JP2005513141A - 修飾トリデジン(tridegins)、その製剤、およびトランスグルタミナーゼ阻害剤としてのその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
・トランスグルタミナーゼに結合する免疫グロブリン、
・システインと反応する低分子量化学的化合物、
・天然基質と競合する低分子量アミン、および
・ヘメンテリア・ギリアニー(Haementeria ghilianii)種に属するヒル(leech)から単離した活性分画
である。
したがって、本発明の目的は、適切な量および純粋な形で、組換え的に、または合成的に、トランスグルタミナーゼの新規ポリペプチド阻害剤を調製することである。
本発明の意味において、ポリペプチドは、15アミノ酸(AA)より多く、そして2000アミノ酸未満を有するペプチド、好ましくは15AAより多く、そして500AA未満を有するペプチド、特に16、17、18、19または20AAより多く、そして400、300、200、100、80、60、50、40または30AA未満を有するペプチドを示すと理解される。
大腸菌から得た組換え野生型トリデジンポリペプチドは、高分子量凝集体もまた形成するが、少なくとも1つのシステイン残基、好ましくは1〜4のシステイン残基、特に好ましくは3または4のシステイン残基が、別のアミノ酸、好ましくはバリン、アラニン、グリシンまたはセリンなどの小さいアミノ酸、特に好ましくはアラニンまたはセリン、特にアラニンと交換されている修飾トリデジンポリペプチドは、凝集体形成の減少を示した。これは、比較解析ゲルろ過実験で確証された。ゲルろ過実験の実験条件を実施例4に示しており、読者はこちらを参照されたい。
出発配列(配列番号25):PMDDIYQRPVEFPNLPLKPR
以下のXアミノ酸の場合の、活性にはまったく減少がなかった置換:
XXDDIYQRXVXFPXLPLKXX
以下のXアミノ酸の場合の、活性にわずかな減少があった置換:
PMXXIYXXPXEXXNXXLXPR
以下のXアミノ酸の場合の、活性により多くの減少があった置換:
PMDDXXQRPVEFPNLPXKPR。
これらの化合物には、特に、トリデジンポリペプチド由来でなく、例えば5〜500、好ましくは5〜400、5〜300、5〜200、5〜100、5〜50、特に5〜20アミノ酸の別のタンパク質由来であるアミノ酸配列の内容を有する融合タンパク質(LaVallieおよびMcCoy,Curr.Opin.Biotechnol.6(5):501−506(1995))とともに、トリデジンポリペプチド由来でなく、例えば5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30または50アミノ酸より多く、そして500、450、400、350、300、250、200、150、100、75、50または40アミノ酸未満の別のタンパク質由来のアミノ酸配列の内容を有する融合ポリペプチド、並びにその単離型のすべての並べ替えが含まれる。これに関連して、トリデジンポリペプチド由来のアミノ酸配列の内容は、好ましくは、50、45、40、35、30、25または20アミノ酸未満である。
前記ポリペプチドの1つを調製する組換え法は、例えば、記載するポリペプチドの1つをコードする核酸を、適切な方式(Sambrookら,“Molecular cloning:a laboratory manual”第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989);Sambrookら,“Molecular cloning:a laboratory manual”第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001))で、原核または真核発現ベクターにクローニングすることからなる。こうした発現ベクターは、少なくとも1つのプロモーター、少なくとも1つの翻訳開始シグナル、本発明記載のポリペプチドの1つをコードする、少なくとも1つの核酸配列、および原核発現ベクターの場合、翻訳終結シグナル、そしてさらに、転写終結シグナル、およびまた真核発現ベクターの場合、ポリアデニル化シグナルを含んでなる。本発明記載のポリペプチドの1つをコードする核酸は、例えば、プラスミド、ファージミド、コスミド、BACまたはYACなどのベクターの一部、特に原核または真核発現ベクターの一部であることが可能である(Sambrookら,“Molecular cloning:A laboratory Manual”第3版,“Cold Spring Harbor Laboratory Press”(2001);プラスミドは1.3−1.29に記載され、ファージミドは3.42−3.52に記載され、コスミドは4.1−4.10に記載され、そして真核発現ベクターは17.83−17.111に記載される)。
本発明の好ましい態様は、少なくとも1つの本発明記載のペプチドとともに、抗凝血剤の形のさらなる活性化合物を含んでなる併用製剤からなる。抗凝血剤は、血栓の溶解を促進するか、または血栓の形成を阻害するかいずれかである。例えば、活性トロンビンまたはプロトロンビンの分解を促進する活性化合物である血栓溶解活性化合物、ポリマー性フィブリンの分解を促進する活性化合物である線維素溶解活性化合物、またはフィブリノーゲンの分解を促進する活性化合物であるフィブリノーゲン溶解(fibrinogenolytic)活性化合物がある。プラスミンまたはプラスミノーゲンのアクチベーター、あるいはトロンビンおよびXa因子の阻害剤、あるいは血小板凝集の阻害剤である抗凝血剤が好ましい。
配列番号2〜配列番号26は、いずれの場合も、配列番号1由来の長さ20アミノ酸のペプチドを示す。
配列番号27〜配列番号46は、トリデジンポリペプチドに突然変異を誘発するのに用いるオリゴヌクレオチドを示す。
配列番号47は、配列番号1由来の長さ16アミノ酸のペプチドを示し、一方、配列番号92は、配列番号1由来の長さ15アミノ酸のペプチドを示す。
配列番号48〜配列番号88は、一部切除(truncated)ペプチドおよびペプチド変異体を示す。
配列番号89は、長さ15アミノ酸のペプチドを示す。
配列番号90および配列番号91は、ピキア・パストリスにおける発現に用いるコードDNA配列を示す。
大腸菌からの組換えトリデジンポリペプチド(配列番号1)の発現および精製
組換えトリデジンポリペプチドをコードする配列を含有する発現プラスミドpET22b−14を図1に示す。現在の方法を用いて、大腸菌発現株Origami(登録商標)B(DE3)(Novagen、注文番号70837)に該プラスミドを移入し、その後、この株を、アンピシリン(100μg/ml)、カナマイシンおよびテトラサイクリン(いずれの場合も、5μg/ml)を含有する液体LB培地中で培養した。発現株BL21(DE3)(Novagen)も同様の結果を生じ、そしてまた修飾トリデジンポリペプチドを発現するのに使用可能である。メインの培養を、0.7のOD600に到達するまで、37℃および220rpmで震蘯した。0.7〜0.9 OD600/mlの細胞密度で、遺伝子発現を誘導するため、培養を2mM IPTG/mlで処理し、そしてその後、37℃および200〜240rpmでさらに4時間震蘯した。続いて、遠心分離(15分間、5825xg)によって細胞を採取した。非常に純粋な水で1:10に希釈しておいた10xBugBusterタンパク質抽出試薬(Novagen)に、細胞沈降物を再懸濁し、そして破壊する目的で、ベンゾナーゼ(benzonase)(Novagen)およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche Diagnostics GmbHのEDTA不含Complete(登録商標))とともに、震蘯しながら4℃で10〜20分間インキュベーションした。続いて、16000xgおよび4℃で20分間遠心分離することによって、上清を得て、そしてその後、上清を等体積の溶解緩衝液(50mM NaH2PO4、pH8.0、300mM NaCl、10mMイミダゾール)で処理した。生じたタンパク質懸濁物を4℃で一晩保存した。精製するため、3mlのニッケルNTAアガロース(Quiagen)を空のカラムに充填し、そして5カラム体積の溶解緩衝液で平衡化した。タンパク質懸濁物をカラム上に装填し(ポンピングなしで、引力の結果、流れる)、そしてその後、洗浄緩衝液(50mM NaH2PO4、pH8.0、300mM NaCl、20mMイミダゾール)で洗浄した(10カラム体積)。溶出緩衝液(2〜3カラム体積)(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、250mMイミダゾール、pH8)でカラムから溶出させた。分画を収集し、そしてトランスグルタミナーゼ阻害剤の存在に関して、SDS−PAGEによって調べた(図2を参照されたい)。収量は、発現培養物1リットルあたり、組換えトリデジンポリペプチド20mgであり、純度は>90%であった。組換えトリデジンポリペプチドを含有する分画を合わせ、そして50mM NaH2PO4、pH8.0、300mM NaClに対して、徹底的に透析した(2lに対して2回)。その後、XIIIa因子に対する精製タンパク質の阻害活性を試験した。Berichrom(登録商標)アッセイ(Dade Behring)を試験法として用いた。
該アッセイは、XIII因子が、試薬中に存在するトロンビンによってXIIIa因子を形成するように活性化されることに基づく。XIIIa因子は、特定のペプチド基質をグリシンエチルエステルに連結し、このとき、アンモニウムイオンが放出される。後者を、平行して進行する酵素反応で測定する。340nmでの消光を用いて、NADHの減少を測定した。測定のため、ペプチドをストック濃度5mMで50%アセトニトリルに入れた。製造者によって供給されるNADHおよび検出試薬を3mlの水に溶解し、続いて、アクチベーター試薬を3mlのNADH試薬に溶解した。使用のため、アクチベーター試薬および検出試薬を1:1の比で混合した。マイクロタイタープレート形式で測定を実行するため、100μlの試料(阻害剤または対照緩衝液)、25μlのXIII因子(10U/ml)および150μlの実験試薬を混合した。マイクロタイタープレート光度計中、340nmおよび37℃で20分間連続して測定を行った。評価するため、16分後および20分後に測定した値の相異を比較した。
測定によって、精製トランスグルタミナーゼ阻害剤に関して、2〜4μMのIC50が得られた(図3を参照されたい)。
大腸菌からの修飾トリデジンの発現および精製
野生型トリデジンポリペプチドをコードする発現プラスミドの部位特異的突然変異誘発によって、修飾トリデジンを産生した。製造者の指示にしたがって、QuikChange試薬(Stratagene)を用いたPCRによって、突然変異誘発を行った。オリゴヌクレオチド、配列番号27〜配列番号40およびそれぞれの逆相補配列を突然変異誘発に用いた。
トリデジンポリペプチド断片の阻害効果
ペプチド合成の現在の方法(Pepscan、Lelystad、NL)を用いて、組換えトリデジンポリペプチドに基づいて、長さ20アミノ酸の25のペプチドを化学的に合成した。該ペプチドはN末端にアセチル基を持ち、そして対応して、C末端にアミド基を持つ。配列は、
a)配列1全体を含み、そして
b)いずれの場合も、18アミノ酸残基が重複する(表3、配列2〜26を参照されたい)
ように選択された。
・配列番号24:IC50:7μM
・配列番号25:IC50:4μM
・配列番号26:IC50:5μM
最少の長さを決定するため、現在の方法を用いて、いずれの場合も、C末端から、またはN末端から、1アミノ酸ずつ一部切除した20のペプチド(アセチル化またはアミド化)を合成した。
結果をさらにチェックするため、2つの配列MDDIYQRPVEFPNLPL(配列番号87)(16量体)およびDDIYQRPVEFPNLP(配列番号88)(14量体)を合成し、そして精製した。精製ペプチドを用いて、出発配列(配列番号25)の値を比較のために測定した。これによって、その後、上述のBerichrom(登録商標)試験において、阻害活性(IC50)を決定することが可能になった:
−(配列番号87)IC50=19μM
−(配列番号88)IC50=〜280μM
システイン残基の交換によって修飾されているトリデジンの大腸菌からの発現および精製
野生型トリデジンに存在するシステインの部位特異的突然変異誘発によって、これらの修飾トリデジンを産生した。この突然変異誘発の目的は、段階的な方式で、分子間ジスルフィド架橋を形成するのに適したシステイン残基を交換することであった。還元剤(例えばメルカプトエタノールおよびDTT)の存在下または非存在下で、元来のトランスグルタミナーゼ阻害剤(配列番号1)の適切なクロマトグラフィー解析を行うことによって、ジスルフィド架橋を形成する傾向、およびそれに付随する最終産物の凝集を検出した。したがって、1つのゲルろ過実験(Amersham−Pharmacia HiPrep26/60 Sephacryl S200 HRカラム上;20mMリン酸ナトリウム、pH8.0、300mM NaCl;1ml/分)では、精製組換えトリデジンポリペプチドは、およそ80%の含量で多量体高分子量凝集体を有した。組換えトリデジンを、1.5mM DTT、20mMリン酸ナトリウム、pH8.0、300mM NaCl中の還元条件下、ゲルろ過実験で分離すると、凝集体の含量は、有意により低かった(<20%)。
組換えトリデジンまたはトリデジン断片の存在下、組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)およびウロキナーゼの線維素溶解活性の改善
本発明記載のポリペプチドの療法的潜在能力を立証するため、大腸菌由来組換えトリデジンポリペプチド(配列番号1、図5)またはピキア・パストリス由来トリデジンポリペプチド(配列番号91、図11)またはトリデジン断片(配列番号25、図10)の存在下、全血において、血液凝固および線維素溶解を測定した。これを行うため、血栓弾性図(thrombelastogram)と呼ばれるものをプロットした。血栓弾性検査(thrombelastography)は、凝血および線維素溶解を測定する、現在の方法である。該方法は、血液中に存在するプランジャーの回転に対する抵抗性の変化によって、血液の粘性の変化を測定する(Calatzisら、2000)。図4は、血栓弾性図における、典型的な凝血相および線維素溶解相を示す。血栓弾性図は、止血の重要なパラメーターを定量化する:
・凝血時間(凝血の開始および血液粘性における測定可能な変化の開始の間の時間、CT)
・血栓安定性(最大の幅(amplitude)、最大の血餅の硬さ、MCF)
・線維素溶解時間(血液粘性における測定可能な変化の開始および凝血前の出発値の達成の間の時間、溶解時間、LT)
Pentapharm GmbH、ミュンヘンから供給されるROTEG(登録商標)装置を、示す測定に用いた。図5および6は、Ca2+(Starteg試薬、Pentapharm GmbH)およびトロンボプラスチン・リン脂質(Integ試薬、Pentapharm GmbH)を添加した後の、全クエン酸血液の血栓弾性図を示す。これらの試薬を用いて、凝血を誘導する。血栓療法に用いられる慣用的な線維素溶解剤、並びに組換えトリデジンポリペプチドおよび修飾トリデジンの協同効果を、本発明にしたがって立証する目的で、多様な実験を行った。血栓弾性図によって、例として選択した線維素溶解剤である組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)およびウロキナーゼによってもたらされる線維素溶解を、組換えトリデジンポリペプチド、および修飾トリデジンが、加速し、そして改善することが示される。これは
a)幅がより小さく(血栓の安定性がより低く)、そして
b)線維素溶解速度が増加している
ことによって明らかとなる。
ピキア・パストリスからの組換えトリデジンポリペプチド(配列番号90にコードされるもの)の発現および精製
組換えトリデジンをコードする配列を含有する、発現プラスミド、トリデジンpPICZαA(発現ベクターpPICZαA、Invitrogenに基づく)を図8に示す。
ピキア・パストリスからの修飾組換えトリデジンポリペプチド(配列番号91にコードされるもの)の発現および精製
実施例6で発現させ、そして精製したトリデジンポリペプチドは、6つのC末端ヒスチジンを欠く。これらのヒスチジンは、おそらく、プロテアーゼによって切断された。したがって、現在の部位特異的突然変異誘発法を用いて、コードされるトリデジンポリペプチドをプロテアーゼが消化するのを阻害するため、コードDNA配列を改変した。これに関連して、発現プラスミドpPICZアルファA−トリデジンR66Lを生成した(トリデジン配列、配列番号91)。該トリデジンポリペプチド配列において、C末端のアルギニン残基をロイシンと交換した。
血液凝固および線維素溶解に対するトリデジンポリペプチド由来ペプチドの影響もまた測定した(図10)。ペプチド(配列番号25および配列番号88)をPBSに溶解して、そして希釈した。全血(4℃で24時間保存)を図10に示す測定に用いた。
Claims (12)
- 配列番号1に示すようなポリペプチドであって、少なくとも1つのシステインと別のアミノ酸との交換、および/または以下のアミノ酸−Lys2、Lys7、His10、Gly12、Leu24、Tyr31、Phe34、Arg39、Ile45、Met48、Asp50、Pro55、Phe58、Asn60、Pro65−の少なくとも1つと別のアミノ酸との交換、および/または残ったポリペプチドが、少なくともアミノ酸配列DDIYQRXVXFPXLPL(配列番号89)を含有する、N末端およびC末端の欠失、および/またはポリエチレングリコールへの共有結合から選択される、少なくとも1つの修飾を含有することで特徴付けられる、前記ポリペプチド。
- 請求項1記載のポリペプチドを少なくとも1つ含有する化合物。
- 融合タンパク質である、請求項2記載の化合物。
- 融合タンパク質が、融合タンパク質を精製するために使用するタグを含有する、請求項3記載の化合物。
- タグが少なくとも5つの連続ヒスチジンを含有する、請求項4記載の化合物。
- 請求項1〜5の少なくとも1つに記載のポリペプチドを調製する方法であって、組換え法またはペプチド化学反応法であることで特徴付けられる、前記方法。
- トランスグルタミナーゼ阻害剤としての、請求項1〜5の少なくとも1つに記載のポリペプチドの使用。
- 血栓症を防止し、そして治療するための、請求項1〜5の少なくとも1つに記載のポリペプチドの使用。
- 請求項1〜5の少なくとも1つに記載のポリペプチドおよび少なくとも1つのガレン(galenic)アジュバントを含んでなる、薬剤。
- 請求項1〜5の少なくとも1つに記載のポリペプチドおよび少なくとも1つのさらなる薬学的活性化合物を含んでなる、併用製剤。
- さらなる活性化合物が抗凝血剤、好ましくはトロンビンおよびXa因子の阻害剤および/または血小板凝集阻害剤であることで特徴付けられる、請求項10に記載の併用製剤。
- アセチルサリチル酸、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ヘパリノイド、ヒルジン、ビバリルジン(bivalirudin)、メラガトラン(melagatran)、アブシキシマブ、エプチフィバビド(eptifibabide)、組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、ウロキナーゼ、エミナーゼ(eminase)、ヘメンチン(hementin)および/またはプラスミンと任意に併用する、請求項1〜5の少なくとも1つに記載のポリペプチド、および適切な場合、さらなる薬学的活性化合物を含んでなる、併用製剤。
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