醇或多元醇混合到植物或动物来源的固定油中。

9、一种药物制剂在制备用于促进体内胶原再生的药物中的应用，所述制剂包含氢氧化钙、二元醇或多元醇、植物或动物来源的固定油以及可适当加入的可药用赋形剂。