SK148797A3

SK148797A3 - Inhibitors of fibrin cross-linking and/or transglutaminases

Info

Publication number: SK148797A3
Application number: SK1487-97A
Authority: SK
Inventors: Roy T Sawyer; Robert B Wallis; Lisa Seale; Sarah Finney
Original assignee: Biopharm Res & Dev Ltd
Priority date: 1995-05-05
Filing date: 1996-05-07
Publication date: 1998-04-08
Also published as: HUP9900408A2; US6025330A; AU723130B2; EP0848719A2; CA2220268A1; JPH11505218A; KR19990008348A; WO1996034890A2; PL323252A1; CZ348197A3; AU5654696A; WO1996034890A3; NO975080L; NO975080D0; BR9608207A; GB9509271D0; HUP9900408A3; MX9708513A

Description

Inhibítory zosieťovania fibrínu a/alebo transglutaminázovej aktivity

Oblasť techniky

Vynález sa týka novej triedy inhibítorov zosieťovania fibrínu a/alebo transglutaminázovej aktivity. Vynález sa predovšetkým týka takých inhibítorov, ktoré sa napríklad môžu izolovať z tkaniva alebo zo sekrétov pijavice.

Doterajší stav techniky

Enzýmy, ktoré sú známe ako transglutaminázy, sú primárne zodpovedné za stabilitu agregátov mnohých proteínov. Zodpovedajú napríklad za tvorbu krvnej zrazeniny. Zosieťovanie proteínov pôsobením transglutamináz je hlavný spôsob, ako dosiahnuť stabilizované zrazeniny fibrínu. U cicavcov za stabilizáciu krvných, zrazenín zodpovedá transglutamináza,, ktorá je známa ako faktor XlIIa. Tento enzým katalyzuje sieťovanie vlákien fibrínu. Žosieťované krvné zrazeniny nie sú tak citlivé na pôsobenie fibrinolytických enzýmov a sú prakticky nerozpustné v denaturačných rozpúšťadlách, ako je 5M močovina.

Faktor XlIIa nie je typický koagulačný enzým, pretože nejde o serínovú proteázu, ale skôr o transamidujúci enzým obsahujúci cysteín, ktorý katalyzuje reakciu postranných reťazcov aminokyselín lyzínu a glutamínu za vzniku amidovej väzby, pričom sa uvoľňuje amoniak. Reakcia prebieha podľa nasledujúcej schémy:

Faktor XlIIa

R_rCONH₂ + NH2-R2 -► R1-CO-NH-R2 + NH₃

Ak je substrátom fibrín, je R)-CONH₂, resp. R₂-NH₂ postranný reťazec glutamínu a lyzínu v odlišných reťazcoch fibrínového polypeptidu.

Faktor XlIIa tiež môže katalyzovať zosieťovanie iných proteínov. Napríklad je známe, že faktor XlIIa zodpovedá za naviazanie ct2-antiplazmínu na fibrín a za zvýšenú rezistenciu fibrínu k lýze. Faktor XlIIa však tiež môže spôsobiť priečne väzby medzi odlišnými štruktúrnymi a kontraktilnými proteínmi, ako je kolagén, laminín, aktín, myozín, trombospondín, vinkulín a vitro2 nektín a pod. Usudzuje sa, že táto vlastnosť je súčasťou procesu hojenia rán a môže mať význam v patológii radu ochorení premeny tkaniva.

Je preto žiadúce vytvoriť inhibítor enzýmov transglutamináz, ktorý môže byť použitý napríklad pri liečbe rôznych patologických alebo tromboembolických stavov. Inhibítory transglutamináz boli už v minulosti opísané a všeobecne sa dajú rozdeliť do štyroch hlavných kategórií:

a) imunoglobulíny namierené proti enzýmu;

b) substráty s nízkou molekulovou hmotnosťou, ktoré konkurujú prirodzeným proteínovým substrátom;

c) činidlá, ktoré reagujú s aktívnymi miestami enzýmu; a

d) peptidové fragmenty samotného faktora XIII.

Tieto inhibítory nie je možné z rôznych dôvodov použiť napríklad vo farmaceutických formuláciách. Výpočet dôvodov nasleduje:

V minulosti sa zistilo, že prirodzene sa vyskytujúce inhibítory transglutaminázy sú imunoglobulíny zamerané proti sub-jednotke transglutaminázy. Tieto inhibítory tým, že redukujú cirkulujúci faktor XIII, dávajú vznik hemoragickým stavom. Americký patent č. 5470957 dokladá liečebné použitie takých imunoglobulínov pomocou vznikajúcich protilátok proti subjednotkám enzýmu transglutaminázy. Nevýhodou takých protilátok, ako sú inhibítory transglutaminázy je, že majú vysoké molekulové hmotnosti. Je nevyhnutné, pred tým, než sa napríklad použijú na liečbu ľudí, vytvoriť chimérické ľudské analógy imunoglobulínov.

Dokument WO91/10427 opisuje transglutaminázové inhibítory, ktorými sú amíny, ktoré pôsobia tak, že sa viažu na zvyšky glutamínu v jednom substráte, aby zabránili sieťovaniu s iným substrátom. Také inhibítory nie sú príliš silné a aby mali podstatný inhibičný účinok, ich koncentrácia musí byť rovnaká alebo vyššia, než je koncentrácia prirodzeného substrátu. Preto sú účinné iba v koncentráciách približne 50 μΜ a vyšších.

Dokument WO92/13530 dokladá použitie rôznych transglutaminázových inhibítorov, ktoré sa opiera o skutočnosť, že transglutaminázová aktivita je vysoko závislá na reaktívnej merkapto skupine. Preto ľubovoľné činidlo, ktoré alkyluje alebo oxiduje túto merkapto skupinu, by malo inhibovať aktivitu transglutaminázy. Také činidlá však sú veľmi reaktívne a sú z toho dôvodu nepoužiteľné zvlášť pri farmaceutickej alebo terapeutickej liečbe.

Pokusy o prípravu peptidických imhibítorov, od ktorých sa očakáva, že sú špecifickejšie a menej toxické, viedli iba k látkam so slabou účinnosťou. Také inhibítory napríklad opisuje americký patent č. 5328898 a publikácia Achyuthan K.E., Slaughter T.F., Santiago M.A. et al; J.Biol.Chem. 268: pp. 21284-21292, 1993; “Factor XlIIa derived peptides inhibit transglutaminase actvity: localisation of substráte recognition sites”.

Podstata vynálezu

Vynález opisuje silný inhibítor enzýmov transglutamináz, ktorý sa môže napríklad použiť na farmaceutické a liečebné účely.

Izoloval sa nový polypetid, ktorý inhibuje transglutaminázovú aktivitu a/alebo sieťovanie fibrínu. Tento polypeptid zahrnuje nasledujúcu sekvenciu aminokyselín:

10 . NH₂-Lys-Leu-'Leu-Pro-Cys-Lys-Glu-X₁-His-Gln-Gly20

Ile-Pro-Asn-Pro-Arg-Cys-X₂-Cys-Gly-Ala-Asp-Leu30

Glu-X₃-Ala-Gln-Asp-Gln-Tyr-Cys-Ala-Phe-Ile-Pro40

Gln-Zi-Arg-Pro-Arg-Ser-Glu-Leu-Ile-Lys-Pro-Met50

Asp-Asp-Ile-Tyr-Gln-Arg-Pro-Val-Z₂-Phe-Pro-Asn60 66 Leu-Pro-Leu-Lys-Pro-Arg-Z₃-COOH, kde Xi, X₂ a X₃ sú ľubovoľné zvyšky aminokyselín; každý zo Z_b Z₂ a Z₃ reprezentuje súčasne alebo striedavo Cys alebo Glu; alebo farmaceutický vhodnú soľ, derivát (ako je chimérický derivát) alebo bioprekurzor uvedenej aminokyselinovej sekvencie alebo jej homológ alebo analóg, ktorý vykazuje v podstate podobnú aktivitu. Termín “homológ” znamená polypeptid, v ktorom sa nie viac než 23 % aminokyselín v polypeptidovom reťazci líši od tu uvedenej aminokyselino4 vej sekvencie. Počet 23 % vychádza zo skutočnosti, že v literatúre je opísaný rad homológov hirudínu vyskytujúcich sa prirodzene v Hirudo medicinalis a že polypeptidový reťazec tých, ktoré sa najviac odlišujú, má odlišných 15 aminokyselín zo 65. Termín “analóg” tu znamená, že sa do polypeptidového reťazca môže vsunúť jedna alebo viac ďalších aminokyselín, bez toho, aby dochádzalo k podstatnej interferencii s farmaceutickou aktivitou polypeptidu. Vynález tiež zahrnuje skrátené formy polypeptidu, ktoré majú hore uvedenú aminokyselinovú sekvenciu.

Polypeptidy podľa vynálezu sú silné inhibítory transglutaminázovej aktivity a/alebo sieťovania fibrínu. Schopnosť polypeptidov podľa vynálezu zabrániť sieťovaniu proteínov má významný účinok na stabilitu napríklad krvných zrazenín. Inhibičný účinok polypeptidu podľa vynálezu na faktor XlIIa, sa môže hodnotiť podľa vzrastajúcej rozpustnosti zrazenín fibrínu v močovine s koncentráciou 5M. Ďalej na meranie inhibičného účinku polypeptidov sa dá využiť skutočnosť, že polypeptidy inhibujú uvoľnenie amoniaku inkorporáciou etylamínu alebo tiež biotínamidopentylamínu do kazeínu.

Verí sa, že doména N-konca je zvlášť silný inhibítor transglutaminázovej aktivity. Vynález preto ďalej zahrnuje polypeptid, ktorý špecifičky inhibuje transglutaminázovú aktivitu a obsahuje nasledujúcu aminokyselinovú sekvenciu:

NH2-Lys-Leu-Leu-Pro-Cys-Lys-Glu-Y-His-Gln-Gly-Ile-Pro-Asn-Pro-Arg-, kde Y je ľubovoľná aminokyselinová sekvencia, alebo jeho farmaceutický vhodnú soľ, derivát alebo bioprekurzor, alebo ich homológ alebo analóg, ktorý vykazuje v podstate podobnú aktivitu.

Polypeptidy podľa vynálezu (ktoré sú tu označené ako “trideginy”) výhodne priamo inhibujú transglutaminázovú aktivitu v koncentrácii 1 až 50 nanomólov (rozdiel aspoň rádovo o 1000 vztiahnuté ku známym inhibítorom kategórií b), c) a d) hore opísaných).

Trideginy môžu tvoriť farmaceutický vhodné soli s ľubovoľnou vhodnou netoxickou organickou alebo anorganickou kyselinou. Medzi také anorganické kyseliny napríklad patrí kyselina chlorovodíková, bromovodíková, sírová alebo fosforečná a kyslé kovové soli, ako sú hydrogénsforečnan sodný a hydrosulfát draselný. Príklady organických kyselín zahrnujú mono-, di- a trikarboxylové kyseliny, ako sú kyselina octová, glykolová, mliečna, pyrohroznová a sulfónová a podobne. Soli časti C-konca aminokyseliny zahrnujú soli netoxických karboxylových kyselín tvorené s vhodnými anorganickými alebo organickými bázami.

Trideginy podľa vynálezu sa môžu extrahovať z tkaniva pijavice alebo z jej sekrétov napríklad homogenizáciou v podstate celej pijavice, slinných žliaz alebo jej chobotu a podobne, vo vhodnom pufri. V minulosti transglutaminázové inhibítory neboli v pijaviciach identifikované ani z nich neboli extrahované; vynález preto zahrnuje inhibítor transglutaminázovej aktivity, ktorý je získateľný z tkaniva pijavice alebo z jej sekrétov. Termín “získateľný” tu označuje materiál, ktorý sa získal priamo, nepriamo alebo sa premenil na chemicky modifikovaný derivát.

Typická extrakcia a čistenie trideginov podľa vynálezu prebieha kombináciou známych metód, ako sú napríklad výmena iónov, gélová filtrácia a/alebo chromatografia s obrátenými fázami.

Pijavice rovnakého rodu alebo dokonce rovnakého druhu často majú vo svojich slinách peptidy, ktoré majú podobné biochemické účinky a vysoko homológnu aminokyselinovú štruktúru. V rovnakých druhoch pijavíc sa môže vyskytovať niekoľko odlišných izoforiem, ktoré sa líšia iba niekoľkými aminokyselinami.

Trideginy podľa vynálezu je možné získať z tkaniva pijavíc alebo z ich sekrétov, príznačne z pijavíc radu Rhynchobdellida. Pretože rad komponentov slinných žliaz alebo sekrétov tkaniva pijavíc, ktoré majú podobnú biochemickú špecifičnosť, sú členy takýchto homolégnych rodín peptidov, tento vynález tiež zahrnuje také izoformy a analógy trideginov podľa vynálezu, ktoré je možné získať z pijavíc. Často sa pozoruje post-translačná modifikácia polypeptidov získaných z pijavíc a vo svetle skutočnosti, že niektoré zvyšky v trideginoch nemohli byť priradené ku známej aminokyselinovej štruktúre, vynález tiež zahrnuje také post-translačne modifikované polypeptidy, ktoré zodpovedajú polypeptidom hore uvedených sekvencií.

Predmetom vynálezu je ďalej inhibítor sieťovania fibrínu a/alebo transglutaminázovej aktivity. Tento inhibítor je možné získať z tkaniva alebo zo sekrétov pijavice, príznačne z pijavíc radu Rhynchobdellida, prednostne z pijavíc rodu Haementeria.

Preferuje sa inhibítor podľa vynálezu, ktorého zdanlivá molekulová hmotnosť určená elektroforézou na polyakrylamidovom géle je v rozmedzí približne 7 000 daltonov až 8 000 dal6 tonov, a má schopnosť inhibovať uvoľnenie amoniaku pri inkorporácii amínov alebo biotínamidopentylamínu do kazeínu kataiyzovanej faktorom XlIIa.

Okrem účinku na faktor XlIIa trideginy sú inhibítormi mnohých rôznych transglutamináz, aj keď inhibícia aktivity faktora XlIIa plazmy, faktora XlIIa krvných doštičiek a aktivity tkanivovej transglutaminázy z pečene morčiat prebieha odlišnou silou. Trideginy sa preto považujú za všeobecné inhibítory transglutaminázy a očakáva sa, že inhibujú mnoho rôznych typov týchto enzýmov.

Vynález tiež zahrnuje, v prípade inhibítora podľa vynálezu (ako sa hore definuje), diagnostický spôsob merania stupňa inhibície transglutaminázovej aktivity. Tento spôsob zahrnuje meranie množstva amoniaku uvoľneného pri transglutaminázou kataiyzovanej inkorporácii amínov do kazeínu v prítomnosti inhibítora, kde množstvo uvoľneného amoniaku a/alebo inkorporovaného amínu je miera stupňa inhibície transglutaminázovej aktivity inhibítorom.

Predmetom vynálezu je ďalej farmaceutická formulácia obsahujúca inhibítor podľa vynálezu a jeho farmaceutický prijateľný nosič, riedidlo alebo excipieňt.

Vzhľadom k tomu, že trideginy vykazujú nízku toxicitu a vysoký stupeň inhibície transglutaminázovej aktivity, môžu sa výhodne využívať vo farmaceutických formuláciách. Tieto formulácie sa môžu napríklad podávať pacientovi buď parenterálnou alebo orálnou cestou.

Termín “parenterálny” spôsob aplikácie zahrnuje podkožné, vnútrožilové, vnútrokíbové a vnútropriedušnicové injekcie a infúzie. Ďalej sa môžu použiť spôsoby aplikácie, ako sú orálne podanie a povrchová aplikácia. Parenterálne kompozície a kombinácie sa prednostne aplikujú vnútrožilovo, buď vo forme bolusu alebo ako stále infúzie podľa známych postupov.

Termín “farmaceutický prijateľný nosič” tu znamená ľubovoľné inertné, netoxické, pevné alebo kvapalné plnidlo, riedidlo alebo materiál vhodný na tvorbu kapsúl. Tieto látky nesmú nepriaznivo reagovať s aktívnou látkou alebo nepriaznivo pôsobiť na pacienta. Preferované kvapalné nosiče sú dobre známe, patria medzi ne sterilná voda, fyziologický roztok, vodný roztok dextrózy, cukrové roztoky, etanol, glykoly a oleje. Tablety a kapsuly, ktoré sú vhodné na orálnu aplikáciu, môžu obsahovať bežné excipienty, ako sú väzobné činidlá, plnidlá, mazivá a zvlhčovadlá, atď.. Orálne kvapalné prípravky môžu byť vo forme vodných a olejových suspenzií, roz7 tokov, emulzií, syrupov, elixírov alebo podobne alebo sa môžu vyskytovať ako suchý produkt, ktorý vo vode mení svoju konštitúciu.

Také kvapalné prípravky môžu obsahovať bežné aditíva, ako sú suspenzačné činidlá, emulgačné činidlá, konzervačné činidlá a nevodné činidlá. Prípravky vhodné na povrchovú aplikáciu môžu byť vo forme vodných alebo olejových suspenzií, roztokov, emulzií, gélov alebo sa preferujú emulzné masti.

Jednotkové dávky farmaceutických prípravkov podľa vynálezu môžu obsahovať denné žiadané množstvá trideginu alebo množstvo menšie, než je denná dávka, z ktorého sa môže denná dávka zložiť. Optimálna terapeutická dávka a rozmedzie dávky, ktoré je vhodné pre pacienta (či už je to cicavec alebo človek), závisí od rôznych faktorov, ako je aktivita špecifického aktívneho materiálu, vek, váha, pohlavie, zdravotný stav, diéta, čas a spôsob podania, rýchlosť vyprázdňovania, objekt liečby, rozlišuje sa liečba od profylaxie a podstata liečeného ochorenia.

Očakáva sa, že systémová dávka, ktorá sa u týchto látok pohybuje v rozmedzí 0,05 až 50 mg/kg telesnej váhy, výhodnejšie v rozmedzí 0,05 až 10 mg/kg a prednostne v rozmedzí 0,1 až 1 mg/kg, je účinná. Vzhľadom k podstate ochorenia, ktoré sa má liečiť, jedna dávka môže obsahovať 0,05 až 10 mg/kg telesnej váhy, či už sa aplikuje systémovo alebo povrchovo.

Trideginy môžu porušiť stabilitu tvoriacich sa trombov, napríklad pri akútnych koronárnych syndrómoch, cievnej trombóze alebo mŕtvici, a tým posilňujú účinok trombolytickej terapie alebo skutočné prirodzené lýtické procesy. V tejto súvislosti inhibícia inkorporácie inhibítorov lýzy fibrínu, ako je začlenenie ot2-antiplazmínu do zrazenín fibrínu, prináša ďalšie výhody.

Skutočnosť, že trideginy tiež veľmi silne inhibujú iné transglutaminázy, umožňuje ich použitie všade, kde transglutaminázová aktivita je patologickým agens. Taká úloha sa prisudzuje enzýmu transglutamináze v prípade Crohnovej choroby, implantácie nádoru, aterosklerotických procesov, keď dochádza k zoslabnutiu stien ciev, trombotickej mikroangiopatie napríklad v obličkách, fibróznych zmien kože, ako je sklerodermia, membránovej glomerulonefritídy, hojenia poškodenia sietnice, zákalu, akné, tvorby jazvového tkaniva a infekcie rôznymi filariálnymi nematódami. Použitie trideginov v uvedených prípadoch je výhodné, nie iba pre ich terapeutický účinok, ale ich vysoká účinnosť umožní tiež aplikáciu nižších dávok.

Táto možnosť je uvedená v dokumente WO93/18760, kde sa opisuje použitie slabého inhibítora putrescínu za účelom liečby hypertrofických jaziev. V tomto prípade sa preferuje dávka 50 mM. Za podobných okolností sa v prípade trideginu preferuje dávka 1 až 100 μΜ.

Formulácia podľa vynálezu sa môže výhodne podávať v kombinácii s antikoagulantom, trombolytickým, fibrinolytickým alebo fibrinogenolytickým činidlom a podobne. Toto činidlo môže výhodne zosilniť schopnosť formulácie rozložiť alebo zabrániť tvorbe krvnej zrazeniny. Antikoagulant môže obsahovať peptid, ako je hirudín alebo heparín. Hirudín sa opisuje v dokumentoch EP 0347376 a EP 0501821 a je to generický názov pre skupinu homológnych polypeptidov, ktoré sa nachádzajú v rôznych druhoch pijavíc a ktoré špecificky a silne inhibujú trombín a následne zrážanie krvi. Podobne sa môže použiť fibrinolytické/fíbrinogenolytické činidlo, ako je hementin, ktorý trávi fibrinogén a robí ho nezrážateľným. Hementin je fibrinolytické činidlo, ktoré sa vyskytuje v rôznych druhoch pijavíc a opisuje sa napríklad v dokumentoch US 4390630 a WO 91/15576.

Zvláštny účinok trideginov je skrátenie času potrebného k lýze zrazenín ľudskej plazmy bohatej na krvné doštičky alebo píazmy bez krvných doštičiek, v prípade, že.lýza je indukovaná fibrinolytickým enzýmom. Keď sa skombinujú trideginy buď s aktivátorom tkanivového plazminogénu alebo s hementinom, výsledkom je rýchlejšia lýza v porovnaní s použitím samotného trideginu. Pretože samotný tridegin nemá tento účinok, je zrejmá súčinnosť týchto dvoch materiálov. Trideginy sa môžu použiť v kombinácii s fibrinolytickými činidlami, ktoré priamo lýzujú fibrín (ako je hementin, plazmín alebo emináza) alebo s aktivátormi plazminogénu, ktoré pôsobia prostredníctvom plazmínu (ako je streptokináza, urokináza, stafylokináza, aktivátor tkanivového plazminogénu alebo jeho deriváty) alebo so skrátenými formami alebo hybridnými molekulami, ktoré majú rysy týchto dvoch alebo aj ďalších uvedených činidiel.

Trombolytické činidlá, ktoré môžu byť zahrnuté vo formulácii podľa vynálezu, môžu obsahovať jednu alebo viac látok zo skupiny zahrnujúcej aktivátor tkanivového plazminogénu, streptokinázu, eminázu, urokinázu a stafylokinázu, rovnako ako deriváty, skrátené formy a hybridy týchto látok. Je výhodné, keď formulácia okrem trideginov obsahuje antikoagulant, trombolytické alebo fibrinolytické činidlo, ktoré značne skracujú čas nutný na štiepenie krvnej zrazeniny. Z tohto dôvodu sa môžu trideginy využívať na inhibíciu stabilizácie tvoriacich sa trombov, napríklad pri akútnych koronárnych syndrómoch, cievnej trombóze alebo mŕtvici, a tým pošil9 ňujú účinok trombolytickej terapie. Ak sa inhibuje sieťovanie fibrínu jedným alebo viac trideginmi, čas potrebný 50% lýze zrazenín fibrínu v prítomnosti plazmínu je približne polovičný.

Ďalej čas potrebný na 50% lýzu zrazenín plazmy v prítomnosti aktivátora tkanivového plazminogénu sa redukuje až o 40 %. Podobne je tomu v prítomnosti streptokinázy, kde dochádza k redukcii väčšej než o 25 % .

Termín “v kombinácii alebo kombinovaný s” znamená, že súčasne alebo následne spolu s trideginmi sa podľa vynálezu aplikuje ľubovoľná látka alebo všetky látky zo skupiny zahrnujúcej antikoagulant, fibrinolytické, fibrinogenolytické alebo trombolytické činidlo.

Trideginy podľa vynálezu sa môžu výhodne použiť pri príprave liekov vhodných na liečbu tromboembolických ochorení. Ďalšie patologické stavy, pri liečbe ktorých sa môžu uplatniť trideginy podľa vynálezu, zahrnujú Crohnovu chorobu, implantáciu nádoru, aterosklerotické procesy, keď dochádza k zoslabnutiu stien ciev, trombotické mikroangiopatie napríklad v obličkách, fibrózne zmeny kože, ako je sklerodermia, membránové glomerulonefritídy, zákal, akné, tvorbu jazvového tkaniva a infekciu mikrofilariálnymi nematódami. Výhodné je nielen to, že trideginy podľa vynálezu môžu byť používané pri terapii alebo prevencii týchto syndrómov, ale aj to, že vysoká účinnosť trideginov podľa vynálezu umožňuje použitie nižších dávok.

Vynález ďalej zahrnuje polypeptid pripravovaný metódou génového inžinierstva. Tento polypeptid je ekvivalentný hore definovanému polypeptidu; vynález ďalej zahrnuje syntetický alebo z proteínov zostavený ekvivalent polypeptidu podľa vynálezu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obrázku č. 1 sa znázorňuje elúcia inhibičnej aktivity polypeptidov podľa vynálezu, ktoré sa izolujú spôsobom opisovaným ďalej v príklade 3.

Na obrázku č. 2 je grafické znázornenie výsledkov elúcie inhibičnej aktivity polypeptidu podľa vynálezu (uvedené v príklade 4), ktorá sa porovnáva s hementinom a gilantínom.

Na obrázku č. 3 je grafické znázornenie výsledkov inhibičnej aktivity polypeptidu podľa vynálezu (uvedené v príklade 6).

Na obrázku č. 4 je chromatogram inhibičnej aktivity z príkladu 3.

Na obrázku č. 5 je chromatogram aktívnych frakcií získaných na obrázku č. 4.

Obrázok č. 6 ukazuje výsledky SDS-elektroforézy na polyakrylamidovom géle opisované v príklade 7.

Obrázok č. 7 znázorňuje výsledky získané v príklade 22.

Obrázok č. 8 znázorňuje výsledky získané v príklade 24.

Obrázok č. 9 znázorňuje výsledky získané v príklade 25.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

V prvom experimente sa chobot, predné a zadné slinné žľazy pijavice druhu,Haementeria ghilianii spoločne homogenizovali v homogenizátore Potter v 10 mM Tris HCl, 0,85 % h/o NaCl pH 7,0 (1 ml) a suspenzia sa centrifugovala pri 13 000 ot/min. Supernatant sa podrobil testu rozpustnosti zrazenín, ktorý je podobný testu, ktorý sa opisuje v publikácii Tymiak, Tuttle, Kimball, Wang and Lee, A simple and rapid screen for inhibitors of factor XHIa, J. Antibiotics 46 (1993) pp. 204-206. V druhom experimente sa chobot, predné a zadné slinné žľazy vyňali z pijavice druhu Haementeria ghilianii a separované sa homogenizovali v alikvótoch pufru s objemom 0,2 ml. Účinok uvedených extraktov sa porovnal s extraktami z chobotu, prednej a zadnej slinnej žľazy pijavíc druhu Haementeria officinalis \ 0,2 ml pufru. Do roztoku 10 mg/ml neupraveného bovinného fibrinogénu, ktorý obsahuje faktor XIII (30 μΐ), sa pridali testované vzorky (30 μΐ). Reakcia sa spustila pridaním 6,25 jednotiek/ml bovinného trombínu, ktorý obsahuje 9 mM CaCl₂(40 μΙ). Po pridaní močoviny v koncentrácii 8 M (160 μΐ) sa v priebehu 15 minút tvorila zrazenina. Močovina zostala v kontakte so zrazeninou. Po 30 minútach sa zmerala absorbancia, ktorá je výsledkom opalescencie tvorenej zrazeninou, pri vlnovej dĺžke 405 nm. Znížená absorbancia indikuje rozpustnosť zrazeniny, čo je výsledok inhibície zosieťovania. Tabuľka č. 1 ukazuje inhibičný účinok (absorbancia pri vlnovej dĺžke 405 nm) rôznych extraktov rozpustnosti zrazenín fibrínu v porovnaní s jódoacetamidom (známy inhibítor faktora XlIIa). Numerické hodnoty uvedené v tabuľke sú absorbancie pri vlnovej dĺžke 405 nm.

Tabuľka č. 1

Testované vzorky	Experiment A	Experiment B
Tris pufer	0,74	0,83
Jódoacetamid (100 μΜ)	0,26	0,42
H.ghilianii komplexný extrakt slín	0,29	-
H.ghilianii extrakt z prednej žľazy	-	0,43
H.ghilianii extrakt zo zadnej žľazy	-	0,43
H.ghilianii extrakt z chobotu	-	0,53
H. officinalis extrakt z prednej žľazy	-	0,64
H. officinalis extrakt zo zadnej žľazy		0,55
H. officinalis extrakt z chobotu	-	0,09

Príklad 2

Za účelom potvrdenia prítomnosti inhibítora faktoru XlIIa sa zisťoval mikrotitračnou metódou, opísanou v publikácii Slaughter T.F., Achyuthan K.E., Lai T.-S. and Greenberg C.S. (1992), A microtitre plate transglutaminase assay utilizing 5-(biotinamido)pentylamine as substráte, Anál Biochem 205: 166-171, účinok extraktov na schopnosť ľudského faktora XlIIa katalyzovať začlenenie biotínamidopentylamínu do kazeínu. Extrakty chobotu, predných a zadných slinných žliaz pijavíc druhu Haementeria sa pripravili spôsobom opísaným v experimente A príkladu 1. Extrakty z Haementeria depressa sa lyofilizovali. Vzhľadom na to, že z pijavíc druhu Hirudo medicenalis a Hirudo manillensis nie je ľahké odstrániť slinné žľazy, extrakty sa pripravili z prednej časti jednej tretiny tela pijavice. Uvedená časť tela sa homogenizovala v 1 ml lOmM Tri HCI obsahujúcej 0,85% NaCl. Supernatant vzniknutý centrifugáciou pri 13 000 ot/min sa použil pre ďalší test. Ν,Ν-dimetylkazeín sa za stáleho miešania počas doby 30 minút pri teplote 85 °C rozpustil v 0,1 M Tris HCI pH 8,5 a potom sa centrifugoval pri 12 000 g počas doby 20 minút. Na potiahnutie komôrok mikrotitračných doštičiek sa použila koncentrácia 10 až 20 mg/ml (0,2 ml). Doštičky sa inkubovali pri teplote 37 °C počas doby 1 hodiny. Nadbytočný kazeín sa odstránil a komôrky sa blokovali roztokom 0,5 % sušeného mlieka bez tuku rozpusteného v 0,1 M Tris HCI pH 8,5 počas doby 30 minút. Doštičky sa potom dvakrát premyli alikvótmi Tris pufru s objemom 0,35 ml. Faktor XlIIa sa pripravil z citrátovanej ľudskej plazmy odstránením fibrinogénu pridaním pevného bentonitu (40 mg/ml), táto zmes sa inkubovala 10 minút a centrifugovala sa pri 12 000 g počas doby 2 minút. Supernatant (0,5 ml) sa aktivoval pridaním 1 000 U/mi bovinného trombínu (0,05 ml) a 200 mM CaCh (0,025 ml) a inkuboval sa pri teplote 37 °C počas doby 15 minút. Trombín sa neutralizoval pridaním 2 000 ATU/ml hirudínu (0,5 ml). Komôrky mikrodoštičiek (celkový objem 0,2 ml) obsahovali 5 mM CaCh, 10 mM ditiotritol, 0,5 mM biotínamidopentylamín, testovanú vzorku (0,05 ml) a aktivovanú plazmu (0,05 ml). Po inkubácii pri teplote 37 °C počas doby 30 minút sa z komôrok odstránil roztok a reakcia sa zastavila dvakrát opakovaným premytím 0,2 M EDTA (0,35 ml do každej komôrky). Potom nasledovalo dvakrát opakované premytie 0,1 M Tris HCI pH 8,5 (0,35 ml do každej komôrky). Do každej komôrky sa pridalo 0,25 ml roztoku pripraveného tak, že sa streptavidín alkalická fosfatáza s koncentráciou 0,25 mg/ml nariedila v pomere 1 : 150 pufrom obsahujúcim 0,5 % sušeného mlieka bez tuku rozpusteného v Tris pufre a všetko sa inkubovalo pri teplote 20 C počas doby jednej hodiny. Doštičky sa jeden raz premyli 0,1 % Tritonom X-100 (0,35 ml), potom sa trikrát premyli Tris pufrom (0,35 ml).

Množstvo naviazanej alkalickej fosfatázy sa zistilo pridaním p-nitrofenylfosforečnanu v koncentrácii 1 mg/ml, 5 mM MgCl₂ v Tris pufre (0,05 ml) a Tris pufru (0,2 ml) a zmeraním absorbancie po 30 minútach pri vlnovej dĺžke 405 nm na prístroji Titertek Uniskan II. Tabuľka č. 2 potvrdzuje, s použitím odlišného a citlivejšieho testu, že v slinných orgánoch pijavíc druhu Haementeria ghilianii a Haementeria officinalis sa vyskytuje inhibičná aktivita faktora XlIIa (merané inkorporáciou biotínamidopentylamínu do kazeínu katalyzovanej faktorom XlIIa ľudskej plazmy). Podstatná, ale nízka inhibičná aktivita sa detegovala v slinných žľazách Haementeria depressa a v predných častiach tela pijavíc Hirudo medicinalis a Hirudinaria manillensis.

Tabuľka č. 2

Testované vzorky	Inhibičná aktivita faktora XlIIa (jednotka/kompletný slinnný komplex alebo jednotka/pijavicu)*
kontrolný pufer	0,00
Haementeria ghilianii	128,7
Haementeria officinalis	10,2
Haementeria depressa	0,5
Hirndo medicinalis	1,5
Hirudinaria manillensis	2,1

* jedna jednotka sa definuje ako dvojnásobné množstvo transglutaminázového inhibítora nutného na inhibíciu ľudského faktora XlIIa v 1 ml normálnej ľudskej plazmy o 50 %. Pre túto štandardizáciu sa využila plazma získaná od siedmich zdravých darcov.

Príklad 3

Rovnakým spôsobom, ako sa opisuje v príklade 1, sa pripravila homogenizovaná suspenzia vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosforečnanom z piatich sád kompletného slinného komplexu (predná a zadná slinná žľaza a chobot) z pijavíc druhu Haementeria ghilianii. Supernatant sa naniesol na kolónu Superdex G-200 s rozmermi 1,5 x 80 cm. Chromatografia prebehla pri prietokovej rýchlosti 1 ml/min a vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosforečnanom, ktorého hodnota pH je 7,2. Eluát sa monitoroval pri vlnovej dĺžke 280 nm a inhibičná aktivita sa stanovila s použitím rovnakého testu, ktorý sa opisuje v príklade 1. Obrázok č. 1 znázorňuje separáciu a miesto, kde sa eluovala inhibičná aktivita. Čiara označuje frakciu, ktorá obsahuje trideginovú aktivitu.

Príklad 4

Z kompletného slinného komplexu piatich pijavíc druhu Haementeria ghilianii sa rovnakým spôsobom ako v príklade 1 pripravila homogénna suspenzia v 20 mM Tris HCl pH 8,0. Supernatant sa naniesol na kolónu Expres-Ion Exchanger Q (Whatman) s rozmermi 0,8 x 7,5 cm a eluovala sa lineárnym gradientom až do koncentrácie 20 mM Tris HCI pH 8,0, tento pufer obsahuje 0,3 M NaCl. Eluát sa monitoroval meraním absorpcie pri vlnovej dĺžke 280 nm a aktivita trideginu sa určila testom rozpustnosti zrazenín ako v príklade 1. Ďalej sa merala aktivita hementinu pomocou fibrinolytického testu a inhibičná aktivita faktora Xa testom chromogénneho substrátu. Aktivita hementinu sa stanovila inkubáciou pri teplote 37 °C počas doby 60 minút v zmesi s bovinným fibrinogénom s koncentráciou 2 mg/ml (50 μΐ), s 20 mM pufrom HEPES, ktorý obsahuje 10 mM CaCÍ2 a 0,1 % h/o Brij 35 pH 7,5 (25 μΐ), a s frakciami z kolóny, ktoré sa sériovo riedili (25 μΐ). Za účelom dosiahnutia tvorby zrazeniny sa pridalo 100 U/ml trombínu (10 μΐ) a obsah zrazeniny sa meral po 30 minútach stanovením turbidity pri vlnovej dĺžke 405 nm. Zníženie turbidity indikuje množstvo štiepeného fíbrinogénu. Testovanie inhibičnej aktivity faktora Xa testom chromogénneho substrátu zahrnuje inkubáciu 2 mM S2765 v 50 mM Tris HCI pH 8,3 vo spektrofotometri a meranie intenzity zmien absorbancie pri vlnovej dĺžke 405 nm. Reakcia sa rozbehla po pridaní ľudského faktora Xa.

Na obrázku č. 2 je znázornený profil elúcie lineárnym gradientom až do koncentrácie 0,3 M NaCl. Sú tu označené miesta, kde sa objavuje trídegín (T), hementin a inhibičná aktivita faktora Xa; je tu viditeľná zrejmá separácia trideginu od dvoch ďalších zložiek slín, menovite hementinu (H) a gilanténu (G), ktoré sa vyskytujú v slinných žľazách týchto druhov pijavíc, čo potvrdzuje, že tridegin sa líši od uvedených známych zložiek. Frakcie obsahujúce inhibičnú aktivitu sú označené priamkou respektíve písmenami T,G a H.

Príklad 5

Z kompletného slinného komplexu pijavíc druhu Hciementeria ghilianii sa pripravila rovnakým spôsobom ako v príklade 1 homogénna suspenzia v 20 mM mravenčane amónnom pH 3,5 (5 ml) a naniesla sa na kolónu Expres-Ion Exchanger Q (Whatman) s rozmermi 0,8 x 7,5 cm.

Frakcie sa eluovali lineárnym gradientom soli mravenčanu sodného až do koncentrácie 20 mM, ktorá obsahuje IM NaCl pH3,5. Eluát sa monitoroval meraním absorbancie pri vlnovej dĺžke 280 nm a podrobil sa testu ako v príklade 1. Inhibičná frakcia sa vymyla pri koncentrácii gradientu okolo 0,6 M.

Príklad 6

Kombináciou chromatografických krokov podobných tým, ktoré sa opisujú v príkladoch 3, 4 a 5, sa pripravila náplň pre preparáciu vo veľkom merítku. Kompletný slinný komplex z 50tich pijavíc druhu Haementerici ghilicmii, ktoré sa nekŕmili počas doby najmenej troch mesiacov, sa homogenizoval a centrifugoval spôsobom ako v príklade 1. Supernatant sa naniesol na kolónu Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia) s rozmermi 60 x 10 cm. Frakcie sa eluovali lineárnym gradientom od východiskového pufru až k pufru, ktorý obsahuje 0,1 M NaCl. Eluát sa monitoroval pri vlnovej dĺžke 280 nm a aktívna frakcia sa nachádza v eluáte, ktorý obsahuje NaCl s približnou koncentráciou 0,09 M (zobrazené na obrázku č. 3, kde frakcie obsahujúce inhibičnú aktivitu sú označené šípkou). pH frakcií (145 ml) vykazujúcich inhibičnú aktivitu sa upravilo pridaním kyseliny mravčej na hodnotu 4 a frakcie sa naniesli na kolónu SP Sepharose Fast Flow (Pharmacia) s rozmermi 5 x 12 cm. Kolóna sa uviedla do rovnováhy pufrom obsahujúcim 20 mM mravenčan sodný pH 3,5. Kolóna sa eluovala lineárnym gradientom začínajúcim ekvilibračným pufrom a končiacim rovnakým pufrom obsahujúcim 1 M NaCl. Aktívna frakcia sa eluovala pri koncentrácii NaCl okolo 0,57 M (obrázok č. 4, kde frakcie obsahujúce inhibičnú aktivitu sú opäť označené priamkou). Táto frakcia sa lyofilizovala a opäť rozpustila vo vode s celkovým objemom 2,4 ml a naniesla sa na kolónu Superdex G-75 s rozmermi 1,6 x 60 cm, ktorá sa uviedla do rovnováhy fyziologickým roztokom pH 7,2 pufrovaným fosforečnanom. Profil elúcie je znázornený na obrázku č. 5, kde frakcie obsahujúce inhibičnú aktivitu sú opäť označené priamkou. Zhromaždené aktívne frakcie obsahujú 715 pg proteínu a uchovávajú sa v zmrazenej forme.

SDS elektroforéza na polyakrylovom géle a farbenie buď Coomassieovou modrou alebo striebrom ukazuje, že proteín bol po tomto kroku v podstate čistý a že porovnaním so štandardom so známou molekulovou hmotnosťou naznačuje, že majoritný pruh má molekulovú hmotnosť okolo 7800 daltonov a molekulová hmotnosť minoritného pruhu, ktorý je detegovateľný iba citlivejším farbením striebrom, je vyšší.

Príklad 7

Za účelom sekvenovania prebehol ďalší stupeň čistenia. Aktívna frakcia opísaná v príklade 6 s objemom 0,3 ml sa naniesla na kolónu ProRPC s rozmermi 0,5 x 10 cm ekvilibrovanou 0,1 % kyselinou trifluóroctovou a eluovala sa gradientom acetonitrilu od 0 do 100 %, ktorý ob16 sahuje 0,1 % kyselinu trifluóroctovú. Našiel sa hlavný pík, ktorý obsahuje inhibičnú aktivitu a po ktorom nasledujú dva separované oveľa menšie inaktívne piky. SDS elektroforéza aktívnej frakcie na polyakrylovom géle vykazuje jediný pruh. Molekulová hmotnosť tohto pruhu, ktorý sa porovnal s peptidovým štandardom so známou molekulovou hmotnosťou, je okolo 7 800, čo je uvedené na obrázku č. 6.

Obrázok č. 6 znázorňuje SDS elektorforézu na polyakrylamidovom géle (PhastGel (Pharmacia), čo je gél s vysokou hustotou) čistého polypeptidu.

V dráhe na strane ľavej ruky (dráha 1) a v dráhe 7 je marker s nízkou molekulovou hmotnosťou (Pharmacia) obsahujúci pruhy s veľkosťou 94, 67, 43, 30, 20,1 a 14,4 kD a aprotinín (molekulová hmotnosť 6,5 kD).

V dráhe 2 a 7 je peptidový marker (Pharmacia) obsahujúci pruhy s molekulovými hmotnosťami 16,9, 14,4, 10,7, 8,2 a 6,2 kD a aprotinín (6,5 kD).

V dráhe 3 je slepé stanovenie (voda).

• · * >

V dráhe 4 je čistený tridegin.

V dráhach 5 a 6 sú minoritné piky z chromatografickej kolóny s obrátenými fázami.

Komponent s najmenšou molekulovou váhou migruje najbližšie k hornej časti gélu.

Pomocou automatického proteínového sekvenátora Applied Biosystems 473A sa našla jediná jasná aminokyselinová sekvencia obsiahnutá na N-konci, čo indikuje, že je prítomný iba jeden peptid. Sekvencia aminokyselín je nasledujúca:

NH₂-Lys-Leu-Leu-Pro-X-Lys-Glu-Y-His-Gln-Gly-Ile-Pro-Asn-Pro-Argkde X a Y neboli s istotou určené a preto to môže byť ľubovoľná aminokyselina. Cysteíny v tejto vzorke neboli derivatizované a preto nemôžu byť uvedené. Sekvenácia sa opakovala po pyridyletylácii a zistilo sa, že zvyšok X je cysteín, zatiaľ čo Y nevykázal žiadny pík a nemôže to preto byť žiadna z bežných aminokyselín.

Príklad 8

Za účelom produkcie dostatočného množstva materiálu pre sekvenáciu aminokyselín sa pripravila vzorka inhibítora transglutaminázy zo zadných slinných žliaz iba 50-tich pijavíc druhu Haementeria ghilianii spôsobom, ktorý sa opisuje v príkladoch 6 a 7. Alikvóty sa denaturovali, amidokarboxymetylovali a štiepili sa buď trypsínom alebo AspN endoproteázou podľa štandardnej metódy, ktorú opisuje Matsudaira v publikácii “A practical guide to proteín and peptide purification for microsequencing” Academic Press. 2^nd Edition pp. 45-67. Fragmenty sa separovali na kolóne ProRPC s rozmermi 0,5 x 10 cm ekvilibrovanou 0,06 % kyselinou trifluóroctovou a eluovali sa postupnými lineárnymi gradientami od 2 do 38 %, od 38 do 75 % a od 75 do 98 % elučného pufru, kde elučný pufer je 80 % acetonitril obsiahnutý v 0,0675 % kyseline trifluóroctovej. Elúcia sa monitorovala pri vlnovej dĺžke 210 nm. Sekvencia izolovaných fragmentov sa určila automatickým proteínovým sekvenátorom Applied Biosystems 473 A. Aminokyselinová sekvencia celého polypeptidu sa odvodila zo sekvenačných dát a z nájdených prekrývajúcich sa peptidov:

· . ' 10 NH₂-Lys-Leu-Leu-Pro-Cys-Lys-Glu-Xi-His-Gln-Gly20

Ile-Pro-Asn-Pro-Arg-Cys-X₂-Cys-Gly-Ala-Asp-Leu30

Glu-X₃-Ala-Gln-Asp-Gln-Tyr-Cys-Ala-Phe-Ile-Pro40

Gln-Zi~Arg-Pro-Arg-Ser-Glu-Leu-Ile-Lys-Pro-Met50

Asp-Asp-Ile-Tyr-Gln-Arg-Pro-Val-Z₂-Phe-Pro-Asn60 66 Leu-Pro-Leu-Lys-Pro-Arg-Z₃-COOH, kde aminokyseliny X_b X₂ a X₃ nebolo možné určiť a môžu reprezentovať zvyšky, ktoré sa môžu post-translačne modifikovať. Z_b Z₂ a Z₃ reprezentujú aminokyseliny, kde nie je jasné, či ide o Cys alebo o Glu. Polypeptid majúci túto sekvenciu sa označil ako tridegin variant 1.

Príklad 9

Okrem testov, ktoré demonštrujú schopnosť faktora XlIIa sprostredkovať inkorporáciu amínov do kazeínu a účinky faktora XlIIa na rozpustnosť zrazenín, sa môže špecificita inhibičnej aktivity preukázať testom, ktorým sa stanoví uvoľnenie amoniaku pri inkorporácii amínov do kazeínu. Transglutaminázová aktivita faktora XlIIa ľudskej plazmy sa merala na spektrofotometri podľa upravenej metódy, ktorá sa opisuje v publikácii Muszbek, Polgar and Fesus; “Kinetic determination of blood coagulation factor XIII in plasma.” Clin. Chem. 31 (1985) pp. 35-40. Táto metóda meria produkciu amoniaku pomocou NADH oxidácie, ktorá je sprostredkovaná reakciou s glutamátdehydrogenázou. NADH oxidácia sa môže monitorovať zmenami v absorpcii pri vlnovej dĺžke 340 nm. Faktor XIII sa aktivuje inkubáciou ľudskej plazmy bez fibrínu (2 ml) a 200 mM CaCb (0,1 ml) s 1 OOOU/ml bovinného trombínu (0,1 ml) pri teplote 37 °C. Po 15 minútach sa reakcia zastaví pridaním 260 antitrombínových jednotiek hirudínu. Reakčná kyveta obsahovala 2,5 mM ditiotritol (0,1 ml), 40 mg/ml defosforylovaného β-kazeínu (0,05 ml), 70 mM etylamín (0,1 ml), 12 mM 2-ketoglutarát sodný (0,1 ml), 4 mM NADH (0,1 ml), 1,2 ml ADP (0,T ml), 40 jednotiek/ml glutamátdehydrogenázy.(0,l ml), 70 mM pufer HEPES pH7,5 (0,25 ml). Táto kyveta sa umiestnila do spektrofotometra pri teplote 20 °C. Všetky zložky sa rozpustili v 70 mM pufru HEPES pH 7,5. Reakcia sa spustila pridaním aktivovaného faktora XIII (0,2 ml) a monitorovala sa pri vlnovej dĺžke 340 nm. Platnosť testu sa overila použitím plazmy bez faktora XIII (Sigma). Zámena normálnej plazmy za deficientnú sa prejavila v rýchlosti reakcie, ktorá sa znížila o 88 % (1,87 versus 11,3 mAbs/min), čo naznačuje, že test skutočne meria faktor XlIIa.

Do kyvety sa pridali testované vzorky v pufre HEPES s objemom 0,1 ml. Inhibičný účinok trideginu variantu 1 sa porovnal s inhibičným účinkom jódoacetamidu, ktorý je známy ako inhibítor na merkapto skupine závislého faktora XlIIa a EGTA, inhibítora aktivácie faktora XIII a aktivity na základe chelatácie esenciálneho vápnika, ako ukazuje tabuľka 3. Tridegin znížil rýchlosť uvolňovania amoniaku približne o 93 %, čo znamená, že inhibícia je rovnaká ako v prípade jódoacetamidu (tabuľka 3). To je ďalší dôkaz, ktorý ukazuje, že trideginy, ktoré inhibujú rozpúšťanie zrazenín, sú inhibítory plazmatickej transglutaminázy alebo faktora XlIIa.

Tabuľka 3

Testované vzorky (koncentrácia v kyvete)	Zmeny v absorbancii (mAbs/min)
kontrola	4,14
EGTA (77mM)	0,024
jódoacetamid (0,077mM)	0,356
tridegin (3,8μβ/ιη1)	0,28

Príklad 10

Účinok trideginu variantu 1, izolovaného v príklade 6, na schopnosť ľudského faktora XlIIa katalyzovat’ začlenenie biotínamidopentylamínu do kazeínu sa stanovil mikrotitračnou metódou opísanou v publikácii Slaughter T.F., Achyuthan K.E., Lai T.-S. and Greenberg C.S. (1992), A microtitre plate ťransglutaminase assay utilizing 5-(biotinamido)pentylamine as substráte, Anál Biochem 205: 166-171. Ν,Ν-dimetylkazeín sa rozpustil v 0,1 M Tris HCI pH 8,5 za stáleho miešania pri teplote 85 °C počas doby 30 minút a potom sa centrifugoval pri 12 OOOg počas doby 20 minút. Na potiahnutie komôrok mikrotitračných doštičiek sa použila koncentrácia 10 až 20 mg/ml (0,2 ml). Doštičky sa inkubovali pri teplote 37 °C počas doby 1 hod. Nadbytočný kazeín sa odstránil a komôrky sa blokovali roztokom 0,5 % sušeného mlieka bez tuku rozpusteného v 0,1 M Tris HCI pH 8,5 počas doby 30 minút. Doštičky sa potom dvakrát premyli alikvótmi Tris pufru s objemom 0,35 ml. Čistený faktor XIII ľudských krvných doštičiek sa aktivoval pridaním 150 U/ml trombínu obsiahnutého v 15 mM CaCb (0,18 ml) a inkubáciou pri teplote 37 °C počas doby 15 minút. Trombín sa potom inhiboval pridaním 140 ATU/ml prírodného hirudínu (0,3 ml). Komôrky mikrodoštičiek (celkový objem 0,2 ml) obsahovali 5mM CaCb, lOmM ditiotritol, 0,5mM biotínamidopentylamín, vzorku trideginu pripravenú rovnakým spôsobom ako v príklade 6 a 0,25 jednotiek/ml aktivovaného faktora XlIIa obsiahnutého v 0,lM Tris HCI pH8,5. Po inkubácii pri teplote 37°C počas doby 30 minút sa z komôrok odstránil roztok a reakcia sa zastavila dvakrát opakovaným premytím 0,2M EDTA (0,35ml do každej komôrky). Potom nasledovalo dvakrát opakované premytie 0,lM Tris HCI pH 8,5 (0,35 mi do každej komôrky). Do každej komôrky sa pridalo 0,25 ml roztoku pripraveného tak, že sa streptavidín alkalická fosfatáza s koncentráciou 0,25 mg/ml nariedila v pomere 1:150 pufrom obsa20 hujúcim 0,5 % sušeného mlieka bez tuku rozpusteného v Tris pufre a všetko sa inkubovalo pri teplote 20 °C počas doby jednej hodiny. Doštičky sa jeden raz premyli 0,1 % Tritonom X-100 (0,35 ml), potom sa trikrát premyli Tris pufrom (0,35 ml). Množstvo naviazanej alkalickej fosfatázy sa zistilo pridaním p-nitrofenylfosforečnanu v koncentrácii 1 mg/ml, 5 mM MgCb v Tris pufre (0,05 ml) a Tris pufru (0,2 ml) a zmeraním absorbancie po 30 minútach pri vlnovej dĺžke 405 nm na prístroji Titertek Uniskan II.

Tridegin variant 1 jasne inhiboval začlenenie aminu, pričom hodnota IC50 je 0,026 +/- 0,002 pg/ml (3,4 nM), čo ukazuje, že je veľmi silným inhibítorom faktora XlIIa krvných doštičiek.

V oddelenom experimente, keď sa postupovalo podľa rovnakého protokolu s tou výnimkou, že došlo k zámene čisteného faktora XIII za plazmu zdravého ľudského darcu a použila sa premenlivá koncentrácia trideginu, sa stanovilo, že hodnota IC50 v prípade plazmatickej formy faktora XlIIa je 0,07 +/- 0,003 pg/ml (9,2 nM).

Príklad 11

Účinok trideginu variantu 1 čisteného podľa príkladu 6 sa testoval na koagulačnom enzýme, trombíne, testom chromogénneho substrátu. lmM S2238 sa inkuboval v 50 mM Tris HC1 pH 8,3 a reakcia sa spustila pridaním trombínu v konečnej koncentrácii 0,15 U/ml. Reakcia sa monitorovala na spektrofotometri pri vlnovej dĺžke 405 nm. Tabuľka Č. 4 ukazuje, že tridegin s koncentráciou 4,6 pg/ml nemal na trombín žiadny účinok, zatiaľ čo hirudín pri koncentrácii 0,046 pg/ml mal znateľný inhibičný účinok (95%).

Tabuľka č. 4

Testovaná vzorka	Koncentrácia (pg/ml)	Rýchlosť reakcie (mAbs/min)
kontrola		49,8
tridegin	4,6	51,8
hirudín	0,046	2,63

2Í

Príklad 12

Účinok trideginu. čisteného spôsobom opísaným v príklade 6 sa testoval na faktore Xa. Činidlo S2765 v koncentrácii 2 mM sa inkubovalo v 50 mM Tris HCl pH 8,3 a reakcia sa spustila pridaním ľudského faktora Xa. Test prebehol ako sa opisuje v príklade 11. Transglutaminázový inhibítor v koncentrácii 4,6 μg/ml nemal žiadny účinok na faktor Xa, zatiaľ čo rekombinantný kliešťový antikoagulačný peptid (rTAP), ktorý je známym inhibítorom faktora Xa (Waxman L., Smith D.E., Arcuri K. et al., Tick anticoagulant peptide (TAP) is a novel inhibítor of blood coagulation factor Xa, Science 248: 593-596: 1990), inhiboval v koncentrácii 0,046 pg/ml o 89,9% (tabuľka 5). To naznačuje, že sa od skôr známych inhibítorov nelíši iba transglutaminázový inhibítor, ale metódy, ktorými sa čistí transglutaminázový inhibítor úspešne odstraňujú inhibítory faktora Xa.

Tabuľka č. 5

Testovaná vzorka	Koncentrácia (pg/ml)	Rýchlosť reakcie (mAbs/min)
kontrola		49,8
tridegin	4,6	56,1
rTAP	0,046	5,53

Príklad 13

Za účelom zistenia, či trideginy majú fibrinolytickú aktivitu ako hementin, sa hodnotila schopnosť čisteného materiálu z príkladu 6 štiepiť fibrinogén. Na hodnotenie tejto schopnosti sa použil spôsob stanovenia tvorby zrazeniny po inkubácii s inhibítorom. Bovinný fibrinogén (50 μΐ) v koncentrácii 2mg/ml sa inkuboval s trideginom, s čisteným hementinom alebo s prípravkom (50 μΐ) a s 20 mM pufrom HEPES, ktorý obsahuje 10 mM CaCb 0,1% h/o Brij 35 pH 7,5 (50 μΐ) pri teplote 37 °C počas doby 60 minút. Potom sa pridalo (10 μΐ) trombínu v koncentrácii 100 U/ml, ktorý spôsobuje tvorbu zrazeniny a množstvo zrazeniny sa stanovuje meraním turbidity po 30 minútach inkubácie pri vlnovej dĺžke 405 nm. Tabuľka č. 6 ukazuje, že transglutaminázový inhibítor nemá žiadny účinok na tvorbu zrazeniny, zatiaľ Čo Štiepenie fibri22 nogénu čisteným hementinom je zrejmé a vedie k tvorbe jemnej zrazeniny. To naznačuje, že trideginy nepôsobia na fíbrinogén proteolyticky a nie sú preto hementinom, ako sa opisuje v dokumente WO 91/15576 (“Treatment of thrombotic events”) a v americkom patente č. 4,390,630 (“Hementin-a fibrinolytic agent”). Naviac, tento príklad poskytuje ďalší dôkaz, že hementin, ktorý sa nachádza v pijavici rodu Haementeria ghilianii, sa separoval opísaným čistiacim postupom od transglutaminázového inhibítora.

Tabuľka č. 6

Testovaná vzorka	Absorbancia	Absorbancia
pufer (kontrola)	0,238	0,224
tridegin (35 pg/ml)	0,226
hementin (30 jednotiek/ml)	-	0,007

Príklad 14

Aktivita enzýmu destabilázy sa môže stanoviť ako jeho účinok, čo je uvoľnenie p-nitroanilínu z chromogénneho substrátu, ktorým je L-y-glutamyl-p-nitroanilid. Aby sa zistilo, či destabiláza a trideginy majú podobné vlastnosti, porovnával sa účinok dvoch činidiel na chromogénny substrát. Na spektrofotometri pri vlnovej dĺžke 405 nm sa kontinuálne zaznamenávala absorbancia kyviet obsahujúcich 0,45 mg/ml L-y-glutamyl-p-nitroanilidu v 50 mM Tris HCI, 10 mM CaCl₂ pH 8,0 (0,9 ml).

Pripravil sa buď tridegin variant 1 (0,1 ml) v koncentrácii 0,046 mg/ml alebo supernatant z extraktu Hurido medicinalis (0,1 ml). Ďalej sa pridal známy zdroj destabilázy pripravený spôsobom opísaným v príklade 2 a merala sa rýchlosť tvorby nitroanilínu. Tabuľka č. 7 ukazuje účinok trideginu na substrát enzýmu destabilázy, ktorým je L-y-glutamyl-p-nitroanilid. Ďalej tabuľka indikuje, že hoci extrakt z pijavice Hurido medicinalis má aktivitu, ktorá spôsobuje zvýšenie absorbancie, čo svedčí o štiepení uvedeného substrátu, čo je vlastnosť destabilázy, tridegin nemá taký účinok. V priebehu času dochádza k slabému vzrastu absorbancie.

Tabuľka č. 7

	Rýchlosť reakcie (mAbs/min)
extrakt z Hurido medicinalis	2,04
tridegin (4,6pg/ml)	-1,17

Príklad 15

Testoval sa účinok trideginu na tvorbu zrazenín plazmy. Porovnávala sa vzorka normálnej plazmy, do ktorej sa pridal inhibítor, ktorý sa čistí spôsobom opísaným v príklade 6 a je obsiahnutý vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosforečnanom, so vzorkou, ktorá obsahovala samotný pufer. Koncentrácia inhibítora vo vzorke plazmy bola 46 pg/ml a jeho objem sa rovnal 0,1 násobku objemu vzorky. Štandardné testy tvorby zrazeniny sa robili na automatizovanom analyzátore. Výsledky v tabuľke č. 8 ukazujú, že medzi týmito dvomi vzorkami neexistuje podstatný rozdiel. Z toho plynie, že tridegin neovplyvňuje zrážanie normálnej ľudskej plazmy. Tento výsledok sa očakával, pretože inhibítory zosieťovania fibrínu nemajú žiadný účinok na tvorbu zrazenín a iba ovplyvňujú ich chemické a fyzikálne vlastnosti po ich vzniku. Toto zistenie, ktoré sa dosiahlo použitím rôznych testov, potvrdzuje absenciu ľubovoľnej inej antikoagulačnej aktivity trideginu, ako je inhibícia faktora Xa alebo trombínu.

V ľudskej citrátovanej plazme bohatej na krvné doštičky sa stanovila agregácia krvných doštičiek. Experiment prebehol v prístroji Bio/Data agregometer ako odozva na obsah buď 6,7 μg/ml kolagénu, 6,3 μΜ AJDP alebo 0,4 U/ml trombínu. Porovnával sa tridegin z príkladu 6 v konečnej koncentrácii 4,6 pg/ml s kontrolami, ktoré tvorí samotný pufer. Tabuľka 8 ukazuje, že tridegin nemá za týchto podmienok zrejmý účinok na agregáciu krvných doštičiek.

Tabuľka 8

Parameter	Kontrola	Tridegin (4,6 gg/ml)
čas zrážania trombínu (s)	9,8	9,8
jedna fáza času v prípade protrombínu (s)	15,2	14,7
čas zrážania kefalinu kaolínu (s)	28,5	27,9
kolagénom indukovaná agregácia (%/min.)	23	28
ADP indukovaná agregácia (%/min)	11	14
trombínom indukovaná agregácia (%/min)	73	82

Príklad 16

Účinok inhibítora na transglutaminázu tkaniva pečene morčiat sa meral v teste podobnom tomu, ktorý sá opisuje v príklade 10, kde aktivovaný faktor XlIIa sa nahradil tkanivovou transglutaminázou. Tridegin (4,5 pg/ml) inhiboval o 95,5% inkorporáciu amínu do kazeínu katalyzovanú týmto enzýmom. Použitím rôznych koncentrácií trideginu sa zistila hodnota IC50, ktorá je 1,55 pg/ml. Tento test indikuje, že tridegin je inhibítor tkanivovej transglutaminázy rovnako ako transglutaminázového faktora XlIIa plazmy a že je pravdepodobné, že je inhibítorom mnohých transglutaminázových enzýmov.

Príklad 17

Inhibítor transglutaminázy je merateľný v žľazách slinného systému a v slinných sekrétoch pijavice druhu Hciementeria ghilianii testom inkorporácie amínu podľa publikácie Slaughter T.F., Achyuthan K.E., Lai T.-S. and Greenberg C.S. (1992), (“A microtitre plate transglutaminase assay utilizing 5-(biotinamido)pentylamine as substráte”, Anál. Biochem. 205: pp. 166171). Z vyhladovaného zvieraťa vykŕmeného do tretieho štádia sa vybrali predné a zadné slinné žľazy a chobot spolu so zadnou prísavkou. Vzorky sa homogenizovali v sklenenom homogenizéri v lmM Tris HCl pH 8,0 (1 ml alebo 0,5 ml v prípade zadných žliaz) a centrifugovali sa pri 12 000 rpm, Supernatant sa použil v teste. Za účelom získania slinných sekrétov sa izoloval z ôsmich vyhladovaných zvierat Haemeníeria ghilianii vykŕmených do tretieho štádia chladených na teplotu 5°C počas doby 2 až 3 hodiny celý slinný aparát (chobot, predné a zadné slinné žľazy). Uskutočnilo sa to vytlačením na Sylgardovu bázu a všetko sa premylo fyziologickým roztokom (65 mM NaCl, 50 mM NH4CI, 4 mM KC1, 1 mM EGTA, 11 mM glukóza, 10 mM HEPES pH 7,4) pri teplote 20 °C počas doby 15 minút. Trubica sa sprístupnila pozdĺžnym prerezaním steny chobotu a tu obsiahnuté sliny sa získali mikropipetou.

Tabuľka č. 9 ukazuje inhibíciu faktora XlIIa ľudskej plazmy uvedenými extraktami a sekrétmi pijavíc druhu Haemeníeria ghilianii. Inhibičná aktivita sa preukázala v oboch slinných žľazách, v slinných sekrétoch a v chobote. V zadnej prísavke je detegovateľná veľmi slabá aktivita s nízkou špecifitou, tvorí 35 % aktivity, ktorá sa preukázala v zadnej slinnej žľaze. V skutočnosti detegovaná aktivita môže pochádzať z veľmi vysokej koncentrácie proteínu, ktorý sa extrahoval z tohto veľkého kusu tkaniva.

Tabuľka č. 9

Tkanivo	Špecifická aktivita (jednotka/mg)^#	% inhibície
Predná slinná žľaza	19,0	99,7
Zadná slinná žľaza	93,3	100
Chobot	11,7	95,5
Zadná prísavka	0,33	. 48,5
Vnútorná sekrécia z chobotu	+	61,9

jedna jednotka sa definuje ako dvojnásobok množstva transglutaminázového inhibítora, ktoré je nutné k 50% inhibícii faktora XlIIa v lml normálnej ľudskej plazmy s použitím testu inkorporácie amínu, ktorý sa opisuje v príklade 10.

* priemer z ôsmich oddelených experimentov.

^T koncentrácia proteínu bola pre meranie veľmi nízka (špecifická aktivita j e veľmi vysoká).

Príklad 18

Účinok trideginu na lýzu fibrínu indukovanú plazmínom sa demonštroval absorbančnou metódou. Bovinný fibrinogén (0,1 ml) s koncentráciou 10 mg/ml sa inkuboval v mikrotitračných doštičkách s 0,01 ml bovinného trombínu s koncentráciou 50 U/ml a ďalej buď s pufrom alebo trideginom (0,04 ml) z príkladu 6 počas doby 2 hodín pri teplote 37 “C. Pridal sa plazmín (0,05 ml) s koncentráciou 2,56 U/ml a doštičky sa inkubovali pri teplote 37 °C. Absorbancia sa merala každých 15 minút na čítacom zariadení pre mikrotitračné doštičky Titretek Uniskan II. Zrazenina sa pozorovala každých 15 minút a zaznamenávala sa doba nutná pre rozpustenie zrazeniny. Ako ukazuje tabuľka č. 10 transglutaminázový inhibítor vo všetkých testovaných koncentráciách skrátil čas lýzy.

Tabuľka č. 10

Tridegin (μβ/πιΐ)	Čas lýzy (hod.)
• . o	3,0
2,0	1,0
1,0	1,25
0,2	1,25
ο,ι	2,5
0,04	1,5

Príklad 19

Účinok trideginu urýchľujúci lýzu fibrínu indukovanú aktivátorom tkanivového plazminogénu sa tiež prejavil v prípade zrazenín ľudskej plazmy. Ľudská plazma (0,1 ml) sa inkubovala počas doby 2 hod. pri teplote 37 °C v mikrotitračných doštičkách v šiestich replikátoch s 5U/ml bovinného trombínu v roztoku 0,18 M CaCl₂, ktorý obsahuje 0,14 M KC1 (0,01 ml) a ďalej buď pufer alebo tridegin. Tridegin sa pripravil spôsobom ako v príklade 6, ale jeho zdrojom boli zadné slinné žľazy pijavíc druhu Haementeria ghilianii (0,04 ml). Potom sa pridal aktivátor tkanivového plazminogénu (0,05 ml) v takom množstve, aby konečná koncentrácia bola 10 IU/ml, a doštičky sa inkubovali pri teplote 37 °C. Absorbancia sa merala každých 30 minút pri vlnovej dĺžke 405 nm s použitím čítacieho zariadenia pre mikrotitračné doštičky Titretek Uniskan II. Zníženie absorbancie indikuje lýzu zrazeniny plazmy. Čas potrebný na dosiahnutie 50% lýzy v kontrolných komôrkach bol 12,9+/-1,1 hodín a v komôrkach, ktoré obsahujú transglutaminázový inhibítor 7,9+/-0,7 hodín, čo predstavuje štatisticky významné zníženie. Tento príklad potvrdzuje, že inhibítor transglutaminázy dramaticky urýchľuje pôsobenie aktivátora tkanivového plazminogénu na ľudskú zrazeninu plazmy.

Príklad 20

Pretože krvné doštičky sú spojené s tvorbou trombov in vivo, je zaujímavé zistiť, či transglutaminázové inhibítory umožňujú rýchlejšiu lýzu zrazenín, ktoré sú bohaté na krvné doštičky. Krvné doštičky sú zdroj bohatý na transglutaminázu plazmy, faktor XIII, rovnako ako na inhibítory lýzy fibrínu. Krvné doštičky silne znižujú účinnosť fibrinolytických činidiel. Ľudská plazma bohatá alebo chudobná na krvné doštičky sa inkubovala počas dóby 2 hod. pri teplote 37°C v mikrotitračných doštičkách v šiestich replikátoch s bovinným trombínom s koncentráciou 5 U/ml v roztoku 0,18 M CaCĽ obsahujúcim 0,14 M KC1 (0,01 ml) a ďalej buď samotný pufer alebo tridegin (pripravený spôsobom, ako sa opisuje v príklade 6; zdrojom trideginu boli zadné slinné žľazy pijavíc druhu Haementeria ghilianii, 0,04 ml). Potom sa pridal aktivátor tkanivového plazminogénu (0,05ml) v množstve, aby konečná koncentrácia bola 10 IU/ml, a doštičky sa inkubovali pri teplote 37 °C. Absorbancia sa merala každých 30 minút počas doby 72 hod. pri vlnovej dĺžke 405 nm s použitím kinetického čítacieho zariadenia pre mikrotitračné doštičky Molecular Device Thermomax (znížená absorbancia ukazuje na lýzu zrazeniny plazmy). Tabuľka č. 11 ukazuje, že v prítomnosti krvných doštičiek sa v priebehu inkubácie počas doby 72 hodín nedosiahla 50% lýza zrazeniny. Tridegin dokonca redukuje účinok doštičiek. V ich prítomnosti skracuje čas 50 % lýzy z viac ako 72 hodín na 24,9 hodín a keď vo vzorke krvné doštičky nie sú prítomné tak z 22,5 hodín na 18 hodín.

Tabuľka č. 11

	kontrolný pufer (čas 50% lýzy v hod.)	tridegin (čas 50 % lýzy v hod.)
plazma chudobná na krvné doštičky	22,5+/-1,99	18,0+/-1,03
plazma bohatá na krvné doštičky	>72	24,9+/-5,57

Príklad 21

Hlavný účinok trideginu je skrátiť Čas potrebný pre lýzu zrazeniny. Tento účinok možno preukázať, ak sa ako lýtické činidlo použije enzým streptokináza. Ľudská plazma (0,1 ml) sa inkubovala počas doby 2 hod. pri teplote 37 °C v mikrotitračných doštičkách v troch replikátoch s bovinným trombínom v koncentrácii 5 U/ml v roztoku 0,18 M CaCl₂ obsahujúcim 0,14 M KC1 (0,01 ml) a ďalej buď samotný pufer alebo tridegin pripravený spôsobom ako v príklade 6. Zdrojom trideginu sú zadné slinné žľazy pijavíc druhu Haementeria ghilianii (0,04 ml). Potom sa pridala streptokináza v množstve, aby konečná koncentrácia bola 30 U/ml, a doštičky sa inkubovali v kinetickom čítacom zariadení pre mikrotitračné doštičky iEMS pri teplote 37 °C. Absorbancia sa odčítala každých 30 minút počas doby 47,5 hodín pri vlnovej dĺžke 405 nm. V komôrkach, kde bola samotná streptokináza nedošlo k dostatočnej lýze, aby sa dal určiť čas pre 50% lýzu. V komôrkach, ktoré obsahovali tridegin prebehla lýza na 50 % v čase 36+/-1,6 hod, čo opäť demonštruje urýchľujúci účinok trideginu, keď sa použije v kombinácii s fibrinolytickým činidlom ako je streptokináza, ako ukazuje obrázok č. 7 (ukazuje účinok trideginu na lýzu zrazeniny plazmy indukovanú streptokinázou). Výsledky sa uvádzajú ako priemer pre tri merania +/stredná odchýlka priemeru.

Príklad 22

Skúmala sa kombinácia trideginu a hementinu, ako sa opisuje v príklade 21, kde aktivátor tkanivového plazminogénu sa nahradil hementinom s koncentráciou 10 U/ml. V tomto príklade sa obe vzorky plazmy, bohaté na krvné doštičky alebo bez krvných doštičiek a získané od rovnakého darcu, použili za účelom zistenia, či je medzi nimi nejaký rozdiel. V tabuľke č. 12 sa uvádza doba nutná k 50% lýze vzoriek. Je tu jasne videť účinok krvných doštičiek, ktoré predlžujú dobu nutnú pre lýzu z 34 hodín na viac ako 56 hodín, pričom tridegin skracuje čas nutný na dosiahnutie 50% lýzy, či už krvné doštičky sú alebo nie sú prítomné. Zdá sa, že tridegin prekonáva pôsobenie krvných doštičiek skrátením doby lýzy na hodnotu, ktorá sa blíži dobe dosiahnutej v kontrolnej vzorke.

Tabuľka č. 12

	Pufer (doba nutná na dosiahnutie 50% lýzy v hod.)	Tridegin (doba nutná na dosiahnutie 50% lýzy v hod.)
Plazma bez krvných doštičiek	34+/-3,5	24+/-0,8
Plazma bohatá na krvné doštičky	>5 6+/-7,8	36+/-2,2

Príklad 23 · '

Za účelom zistenia vlastností trideginu získaného z mexických pijavíc druhu Haementeria officinalis, sa ich extrakt podrobil analýze gélovou chromatografiou, po ktorej nasledovala vysokotlaková kvapalná chromatografia s obrátenými fázami. Z piatich pijavíc druhu Haementeria officinalis, ktoré sa nechali vyhladovať do štádia, keď v čreve nebola krv, sa vyňali slinné žľazy a chobot. Homogenizovali sa homogenizátorom z materiálov sklo a teflon vo fyziologickom roztoku pH 7,2 pufrovanom fosforečnanom (1 ml). Potom sa centrifugovali pri 12 OOOg počas doby 5 minút a získal sa číry supernatant. Supernatant sa naniesol na kolónu Superdex G75 s rozmermi 1,6 x 60 cm a eluát sa monitoroval pri vlnovej dĺžke 280 nm. Zhromaždili sa všetky frakcie a podrobili sa testu rozpustnosti zrazeniny ako v príklade 1. Inhibičná aktivita sa prejavila v jedinom piku, ako ukazuje obrázok č. 8 (na tomto obrázku sú frakcie obsahujúce inhibičnú aktivitu označené priamkou).

Aktívna frakcia sa lyofilizovala a znovu rozpustila vo vode (1 ml). Časť vzorky (0,3 ml) sa naniesla na kolónu Pro-RPC s rozmermi 0,5 x 10 cm, ktorá sa ekvilibrovala 0,1% kyselinou trifluóroctovou (TFA). Pri elúcii s lineárnym gradientom od 0,1 % TFA do 0,1 % TFA obsahujúcej acetonitril sa pri vlnovej dĺžke 280 nm objavil rad píkov. Každá z týchto frakcií sa podro30 bila testu rozpustnosti zrazeniny, ako sa opisuje v príklade 1 a získal sa jediný pík, ktorý vykazuje aktivitu.

Porovnanie polôh elúcie podobných extraktov z pijavíc druhu Haementeria ghilianii na dvoch kolónach vykazuje podobnosť s polohou elúcie trideginu variantu 1. Inhibičná aktivita získaná zo slinných žliaz pijavíc druhu Haementeria ghilianii má veľmi podobné fyzikálne chemické vlastnosti ako tridegin variant 1. Ide o molekulovú hmotnosť určenú gélovou filtráciou, koeficient delenia určený vysokotlakovou kvapalnou chromatografiou s obrátenými fázami.

Príklad 24

Za účelom určenia chovania trideginu variantu 1 in vivo, dávka 0,207 mg/kg i.v. obsiahnutá v roztoku 0,01 M fosforečnanu sodného, 0,027 M KC1, 0,137 M NaCl pH 7,4 (4,7 ml) sa aplikovala intravenózne skupine štyroch krýs. Vzorky krvi (približne 0,3 ml) sa odobrali z chvostovej žily. Dve vzorky sa odobrali pred aplikáciou trideginu a ďalšie po 2 alebo 5 a 10, 20, 30, 60 a 120 minútach po aplikácii dávky trideginu a bezprostredne sa zmiešali s 0,04 ml 3,8 % h/o citrátu trisodného. Vzorky sa ihneď centrifugovali pri 12 OOOg počas doby 5 minút a získané supernatanty sa rýchlo zmrazili na suchom ľade. Neboli zaznamenané žiadne vedľajšie účinky spojené s aplikáciou trideginu.

Prítomnosť trideginu vo vzorkách sa testovala použitím modifikovaného testu inkorporácie aminu, ako sa opisuje v príklade 2, kde sa v každej vzorke aktivoval (0,097 ml) faktor XIII pridaním 0,1 M Tris HCI pH 8,5 (0,03 ml) a 1 000 U/ml bovinného trombínu (0,01 ml) a inkuboval sa počas doby 15 minút pri teplote 37 °C. Centrifugáciou sa odstránila zrazenina fibrínu a sérum sa použilo v teste. Vzorky pre vynesenie štandardnej krivky sa pripravili tak, že do citrátovanej plazmy krýs sa pridali známe koncentrácie čistého trideginu variantu 1 a aktivácia faktora XlIIa prebehla rovnakým spôsobom. Koncentrácia trideginu v každej vzorke sa určila ako percento inhibície faktora XHIa ako v príklade 2 porovnaním so štandardnou krivkou.

Obrázok č. 9 znázorňuje farmakokinetiku trideginu v krysách. Je zrejmé, že časový priebeh má viac fáz; konečný polčas rozpadu je 30 až 60 minút, čo významne indikuje dlhé pôsobenie trideginu a možnosť využitia na farmakologické účely.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Polypeptid s nasledujúcou aminokyselinovou sekvenciou

NH2-Lys-Leu-Leu-Pro-Cys-Lys-Glu-Y-His-Gln-Gly-Ile-Pro-Asn-Pro-Arg-, kde Y predstavuje ľubovoľnú aminokyselinovú sekvenciu; alebo farmaceutický vhodná soľ, derivát alebo bioprekurzor uvedenej sekvencie, alebo ich homológ, analóg alebo skrátená forma, vykazujúca v podstate podobnú aktivitu.
2. Polypeptid s nasledujúcou aminokyselinovou sekvenciou

1 10 NHz-Lys-Leu-Leu-Pro-Cys-Lys-Glu-Xi-His-Gln-Gly20

Ile-Pro-Asn-Pro-Arg-Cys-X2-Cys-Gly-Ala-Asp-Leu30

Glu-X₃-Ala-Gln-Asp-Gln-Tyr-Cys-Ala-Phe-Ile-Pro40

Gln-Zi-Arg-Pro-Arg-Ser-Glu-Leu-Ile-Lys-Pro-Met50

Asp-Asp-Ile-Tyr-Gln-Arg-Pro-Val-Z₂-Phe-Pro-Asn60 66 Leu-Pro-Leu-Lys-Pro-Arg-Z₃-COOH, kde každé X_b X₂ a X₃ predstavuje ľubovoľný aminokyselinový zvyšok; každé Z_b Z₂ a Z₃predstavuje súčasne alebo striedavo Cys alebo Glu; alebo farmaceutický prijateľná soľ, derivát alebo bioprekurzor uvedenej aminokyselinovej sekvencie alebo jej skrátená forma, homológ alebo analóg vykazujúci v podstate podobnú aktivitu.
3. Polypeptid podľa nároku 1 alebo 2, ktorý sa získal z tkaniva alebo zo sekrétov pijavice.
4. Polypeptid podľa nároku 3, kde pijavica je z radu Rhynchobdellida.
5. Polypeptid podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 4, ktorý sa získal z tkaniva alebo sekrétov pijavíc rodu Haementeria.
6. Inhibítor transglutaminázovej aktivity, vyznačujúci sa tým, že je ho možné získať z tkaniva alebo sekrétov pijavíc.
7. Inhibítor podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že pijavice sú z radu Rhynchobdellida. ,
8. Inhibítor podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že pijavice sú z rodu Haementeria.
9. Inhibítor podľa ľubovoľného z nárokov 6 až 8, vyznačujúci sa tým, že uvedený inhibítor je polypeptid, ktorého zdanlivá molekulová hmotnosť určená elektroforézou na polyakrylamidovom géle je približne 7 000 až 8 000 daltonov.
10. Inhibítor podľa ľubovoľného z nárokov 6 až 9, vyznačujúci sa tým, že má schopnosť inhibovať inkorporáciu amínov do kazeínu katalyzovanú faktorom XlIIa.
11. Inhibítor podľa ľubovoľného z nárokov 6 až 10, vyznačujúci sa tým, že má schopnosť inhibovať inkorporáciu biotínamidopentylamínu do kazeínu katalyzovanú faktorom XlIIa, pričom hodnota IC50 je 0,026 ^0,002 mg/ml.
12. Diagnostický spôsob na meranie stupňa inhibície transglutaminázovej aktivity u polypeptidu podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 5 alebo u inhibítora podľa ľubovoľného z nárokov 6 až 11, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje meranie množstva amoniaku uvoľneného pri transglutaminázou katalyzovanej inkorporácii amínov do kazeínu v prítomnosti uvedeného polypeptidu, resp. extraktu, pričom množstvo uvoľneného amoniaku určuje mieru stupňa inhibície transglutaminázy.
13. Použitie polypeptidu podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 5 alebo inhibítora podľa ľubovoľného z nárokov 6 až 11 na prípravu lieku vhodného na liečbu tromboembolického ochorenia.
14. Použitie polypeptidu podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 5 alebo inhibítora podľa ľubovoľného z nárokov 6 až 11 na prípravu lieku vhodného na liečbu Crohnovej choroby, implantácie nádoru, zoslabnutia stien ciev u aterosklerotických procesov, trombotickej rriikroangiopatie, fibróznych zmien kože, membránovej glomerulonefritidy, zákalov, akné alebo tvorby jazvovitého tkaniva alebo infekcie mikrofilariálnymi nematódami.
15. Farmaceutická formulácia, vyznačujúca sa tým, že zahrnuje polypeptid podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 5 a/alebo inhibítor podľa ľubovoľného z nárokov 6 až 11 a farmaceutický prijateľný nosič, riedidlo alebo excipient.
16. Farmaceutická formulácia podľa nároku 15 na aplikáciu v kombinácii s antikoagulantom.
17. Formulácia podľa nároku 16, vyznačujúca sa tým, že antikoagulant zahrnuje hirudín alebo heparín.
18. Formulácia podľa nároku 15 na aplikáciu v kombinácii s fíbrinolytickým, fibrinogenolytickým alebo trombolytickým činidlom.
19. Formulácia podľa nároku 18, vyznačujúca sa tým, že trombolytické činidlo zahrnuje jednu alebo viac látok zo skupiny zahrnujúcej aktivátor tkanivového plazminogénu, plazmín, streptokinázu, eminázu, urokinázu, hementin a stafylokinázu.
20. Formulácia podľa nároku 18, vyznačujúca sa tým, že fibrinolytické alebo fíbrinogenolytické činidlo zahrnuje hementin.
21. Použitie formulácie podľa ľubovoľného z nárokov 15 až 20 na prípravu lieku vhodného na liečbu tromboembolického ochorenia.
22. Použitie formulácie podľa ľubovoľného z nárokov 15 až 20 na prípravu lieku vhodného na liečbu Crohnovej choroby, implantácie nádoru, zoslabnutia stien ciev u aterosklerotických procesov, trombotickej mikroangiopatie, fibróznych zmien kože, membránovej glomerulonefritídy, zákalov, akné alebo tvorby zjazveného tkaniva alebo infekcie mikrofilariálnymi nematódami.
23. V podstate čistý polypeptid majúci transglutaminázovú inhibičnú aktivitu, kde uvedený polypeptid je možné získať z tkaniva alebo sekrétov pijavíc postupom, ktorý zahrnuje čistenie iónomeničovou chromatografiou a/alebo čistenie kolónovou gélovou chromatografiou.
24. Spôsob izolácie polypeptidu podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 5 alebo inhibítora podľa ľubovoľného z nárokov 6 až 11, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje extrahovanie tkaniva alebo sekrétov pijavíc radu Rhynchobdellida a čistenie extrahovaného materiálu jedným alebo viacerými postupmi zo skupiny zahrnujúcej iónomeničovú chromatografiu, kolónovú gélovú chromatografiu a chromatografiu s obrátenými fázami.