PL192094B1

PL192094B1 - Preparat farmaceutyczny do regeneracji kolagenu, sposób wytwarzania preparatu i zastosowanie preparatu

Info

Publication number: PL192094B1
Application number: PL345210A
Authority: PL
Inventors: Georg Dietz
Original assignee: Georg Dietz
Priority date: 1998-04-16
Filing date: 1999-04-16
Publication date: 2006-08-31
Also published as: BR9909670A; EP1071481A1; EP1071481B1; JP2002512088A; CN1297364A; CN1198659C; AU745434B2; WO1999053969A1; DE19980655D2; TR200002962T2; ATE225191T1; ES2184450T3; IL138049A; CA2320135A1; PL345210A1; HK1035675A1; IL138049A0; SK15212000A3; AU3818099A

Abstract

1. Preparat farmaceutyczny do regeneracji kolagenu zawierajacy substancje aktywna i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalne zaróbki, znamienny tym, ze jako substancje aktywna obejmuje wodorotlenek wapnia, olej ciekly pochodzenia roslinnego albo zwierzecego i dodatkowo alkohol diwodorotlenowy albo poliwodorotlenowy. 12. Sposób wytwarzania preparatu farmaceutycznego okreslonego w zastrz. 1, znamienny tym, ze obejmuje mieszanie wodorotlenku wapnia i alkoholu diwodorotlenowego albo poliwodoro- tlenowego z olejem cieklym pochodzenia roslinnego albo zwierzecego. 13. Zastosowanie preparatu farmaceutycznego obejmujacego wodorotlenek wapnia, alkohol diwodorotlenowy albo poliwodorotlenowy oraz olej ciekly pochodzenia zwierzecego albo roslinne- go, i ewentualnie zaróbke dopuszczalna farmaceutycznie do wytwarzania leku do pobudzania re- generacji kolagenu in vivo. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest preparat farmaceutyczny do regeneracji kolagenu, sposób wytwarzania preparatu i zastosowanie preparatu.

Kość składa się w około 60% z substancji mineralnej (hydroksyapatyt, fosforan wapnia) i w około 40% z substancji organicznej, głównie kolagenu. Metabolizm kości określony jest głównie przez oddziaływanie komórek tworzących kość (osteoblastów) i komórek degenerujących kość (osteoklastówi osteocytów), których działalność w zdrowej kości pozostaje w zrównoważonej zależności.

Tworzenie kości można podzielić na dwie główne fazy, (a) syntezę tkanki organicznej (syntezę kolagenu) i (b) włączanie substancji mineralnej do uprzednio przygotowanej macierzy organicznej za pośrednictwem tzw. pęcherzyków matrycowych.

Białko tkanki łącznej, kolagen, stanowi większość substancji organicznej kości. Białko składa się z trzech helikalnie skręconych łańcuchów polipeptydowych, których skład aminokwasowy może się różnić, co prowadzi do różnorodności poszczególnych rodzajów kolagenu. Wspólna dla wszystkich rodzajów kolagenu jest niezwykle duża odporność mechaniczna włókien kolagenowych. Odporność ta spowodowana jest wieloma wiązaniami między- i wewnątrzcząsteczkowymi włókien kolagenu, które w ten sposób tworzą gęstą sieć włókien kolagenowych tkanki łącznej. Tkanka kości jest, jak już wspomniano, utworzona przez włączenie substancji mineralnych (hydroksyapatytu i fosforanu wapnia) dotej sieci. Tworzenie się kości jako wynik wzrostu albo regeneracji jest zawsze poprzedzone biosyntezą kolagenu.

Do tej pory, w przypadku uszkodzenia kości niezależnie od powodu, proces regeneracji kości pozostawiano własnemu przebiegowi, co najwyżej podając antybiotyki i kortykosteroidy w celu zapobieżenia ryzyku zakażenia przeszkadzającego w procesie leczenia.

Opisano pewne czynniki zdolne do wywierania wpływu na tworzenie i regenerację kości. Sąto głównie czynniki fizyczne (siły mechaniczne i elektryczne), hormony (przykładowo hormon przytarczyc, kalcytonina, insulina, glikokortykoidy, 1,25(OH)2D3) oraz niezbyt ściśle określona grupa czynników wzrostowych o cechach białkowych (osteokalcyna, osteonektyna, „czynniki wzrostowe insulinopodobne”), patrz, Wallach S., L.V.Avioli, J.H.Carstenas jun., „Factors in Bone Formation”, Calcified Tissue International 45:4-6 (1989). Wpływ stężenia jonów wodorowych (pH) na procesy metaboliczne w regeneracji kości nie został dotej pory odpowiednio zbadany.

Dietz opisuje w DE-A-42 40 713 zastosowanie mieszaniny wodorotlenku wapnia i oleju z kopyt bydła do regeneracji kolagenu po uszkodzeniach kości. Preparat ten jednakże jest obarczony taką wadą, że jego stabilność jest bardzo ograniczona z powodu zmydlania. Może to zakłócać działanie mieszaniny.

Celem wynalazku jest dostarczenie polepszonej mieszaniny o długotrwałej stabilności do specyficznego zewnętrznego działania na proces regeneracji kości przez pobudzanie albo zapoczątkowanie regeneracji kolagenu.

Obecnie, nieoczekiwanie stwierdzono, że może warunki te spełniać preparat według wynalazku.

Preparat farmaceutyczny do regeneracji kolagenu zawierający substancję aktywną i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalne zaróbki, według wynalazku, jako substancję aktywną zawiera wodorotlenek wapnia, olej ciekły pochodzenia roślinnego albo zwierzęcego i dodatkowo alkohol diwodorotlenowy albo poliwodorotlenowy.

Korzystnie stosunek objętościowy wodorotlenku wapnia i oleju ciekłego pochodzenia roślinnego albo zwierzęcego w tym preparacie wynosi 5/1 do 1/5.

Korzystnie stosunek objętościowy wodorotlenku wapnia i ciekłego oleju pochodzenia roślinnego albo zwierzęcego wynosi 1/1.

Korzystnie stosunek objętościowy wodorotlenku wapnia i oleju ciekłego pochodzenia roślinnego albo zwierzęcego wynosi 5/1.

Korzystnie preparat dodatkowo zawiera siarczan baru.

Korzystnie preparat dodatkowo zawiera wazelinę białą.

Korzystnie preparat dodatkowo zawiera MgO.

Korzystnie alkoholem poliwodorotlenowym w preparacie jest gliceryna.

Korzystnie olejem ciekłym zwierzęcym jest olej kopytkowy.

Korzystnie olejem ciekłym roślinnym jest olej z oliwek.

Korzystnie preparat farmaceutyczny zawiera dodawane w procesie wytwarzania ilości składników: wodorotlenek wapnia od1 do90% wagowych, ciekłe oleje roślinne albo zwierzęce w ilości od9 do 90%, alkohol diwodorotlenowy albo wielowodorotlenowy w ilości od1 do 40% wagowych w odniesieniu do ciężaru całkowitego preparatu.

PL 192 094 B1

W zakres wynalazku wchodzi też sposób wytwarzania takiego preparatu przez mieszanie wodorotlenku wapnia, alkoholu diwodorotlenowego albo poliwodorotlenowego i ewentualnie zaróbek dopuszczalnych farmaceutycznie z olejem ciekłym pochodzenia roślinnego albo zwierzęcego.

Wynalazek obejmuje też zastosowanie takiego preparatu do wytwarzania leku do przyczyniania się do regeneracji kolagenu in vivo.

Mieszaniny wodorotlenku wapnia i oleju kopytkowego, zawierające siarczan baru są stosowane w stomatologii jako pasty do wypełniania korzeni (DE-C 29 32 738). Mieszaniny cementu karboksylanowego, wodorotlenku wapnia i oleju kopytkowego podobnie stosuje sięw stomatologii jako środek do utwardzania okresowego wypełnienia (DE-C 34 13 864). Zadaniem wodorotlenku wapnia w pierwszym przypadku jest przekształcenie kwasowego środowiska w kanałach zębowych w środowisko alkaliczne, co powoduje wyeliminowanie stanu zapalnego i stopniowe tworzenie bariery twardej tkanki. W tym ostatnim przypadku, wykorzystuje się profilaktyczne działanie wodorotlenku wapnia, zapobiegające tworzeniu stanu zapalnego miazgi. Olej kopytkowy służy w obu przypadkach jako dodatek, wcelu po pierwsze zapewnienia prostego i dokładnego wypełnienia kanałów korzeniowych wodorotlenkiem wapnia jako substancją czynną (i czynnikiem kontrastowym, siarczanem baru), oraz po drugie w celu opóźnienia twardnienia wypełnienia, tak aby umożliwić wniknięcie wodorotlenku wapnia do kanalików zębowych w celu wykazania swojego działania. W żadnej z tych dwóch publikacji nie ma najmniejszej wskazówki, że mieszanina według obecnego wynalazku mogłaby indukować regenerację kolagenu co jest wstępnym warunkiem regeneracji kości.

Określenie „preparat”, które jest nowe według wynalazku w znaczeniu tu zastosowanym, dotyczy preparatu farmaceutycznego (czasem określanego jako mieszanina), który zawiera przynajmniej powyższe składniki. Szczególnie jest on przydatny do podawania ludziom albo zwierzętom w regeneracji kolagenu jako warunek podstawowy dla regeneracji kości.

Składniki mieszaniny według wynalazku opisane są szczegółowo niżej.

Ciekłe oleje pochodzenia roślinnego, które można zastosować, mogą obejmować jeden albo wiele następujących olejów roślinnych:

olej sojowy, słonecznikowy, rzepakowy, bawełniany, lniany, rycynowy, palmowy, olej z nasion palmy, olej kokosowy i olej z oliwek.

Ciekłe oleje roślinne, które można zastosować korzystnie są ciekłymi olejami roślinnymi o wysokiej stabilności na ogrzewanie, takimi jak olej sojowy, słonecznikowy i olej z oliwek, w szczególności olej z oliwek.

Ciekłe oleje zwierzęce, które można zastosować, mogą obejmować jeden albo wiele następujących olejów zwierzęcych:

olej rybny, olej kopytkowy i łój.

Oleje zwierzęce, które można zastosować, korzystnie obejmują oleje z kopyt zwierzęcych, w szczególności olej kopytkowy.

Alkohole diwodorotlenowe i poliwodorotlenowe, które można zastosować mogą obejmować alkohole diwodorotlenowe, takie jak glikol etylenowy, glikol propylenowy, glikol butylenowy, glikol pentylenowy, glikol heksylenowy oraz glikole polietylenowe takie jak glikol dietylenowy, glikol trietylenowy, glikole polipropylenowe, takie jak glikol dipropylenowy, alkohole triwodorotlenowe, takie jak gliceryna, alkohole tetrawodorotlenowe, takie jak treitol, erytritol, alkohole pentawodorotlenowe takie jak arabitol, adonitol, ksylitol, alkohole heksawodorotlenowe, takie jak sorbitol, mannitol, dulcitol albo wyższe alkohole poliwodorotlenowe.

Korzystne jest zastosowanie alkoholi diwodorotlenowych i triwodorotlenowych, takich jak glikol etylenowy, glikol propylenowy, glikol butylenowy, glikol pentylenowy, glikol heksylenowy oraz glikole polietylenowe, takie jak glikol dietylenowy, glikol trietylenowy, glikole polipropylenowe, takie jak glikol dipropylenowy, alkohole triwodorotlenowe, takie jak gliceryna.

Uważa się, że alkohol diwodorotlenowy i poliwodorotlenowy zapobiega zmydlaniu ciekłego oleju roślinnego albo zwierzęcego. Umożliwia to utrzymanie mieszaniny o konsystencji ciasta albo kremu przez dłuższy czas tak, aby biosynteza kolagenu mogła być zwiększona i poprawiona.

Ciekłe oleje pochodzenia roślinnego albo zwierzęcego są dodane do kompozycji w celu nadania konsystencji kremu albo ciasta, w ilości korzystnie 9-90% wagowych, korzystniej 10-60% wagowych, jeszcze korzystniej 20-40% wagowych, w oparciu o całkowity ciężar preparatu.

Alkohol diwodorotlenowy albo poliwodorotlenowy jest dodany do kompozycji w celu nadania konsystencji kremu albo ciasta, w ilości korzystnie 1-40% wagowych, korzystnie 10-40% wagowych, jeszcze korzystniej 20-30% wagowych, w oparciu o całkowity ciężar preparatu.

PL 192 094 B1

W korzystnym wykonaniu, preparat według wynalazku dodatkowo zawiera MgO. MgO można dodawać w ilości 1-90% wagowych, korzystnie 10-70% wagowych, jeszcze korzystniej 20-60% wagowych, w oparciu o całkowity ciężar preparatu. Jednakże, uważa się, że MgO korzystnie dodaje się w mniejszych ilościach rzędu 10-20% wagowych. MgO działa jako środek zobojętniający w substancji kostnej, przeciwdziałając kwaśnemu środowisku kości.

Stosunek wodorotlenku wapnia do ciekłego oleju roślinnego albo zwierzęcego w preparacie według wynalazku wynosi od 5/1 do 1/5, korzystnie 5/1 lub 1/1. Jednakże, może być konieczna zmiana korzystnego stosunku na skutek konkretnych okoliczności urazu.

Jeżeli preparat według wynalazku ma mieć szczególnie miękką i gładką konsystencję, możliwe jest również włączenie do niego wazeliny białej. Zwykle możliwe jest włączenie wazeliny białej w ilości odpowiednio 1-60% wagowych, korzystnie 10-60% wagowych, jeszcze korzystniej 20-40% wagowych w oparciu o całkowity ciężar preparatu.

Jakkolwiek normalnie nie jest konieczne śledzenie radiologiczne procesów gojenia albo regeneracji kości, może być jednak wskazane w niektórych przypadkach. W tym przypadku możliwe jest również włączenie do preparatu według wynalazku siarczanu baru jako środka kontrastującego promieniowanie rentgenowskie. Jednakże, ponieważ regeneracja kolagenu pod wpływem siarczanu baru nie jest zbyt dobra, siarczan baru dodaje się do preparatu według wynalazku, jeśli jest konieczny, w ilości wystarczającej (przykładowo 10-20% wagowych w oparciu o całkowity ciężar preparatu) aby mieszanina była widzialna radiologicznie.

Zastosowanie preparatu według wynalazku na miejsce albo w miejscu uszkodzenia kości zależnie od jego konsystencji, można przeprowadzić przy użyciu strzykawek, szpatułek albo szczotek.

Istnieje wiele możliwych zastosowań preparatu według wynalazku w chirurgii ogólnej i szczękowej, ortopedii, implantologii, traumatologii itp., ponieważ preparat według wynalazku można nakładać na albo do uszkodzeń tkanki kostnej, takich jak powierzchnie złamań, wywiercone otwory, jamy itp., i natychmiast wywołuje on regenerację kolagenu in vivo w miejscu zastosowania.

Ponieważ, jak wiadomo, w niektórych dyscyplinach medycyny stosuje się metalowe zamocowania, wówczas zaleca się wypełnianie otworów wytworzonych w celu wprowadzenia metalowych zamocowań, preparatem według wynalazku, a następnie wprowadzanie zamocowań. W ten sposób możliwe jest przeciwdziałanie pierwotnej osteolizie nieuniknionej przy takich procedurach i przyspieszenie dopasowania albo adaptacji zamocowania, w otaczającej tkance kostnej i umocowanie samego zamocowania do kości.

Jednakże, nadmiar mieszaniny nie przeszkadza w tym przypadku, ponieważ podczas wprowadzenia zamocowania do wywierconego otworu wypełnionego mieszaniną, jest on wypychany na zewnątrz albo pozostaje w celu dyfuzji do warstwy gąbczastej kości.

Oczywiste jest, że preparat według wynalazku i jego składniki muszą być zarówno pakowane jaki stosowane w warunkach jałowych.

Nieoczekiwanie okazało się, że preparat według wynalazku przeciwdziała, nawet bez obecności antybiotyków i/lub kortykoidów, reakcjom zapalnym spowodowanym uszkodzeniem kości, oraz gwałtownie powoduje ich wygaśnięcie. Nieskomplikowany skład i przewidywana skuteczność do regeneracji kolagenu in vivoz równoczesnym zahamowaniem stanu zapalnego czyni z preparatu według wynalazku kompozycję niezastąpioną w traumatologii złamań kości.

Poniższe przykłady mają na celu szczegółowe zilustrowanie wynalazku.

Przykład 1

Na początku, wyjaśniamy oddziaływanie pomiędzy preparatem według wynalazku i tkanką. Zatem, dane o dystrybucji preparatu według wynalazku w tkance kostnej stanowią warunek wstępny do zaproponowania teorii dotyczących możliwego mechanizmu działania leku. Doświadczenia na hodowlach tkankowych są bardziej czułe niż przeprowadzone na hodowlach komórkowych, ponieważ jedynie na hodowli tkankowej można badać oddziaływania międzykomórkowe.

1. Materiał i metody

1.1 Materiał tkankowy

Ludzką tkankę kostną pochodzącą z osteotomii udostępniły szpitale.

Zarodkową tkankę kostną uzyskano z 10-17 dniowych zarodków kurzych (Gallus domesticus).

1.2 Hodowla tkankowa

Tkankę przeniesiono do pożywki transportowej natychmiast po pobraniu. Fragmenty kości o wielkości około 2 mm³ przygotowano w warunkach sterylnych i po określeniu ciężaru zastosowano bezpośrednio w doświadczeniach.

PL 192 094 B1

Do hodowli tkankowej zastosowano minimalną pożywkę Eagle'a w modyfikacji Earl'a (MEM) z 20 mM buforem Hepes.

Przed rozpoczęciem doświadczenia, do pożywki dodano 4% cielęcą surowicę płodową i 1% roztwór antybiotyków (penicylina/streptomycyna/amfoterycyna B), zaś do doświadczeń ze znakowaniem, dodatkowo dodano 1 mM beta-aminopropionitryl, 2 mM askorbinian sodu i 2-10 μg izotopów (¹⁴C-prolina). Hodowlę przeprowadzonow25mlbutelkachErlenmeyeraw37°Cwwytrząsanej łaźni wodnej ustawionej nanajniższej częstotliwości obrotów.

1.3 Oznaczenie aktywności oddechowej

Aktywność oddechowa jest czułymznacznikiemaktywności metabolicznej tkanki. Nawet bardzo małe zmianywarunków fizjologicznych tkanki są odzwierciedlane w możliwych do zmierzenia zmianach aktywności oddechowej.

Czujnik Clark'a (elektrody platynowo/srebrne w nasyconym roztworze chlorku potasu zastosowano do określenia aktywności oddechowej. Przez przyłożenie do elektrody napięcia 0,8 V,prądredukcji tlenu jest bezpośrednio proporcjonalny do parcjalnegociśnieniatlenuwmierzonymroztworze (pożywka hodowlana). Dostarczenie pożywki nasyconej O2, wktórej ciśnienieparcjalnetlenuspada poniżej konkretnej wartości orazanalizędanych, prowadzono pod kontrolą komputera.

Tkanka kostna zwykle miała aktywność oddechową 2-3 μl O₂ x min^-1 x g^-1. Aktywność oddechowa była zatem w zakresie rzędu wielkości aktywności oddechowej spoczynkowej tkankimięśniowej. Typowa krzywa oddechowa dla tkanki kostnej jest przedstawiona na fig. 1. Piło-kształtny przebieg krzywej oddechowej nafig. 1jest spowodowany faktem, żegdyciśnienie parcjalneO2 w mierzonym roztworze spadaponiżej konkretnej wartości, dostarczanajest świeża pożywka nasycona O2.

Nafig. 2 pokazano średnie zużycie O2 wtrzech pomiarach. Zużycie tlenuprzez zarodkową tkankę kostną (Gallus domesticus) określonowhodowli tkankowej przy użyciu czujnika Clark'a. Zużycie tlenu wynosiło 3-5 μl O₂ x min^-1 x g^-1. Aktywność oddechowa spadała o około 50% w trakcie doświadczenia, co jest całkiemnormalnedlahodowli tkankowych.

1.4 Test enzymatyczny

Enzymem, który jest uważany za związany blisko z mineralizacjątkankikostnej, jest fosfataza alkaliczna. Enzym ten scharakteryzowano jakiś czas temu, alewciąż trwają dyskusje dotyczące funkcji enzymu w mineralizacji. Ponieważ istnieje ścisłe powiązanie pomiędzy aktywnością osteoblastów i aktywnością fosfatazy alkalicznej, można uważać fosfatazę alkalicznązaznacznikaktywnościosteoblastu. Podwyższone poziomy aktywności fosfatazy alkalicznej w surowicy krwi stwierdza się podczas wzrostu szkieletowego w dzieciństwie, podczas regeneracjikościorazwzaburzeniachmetabolizmu kości.

Aktywność fosfatazy alkalicznej określanona surowych ekstraktach. Wtymcelu, 500mgtkanki zmieszano z 1ml buforuniszczącegoipociętonożem. Następnie, dodawano500 mgperełekdomielenia i przeprowadzano rozdrabnianie przez 20minut. Poodwirowaniu, surowyekstrakt zastosowano do pomiaru.

Fosfatazę alkaliczną wykrywa się w oparciu o przekształcanie fosforanu p-nitrofenylu w nitrofenol i fosforan. Nitrofenol wytworzony podczas hydrolizy jest żółtyimożnago wykrywać fotometrycznie przy długości fali 410 nm.

Nafig. 3 pokazano zależność od pH aktywności fosfatazy alkalicznej. Aktywność fosfatazy alkalicznej kości określono woparciuoprzekształcanie fosforanu p-nitrofenylu. Aktywność maksymalna występowałaprzypH10,5.PrzypH fizjologicznym, równym7, fosfataza alkaliczna wykazywała jedynieokoło1%aktywnościmaksymalnej.

1.5 OkreślaniepH

Preparat według wynalazku, zawierający wodorotlenek wapnia, glicerynę i olej kopytkowy w proporcjach wagowych, odpowiednio30%: 30%: 40%, w odniesieniu do całkowitego ciężaru preparatu, albo wodny roztwór wodorotlenku wapnia zalewano 30ml buforu imidazol/HCl (1 mM, pH7), po czym pH roztworu śledzono stosując elektrodę pH.

Z tychpomiarówwyniknęło,żemieszaninawodorotlenku wapniaiglicerynywolejukopytkowym ma zasadniczo inne właściwości niżwodorotlenekwapniawzawiesiniewodnej. Nafig. 4pokazano, że wodna zawiesina wodorotlenku wapnia powoduje natychmiastowy skok pH do wartości pH 12, zaś preparat wodorotlenek wapnia/gliceryna/olej kopytkowy według wynalazku powoduje wolniejszy wzrost pH powyżej 10.

PL 192 094 B1

1.6 Oznaczanie kolagenu

Główna część substancji organicznej kości składa się, jak już wspomniano, z kolagenu, białka tkanki łącznej. Wzrost i regeneracja kości związane są z syntezą nowego kolagenu. Synteza poprzedza dalsze procesy wewnątrz- i zewnątrzkomórkowe. W celu oceny ilościowej syntezy kolagenu w hodowli tkankowej można zastosować radioaktywny prekursor kolagenu (¹⁴C-prolina). Umożliwia to jakościowe i ilościowe określenie wpływu leków na syntezę kolagenu.

Całkowitą zawartość kolagenu określa się tzw. testem hydroksyprolinowym. Aminokwas hydroksyprolina występuje głównie w kolagenie, zaś zawartości hydroksyproliny w innych białkach nie bierze się pod uwagę. Po uwolnieniu aminokwasów z białek przez hydrolizę (16 godz. w 116°C, 22% HCl) i modyfikacji chemicznej (utlenianie 4-hydroksyproliny do pirolu), całkowitą zawartość hydroksyproliny w mieszaninie badanej oznacza się ilościowo swoistą reakcją barwną z p-dimetyloaminobenzaldehydem.

1.7 Określanie wielkości syntezy kolagenu

Kolagen w tkankach i pożywce otrzymuje się metodą Miller i Rhodes (Methods Enzymol. 82:33 (1982)) w modyfikacji Proffa (1991). Przez kilka etapów precypitacji z kolejnymi wirowaniami, kolagen oznacza się ilościowo przez elektroforezę na żelu agarozowym z SDS, a następnie pomiar scyntylacji (oznaczenie radioaktywności właściwej). W celu określenia wielkości nowej syntezy, zawartość kola14 genu określa się przez fakt, że włączanie ¹⁴C-proliny jest zależne od całkowitej zawartości kolagenu oznaczonej w teście hydroksyprolinowym.

Istniejemożliwość oznaczenia ilościowego biosyntezy kolagenu w celu zbadania wpływu wodorotlenkuwapniana tworzenie kości.

Biosyntezę kolagenu oznacza się ilościowo- jak zaznaczono w 1.7 - techniką radioznakowania kolagenu. Jednym ze składników włókien kolagenowych jest aminokwas, prolina. Określoną ilość pro14 liny znakowanej ¹⁴C dodaje się do pożywki hodowlanej. Prolina ta jest włączana do białek syntetyzowanych na nowo podczas inkubacji tkanki. Po oddzieleniu kolagenu od innych białek możliwe jest przezokreślenie swoistej radioaktywności, dokładneokreśleniewielkości syntezy nowego kolagenu.

Kolagen izoluje się przez kilka etapów precypitacji z kolejnymi wirowaniami i elektroforezą na żelu agarozowym z SDS. W swoistej precypitacji kolagenu, włókna kolagenowe są oddzielane od innych białek przez doprowadzenie dodatkiem chlorku sodu do odpowiedniego stężenia soli, przy którym białka inneniżkolagenpozostająwroztworze, alekolagen oddzielasięodroztworujakoosad. Kolagen osadza się przez wirowanie. Podczas elektroforezy na żelu SDS białka rozdziela się w sposób zależny od wielkości. Białka migrują w polu elektrycznym przez matrycę z silnie usieciowanego polimeru (akryloamid). Drobne białka migrują szybciej przez tęmatrycę, ponieważ stawiaona mniejszy opór mniejszym cząsteczkom, podczas gdy większe białka migrują wolniej, ponieważ ich ruchliwość jest silnie hamowana przez matrycę. Po zabarwieniu, białka są widoczne w żelu jako tzw. „prążki”. W ten sposób można zidentyfikować białka na podstawie ich wielkości stosując wewnętrzne wzorce wielkości.

Białka można dalej analizować, przez na przykład, pomiar radioaktywności, przez wycięcie prążkaz żelu.

Ekstrakcja kolagenu

Hodowle tkankowe (patrz, 1.2) przerwano przez dodanie 3% kwasu octowego. Kolagen, który się rozpuścił, wytrącono 2 M chlorkiem sodu w 4°C przez noc, a następnie odzyskano przez wirowanie (1 godz. 24000 x g, 4°C). Do osadu dodano 10 ml 3% kwasu octowego. Nowo zsyntetyzowany kolagen zawarty w bloku tkanek włączono do analizy przez mechaniczne rozerwanie bloków tkanki. Resztki tkanki odzyskano przez wirowanie (1 godz. 45000 x g, 4°C). Osad frakcjonowano przez elektroforezę na żeluposolubilizacji. W celu sprawdzenia frakcjonowania białek, barwiono jewżelu.

Żel ciętonapaski o szerokości 5mmwzdłużkierunku migracji, zaś fragmenty żelu przenoszono doprobówek scyntylacyjnychi badanowlicznikuscyntylacyjnym.

Nafig. 5 pokazanoporównaniepomiędzytkankążywąi zdenaturowaną termicznie.

Porównanie to jest przedstawione na fig. 5 na podstawie rozmieszczenia radioaktywności wżelu. Kolagen, jako względnieduże białko, wykrywa się w reg ion ie około 2 cm od miejsca startu.

Konkretny radioaktywny prążek można przyporządkować prążkowi kolagenu wykrywalnemu przezbarwienieCoomassie.

Figura 5 znacznikI, głowa kości udowej, warstwagąbczasta, mężczyzna, 45 lat.

Różnica w wydajności syntezy kolagenu pomiędzy tkankami żywymi i zdenaturowanymi termicznie (CMP: zliczeniana minutę).

PL 192 094 B1

Pokazuje to rozmieszczenie radioaktywności w żelu. Prążek kolagenu stwierdza się w regionie 2cm od miejsca startu. Prążek kolagenu występuje wyłącznie w żywej tkance, co oznacza, że radioaktywność wykrywalna w żelu odpowiada syntezie nowego kolagenu na nowo podczas inkubacji.

Żywa tkanka wykazuje wykrywalną wydajność syntezy kolagenu, podczas gdy martwa tkanka nie wykazuje żadnej aktywności metabolicznej. Pokazuje to, że wykrywany radioaktywny kolagen można przypisać syntezie nowego kolagenu w hodowli tkankowej, nie zaś nieswoistemu wiązaniu radioaktywnej proliny z tkanką kostną. We wszystkich doświadczeniach zastosowano porównywalną ilość materiału tkankowego (około 100 mg).

Można wykrywać inne mniejsze prążki znakowane radioaktywnie, prawdopodobnie stanowiące produkty degradacji kolagenu. Degradacja kolagenu w hodowlach tkankowych obserwowana jest w szczególności w doświadczeniach ze znakowaniem z okresem inkubacji ponad 4 dni. Prolina znakowana radioaktywnie występuje również w żelu w mniejszych ilościach, ale nie jest możliwe całkowite usunięcie przez wytrącanie.

Tolerancja tkanki kostnej wobec słabo alkalicznego pH jest oczywista jak wynika z doświadczeń analogicznych do przedstawionych na fig. 5. W analogicznym doświadczeniu, fizjologiczny bufor Hepes w pożywce hodowlanej (pH 7,4) zastąpiono buforem wodorowęglanowym (pH 8,0). Na podstawie tej alkalizacji pożywki hodowlanej do pH 8,0 okazało się, że nie było dającej się zmierzyć różnicy w syntezie kolagenu od pH 7,4. Powyżej pH 8,5 nie obserwowano już żadnego wzrostu regeneracji kolagenu w porównaniu ze spontaniczną regeneracją kolagenu.

Na fig. 6 do 9 pokazano ilość nowo syntetyzowanego kolagenu w partiach testowych z różnymi mieszaninami według wynalazku w porównaniu z partiami kontrolnymi bez takiej mieszaniny albo pod nieobecność alkoholu di- albo poliwodorotlenowego. Różnica w ilości nowosyntetyzowanego kolagenu w próbce kontrolnej orazw partiach badanych wyrażona jest w procentach. 0% oznacza, że nie występował wzrost ilości kolagenu nowosyntetyzowanego w porównaniu z kontrolą, 100% oznacza 2-krotny wzrost regeneracji kolagenu w porównaniu z kontrolą pod wpływem mieszaniny według wynalazku.

Jak widać na fig. 6, w czterech doświadczeniach synteza kolagenu jest zwiększona o około 100 do 120% w porównaniu z kontrolą pod wpływem mieszaniny gliceryny/wodorotlenku wapnia/oleju kopytkowego (skład: 30% wagowych Ca(OH)2, 30% wagowych gliceryny, 40% wagowych oleju kopytkowego). Ten wzrost jest istotny, ponieważ zmienność doświadczalna w wydajności syntezy kolagenu jest w zakresie od 10 do 20%, podczas gdy wzrost określony pod wpływem mieszaniny gliceryny/wodorotlenku wapnia/oleju kopytkowego wynosi od 100 do 120%. Oprócz tego, istnieją dowody wzrostu wydajności syntezy kolagenu w porównaniu z mieszaniną niezawierającą gliceryny.

Jak widać na fig. 7, w czterech doświadczeniach synteza kolagenu jest zwiększona o 100 do 120% w porównaniu z kontrolą pod wpływem mieszaniny glikolu propylenowego/wodorotlenku wapnia/oleju kopytkowego (skład: 30% wagowych Ca(OH)2, 30% wagowych glikolu propylenowego, 40% wagowych oleju kopytkowego). Ten wzrost jest istotny, ponieważ zmienność doświadczalna w wydajności syntezy kolagenu znajduje się w zakresie od 10 do 20%, podczas gdy wzrost pod wpływem mieszaniny glikolu propylenowego/wodorotlenku wapnia/oleju kopytkowego wynosi od100 do 120%. Oprócz tego, istnieją dowody wzrostu syntezy kolagenu w porównaniu z mieszaniną niezawierającą glikolu propylenowego.

Jak widać na fig. 8, w czterech doświadczeniach synteza kolagenu jest zwiększona o około 100 do 120% w porównaniu z kontrolą pod wpływem mieszaniny gliceryny/wodorotlenku wapnia/oleju z oliwek (skład: 30% wagowych Ca(OH)2, 30% wagowych gliceryny, 40% wagowych oleju z oliwek). Ten wzrost jest istotny, ponieważ zmienność doświadczalna w wydajności syntezy kolagenu znajduje się w zakresie od 10 do 20%, podczas gdy wzrost pod wpływem mieszaniny gliceryny/wodorotlenku wapnia/oleju z oliwek wynosi od100 do 120%. Oprócz tego, istnieją dowody wzrostu wydajności syntezy kolagenu w porównaniu z mieszaniną niezawierającą gliceryny.

Jak widać na fig. 9, w czterech doświadczeniach synteza kolagenu jest zwiększona o około 100 do 140% w porównaniu z kontrolą pod wpływem mieszaniny gliceryny/wodorotlenku wapnia/tlenku magnezu/oleju kopytkowego (skład: 20% wagowych Ca(OH)2, 20% wagowych gliceryny, 20% wagowych tlenku magnezu, 40% wagowych oleju z kopyt bydlęcych). Ten wzrost jest istotny, ponieważ zmienność doświadczalna w wydajności syntezy kolagenu znajduje się w zakresie od 10 do 20%, podczas gdy wzrost pod wpływem mieszaniny gliceryny/wodorotlenku wapnia/tlenku magnezu/oleju kopytkowego wynosi od 100 do 140%. Oprócz tego, istnieją dowody wzrostu syntezy kolagenu w porównaniu z mieszaniną niezawierającą gliceryny i MgO.

PL 192 094 B1

P r z y k ł a d 2

Stwierdzono, że w testach stabilności, w których mieszaniny wskazane poniżej po nadaniu im postaci ciastowatej albo konsystencji kremu przechowywano w temperaturze pokojowej i w warunkach wilgotności otoczenia, że można przedłużyć czas istnienia pożądanej konsystencji mieszaniny przynajmniej o 50% okresu stabilności w obecności alkoholu di- albo poliwodorotlenowego w porównaniu z próbkami bez alkoholu.

Zastosowane mieszaniny

1) gliceryna/wodorotlenek wapnia/olej kopytkowy (30% wagowych, 30% wagowych, 40% wagowych);

2) glikol propylenowy/wodorotlenek wapnia/olej kopytkowy (30% wagowych, 30% wagowych, 40% wagowych);

3) gliceryna/wodorotlenek wapnia/olej z oliwek (30% wagowych, 30% wagowych, 40% wagowych).

mieszanina

Konsystencja ciastowata konsystencja kremu 2 mieszanina

Konsystencja ciastowata konsystencja kremu 3 mieszanina konsystencja ciastowata konsystencja kremu bez gliceryny miesięcy miesięcy bez glikolu propylenowego miesięcy miesięcy bez oleju z oliwek miesięcy miesięcy z gliceryną miesięcy miesięcy z glikolem propylenowym miesięcy miesięcy z olejem z oliwek miesięcy miesięcy

Claims

1. Preparat farmaceutyczny do regeneracji kolagenu zawierający substancję aktywną i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalne zaróbki, znamienny tym, że jako substancję aktywną obejmuje wodorotlenek wapnia, olej ciekły pochodzenia roślinnego albo zwierzęcego i dodatkowo alkohol diwodorotlenowy albo poliwodorotlenowy.

2. Preparat farmaceutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek objętościowy wodorotlenku wapnia i oleju ciekłego pochodzenia roślinnego albo zwierzęcego wynosi 5/1 do 1/5.

3. Preparat farmaceutyczny według zastrz. 2, znamienny tym, że stosunek objętościowy wodorotlenku wapnia i oleju ciekłego pochodzenia roślinnego albo zwierzęcego wynosi 1/1.

4. Preparat farmaceutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek objętościowy wodorotlenku wapnia i oleju ciekłego pochodzenia roślinnego albo zwierzęcego wynosi 5/1.

5. Preparat farmaceutyczny według jednego z zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo zawiera siarczan baru.

6. Preparat farmaceutyczny według jednego z zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo zawiera wazelinę białą.

7. Preparat farmaceutycznywedług zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo zawiera MgO.

8. Preparat farmaceutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że alkoholem poliwodorotlenowym jest gliceryna.

9. Preparat farmaceutyczny według jednego z zastrz. 1, znamienny tym, że olejem ciekłym zwierzęcymjest olej kopytkowy.

10. Preparat farmaceutyczny według jednego z zastrz. 1, znamienny tym, że olejem ciekłym roślinnym jest olej z oliwek.

11. Preparat farmaceutyczny według zastrz.1, znamienny tym, że zawiera wodorotlenek wapnia w ilości od 1 do 90% wagowych, oleje ciekłe roślinne albo zwierzęce w ilości od 9 do 90%, i alkohol diwodorotlenowy albo wielowodorotlenowy w ilości od 1 do 40% wagowych w odniesieniu do ciężaru całkowitego preparatu.

12. Sposób wytwarzania preparatu farmaceutycznego określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje mieszanie wodorotlenku wapnia i alkoholu diwodorotlenowego albo poliwodorotlenowego z olejem ciekłym pochodzenia roślinnego albo zwierzęcego.

PL 192 094 B1

13. Zastosowanie preparatu farmaceutycznego obejmującego wodorotlenek wapnia, alkohol diwodorotlenowyalbo poliwodorotlenowyorazolej ciekły pochodzenia zwierzęcego alboroślinnego, iewentualnie zaróbkędopuszczalnąfarmaceutyczniedowytwarzanialekudopobudzaniaregeneracji kolagenu in vivo.