JPH1028587A - スタフィロキナーゼ変異体 - Google Patents
スタフィロキナーゼ変異体Info
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- JPH1028587A JPH1028587A JP8208991A JP20899196A JPH1028587A JP H1028587 A JPH1028587 A JP H1028587A JP 8208991 A JP8208991 A JP 8208991A JP 20899196 A JP20899196 A JP 20899196A JP H1028587 A JPH1028587 A JP H1028587A
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 より強い血栓溶解作用を有する誘導体、物理
化学的安定性のより優れた誘導体を得るため、又は、誘
導体設計の研究情報を得るため、スタフィロキナーゼの
構成アミノ酸の一部を他のアミノ酸に置換したスタフィ
ロキナーゼ変異体を得る。 【解決手段】 例えば次の塩基配列に示すように、スタ
フィロキナーゼのアミノ酸の一部を別のアミノ酸に置換
したもの。 Ser-Ser-Ser-Phe-Asp-Lys-Gly-Lys-Tyr-Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ala-Ser-Tyr-Phe- Glu-Pro-Thr-Gly-Pro-Tyr-Leu-Met-Val-Asn-Val-Thr-Gly-Val-Asp-Gly-Lys-Gly- Asn-Glu-Leu-Leu-Ser-Pro-His-Tyr-Val-Glu-Phe-Pro-Ile-Lys-Pro-Gly-Thr-Thr- Leu-Thr-Lys-Glu-Lys-Ile-Glu-Tyr-Tyr-Val-Glu-Trp-Ala-Leu-Asp-Ala-Thr-Ala- Tyr-Lys-Glu-Phe-Arg-Val-Val-Glu-Lue-Asp-Pro-Ser-Ala-Lys-Ile-Glu-Val-Thr- Tyr-Tyr-Asp-Lys-Asn-Lys-Lys-Lys-Glu-Glu-Thr-Lys-Ser-Phe-Pro-Ile-Thr-Glu- Lys-Gly-Phe-Val-Val-Pro-Asp-Leu-Ser-Glu-His-Ile-Lys-Asn-Pro-Gly-Phe-Asn- Leu-Ile-Thr-Lys-Val-Val-Ile-Glu-Lys-Lys
化学的安定性のより優れた誘導体を得るため、又は、誘
導体設計の研究情報を得るため、スタフィロキナーゼの
構成アミノ酸の一部を他のアミノ酸に置換したスタフィ
ロキナーゼ変異体を得る。 【解決手段】 例えば次の塩基配列に示すように、スタ
フィロキナーゼのアミノ酸の一部を別のアミノ酸に置換
したもの。 Ser-Ser-Ser-Phe-Asp-Lys-Gly-Lys-Tyr-Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ala-Ser-Tyr-Phe- Glu-Pro-Thr-Gly-Pro-Tyr-Leu-Met-Val-Asn-Val-Thr-Gly-Val-Asp-Gly-Lys-Gly- Asn-Glu-Leu-Leu-Ser-Pro-His-Tyr-Val-Glu-Phe-Pro-Ile-Lys-Pro-Gly-Thr-Thr- Leu-Thr-Lys-Glu-Lys-Ile-Glu-Tyr-Tyr-Val-Glu-Trp-Ala-Leu-Asp-Ala-Thr-Ala- Tyr-Lys-Glu-Phe-Arg-Val-Val-Glu-Lue-Asp-Pro-Ser-Ala-Lys-Ile-Glu-Val-Thr- Tyr-Tyr-Asp-Lys-Asn-Lys-Lys-Lys-Glu-Glu-Thr-Lys-Ser-Phe-Pro-Ile-Thr-Glu- Lys-Gly-Phe-Val-Val-Pro-Asp-Leu-Ser-Glu-His-Ile-Lys-Asn-Pro-Gly-Phe-Asn- Leu-Ile-Thr-Lys-Val-Val-Ile-Glu-Lys-Lys
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、血栓溶解剤として
有用な、または血栓溶解剤の研究上有用な、スタフィロ
キナーゼのアミノ酸変異誘導体に関するものである。
有用な、または血栓溶解剤の研究上有用な、スタフィロ
キナーゼのアミノ酸変異誘導体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】スタフィロキナーゼ（以下「ＳＡＫ」と
記す）は、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphyloc
occus aureus) （以下「Ｓ．アウレウス」と記す）が産
生する繊維素溶解酵素であって、血中のプラスミノーゲ
ンをプラスミンに変える機能を有し、血栓溶解作用を示
す物質として知られている。
記す）は、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphyloc
occus aureus) （以下「Ｓ．アウレウス」と記す）が産
生する繊維素溶解酵素であって、血中のプラスミノーゲ
ンをプラスミンに変える機能を有し、血栓溶解作用を示
す物質として知られている。
【０００３】ＳＡＫの特徴として、ウロキナーゼや組
織プラスミノーゲンアクチベータのようにそれ自身プロ
テアーゼ活性をもたないこと、ストレプトキナーゼと
類似した機構によりプラスミノーゲンを活性化するが、
インビトロ及びインビボのいずれの実験系においても高
いフィブリン分解特異性を有していること（酒井ら、Bi
ochem. Biophys. Res. Commun., vol.162, 830-837(198
9)、H.R.Lijnenら、Thromb. Haemostasis, Vol.66, 468
-473(1991)、D.Collenら、Circulation, vol.87,996-10
06(1993)）が挙げられる。
織プラスミノーゲンアクチベータのようにそれ自身プロ
テアーゼ活性をもたないこと、ストレプトキナーゼと
類似した機構によりプラスミノーゲンを活性化するが、
インビトロ及びインビボのいずれの実験系においても高
いフィブリン分解特異性を有していること（酒井ら、Bi
ochem. Biophys. Res. Commun., vol.162, 830-837(198
9)、H.R.Lijnenら、Thromb. Haemostasis, Vol.66, 468
-473(1991)、D.Collenら、Circulation, vol.87,996-10
06(1993)）が挙げられる。
【０００４】これらの特徴により、既存の血栓溶解剤と
対比しても、独特の機構によって血栓溶解に至らしめる
全く新しい型の血栓溶解剤としての優れた性質を有して
いることが指摘されている。
対比しても、独特の機構によって血栓溶解に至らしめる
全く新しい型の血栓溶解剤としての優れた性質を有して
いることが指摘されている。
【０００５】ＳＡＫはその産生遺伝子（ｓａｋ遺伝子）
のＤＮＡ配列も明らかにされており、後述する配列番号
１に示すように１３６個のアミノ酸からなるペプチドで
ある（左古、Eur.J.Biochem.,vol.149,557-563(198
5)）。また、本発明者ら又は本願出願人は、ｓａｋ遺伝
子を大腸菌や枯草菌に組み込み、ＳＡＫを産生するとい
う遺伝子組み換え技術を用いた生産方法を提案（特開昭
５８−６７１８１号公報、特開昭５９−１３５８８８号
公報）し、ＳＡＫを医薬品として開発する道を開いてい
る。
のＤＮＡ配列も明らかにされており、後述する配列番号
１に示すように１３６個のアミノ酸からなるペプチドで
ある（左古、Eur.J.Biochem.,vol.149,557-563(198
5)）。また、本発明者ら又は本願出願人は、ｓａｋ遺伝
子を大腸菌や枯草菌に組み込み、ＳＡＫを産生するとい
う遺伝子組み換え技術を用いた生産方法を提案（特開昭
５８−６７１８１号公報、特開昭５９−１３５８８８号
公報）し、ＳＡＫを医薬品として開発する道を開いてい
る。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、インビ
トロおよびインビボにおける単位モル濃度当りのフィブ
リン溶解活性は既存の血栓溶解剤（例えばストレプトキ
ナーゼや組織プラスミノーゲンアクチベータ）と比較し
てかならずしも高くないことが報告されている（伊藤、
慈恵医大誌、vol.97,1041-1046(1982)、O.Matsuoら、Bl
ood, vol.76, 925-929(1990)、H.R.Linjenら、前出）。
トロおよびインビボにおける単位モル濃度当りのフィブ
リン溶解活性は既存の血栓溶解剤（例えばストレプトキ
ナーゼや組織プラスミノーゲンアクチベータ）と比較し
てかならずしも高くないことが報告されている（伊藤、
慈恵医大誌、vol.97,1041-1046(1982)、O.Matsuoら、Bl
ood, vol.76, 925-929(1990)、H.R.Linjenら、前出）。
【０００７】本発明は、ＳＡＫ自身が有する血栓溶解作
用に着目し、更に強い血栓溶解作用を有する誘導体、物
理化学的安定性に更に優れた誘導体を得るため、又は、
誘導体設計の研究情報を得るために、ＳＡＫの構成アミ
ノ酸の一部を他のアミノ酸に置換したＳＡＫ変異体を得
ることを目的とする。
用に着目し、更に強い血栓溶解作用を有する誘導体、物
理化学的安定性に更に優れた誘導体を得るため、又は、
誘導体設計の研究情報を得るために、ＳＡＫの構成アミ
ノ酸の一部を他のアミノ酸に置換したＳＡＫ変異体を得
ることを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明のＳＡＫ変異体
は、塩基番号１に示されるＳＡＫのアミノ酸の一部を別
のアミノ酸に置換したものである。本発明では、ＳＡＫ
に比べて強い血栓溶解作用を有する誘導体、ＳＡＫに比
べて物理化学的安定性に更に優れた誘導体を得るため、
また、ＳＡＫの作用機作の研究、誘導体設計の研究情報
を得るために行なわれるものを全て指す。
は、塩基番号１に示されるＳＡＫのアミノ酸の一部を別
のアミノ酸に置換したものである。本発明では、ＳＡＫ
に比べて強い血栓溶解作用を有する誘導体、ＳＡＫに比
べて物理化学的安定性に更に優れた誘導体を得るため、
また、ＳＡＫの作用機作の研究、誘導体設計の研究情報
を得るために行なわれるものを全て指す。
【０００９】具体的な本発明のＳＡＫ変異体（Ｄ４１
Ｎ）は、配列番号２に示されるように、１３６個のアミ
ノ酸からなるスタフィロキナーゼの１４番目のアスパラ
ギン酸残基（Asp ）をアスパラギン残基（Asn ）に置換
したものである。
Ｎ）は、配列番号２に示されるように、１３６個のアミ
ノ酸からなるスタフィロキナーゼの１４番目のアスパラ
ギン酸残基（Asp ）をアスパラギン残基（Asn ）に置換
したものである。
【００１０】具体的な本発明のＳＡＫ変異体（Ｅ８５
Ｑ）は、配列番号３に示されるように、１３６個のアミ
ノ酸からなるスタフィロキナーゼの５８番目のグルタミ
ン酸残基（Glu ）をグルタミン残基（Gln ）に置換した
ものである。
Ｑ）は、配列番号３に示されるように、１３６個のアミ
ノ酸からなるスタフィロキナーゼの５８番目のグルタミ
ン酸残基（Glu ）をグルタミン残基（Gln ）に置換した
ものである。
【００１１】具体的な本発明のＳＡＫ変異体（Ｋ１１３
Ａ）は、配列番号４に示されるように、１３６個のアミ
ノ酸からなるスタフィロキナーゼの８６番目のリジン残
基（Lys ）をアラニン残基（Ala ）に置換したものであ
る。
Ａ）は、配列番号４に示されるように、１３６個のアミ
ノ酸からなるスタフィロキナーゼの８６番目のリジン残
基（Lys ）をアラニン残基（Ala ）に置換したものであ
る。
【００１２】具体的な本発明のＳＡＫ変異体（Ｋ３８
Ｓ）は、配列番号５に示されるように、１３６個のアミ
ノ酸からなるスタフィロキナーゼの１１番目のリジン残
基（Lys ）をセリン残基（Ser ）に置換したものであ
る。
Ｓ）は、配列番号５に示されるように、１３６個のアミ
ノ酸からなるスタフィロキナーゼの１１番目のリジン残
基（Lys ）をセリン残基（Ser ）に置換したものであ
る。
【００１３】具体的な本発明のＳＡＫ変異体（Ｅ７３
Ｑ）は、配列番号６に示されるように、１３６個のアミ
ノ酸からなるスタフィロキナーゼの４６番目のグルタミ
ン酸残基（Glu ）をグルタミン残基（Gln ）に置換した
ものである。
Ｑ）は、配列番号６に示されるように、１３６個のアミ
ノ酸からなるスタフィロキナーゼの４６番目のグルタミ
ン酸残基（Glu ）をグルタミン残基（Gln ）に置換した
ものである。
【００１４】具体的な本発明のＳＡＫ変異体（Ｄ９６
Ｅ）は、配列番号７に示されるように、１３６個のアミ
ノ酸からなるスタフィロキナーゼの６９番目のアスパラ
ギン酸残基（Asp ）をグルタミン酸残基（Glu ）に置換
したものである。
Ｅ）は、配列番号７に示されるように、１３６個のアミ
ノ酸からなるスタフィロキナーゼの６９番目のアスパラ
ギン酸残基（Asp ）をグルタミン酸残基（Glu ）に置換
したものである。
【００１５】具体的な本発明のＳＡＫ変異体（Ｋ１３６
Ａ）は、配列番号８に示されるように、１３６個のアミ
ノ酸からなるスタフィロキナーゼの１０９番目のリジン
残基（Lys ）をアラニン残基（Ala ）に置換したもので
ある。
Ａ）は、配列番号８に示されるように、１３６個のアミ
ノ酸からなるスタフィロキナーゼの１０９番目のリジン
残基（Lys ）をアラニン残基（Ala ）に置換したもので
ある。
【００１６】本発明においては、塩基番号１に示される
ＳＡＫのアミノ酸の一部を別のアミノ酸に置換したペプ
チドを開示している。これらのペプチドはアミノ酸合成
機等を用いて合成してもよいが、各ペプチドをコードす
る産生遺伝子を宿主菌内に導入し、この宿主菌を培養す
ることによって得た方が、効率的である。
ＳＡＫのアミノ酸の一部を別のアミノ酸に置換したペプ
チドを開示している。これらのペプチドはアミノ酸合成
機等を用いて合成してもよいが、各ペプチドをコードす
る産生遺伝子を宿主菌内に導入し、この宿主菌を培養す
ることによって得た方が、効率的である。
【００１７】従って、好ましくは各ペプチドをコードす
る産生遺伝子もｓａｋ遺伝子の該当する一部を変異させ
て、変異を導入しようとするアミノ酸配列に対応するよ
うな変異を加えた変異ｓａｋ遺伝子を作成し、これを大
腸菌等の宿主菌に導入して、目的とする変異ＳＡＫを作
成する。
る産生遺伝子もｓａｋ遺伝子の該当する一部を変異させ
て、変異を導入しようとするアミノ酸配列に対応するよ
うな変異を加えた変異ｓａｋ遺伝子を作成し、これを大
腸菌等の宿主菌に導入して、目的とする変異ＳＡＫを作
成する。
【００１８】
【発明の実施の形態】本発明においては、ｓａｋ遺伝子
において変異の導入しようとするアミノ酸配列に対応す
るような変異を加えた変異ｓａｋ遺伝子を作成し、これ
を大腸菌等の宿主菌に導入して、このものを利用して、
目的とする変異ＳＡＫを作成する。
において変異の導入しようとするアミノ酸配列に対応す
るような変異を加えた変異ｓａｋ遺伝子を作成し、これ
を大腸菌等の宿主菌に導入して、このものを利用して、
目的とする変異ＳＡＫを作成する。
【００１９】具体的には、Ｓ．アウレウス由来のＳＡＫ
遺伝子を組み込んだ適当なプラスミド（ｐＳＡ０１）よ
り、ウリジンを含む１本鎖ＤＮＡを調製した。一方、変
異アミノ酸情報を有する、合成プライマーを合成し、こ
れを前記１本鎖ＤＮＡにアニールさせた後、ＤＮＡポリ
メラーゼ処理、ＤＮＡリガーゼ処理した。これを修復・
結合させた後、適当な宿主（大腸菌）に形質転換し、こ
の大腸菌の中から、目的の遺伝子情報が導入されたもの
を選択して、これを用いて変異が導入されたＳＡＫ誘導
体を合成した。
遺伝子を組み込んだ適当なプラスミド（ｐＳＡ０１）よ
り、ウリジンを含む１本鎖ＤＮＡを調製した。一方、変
異アミノ酸情報を有する、合成プライマーを合成し、こ
れを前記１本鎖ＤＮＡにアニールさせた後、ＤＮＡポリ
メラーゼ処理、ＤＮＡリガーゼ処理した。これを修復・
結合させた後、適当な宿主（大腸菌）に形質転換し、こ
の大腸菌の中から、目的の遺伝子情報が導入されたもの
を選択して、これを用いて変異が導入されたＳＡＫ誘導
体を合成した。
【００２０】さらに具体的には、１４番目のアスパラギ
ン酸残基をアスパラギン残基に置換したＳＡＫ変異体
（Ｄ４１Ｎ）、５８番目のグルタミン酸残基をグルタミ
ン残基に置換したＳＡＫ変異体（Ｅ８５Ｑ）、８６番目
のリジン残基をアラニン残基に置換したＳＡＫ変異体
（Ｋ１１３Ａ）、１１番目のリジン残基をセリン残基に
置換したＳＡＫ変異体（Ｋ３８Ｓ）、４６番目のグルタ
ミン酸残基をグルタミン残基に置換したＳＡＫ変異体
（Ｅ７３Ｑ）、６９番目のアスパラギン酸残基をグルタ
ミン酸残基に置換したＳＡＫ変異体（Ｄ９６Ｅ）、及
び、１０９番目のリジン残基をアラニン残基に置換した
ＳＡＫ変異体（Ｋ１３６Ａ）の７つの変異体を得た。
ン酸残基をアスパラギン残基に置換したＳＡＫ変異体
（Ｄ４１Ｎ）、５８番目のグルタミン酸残基をグルタミ
ン残基に置換したＳＡＫ変異体（Ｅ８５Ｑ）、８６番目
のリジン残基をアラニン残基に置換したＳＡＫ変異体
（Ｋ１１３Ａ）、１１番目のリジン残基をセリン残基に
置換したＳＡＫ変異体（Ｋ３８Ｓ）、４６番目のグルタ
ミン酸残基をグルタミン残基に置換したＳＡＫ変異体
（Ｅ７３Ｑ）、６９番目のアスパラギン酸残基をグルタ
ミン酸残基に置換したＳＡＫ変異体（Ｄ９６Ｅ）、及
び、１０９番目のリジン残基をアラニン残基に置換した
ＳＡＫ変異体（Ｋ１３６Ａ）の７つの変異体を得た。
【００２１】また、これらのＳＡＫ変異体の活性を測定
し、もとのＳＡＫと比較した。その結果、ＳＡＫ変異体
（Ｄ４１Ｎ）が１．６５倍、ＳＡＫ変異体（Ｅ８５Ｑ）
が１．３５倍、ＳＡＫ変異体（Ｋ１１３Ａ）が１．２７
倍の活性で、活性の増強されたＳＡＫ誘導体が得られ
た。
し、もとのＳＡＫと比較した。その結果、ＳＡＫ変異体
（Ｄ４１Ｎ）が１．６５倍、ＳＡＫ変異体（Ｅ８５Ｑ）
が１．３５倍、ＳＡＫ変異体（Ｋ１１３Ａ）が１．２７
倍の活性で、活性の増強されたＳＡＫ誘導体が得られ
た。
【００２２】また、逆にＳＡＫ変異体（Ｋ３８Ｓ）は１
／６０に、ＳＡＫ変異体（Ｅ７３Ｑ）は１／４に、ＳＡ
Ｋ変異体（Ｄ９６Ｅ）は１／９００に、ＳＡＫ変異体
（Ｋ１３６Ａ）は１／３８０にと、活性が減弱した変異
体が得られた。これら活性が減弱した変異体の変異導入
位置が活性の発現に重要であることが示唆された。従っ
て、これら活性が減弱した誘導体もその他の部分ではＳ
ＡＫの構造を維持しているので、例えばＳＡＫの物理化
学的安定性や抗原性等の研究など、ＳＡＫの作用機作の
研究や誘導体設計上に有用な物質である。
／６０に、ＳＡＫ変異体（Ｅ７３Ｑ）は１／４に、ＳＡ
Ｋ変異体（Ｄ９６Ｅ）は１／９００に、ＳＡＫ変異体
（Ｋ１３６Ａ）は１／３８０にと、活性が減弱した変異
体が得られた。これら活性が減弱した変異体の変異導入
位置が活性の発現に重要であることが示唆された。従っ
て、これら活性が減弱した誘導体もその他の部分ではＳ
ＡＫの構造を維持しているので、例えばＳＡＫの物理化
学的安定性や抗原性等の研究など、ＳＡＫの作用機作の
研究や誘導体設計上に有用な物質である。
【００２３】
【実施例】以下、実施例により、さらに詳細に本発明を
説明する。 実験例１．１本鎖ＤＮＡの製造 Ｓ．アウレウス由来のＳＡＫ遺伝子を組み込んだプラス
ミドｐＳＡ０１を保持する大腸菌ＭＶ１１８４の前培養
液と、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７とを混和し、２×
ＹＴ培地（１．６％バクト・トリプトン；Ｄｉｆｃｏ社
製、１％イースト・エキストラクト；Ｄｉｆｃｏ社製、
０．５％食塩）で終夜培養した。
説明する。 実験例１．１本鎖ＤＮＡの製造 Ｓ．アウレウス由来のＳＡＫ遺伝子を組み込んだプラス
ミドｐＳＡ０１を保持する大腸菌ＭＶ１１８４の前培養
液と、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７とを混和し、２×
ＹＴ培地（１．６％バクト・トリプトン；Ｄｉｆｃｏ社
製、１％イースト・エキストラクト；Ｄｉｆｃｏ社製、
０．５％食塩）で終夜培養した。
【００２４】尚、プラスミドｐＳＡ０１は、プラスミド
ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）を制限酵素ＢａｍＨＩで切
断後、アルカリ性ホスフォターゼ処理を行なったもの
と、プラスミドｐＴＩ１０（Ｉｉｎｏら、J.Biol.Che
m.,vol.262,7412-7417(1987)）より、ＢａｍＨＩ切断に
より得られるｓａｋ遺伝子を含むＤＮＡ断片を混合し
て、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処理した後に、大腸菌ＭＶ１
１８４コンピテントセルに導入したものから、ラクトー
スオペロンプロモータの下流に正しくｓａｋ遺伝子が組
込まれたプラスミドを保持するクローンを選択したもの
である。
ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）を制限酵素ＢａｍＨＩで切
断後、アルカリ性ホスフォターゼ処理を行なったもの
と、プラスミドｐＴＩ１０（Ｉｉｎｏら、J.Biol.Che
m.,vol.262,7412-7417(1987)）より、ＢａｍＨＩ切断に
より得られるｓａｋ遺伝子を含むＤＮＡ断片を混合し
て、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処理した後に、大腸菌ＭＶ１
１８４コンピテントセルに導入したものから、ラクトー
スオペロンプロモータの下流に正しくｓａｋ遺伝子が組
込まれたプラスミドを保持するクローンを選択したもの
である。
【００２５】遠心後、上清を大腸菌ＢＷ３１３前培養液
と混和し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％バク
ト・トリプトン、０．５％イースト・エキストラクト、
０．５％食塩、０．１％グルコース、１．５％アガー；
Ｄｉｆｃｏ社製）にプレーティングした。
と混和し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１％バク
ト・トリプトン、０．５％イースト・エキストラクト、
０．５％食塩、０．１％グルコース、１．５％アガー；
Ｄｉｆｃｏ社製）にプレーティングした。
【００２６】得られたコロニーを２×ＹＴ培地で終夜培
養した。培養液にヘルパーファージ液Ｍ１３ＫＯ７を加
え、２×ＹＴ培地で更に一晩培養を続けた。遠心後、上
清にポリエチレングリコール水溶液（２．５Ｍ食塩、２
０％ポリエチレングリコール＃６０００）を加え、室温
で、３０分間放置した。遠心後、沈殿を少量の水に懸濁
し、フェノール処理により、蛋白質を除去し、ウリジン
を含む１本鎖ＤＮＡを得た。
養した。培養液にヘルパーファージ液Ｍ１３ＫＯ７を加
え、２×ＹＴ培地で更に一晩培養を続けた。遠心後、上
清にポリエチレングリコール水溶液（２．５Ｍ食塩、２
０％ポリエチレングリコール＃６０００）を加え、室温
で、３０分間放置した。遠心後、沈殿を少量の水に懸濁
し、フェノール処理により、蛋白質を除去し、ウリジン
を含む１本鎖ＤＮＡを得た。
【００２７】実験例２．プライマーの合成 変異導入を目的とするプライマーとして ・ GTTCAAAATATGATGCATTATCGCCCTTT ・ TCAATTTTTGTTTTGTAAGT ・ GACTTCGATCGCTGCGCTTGGA ・ TCGCGTCATCTCCGGATTTATATTTT ・ AGGAAACTGGACATAAT ・ ATGCTGTCGCCTCGAGTGCCCATTCG ・ CAACAAAACCCGCTTCTGTTATA をＤＮＡ合成機（アプライド・バイオシステム社製、３
８０Ｂ型）を用いて合成した。
８０Ｂ型）を用いて合成した。
【００２８】実験例３．変異導入ＤＮＡを形質転換した
大腸菌の作成 実験例１に記載した方法で作成した、ウリジンを含む１
本鎖ＤＮＡに目的の変異を有する合成プライマーをアニ
ールさせ、ＤＮＡポリメラーゼクレノウ断片、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼにより修復・結合させた。これを大腸菌ＢＭ
Ｈ７１−８１ｍｕｔＳに形質転換し、目的の変異を有す
る大腸菌を選び出し、塩基配列の確認を行い、目的の変
異が導入されていることを確認した。
大腸菌の作成 実験例１に記載した方法で作成した、ウリジンを含む１
本鎖ＤＮＡに目的の変異を有する合成プライマーをアニ
ールさせ、ＤＮＡポリメラーゼクレノウ断片、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼにより修復・結合させた。これを大腸菌ＢＭ
Ｈ７１−８１ｍｕｔＳに形質転換し、目的の変異を有す
る大腸菌を選び出し、塩基配列の確認を行い、目的の変
異が導入されていることを確認した。
【００２９】実験例４．変異ＳＡＫの製造 (1) 製造 変異ｓａｋ遺伝子を有する大腸菌の前培養液をＬＢ培地
に１／１００量接種し３７℃で振盪培養した。９０分後
に１００ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β
−Ｄ−ガラクトシド）水溶液を１／１００量加え、変異
ＳＡＫ蛋白質の発現を誘導し、更に培養を６時間続け
た。遠心分離により、菌体を集めた。菌体を、１／２０
０量のリシス溶液（３０％シュクロース、１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、
１．５ｍＭ ＥＤＴＡ）で懸濁し氷水中で放置した。５
分後、１／１０量の５ｍＭ ＭｇＣｌ2 水溶液を加え、
時々攪拌しながら氷水中に１０分間放置し、細胞に浸透
圧ショックをかけた。遠心分離により、上澄み液を回収
し、ペリプラズム画分を得た。
に１／１００量接種し３７℃で振盪培養した。９０分後
に１００ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β
−Ｄ−ガラクトシド）水溶液を１／１００量加え、変異
ＳＡＫ蛋白質の発現を誘導し、更に培養を６時間続け
た。遠心分離により、菌体を集めた。菌体を、１／２０
０量のリシス溶液（３０％シュクロース、１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、
１．５ｍＭ ＥＤＴＡ）で懸濁し氷水中で放置した。５
分後、１／１０量の５ｍＭ ＭｇＣｌ2 水溶液を加え、
時々攪拌しながら氷水中に１０分間放置し、細胞に浸透
圧ショックをかけた。遠心分離により、上澄み液を回収
し、ペリプラズム画分を得た。
【００３０】(2) 精製 前記ペリプラズム画分からの変異ＳＡＫ蛋白質の精製は
以下のとおりに行った。得られたペリプラズム画分を２
０ｍＭクエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．０）に対し透析し
た。２０ｍＭクエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．０）を用い
て平衡化したＴＳＫ−Ｇｅｌ ＣＭ−３ＳＷカラムに添
加し、０から０．６ＭのＮａＣｌの直線グラジェント法
により、溶出させた。
以下のとおりに行った。得られたペリプラズム画分を２
０ｍＭクエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．０）に対し透析し
た。２０ｍＭクエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．０）を用い
て平衡化したＴＳＫ−Ｇｅｌ ＣＭ−３ＳＷカラムに添
加し、０から０．６ＭのＮａＣｌの直線グラジェント法
により、溶出させた。
【００３１】変異ＳＡＫ蛋白質に対応する部分を集め
て、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）に対して透析
後、凍結乾燥により粉末とした。各変異体でばらつきは
あるが、純度はほぼ１００％で、収量は、培地１００ｍ
ｌあたり１００μｇから１ｍｇ程度得られた。
て、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）に対して透析
後、凍結乾燥により粉末とした。各変異体でばらつきは
あるが、純度はほぼ１００％で、収量は、培地１００ｍ
ｌあたり１００μｇから１ｍｇ程度得られた。
【００３２】実験例５．変異ＳＡＫの活性測定 野性型のＳＡＫおよび、実施例で作成した変異ＳＡＫに
ついて、適当な倍率段階でＧＴ（０．０５Ｍトリス／グ
リシ、ｐＨ８．０）で希釈した溶液１０μｌを９６穴プ
レートに分注した。これに、ＧＴ２０μｌを加え、更に
プラスミノーゲン溶液（べーリンガー・マンハイム・山
之内社製）溶液（ＧＴで０．８Ｕ／ｍｌとしたもの）５
０μｌを加えて、２５℃で１０分間放置した。
ついて、適当な倍率段階でＧＴ（０．０５Ｍトリス／グ
リシ、ｐＨ８．０）で希釈した溶液１０μｌを９６穴プ
レートに分注した。これに、ＧＴ２０μｌを加え、更に
プラスミノーゲン溶液（べーリンガー・マンハイム・山
之内社製）溶液（ＧＴで０．８Ｕ／ｍｌとしたもの）５
０μｌを加えて、２５℃で１０分間放置した。
【００３３】次に、これに、合成基質溶液（０．１９Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５／０．１９ＭＮａ
Ｃｌ／０．００１％ポリソルベート８０／０．４４ｍＭ
５，５’−ジチオ・ビス−２−ニトロ安息香酸（シグマ
社製）／０．４ｍＭＮ−α−ＣＢＺ−Ｌ−リジン−チオ
ベンジルエステル（シグマ社製））１００μｌを加え、
更に２５℃で５分間保温後、ソイビーントリプシンイン
ヒビター（シグマ社製、水で０．１ｍｇ／ｍｌとしたも
の）５０μｌを加えて、反応を停止し、モデル４５０マ
イクロプレートリーダ（バイオラッド社製）で４０５ｎ
ｍの吸光度を測定し、活性を比較した。野生型ＳＡＫの
活性を１００としたときの相対的な活性の値を次の表１
に示す。
リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５／０．１９ＭＮａ
Ｃｌ／０．００１％ポリソルベート８０／０．４４ｍＭ
５，５’−ジチオ・ビス−２−ニトロ安息香酸（シグマ
社製）／０．４ｍＭＮ−α−ＣＢＺ−Ｌ−リジン−チオ
ベンジルエステル（シグマ社製））１００μｌを加え、
更に２５℃で５分間保温後、ソイビーントリプシンイン
ヒビター（シグマ社製、水で０．１ｍｇ／ｍｌとしたも
の）５０μｌを加えて、反応を停止し、モデル４５０マ
イクロプレートリーダ（バイオラッド社製）で４０５ｎ
ｍの吸光度を測定し、活性を比較した。野生型ＳＡＫの
活性を１００としたときの相対的な活性の値を次の表１
に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】以上のように、野生ＳＡＫの一部のアミノ
酸を他のアミノ酸に置換した変異ＳＡＫ蛋白質はその血
栓溶解作用が、天然ＳＡＫより優れたものと、血栓溶解
作用が殆ど失われたものが得られた。活性が優れたもの
は、このまま血栓溶解剤としての用途が考えられる。ま
た、活性がなくなったものも、その他のＳＡＫタンパク
の特性はそのまま保持しているので、ＳＡＫの作用機作
の研究や誘導体の設計等に有用である。
酸を他のアミノ酸に置換した変異ＳＡＫ蛋白質はその血
栓溶解作用が、天然ＳＡＫより優れたものと、血栓溶解
作用が殆ど失われたものが得られた。活性が優れたもの
は、このまま血栓溶解剤としての用途が考えられる。ま
た、活性がなくなったものも、その他のＳＡＫタンパク
の特性はそのまま保持しているので、ＳＡＫの作用機作
の研究や誘導体の設計等に有用である。
【００３６】
【発明の効果】以上説明した通り、ＳＡＫの構成アミノ
酸の一部を他のアミノ酸に置換したＳＡＫ変異体を得る
ことができるという効果を有する。
酸の一部を他のアミノ酸に置換したＳＡＫ変異体を得る
ことができるという効果を有する。
【００３７】
配列番号：１ 配列の長さ：136 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Staphylococcus aureus を宿主とするバクテリ
オファージ 株名：ＳφＣ 配列 Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr 5 10 15 Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val Asp Gly 20 25 30 Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro Ile Lys Pro 35 40 45 50 Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu 55 60 65 Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Lue Asp Pro Ser Ala 70 75 80 85 Lys Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys 90 95 100 Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His 105 110 115 Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys 120 125 130 135
オファージ 株名：ＳφＣ 配列 Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr 5 10 15 Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val Asp Gly 20 25 30 Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro Ile Lys Pro 35 40 45 50 Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu 55 60 65 Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Lue Asp Pro Ser Ala 70 75 80 85 Lys Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys 90 95 100 Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His 105 110 115 Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys 120 125 130 135
【００３８】配列番号：２ 配列の長さ：136 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号：Modified-site 存在位置：14 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asn Ala Ser Tyr 5 10 * 15 Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val Asp Gly 20 25 30 Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro Ile Lys Pro 35 40 45 50 Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu 55 60 65 Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Lue Asp Pro Ser Ala 70 75 80 85 Lys Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys 90 95 100 Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His 105 110 115 Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys 120 125 130 135
【００３９】配列番号：３ 配列の長さ：136 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号：Modified-site 存在位置：58 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr 5 10 15 Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val Asp Gly 20 25 30 Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro Ile Lys Pro 35 40 45 50 Gly Thr Thr Leu Thr Lys Gln Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu 55 * 60 65 Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Lue Asp Pro Ser Ala 70 75 80 85 Lys Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys 90 95 100 Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His 105 110 115 Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys 120 125 130 135
【００４０】配列番号：４ 配列の長さ：136 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号：Modified-site 存在位置：86 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr 5 10 15 Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val Asp Gly 20 25 30 Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro Ile Lys Pro 35 40 45 50 Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu 55 60 65 Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Lue Asp Pro Ser Ala 70 75 80 85 Ala Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys * 90 95 100 Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His 105 110 115 Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys 120 125 130 135
【００４１】配列番号：５ 配列の長さ：136 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号：Modified-site 存在位置：11 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Ser Gly Asp Asp Ala Ser Tyr 5 10 * 15 Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val Asp Gly 20 25 30 Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro Ile Lys Pro 35 40 45 50 Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu 55 60 65 Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Lue Asp Pro Ser Ala 70 75 80 85 Lys Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys 90 95 100 Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His 105 110 115 Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys 120 125 130 135
【００４２】配列番号：６ 配列の長さ：136 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号：Modified-site 存在位置：46 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr 5 10 15 Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val Asp Gly 20 25 30 Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Gln Phe Pro Ile Lys Pro 35 40 45 * 50 Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu 55 60 65 Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Lue Asp Pro Ser Ala 70 75 80 85 Lys Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys 90 95 100 Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His 105 110 115 Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys 120 125 130 135
【００４３】配列番号：７ 配列の長さ：136 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号：Modified-site 存在位置：69 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr 5 10 15 Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val Asp Gly 20 25 30 Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro Ile Lys Pro 35 40 45 50 Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu 55 60 65 Glu Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Lue Asp Pro Ser Ala * 70 75 80 85 Lys Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys 90 95 100 Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His 105 110 115 Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys 120 125 130 135
【００４４】配列番号：８ 配列の長さ：136 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号：Modified-site 存在位置：109 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr 5 10 15 Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val Asp Gly 20 25 30 Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro Ile Lys Pro 35 40 45 50 Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu 55 60 65 Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Lue Asp Pro Ser Ala 70 75 80 85 Lys Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys 90 95 100 Ser Phe Pro Ile Thr Glu Ala Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His 105 * 110 115 Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys 120 125 130 135
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 左古 知行 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式会 社ヤクルト本社内 (72)発明者 木脇 真祐美 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式会 社ヤクルト本社内
Claims (7)
- 【請求項１】 １３６個のアミノ酸からなるスタフィロ
キナーゼの１４番目のアスパラギン酸残基（Asp ）をア
スパラギン残基（Asn ）に置換した配列番号２で示され
るスタフィロキナーゼ変異体（Ｄ４１Ｎ）。 - 【請求項２】 １３６個のアミノ酸からなるスタフィロ
キナーゼの５８番目のグルタミン酸残基（Glu ）をグル
タミン残基（Gln ）に置換した配列番号３で示されるス
タフィロキナーゼ変異体（Ｅ８５Ｑ）。 - 【請求項３】 １３６個のアミノ酸からなるスタフィロ
キナーゼの８６番目のリジン残基（Lys ）をアラニン残
基（Ala ）に置換した配列番号４で示されるスタフィロ
キナーゼ変異体（Ｋ１１３Ａ）。 - 【請求項４】 １３６個のアミノ酸からなるスタフィロ
キナーゼの１１番目のリジン残基（Lys ）をセリン残基
（Ser ）に置換した配列番号５で示されるスタフィロキ
ナーゼ変異体（Ｋ３８Ｓ）。 - 【請求項５】 １３６個のアミノ酸からなるスタフィロ
キナーゼの４６番目のグルタミン酸残基（Glu ）をグル
タミン残基（Gln ）に置換した配列番号６で示されるス
タフィロキナーゼ変異体（Ｅ７３Ｑ）。 - 【請求項６】 １３６個のアミノ酸からなるスタフィロ
キナーゼの６９番目のアスパラギン酸残基（Asp ）をグ
ルタミン酸残基（Glu ）に置換した配列番号７で示され
るスタフィロキナーゼ変異体（Ｄ９６Ｅ）。 - 【請求項７】 １３６個のアミノ酸からなるスタフィロ
キナーゼの１０９番目のリジン残基（Lys ）をアラニン
残基（Ala ）に置換した配列番号８で示されるスタフィ
ロキナーゼ変異体（Ｋ１３６Ａ）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8208991A JPH1028587A (ja) | 1996-07-19 | 1996-07-19 | スタフィロキナーゼ変異体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8208991A JPH1028587A (ja) | 1996-07-19 | 1996-07-19 | スタフィロキナーゼ変異体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1028587A true JPH1028587A (ja) | 1998-02-03 |
Family
ID=16565524
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8208991A Pending JPH1028587A (ja) | 1996-07-19 | 1996-07-19 | スタフィロキナーゼ変異体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1028587A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113563481A (zh) * | 2021-07-13 | 2021-10-29 | 江南大学 | 一种能同时降解黄曲霉毒素b1和玉米赤霉烯酮的融合酶的突变体构建方法及其应用 |
-
1996
- 1996-07-19 JP JP8208991A patent/JPH1028587A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113563481A (zh) * | 2021-07-13 | 2021-10-29 | 江南大学 | 一种能同时降解黄曲霉毒素b1和玉米赤霉烯酮的融合酶的突变体构建方法及其应用 |
| CN113563481B (zh) * | 2021-07-13 | 2023-04-28 | 江南大学 | 一种能同时降解黄曲霉毒素b1和玉米赤霉烯酮的融合酶的突变体构建方法及其应用 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050330 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050720 |