SI20923A - Postopek kultivacije glive ganoderma lucidum na trdnem gojišču - Google Patents

Abstract

Izum se nanaša na nov postopek za kultivacijo/gojenje glive Ganoderma lucidum na trdnem gojišču, s tako imenovano "solid-state" kultivacijo, v horizontalnem mešalnem bioreaktorju. Kot trdno gojišče uporabljamo bukovo žaganje. Postopek omogoča natančno vodenje in spremljanje rasti glive v sterilnih pogojih. Po postopku se da pripraviti velike količine glivne biomase, ki daje produkte uporabne v farmaciji. Glivno biomaso lahko uporabimo tudi kot trdni vcepek za nadaljnjo gojenje glive.ŕ

Description

Postopek kultivacije glive Ganoderma lucidum na trdnem gojišču

Tehnično področje izuma

Predloženi izum se nanaša na področje biotehnologije, zlasti na nov postopek kultivacije/gojenja glive Ganoderma lucidum na trdnem gojišču, s tako imenovano »solid-state« kultivacijo, v horizontalnem mešalnem bioreaktorju. Kot trdno gojišče uporabljamo bukovo žaganje. Postopek omogoča natančno vodenje in spremljanje rasti glive v sterilnih pogojih. Po postopku se da pripraviti velike količine glivne biomase, ki daje produkte uporabne v farmaciji. Glivno biomaso lahko uporabimo tudi kot trdni vcepek za nadaljnjo gojenje glive.

Stanje tehnike

Ganoderma lucidum (Curtis ex Fries) Karsten je goba, ki jo že stoletja uporabljajo različna ljudstva, predvsem v zdravilne namene. Zaradi njenih zdravilnih učinkov so ji podelili mnogo imen. Japonci jo imenujejo Reishi ali Mannentake, kar pomeni desettisočletna goba. Kitajci in Korejci pa so ji podelili ime Ling Chi, Ling Chih, ali Ling Zhi, ker je to zanje goba nesmrtnosti. Tradicionalno jo povezujejo z dostojanstvom, zdravjem in okrevanjem, dolgim življenjem, spolno aktivnostjo, modrostjo in srečo.

V naravi raste Ganoderma lucidum kot enoletnica na različnih drevesih. Primarno raste na listavcih (hrast, javor, brest, vrba, magnolija, akacija; na Vzhodu na slivah). V jugovzhodnih in jugozahodnih delih Amerike je najpogostejša v hrastovih gozdovih, severovzhodnih predelih Amerike pa na javorju. Na iglavcih (jelki) se pojavlja redkeje (Stametes, P. 1993. Grovving gourment and medical mushrooms. A companion guide to the mushroom cultivator. Berkeley, Ten speed Press, s. 355-369).

Zaradi številnih vsebovanih snovi, kot so: polisaharidi, triterpenoidi, proteini, adenozin in derivati adenozina, RNK, ki imajo zdravilni učinek, se uporabljajo predvsem v farmaciji. Tržni produkti Ganoderma lucidum se uporabljajo v obliki sirupov, injekcij, tablet, kapsul, tinkture, pilul, čajev in v kombinaciji z medom. Uporabljajo se za zdravljenje različnih bolezni: nevrastenije, prebavnih motenj, nespečnosti, kroničnega hepatitisa, vnetja ledvic, visoke koncentracije serumskega holesterola, hipertenzije, levkocitopenije, rinitisa, kroničnega bronhitisa, angine, bronhialne astme, gastropatije, čira na dvanajsterniku in drugih bolezni (VVasser, S.P., Weis, A.L. 1997. Medicinal mushrooms - Ganoderma lucidum, Reishi mushroom. Haifa, Pedeifus Publishing House, s. 29; Li, P., Xu R., Xia J., Zhang K., Production of tetracyclic triterpenoid acids by submerged fermentation of Ganoderma lucidum, Gongye VVeishengvvu (2000), 30(1), 15-17).

G. lucidum oziroma njene aktivne substance pa se uporabljajo tudi pri zdravljenju danes najbolj nevarnih bolezni, raka in AIDS-a (Lee, S.-Y., Kang T.-S, Structural analysis of the antitumor active exo-polysaccharide produced by submerged cultivation of Ganoderma lucidum mycelium. Hariguk Kyunhakhoechi (1999), 27(1), 76-81).

Številni polisaharidi imajo namreč antitumorske in imunostimulativne aktivnosti (Lee, S.-Y., Kang T.-S, Structural analysis of the antitumor active exopolysaccharide produced by submerged cultivation of Ganoderma lucidum mycelium. Hariguk Kyunhakhoechi (1999), 27(1), 76-81). Delujejo citotoksično na maligne celice in stimulirajo ter okrepijo imunski sistem (Mizuno, T. Wang.,

G., Zhang, J., Kavvagishi, H., Nishitoba, T., Li, J. 1995. Reishi, Ganoderma lucidum and Ganoderma tsuage: Bioactive substances and medicinal effects, Food Revievvs International, 11, (1), s. 151-166.).

Poleg teh imajo izolirane substance še druge aktivnosti: citotoksične, imunomodulatorne (Liu, G.T., Bao, T.T., Niu, Χ.Υ., Li, S.Z., 1979. Some pharmacological actions of the spores of Ganoderma lucidum and Ganoderma capense (Loyd) Teng cultivated by submerged fermentation, Chin. Med. J., 92, s. 496-500; Berovič, M., Boh B., Hodžar D., Pohleven F., Zore I., Submerged culture of the fungus Ganoderma lucidum and process for isolation of active agents. Zb. Ref. Posvetovanja Slov. Kem. Dnevi (1997), 695- 700, Editor(s): Glavič, Peter; Brodnjak-Vončina, Darinka. Publisher:

Fakulteta za Kemijo in Kemijsko Tehnologijo Univerze v Mariboru, Maribor, Slovenia.), hipoglikemične (Hikino, H., Ishiyama, M., Suzuki, Y., Konno, C., 1989. Mechanism of Hypoglemic activity of Ganoderan B: Glycan of Ganoderma lucidum fruit bodies, Planta Medica, 55, s. 423-428; Hodžar D., Boh, B., Berovič M., Habijanič J., Pohleven, F., Isolation and characterization of polysaccharides from the fungus Ganoderma lucidum cultured by submerged and solid - State fermentation. Zb. Ref. Posvetovanja Slov. Kem. Dnevi (1998), 704-709. Editor(s); Glavič P., Brodnjak-Vončina D., Publisher: Fakulteta za Kemijo in Kemijsko Tehnologijo Univerze v Mariboru, Maribor, Slovenia.), zaščitne pred sevanjem, hipotenzivne (Kabir, Y., Kimura, S., Tamura, T. 1988. Dietary effect of Ganoderma lucidum Mushroom on Blood Pressure and Lipid Levels in Sponataneously Hypertensive Rats (SHR). Nutr. Sci. Vitaminol., 34, s. 433-438; Morigiwa, A., Kibatake, K., Fujimoto, Y., Ikekavva, N. 1986. Angitensin converting enzyme-inhibiting triterpenes from Ganoderma lucidum. Chem. Pharm. Buli., 34, s. 3025-3028.), hipoholesterolemske (Jong, S.C., Birmingham, J.M., 1992. Medicinal benefits of the mushrooms Ganoderma, Adv. Appl. Microbiol., 37, s. 101-134.) in še druge (VVasser, S.P., Weis, A.L. 1997. Medicinal mushrooms - Ganoderma lucidum, Reishi mushroom. Haifa, Pedeifus Publishing House, s. 29; Li in sod. 2000).).

Razen v klasičnih zdravilih najdemo aktivne učinkovine Ganoderma lucidum tudi v tako imenovanih zdravilih brez recepta ali Over Counter Drugs (OCD). Številni uspehi uporabe zdravil na osnovi aktivnih učinkovin Ganoderme lucidum predstavljajo glavni vzrok za intenzivne raziskave zlasti v azijskem prostoru (Japonska, Kitajska, Koreja, Malezija, Singapur,...) kjer predstavlja proizvodnja aktivne biomase Ganoderma lucidum in njenih učinkovin produkte strateškega pomena (Li, P., Xu R., Zhang K., Medium optimization for producing extrapolysaccharide by submerged fermentation of Ganoderma lucidum, Wuxi Qinggong Daxue Xuebao (1998), 17(4), 26-30.; Li, P., Xu R., Xia J., Zhang K., Production of tetracyclic triterpenoid acids by submerged fermentation of Ganoderma lucidum, Gongye Weishengwu (2000), 30(1), 1517; Li, Chun; Hong, Zhou; Zhu, Daohong; Li, Hui. Submerged fermentation of ediblefungi. Shihezi DaxueXuebao, Ziran Kexueban (1998), 2(2), 121-124. Morigivva, A., Kibatake, K., Fujimoto, Y., Ikekawa, N. 1986. Angitensin converting enzyme-inhibiting triterpenes from Ganoderma lucidum. Chem. Pharm. Buli., 34, s. 3025-3028).

US 5,721,134 opisuje soj Ganoderma lucidum KCCM 10045, ki proizvaja proteoglikan (G009), ki povzroča imunost na tumorje. Gojenje glive poteka samo v tekočem, stresanem mediju.

US 5,744,138 opisuje separacijo organo-germanijevih spojin in anorganskih germanijevih spojin od germanij vsebujoče rastline ali produktov njene predelave. Pri tem med drugim uporabljajo tudi glivo Ganoderma lucidum. Gojenje glive poteka na trdnem gojišču, to je lesnem drobirju, vendar samo v polietilenskih vrečah.

Gojenje glive na trdnem gojišču, vendar izključno v polistirenskih vrečah, čokih in hlodih je opisano v Wang, Qian; Ji, Hong; Wang, Hong; Chen, VVenjie; Bi, Kewei; Li, Zongvvu; Gu, Yajun, Preparation and analysis of the nutrient solution of Ganoderma lucidum by fermentation. Hebei Daxue Xuebao, Ziran Kexueban (1999), 19(1), 50-53.

US 5,756,318 opisuje glivne polisaharide in njihovo pripravo. V zahtevkih se navaja samo gojenje glive v tekočem mediju.

US 6,041,544 obširno opisuje pripravo vcepkov za gojenje jedilnih gob na različnih gojiščih. Vendar pa ne omenja pogojev za gojenje Ganoderma lucidum, in ne obravnava kakovosti gojenih gob kot potencialnih farmacevtskih surovin.

US 6,197,573 obravnava fermentacijo v trdnem stanju, vendar samo s stališča konstrukcije fermentorja in ne navaja nobenih podatkov o gojenju Ganoderma lucidum za pridobivanje farmacevtskih produktov.

Zato lahko zaključimo, da v pregledu strokovne in patentne literature nismo zasledili nobenih objav o gojenju glive Ganoderma lucidum oziroma o pripravi njenega inokuluma v bioreaktorju na trdnem gojišču na osnovi bukove žagovine.

Opis rešitve tehničnega problema z izvedbenimi primeri

Sedaj pa smo ugotovili nov postopek za gojenje glive Ganoderma lucidum na trdnem gojišču, to je bukovem žaganju. Postopek po predmetnem izumu mogoča enostavno pripravo velike količine glivne biomase v obliki micelija glive Ganoderma lucidum, ki jo je mogoče uporabiti kot surovino za farmacevtske produkte, ali pa kot trdni vcepek za nadaljnjo kultivacijo fruktificirane glive-gobe. Tako pripravljen vcepek je primeren za ponovno inokuliranje sterilnega bukovega žaganja.

Postopek omogoča natančno vodenje in spremljanje rasti glive v sterilnih pogojih. Postopek omogoča delo v sodobnih kontroliranih, sterilnih pogojih pri katerih hitro proizvedemo želeno obliko biomase oziroma velike količine vcepka/inokuluma, ki ga lahko uporabimo pri nadaljnjem gojenju na bukovem žaganju.

Pri postopku smo kot glivo uporabili prednostno soj Ganoderma lucidum Gal 4, deponiran 15.aprila 1996 pri depozitni ustanovi BFWS (Mikrobiološka zbirka Katedre za gozdarstvo na Biotehniški fakulteti, Ljubljana, Slovenija).

Po predmetnem postopku najprej pripravimo vegetativni vcepek glive submerzno na stresalniku in ga v submerznem bioreaktorju namnožimo, potem pa ga prenesemo v horizontalni mešalni bioreaktor, kjer na trdnem gojišču na osnovi kompleksnih naravnih sestavin, to je bukovega žaganja (vir ogljikovodikov), glukoze, olivnega olja in anorganskih soli, poteka rast glivne biomase in biosinteza glivnih učinkovin.

Postopek gojenja glive Ganoderma lucidum na trdnem gojišču v horizontalnem mešalnem bioreaktorju je veliko bolj enostaven in ekonomičen, kot do sedaj opisani postopki. Sterilizacija substrata poteka znotraj bioreaktorja, zato dodatne aparature za sterilizacijo substrata niso potrebne. Inokulacija substrata je zelo enostavna. Pogoji za kultivacijo glive (temperatura, vlažnost, ρθ₂, PCO2) so kontrolirani, zato lahko proizvodnjo biomase in produktov vodimo v željeni smeri. Možno je mešanje substrata pri čemer dosežemo bolj homogene pogoje v substratu med kultivacijo in homogen produkt. Med kultivacijo je možno vzorčenje in tako spremljanje rasti glive in proizvodnje produktov. Okužbe so zelo redke, saj tako inokulacija kot tudi kultivacija potekata v sterilnih pogojih. Po predloženem postopku lahko v zelo kratkem času, ob izrabi sekundarnih surovin, proizvedemo velike količine glivne biomase in produktov.

Postopek v smislu izuma izvedemo tako, da

a) pripravimo trdni substrat iz 600 g do 1000 g, prednostno 800 g bukovega žaganja, ki ga navlažimo z 1,2 L do 1,8 L, prednostno 1.5 L destilirane vode, ki vsebuje 60 g do 100 g, prednostno 80 g glukoze, od 40 g do 80 g, prednostno 50 mg (NH^SCU, od 150 mg do 250 mg, prednostno 200 mg KH2PO4, od 25 mg do 75 mg, prednostno 50 mg CaCI₂ X 2H₂O, od 30 mg do 60 mg, prednostno 50 mg MgSCU X 7H2O, od 120 do 180 mg, prednostno 150 mg FeSC>4 X 7H2O;

b) z dobljenim vlažnim žaganjem napolnimo bioreaktor in steriliziramo od 45 minut do 90 minut, prednostno 60 minut, pri temperaturi 110 do 130°C, prednostno 121°C (394 K), pri tlaku od 1 do 1,4 Ί0⁵ Pa, prednostno 1,2 10⁵ Pa;

c) ohladimo na 25 do 35 °C, prednostno 30°C, in substrat sterilno inokuliramo z 1,5 L do 2,5 L, prednostno 2 L, tekočega vcepka pripravljenega po postopku, opisanem v Primeru 3 našega patenta Sl 9700014 (Zore, I., Berovič, M., Hodžar, D., Boh, B., Pohleven, F. 1997, The submerged cultivation of Ganoderma lucidum in laboratory bioreactor);

d) nato gojimo glivo 40 do 55 dni, prednostno 49 dni, pri temperaturi 25 do 35°C, prednostno 30°, pri čemer je prvi teden kultivacije pretok zraka od 0 do 1 liter/minuto, prednostno 0,5 litra/minuto, naslednje tri tedne pa 1 do 5 litrov/minuto, prednostno 2 litra/minuto, mešanje substrata poteka pri 50 do 150 rpm, prednostno 80 rpm 1 do 4 minute, prednostno 2 minuti, pri čemer poteka prvi teden kultivacije mešanje enkrat na dan do enkrat na štiri dni, prednostno enkrat na dva dni, naslednje tri tedne pa enkrat na dan do enkrat na dva dni, prednostno enkrat na dan.

Na koncu kultivacije glive znaša količina nastale suhe biomase 0,5 mg glukozamina/g suhe teže vzorca, polisaharidov pa 5,77 mg/g.

Predmetni izum pojasnjujemo, vendar ne omejujemo, z naslednjimi izvedbenimi Primeri.

V vseh naslednjih Primerih so bili zgoraj opisani pogoji kultivacije analogni, pretok zraka pa je znašal v prvem primeru 5 L/min, v drugem primeru 2 L/min, v tretjem primeru pa je bil pretok 2 L/min, pri čemer je bil na prezračevalnik priključen še vlažilec zraka.

Prvi primer

Trdni substrat, katerega smo inokulirali z micelijem, smo pripravili tako, da smo 800 g bukovega žaganja namočili z 1,5 litra destilirane vode, ki je vseboval 80 g glukoze, 50 mg (NH₄)₂SO₄, 200 mg KH2PO4, 50 mg CaCl2 X 2H₂O, 50 mg MgSO₄ X 7H₂O, 150 mg FeSO₄ X 7H₂O. Z vlažnim žaganjem smo napolnili bioreaktor in sterilizirali od 45 minut do 90 minut, prednostno 60 minut pri temperaturi 110 do 130°C, prednostno 121°C (394 K) in tlaku od 1 do 1,4 Ί O⁵ Pa, prednostno 1,2 -10⁵ Pa.

Po ohladitvi na 30°C smo substrat sterilno inokulirali z 2 L tekočega vcepka pripravljenega tako, kot je opisano v Primeru 3 našega patenta Sl 9700014 (Zore, I., Berovič, M., Hodžar, D., Boh, B., Pohleven, F. 1997, The submerged cultivation of Ganoderma lucidum in laboratory bioreactor). Kultivacija poteka pri temperaturi 30°. Prvi teden kultivacije je pretok znašal 0,5 litra/minuto, naslednje tedne 5 litrov/minuto. Mešanje substrata je potekalo pri 80 rpm 2 minuti. Prvi teden kultivacije je potekalo mešanje enkrat na dva dni, naslednje tedne pa enkrat na dan.

Kultivacija glive po tem postopku je trajala 35 dni. Substrat se je po 35 dneh izsušil. Količina nastale suhe biomase ob koncu kultivacije je znašala 0,21 mg glukozamina/g suhe mase vzorca in polisaharidov 1,27 mg/g.

Drugi primer

Trdni substrat, katerega smo inokulirali z micelijem, smo pripravili tako, da smo 800 g bukovega žaganja namočili z 1.5 litra destilirane vode, ki je vsebovala 80 g glukoze, 50 mg (NH₄)₂SO₄, 200 mg KH₂PO₄, 50 mg CaCI₂ X 2H₂O, 50 mg MgSO₄ X 7H₂O, 150 mg FeSO₄ X 7H₂O. Z vlažnim žaganjem smo napolnili bioreaktor in sterilizirali od 45 minut do 90 minut, prednostno 60 minut pri temperaturi 110 do 130°C, prednostno 121°C (394 K) in tlaku od 1 do 1,4 ΊO⁵ Pa, prednostno 1,2 -10⁵ Pa.

Po ohladitvi na 30°C smo substrat sterilno inokulirali z 2 L tekočega vcepka, pripravljenega tako, kot je opisano v Primeru 3 našega patenta Sl 9700014 (Zore, I., Berovič, M., Hodžar, D., Boh, B., Pohleven, F. 1997, The submerged cultivation of Ganoderma lucidum in laboratory bioreactor). Kultivacija je potekala pri temperaturi 30°C. Prvi teden kultivacije je pretok znašal 0,5 litra/minuto, naslednje tedne 2 litra/minuto. Mešanje substrata je potekalo pri 80 rpm 2 minuti. Prvi teden kultivacije je potekalo mešanje enkrat na dva dni, naslednje tedne pa enkrat na dan.

Kultivacija glive po tem postopku je trajala 42 dni, količina nastale suhe biomase ob koncu kultivacije je znašala 0,39 mg glukozamina/g suhe mase vzorca, polisaharidov pa 2,24 mg/g.

Tretji primer

Trdni substrat, katerega smo inokulirali z micelijem, smo pripravili tako, da smo 800 g bukovega žaganja namočili z 1,5 litra destilirane vode, ki je vsebovala 80 g glukoze, 50 mg (NH₄)₂SO4, 200 mg KH₂PO₄, 50 mg CaCI₂ X 2H₂O, 50 mg MgSO₄ X 7H₂O, 150 mg FeSO₄ X 7H₂O. Z vlažnim žaganjem smo napolnili bioreaktor in sterilizirali od 45 minut do 90 minut, prednostno 60 minut pri temperaturi 110 do 130°C, prednostno 121 °C (394 K) in tlaku od 1 do 1,4 Ί0⁵ Pa, prednostno 1,2 -10⁵ Pa.

Po ohladitvi na 30°C smo substrat sterilno inokulirali z 2 L tekočega vcepka pripravljenega tako, kot je opisano v Primeru 3 našega patenta Sl 9700014 (Zore, I., Berovič, M., Hodžar, D., Boh, B., Pohleven, F. 1997, The submerged cultivation of Ganoderma lucidum in laboratory bioreactor). Kultivacija je potekala pri temperaturi 30°C. Prvi teden kultivacije je pretok znašal 0,5 litra/minuto, naslednje tedne pa 2 litra/minuto. Mešanje substrata je potekalo pri 80 rpm 2 minuti. Prvi teden kultivacije je potekalo mešanje enkrat na dva dni, naslednje tedne pa enkrat na dan. Po 28 dneh kultivacije se je pričelo navlaževanje substrata.

-1010

Kultivacija glive po tem postopku je trajala 49 dni, količina nastale suhe biomase ob koncu kultivacije pa je znašala 0,65 mg glukozamina/g suhe mase vzorca, polisaharidov pa 5,77 mg/g.

Claims (4)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Postopek za kultivacijo/gojenje glive Ganoderma lucidum na trdnem gojišču, značilen po tem, da ga izvedemo tako, da

   e) pripravimo trdni substrat iz 600 g do 1000 g, prednostno 800 g bukovega žaganja, ki ga navlažimo z 1,2 L do 1,8 L, prednostno 1.5 L destilirane vode, ki vsebuje 60 g do 100 g, prednostno 80 g glukoze, od 40 g do 80 g, prednostno 50 mg (NH^SO^ od 150 mg do 250 mg, prednostno 200 mg KH2PO4, od 25 mg do 75 mg, prednostno 50 mg CaCI₂ X 2H₂O, od 30 mg do 60 mg, prednostno 50 mg MgSO4 X 7H₂O, od 120 do 180 mg, prednostno 150 mg FeSO₄ X 7H₂O;

   f) z dobljenim vlažnim žaganjem napolnimo bioreaktor in steriliziramo od 45 minut do 90 minut, prednostno 60 minut, pri temperaturi 110 do 130°C, prednostno 121°C (394 K), pri tlaku od 1 do 1,4 -10⁵ Pa, prednostno 1,2 •10⁵ Pa;

   g) ohladimo na 25 do 35 °C, prednostno 30°C, in substrat sterilno inokuliramo z 1,5 L do 2,5 L, prednostno 2 L, tekočega vcepka glive Ganoderma lucidum^-,

   h) nato gojimo glivo 40 do 55 dni, prednostno 49 dni, pri temperaturi 25 do 35°C, prednostno 30°, pri čemer je prvi teden kultivacije pretok zraka od 0 do 1 liter/minuto, prednostno 0,5 litra/minuto, naslednje tri tedne pa 1 do 5 litrov/minuto, prednostno 2 litra/minuto, mešanje substrata poteka pri 50 do 150 rpm, prednostno 80 rpm 1 do 4 minute, prednostno 2 minuti, pri čemer poteka prvi teden kultivacije mešanje enkrat na dan do enkrat na štiri dni, prednostno enkrat na dva dni, naslednje tri tedne pa enkrat na dan do enkrat na dva dni, prednostno enkrat na dan.
2. 2. Postopek po zahtevku 1, značilen po tem, da kot glivo Ganoderma lucidum uporabimo soj Ganoderma lucidum Gal 4, deponiran 15.aprila 1996 pri depozitni ustanovi BFVVS (Mikrobiološka zbirka Katedre za gozdarstvo na Biotehniški fakulteti, Ljubljana, Slovenija.

   -1212
3. 3. Postopek po zahtevku 1 in 2, značilen po tem, da lahko poteka v laboratorijskem merilu.
4. 4. Postopek po zahtevku 1 in 2, značilen po tem, da lahko poteka v industrijskem merilu.