SE513481C3 - Implantatelement utfört av titan med en titanoxidyta modifierad med eloxidering - Google Patents

Description

513 4812 längtidsstabiliteten under kliniska belastningstillständ synes därför vara viktiga.

Ett biomaterial är ett material som användes i en medicinsk anordning, avsedd att samverka med biologiska system (Black, 1992). Materialen som användes i av människan gjorda strukturer kan indelas i tre klasser: metaller, keramer och polymerer. Klasserna urskiljes av typen av atomernas växelverkan (Cooke et al., 1996).

Metaller bestär av ett stort antal av smà kristalliner.

Varje kristallin är ett aggregat av atomer som är reguljärt. anordnade i en kristallin strukturz Dä smälta metaller (som är amorfa) stelnar startar smä kristaller (korn) att växa. De irregulärt anordnade kristallerna möter* slutligen varandra vilket. ger upphov till gränser mellan kristallerna, korngränser. Den ofullständiga packningen av atomer i gränssnitten utgör veka punkter i materialet, vilket kommer att bli högst starkt påverkat av en ytbehandling säsom etsning eller plasmarengöring och en fördjupning kommer att bildas och uppträder som en nßrk linje. Ytegenskaperna. hos ett material skiljer sig frän massaegenskaperna.

Termen kommersiellt rent (CP) titan användes för olegerat titan och innefattar flera kvalitéer innefattande mindre mängder av föroreningselement, säsom kol, järn och syre.

Mängden syre kan styras till olika niväer för att àstadkomma ökad hàllfasthet. Det finns fyra grader av titan där grad 11 (användes i innevarande tes) innehäller den minsta mängden syre. Mikrostrukturen pà CP-titan är väsentligen all-a~titan som har en HCP-kristallstruktur.

Titandioxid, TiOp är den mest vanliga och stabila av titanoxiderna, medan Tißh och TiO är mer sällsynta (Lausmaa, 1991). 513 4831 TiO2 kan existera i. tre kristallin-modifikationer1 anatas (tetragonal struktur), rutil (tetragonal), och brookit (ortorombisk). Rutil och anatas är de mest vanliga formerna medan brookit är mycket sällsynt (Keesman, 1966).

Tekniker har utvecklats för att ändra och modifiera ytegenskaperna pà implantat via mekaniska och kemiska procedurer (Lausmaa, 1996; Smith et al., 1991a; Smith et al., 1991b). Plasma-spraying, förstoftningsdeposition, oxidation, förängning, (grus, sand) blästring, polering, etsning, plasmarengöring och jonbombardemang är exempel pà tekniker som är tillgängliga för detta ändamäl.

Elektropolering är en elektrokemisk teknik som ofta använ- des för att uppnä en förbättrad ytfinish genom styrd upp- lösning av metallens ytlager. Det amorfa ytlagret som produceras genom maskinbearbetning av implantaten avlägs- nas. Efter elektropolering framträder en polykristallin yta med en ytoxid som består huvudsakligen av TiO2, typiskt 3-5 nm tjock som kan mätas med med röntgenstràlar arbetande fotoelektronisk spektroskopi (XPS), pä ytan (Lausmaa, 1996).

Anodoxidation är en elektrokemisk metod som användes för att öka tjockleken pà oxidlager pa metallimplantaten. En ström pàföres i en elektrolytisk cell, i vilken prov- stycket är anoden.__Dà en potential appliceras pà provstycket kommer strömmen att transportera syre som innehàller negativa joner genom elektrolyten och en kontinuerlig oxid bildas pà metallprovstycket.

Stokiometrin för eloxider pà titan är huvudsakligen TiO, Eloxiderna pä titan Winnehàller varierande strukturella särdrag sàsom porositet (Lausmaa, 1996). v alu 1 513 4814 För att karakterisera ytegenskaperna efter modifika- tionerna utnyttjades foljande tekniker; SEM och AFM for yttopografi och cgämnheten; ESCA och AES for ytsammansättning och oxidtjocklek.

Samverkan mellan titanytor och proteiner/celler/vävnader En genomgång av litteraturen visar att ytmodifikationer påverkar det biologiska gensvaret. Det forsta som händer då ett implantat insättes är "in vivo" exponeringen av materialytan för vatten och biomolekyler, inkluderande plasmaproteiner. Både under "in vitro" och "in vivo"- förhållanden är det känt att serumproteiner adsorberas till främmande materialytor inom sekunder. Adsorptions- och desorptions-fenomenen på olika biomaterialytor har studerats ingående. En arbetshypotes är att det biologiska gensvaret riktar sig mot den initiala protein-adsorptionen vilken därefter påverkar det cellulara-/vävnads-gensvaret och slutligen egenskaperna hos implantatet (Horbett, 1996).

Tre typer av adsorption-/desorption-mönster har beskrivits for metaller och deras oxider (Williams och Williams, 1988). Till. exempel har 'titan befunnits adsorbera lägre nivåer av albumin, vilken forblev låg under en 48-timmars period. Därtill kommer att albumin desorberar relativt lätt. Andra metallytor såsom vanadin uppvisade en initialt liten mängd albumin, men mängden. ökade och desorptionen var långsam. Guld befanns vara karakteristiskt for en yta med en hög initial adsorption av albumin och mängden ökade genom hela experimentet.

En modifikation och variation av ytegenskaperna och, de resulterande effekterna av molekyläradsorption till ytorna skulle kunnat ge viktiga insikter" i ytegenskapernas roll for biologiska reaktioner. Modifierade och karakteriserade 513 4815 ytor har använts för att detektera skillnader i beteendet och adsorptions-mönstren för proteiner (Mc Alarney et al., 1991; Mc Alarney et al., 1996; Nygren, 1996; Shelton et al., 1988; Sunny*and Sharma, 1990; Tengvall et al., 19921 Wälivaara et al., 1994; Walivaare et al., 1992). Shelton et al., (1988) fann att större mängd av proteiner adsorberades till negativt laddade polymerdroppar än till positivt laddade droppar, men ojämnheten pä ytan tycktes inte påverka protein-adsorptionen eller det cellulära beteendet. I allmänhet är ojämna ytor ansedda att bli mer fuktiga än jämna ytor vilket skulle kunna vara en effekt som förorsakas av en utökning av ytarean så väl som av en ökad vätbarhet for ytan (Curtis et al., 1983).

Nygren (1996) fann 'tvä olika reaktioner då vätbara och vattenavvisande 'titanytor exponerades för helt. blod. Pà den vattenavvisande ytan fanns vidhängande protoplasmiska skivor och fibrinogener närvarande medan komplementär faktor 1 (Cl) och protrombin/trombin fanns närvarande pà den vätbara. ytan. Baier et al. (1982) har gàtt igenom principerna för adhesiva fenomen i olika system och utpekat vätbarheten hos en yta som en viktig parameter som päverkar proteinadsorptions-mönstret.

Ytenergin i ett material päverkas av olika rengö- ringsprocedurer och oxidtjocklekarna. Enligt Sunny and Sharma (1990) ökar en ökning av oxidlagret pä aluminium hydrofobiteten för ytan, vilket resulterar i en ökad adsorption av fibrinogener. I anslutning härtill gör glimurladdningstekniken ytan mer vätbar, vilket förorsakar mindre fibrinogen-adsorption. Andra resultat uppnaddes emellertid av Wälivaara et al. (1994) som fann att titanoxidtjockleken och. kolinblandningen inte hade nagon päverkan pä protein-adsorption och kontaktaktivering.

Intressant var att ökade ytkoncentrationer av komplementära faktorn 13 (C3) korrelerades rmxi en växande 515 4816 filmtjocklek pà titandioxiden och/eller kristalliniteten.

Oxidkristalliniteten tycktes vara av större signifikans än oxidtjockleken (Mc Alarney et al., 1996). I en annan studie fann Mc Alarney (1991) att C3 adsorberades perifert pà korngränserna vilket skulle kunna förklaras av skillnaderna i ytenergin mellan korngränserna och massytan. Det är kant att titanoxidytor binder katjoner, speciellt polivalenta katjoner (Abe, 1982).

Oxidlagret är i högsta grad polärt och attraherar vatten och vattenlösliga molekyler. Kalciumjoner kan därför i allmänhet bli attraherade till oxidytan medelst elektrostatisk interaktion med syre (O). I en studie av Lausmaa et al. (1988), analyserades uppskattningsvis 100 prover som preparerats enligt kliniska procedurer med ESCA. Spektrat visade att flytan bestod huvudsakligen av TiO2. Kol och mindre mängder av N, Cl, Ca, S, P, Na och Si upptäcktes pà ytan men efter förstoftning avlägsnades alla nämnda komponenter bortsett fràn Ca som upptäcktes genom hela oxiden.

Det är av största intresse att första, pä en tidskala fràn omedelbara gensvar upp till är, hur materialegenskaper påverkar cellaktiviteten i gränsytan och vice versa sedan àtergàng, överflödiga ärrformationer/inkapslingar av fibrös vävnad och restitution av ursprunglig vävnad omfattande skulle kunna päverka utförandet pà implantatet.

I mjuka vävnader är en fibrös kapsel formerad kring implantatet (fenomen med särskiljning av nnterialet fràn den biologiska omgivningen) (Thomsen and Ericson, 1991). I ben kan inkapsling av implantat med fibrös vävnad uppträda, men det är inte obligatoriskt och i stället kan mineraliserade ben etablera direkt. kontakt med inplantatet, en process som benämns osseointegration (Brànemark et al., 1969). Fastän arbetet med cell- materialsamverkningar' har intensifierats under senare är 513 4817 är mekanismerna genom vilka materialegenskaperna påverkar biologiska reaktioner fortfarande inte klarställda.

Infastningen av vävnader till implantat "in vivo" är av komplex natur pà grund av att det i de flesta fall finns olika typer av involverade vävnader som kan uppföra sig olika pà olika ytor. Svaret fràn cellerna pà variationerna i topografin pà odlade substrat varierar för olika celltyper i likhet med macrofager (Rich and Harris, 1981; Salthouse, 1984), fibroblaster (van der Valk et al., 1983), periodontala celler (Cochran et al., 1994), epitelial-celler (Cheheroudi et al., 1889; Cheheroudi et al., 1990), osteoblaster (Bowers et al., 1992; Martin et al., 1995) och condrocyter (Schwartz et al., 1996).

Rich and Harris (1981) visade att makrofager ackumulerade företrädesvis pà mindre vätbarhet även pà ett grovgjort substrat. Murray et al., (1989) visade att dä makrofager vidhängde vätbara ytor PGE2 stimulerades frigivning jämfört med hydrofobiska ytor. Som tilläggseffekt konstaterades att ojämna ytor stimulerade benresorption i en större utsträckning än _jämna ytor. Fastän ojämnheten och ytenergin pà de olika ytorna inte kvantifierades indi- kerar detta att samverkan mellan makrofager och implantatytor orsakar frigörningsfaktorer som är högre än om cellerna är i suspension. Studier pá mänskliga monocyte-samverkningar med titanytor har visat att interleukin-1-frigörelsen av cellerna. blir modifierad av proteinadsorption och närvaron av materialpartiklar (Gretzer et al., 1996).

Intressant. härvidlag är latt. olika resultat. har uppnåtts med fibroblaster. Mänskliga fibroblaster bindes bättre till _jämna än till ojämna titanytor, (polerade med lpm diamantpasta _jämfört med det ojämnaj preparerad med 240 eller 600 grussilikonkarbidiskt metallografiskt papper) 513 4818 (Keller et al., 1989). Utbredningen av fibroblaster befanns bero pà den polärytfria energin (van der Walk et al., 1983) sedan àtminstone pä olika polymerytor en liten cellutbredning konstaterades pà lägpolära delar. Sukenick et al., (1990) modifierade titanytor med. olika kovalent fästa sjalv-sammansatta enkelskikt (fyra olika kemiska slutgrupper; CH¿ C=C; Br; Diol). Den neuroblastomatiska cellanslutningen till olika ytor var jämförbara men cellutbredningen var mindre uttalad pà de mest hydrofobiska ytorna (CH,och C=C).

Osteoblaster är känsliga för subtibla skillnader i ytgrovhet och ytkemi och gensvar pà ändrad ytkemi genom ändring av proliferation, extracellulär matrissyntes, och differentiering (Boyan et al., 1995). Osteoblaster uppvisade olika fenotyper dä de odlas pà rutila eller amorfa Tiüfywor, men med samma oxidtjocklek och grad av grovhet. Skillnader antogs därför vara hänförbara till kristalliseringen enbart (Boyan et al., 1995).

Osteoblaster har en intitialt större infästning till grova, sandblästrade titanytor med irregulär morfologi men genomsnittsgrovhetens (RQ parametrar förutsade inte cellinfästning och utbredning "in vitro" (Bowers et al., 1992).

Proliferation- och differentiation-parametrar i osteo- blast-liknande celler modifierades med växande celler pà 'titanplattor med en ökad grovhet (15-18 pm) (Martin et al., 1995). Intressant är att celler vid olika skeden av differentiation responderade olika till samma yta (Boyan et al., 1995; Schwartz et al., 1996).

En utgångspunkt för de flesta studier "in vitro" pà karaktären pà ytegenskaper for cellfunktioner är vidhängandet av celler till ytan pà odlingen. Den resulte- 513 4819 rande interaktionen mellan cellen och ytan, med eller utan adsorberade molekyler, är därför en fundamental och självklar del i det exprimentella upplägget. I anslutning härtill kan det även framhållas att egenskaperna på materialytan som stimulerande eller inhiberande faktorer på cellerna skulle kunna vara överbetonade i relation till andra potentiella och måhända lika viktiga modulations- faktorer som finns i lanslutning till celler' och ytor i komplexa biologiska situationer "in vivo".

Studier på titaninplantat i ben (Sennerby et al., 1993a; Sennerby et al., 1993b), indikerar att osteoblaster inte vidhaftar på implantatytor och att formering av ben inte blev initierad vid ytan. Denna observation föreslår' att studierna på interaktion mellan osteoblaster och titanytor "in vitro" är av mindre relevans.

Inte desto mindre kan studier "in vitro" där olika aspekter av den komplexa "in vivo"-situationen kan studeras i detalj vara av stort värde men det krävs att förhållandena "in 'vivo" övervägs då "in vitro"-systemet utformas.

Med utgångspunkt från de publicerade "in vitro"-studierna kan det fastslås att ytgrovheten verkar påverka cellprofilerationen ehuru olika beroende på graden av cellmognad. Skillnader i ytegenskaper kan påverka cellvidhäftningen och profilerationen fastän mekanismen inte är uppenbar. Det är även tydligt att olika celltyper är olika påverkade av ytegenskaperna. Emellertid finns det till dags dato få studier på effekten av modifierade titanytor på cellulärt beteende. En genomgång av litteraturen på "in vivo"-gensvaret för titanimplantat är därför lämplig. i f 513 4810 I allmänhet har cellvävnadslära, cellkemi- och immun- cellkemi-tekniker använts för bedömning av mjuka väv- nadsreaktioner. Beroende pà tekniska svårigheter att uppnà tunna sektioner av ett intakt metall-vävnadsgränssnitt har ultrastrukturen pà interface-vävnaden varit svär att studera (Ericson och Thomsen, 1995). Emellertid har för metaller i mjuka vävnader en elektropoleringsmetod med vilken bulkmetallen, men inte de tunna ytoxidlagret, avlägsnats (Bjursten, 1990), möjliggjort sådana studier.

Macrofagrerna spelar en väsentlig roll under läkningen av mjuk vävnad runt implantat. Svaret fràn den mjuka vävnaden pà titanimplantat pä ràttor beskrives av Thomsen och Ericson i (Brànemark. et. al., 1995). Ett. vätskesutrymme, som innefattar celler och proteiner fanns närvarande under den tidigare fasen (1- 2 veckor) efter inplaceringen av ett. titanimplantat i mjuka vävnader (Johansson et. al., 1992; Röstlund et al., 1990). Koncentrationen pà leukocyter och proportionen PMN i vätskeutrymmet minskade mellan 1 och 7 dagar (Eriksson el al., 1994). Efter 1 vecka vidhäftade majoriteten av inflammatoriska celler i vätskeutrymmet, företrädesvis monocyter och makrofager, till fibrinmatrisen vid gränsen mellan vätskeutrymmet och den reorganiserade vävnaden hellre än till implantatytan.

Efter 6 veckor hade vätskeutrymmet till större delen försvunnit och makrofagerna hade etablerat kontakt med implantatytan (Johansson et al., 1992; Röstlund et al., 1990). Makrofager konstituerar den mest allmänna celltyp vid titanytan och exhiberade olika fenotyper, såsom bedömda genom sin ultrastruktur (Johansson et al., 1992).

Immuncellkemiska observationer (Rosengren et al., 1993) visar att vätskeutrymmet runt ett titanimplantat 1 vecka efter implantationen innefattar albumin, komplementär- faktor C3c immunglobuliner, fibrinogen och fibronectin.

Albumin och C30 distribuerades i vätskeutrymmet och genom hela vävnadsutrymmet under den första veckan. Fibrinogen 513 481 11 och fibronectin samlokaliserades huvudsakligen vid gränsen mellan vätskeutrymmet och vävnaden och bildade således en provisorisk matris till vilken makrofager och fibroplaster vidhäftade.

Efter 6 och 12 veckor, detekterades ingen fibrinogen i den omgivande vävnaden, däremot upptäcktes strängar av fibronectin i den omgivande kapseln “(Rosengren et al., 1996). Collagen av typ I immunreaktivitet, som sammanfaller med collagen-sammansättningar i den omgivande vävnaden, uppvisade en distribution liknande den for fibronectin, och nådde fram i anslutning till titanytan, men var alltid separerad från denna med ett till flera lager av makrofager efter 12 veckor.

Den allmänna, sekvensen av cellulär migration och acku- mulation såväl som läckaget av plasma intill vävnaden i den omedelbara närheten av implantatytan har blivit observerad efter implantering av flera olika material, inkluderande metaller, i mjuka vävnader (Thomsen och Ericson, 1991). Vävnadssvaret runt nitrogen-jonsimplante- rade titanskivor isatta i den abdominala väggen på råttor var inte signifikant olik från den som observerades runt rena titanimplantat. Emellertid upptäcktes, efter 6 veckor en predominans av makrofager och multinukleära jätteceller kring de nitrit-jonsimplanterade skivorna (Rostlund et al., 1990). En jämförelse mellan titan och Ti6Al4V efter 1, 6 och 12 veckor i densamma råttabdominala väggmodellen avslöjade inte några skillnader med hänsyn till celltyper och antal i interfacet (Johansson et al., 1992). Dessutom hittade författaren inte någon skillnad i bredden for den fibrosa kapseln. Therin et al. (1990) visade liknande resultat vid jämförelse av kapseltjocklek för titan, TiO¿- belagd titan, Ti6A14V, lïík-belagd-Ti6A14V, TiN-belagd- Ti6A14V, Ti5A12.5Fe och rostfritt stål (316 L). 513 48112 I motsats till polymerer (Chehroudi et al., 1989; Chehroudi et al., 1990) är studier om mguka vävnader som har fokuserats pà de biologiska effekterna vid ändrad yttopografi och grovhet pà metallimplantat relativt fa.

Emellertid visades det i en extensiv ljusmikroskopsstudie avseende effekterna pä ytgrovleksvariationer hos titan och rostfritt stàl, (Ungersböck et al., 1994) att jämna implantat inducerade en tjockare ngukvävnadskapsyl med ett mellanliggande vätskeutrymme. I kontrast härtill, blev blästrade och eloxiderade titanplattor med relativt höga värden pà grovhetparametrar (Ra 0,75) omgivna av ett signifikant tunnare mjukvävnadslager utan ett kontinuerligt vätskeutrymme. Pä basis av dessa resultat är det svart att dra den slutsatsen att det existerar en enkel relation mellan ökad ytgrovhet och kapseltjockhet.

T.ex. hade Aláh-blästrade titanplattor med en än större ytgrovhet (Ra 1.5) en kapseltjocklek som var liknande den runt blästrade, eloxiderade titanprover. Vidare hade trum- lade titanplattor (Ra 0.15) en kapseltjocklek som var liknande den vid trumlat och eloxiderat _jamnt. titan (Ra 0.33). Skrovligheten mättes med en profilometer' och den elementära kompositionen av implantatytor rapporterades inte. Det är därför möjligt att ytkemikompositionen och/eller' skrovligheten pà submikrometernixëux skilde sig mellan proven. Studier pà effekterna hos olika yttopografier (jämna i förhållande till olika mikrotexturer mellan 1-10 p) för titanskivor implanterade i mjuka vävnader pà kaniner visade att collagen typ III immunreaktivitet detekterades i_ den fïbrösa kapseln runt flera material, men att .collagen typ I blev positivt belagd endast. i kapslar runt ititan (von Recum et al., 1993).

I allmänhet indikerar de exprementella studierna i nUuka vävnader att metaller blir omgivna av en fibrös kapsyl med 513 48113 makrofager lokaliserade närmast intill ytan, och således separerande fibroblaster frän ytan. Hitintills finns det fä tillgängliga morfologiska data pä interface-strukturen runt titanytsmodifikationer. Det är fbrtfarande en öppen fråga hur materialytegenskaperna paverkar proteinad- sorptionen under "in vivo"-förhållanden och hur ytegen- skaperna pàverkar cellerna närmast ytan. Dessutom är det inte klargjort hur kompositionen och strukturen av den omgivande fibrösa kapseln päverkas av materialets yt- macrofaginteraktionert Det; är ctroligt. att. flera 'tillkom- mande faktorer mäste övervägas, inkluderande urlakning av metalljoner, belastningsförhallanden och mikrorörelser mellan implantatytan och vävnaden.

Censvaret fràn benet pà en skada är regeneration följd av remodellering av det pä nytt formade benet i riktningen för' päverkningarnai Analogt. förväntas, när' ett. implantat insättes i benet, att en liknande kaskad av händelser uppkommer inkluderande rekrytering av mesencymala celler till det skadade stället, deras differentiation till osteoblaster, synteser, för ostoider, och klargörande av den extra cellulära matrisen. De mesencymala progenitorcellerna är flerpotenta och kan differentiera sig till osteoblaster, condrocyter, muskelceller och fettceller (Caplan och Boyan, 1994). Sträckan för differentiation av de mecencymala cellerna liksom regenerationen av benet runt ett implantat är mest troligt beroende av en kombination av faktorer inkluderande graden av trauma, lokala och" systemrelaterade faktorer liksom implantategenskaper och stabilitet.

I det. följande skall lämnas en kort, sammanställning pà tidigare arbete pä samverkan mellan metallimplantat och ben. Utförandet av icke-metallimplantat àterges pä annat ställe (de Groot et al., 1994). 515 481,, Studier jämförande utformningen pä olika implantat av metaller inkluderande Vitallium®, niobium, titan, titanlegering, rostfritt. stal (Johansson et al., 1991), och zirconium (Albrektsson et al., 1985; Johansson et al., 1994) i ben avslöjade inte nägra större kvalitativa skillnader. De gängade titanimplantaten befanns i allmänhet vara i kontakt med mer mineraliserat ben än de andra 'typerna av rnetall. Mekanismerna för detta. är inte klarlagda och inte heller vet man varför egenskaper hos titan har fördelar vid biologiska applikationer _jämfört andra. metaller, inkluderande de nämnda i det. periodiska systemet. Det goda biologiska utförandet. med titan har tillskrivits titanoxidlagret som täcker ytan, men ingen övertygande bevisning för denna åsikt har presenterats.

Flera studier har indikerat att en ökad grovhet pa implantatytor (inom ett visst omráde) förbättrar det biomekaniska genomförandet för implantat. Benresponsen visar emellertid sällan skillnader eftersom nägra studier indikerar en ökad benimplantatkontakt med ökad ytgrovhet (Buser et al., 1990; Goldberg et al., 1995; Gotfredsen et al., 1995). Flera studier avslöjar inte nàgon sàdan korrelation (Carlsson et al., 1988; Gotfredsen et al., 1992, Thomas och Cook, 1985; Thomas et al., 1985; Thomas et al., 1987; Wennerberg, 1996; Wilke et al., 1990; Wong et al., 1995). Brànemark, (1996) utförde en korrelation mellan morfologiska parametrar och osseointegration av gängade titanimplantat och olika biomekaniska tester och kom fram till att utdragningstester huvudsakligen aterger mekaniken pà omgivande ben medan vridmotstàndsprov vid borttagning àterger skärkrafterna som leder till plastiska deformationer i benimplantatsgränssnittet. Biomekaniska tester som utföres pà implantat med en grov yta (pà mikrometerniva) som insättes i ben återger möjligen huvud- sakligen benmaterialets mekaniska interaktion (läsning) fastän det inte kan uteslutas att skillnader i strukturen 513 4§51 pà interfacet som inte löses med ljusmikroskopi är av vikt.

Med användandet av en djurmodell liknande den som användes i den innevarande studien av Sennerby et al (1993b), studerades bengensvaret 3-180 dagar efter insättningen av skruvformade titanimplantat. Under 3 dagar migrerades messencymala celler i skadeomràdet runt implantatet.

Implantatytan blev temporärt *täckt. av multinukleära jätteceller som försvann med tiden och dä ben-titan- kontakten ökade. Det nyformade benet sträckte sig frän den endosteala ytan mot implantatet och formades även som öar inom implantatgängorna.

Med tiden sammansmälte de tva typerna av nytt bildat ben.

Gängorna som fràn början sköt in i den spiralformade urtagningen fylldes efter hand med ben som mognade genom remodellering. Formation av nytt ben direkt vid titanytan observerades inte vid nagot tidsintervall.

Endast ett begränsat antal studier pà ultrastrukturen hos vävnad i ben-metallinterface finns tillgängliga. Detta kan måhända reflekteraf det faktum att preparationen av interfacevävnad för analys. genom transmitterad elektron- mikroskopi TEM är tekniskt krävande, speciellt. dä avkalkningssteget uteslutes.

Albrektsson et al (1982) introducerade polykarbonat- pluggar med ett tunt lager av föràngad metall som en modell för metallimplantat. Pluggarna implanterades i. en kanins tibia. TEM pà partiellt avkalkade prover visade närvaro (efter 3 månader) av collagen-knippen nära intill titanimplantatet men de sista 100-500 nm närmast implantatet. innefattade slumpvis arrangerade fibrer. Ett -40 nm tjockt lager av partiellt kalciumartad amorfsubstans, som föreslogs bestà av proteoglycans, 513 481,6 konstaterades vara i kontakt med implantatytan. En gradient av minskande mineralisering mot implantatytan beskrevs även. I kontrast. härtill upptäcktes ett. större antal makrofager och osteocyter i anslutning till guldbelagda pluggart I senare studier' son1 baseras pà. en teknik med plastisk plugg, har andra metallbeläggningar inkluderande zirconium jämförts med titan (Albrektsson och Hansson, 1986; Albrektsson et al., 1985).

Linder" el al., (1989) studerade interface-morfologirx hos plomber av titan. Ultrastrukturella observationer i kanin- corticalben (11 månaders observationsperiod) intill titan, Tivaniumêh VitalliumCL och rostfritt stàl avslöjade en oförutsägbar variation i gränssnittets ultrastruktur inom 500-1000 nm för alla metallytor. Tre huvudtyper av inter- facestruktur upptäcktes; a) Mer eller mindre reguljärt arrangerade sönderspaltningar av collagen, med de longitu- dinella korsbanden (mn 68 1¶n typiska för ttyp-I-collagen, närmande sig metallytan till inom 50 nm; b) Typ-I-colla- genfibriller separerade frän implantatet genom en zon av odistinkta strukturer, men med nagot fiberaktigt material, i de flesta fall omkring 500 nm i tjocklek, men ibland upp till 1000 nm; c) Typ-I-collagsfibriller separerade fràn implantatet av en 500-600 nm zon av tunna fiberaktiga strukturer, klart mer täta än i fallet enligt b. Det fanns inget strukturellt särdrag som specificerades för ett speciellt material (Linder et al., (1989).

Sennerby et al., (1992) undersökte interfacemorfologin för titanimplantat insatta i en kanins tibia under 12 mànader och fann mineraliserat ben existera mycket nära implantatsytan utan nàgon uppenbar minskningsgradient för koncentrationen av benmineral mot implantatytan. Ett tunt lager av amorft icke-mineraliserat material (100-200 nm tjockt) var närvarande perifert till det. mineraliserade benetu I anslutning härtill synligt när ndneralisationen 513 4811, var låg, upptäcktes en omkring 100 nm bred elektrontät tunnlagerbegränsning som bildade gränsen mellan mineraliserat ben och det amorfa lagret. Denna tunnväggiga begränsning kunde ofta ses i direkt kontinuitet med tunnväggsbegränsningar som skiljer osteocytkanalisering eller separerar ben av olika mineraliseringsgrader.

Steflik studerade interfacemorfologin vid olika typer av implantat i hundkäke och använde TEM och hög spännings-TEM och fann en omkring 50 nm bred elektrontät deposition vid implantatytan (Steflik et. al., 1992 a; Steflik et al., 1992 b). Inga skillnader sägs mellan belastade och obelastade implantat (Steflik et al., 1993).

Nanci et al., (1994) studerade vävnadsresponsen pà titanimplantat som sattes in under 1 dag till 5 mànader i tibian och femur pà råttor. Morfologin pà inter- facevävnaden varierade. För det mesta bestod gränssnittet mellan ben och titanimplantat av ett tunt, elektrontatt lager. Detta interfacelager upptäcktes bàde intill mineraliserat ben och omineraliserat collagen. Vid immuncytokemiska tekniker, visade det sig att det elektrontäta lagret som beskrivs som tunnväggsbegräsningar var immunreaktiva for osteopontin. Cementerade linjer i det omgivande benet, ofta i kontinuitet med tunnvaggsbegränsningarna vid implantatytan, visade liknande immunreaktivitet for osteopontin. Osteocalcin, fibronectin, och albumin visade ingen framträdande ackumulation vid gränssnittet. I en nyligen gjord studie av Mc Kee och Nanci, (1996) föreslås att osteopontin- funktioner som en medlare for cell-matris och matris- matris/mineral-vidhäftning under formatering, förändring och reparation av mineraliserad vävnad.

En genomgång av litteraturen av den mjuka vävnadens gensvar pà titanimplantan är viktig eftersom en penetre- 513 481,8 ring genom skinn och mucoösa membran är nödvändig för att tillata infästning av yttre protetiska applikationer (dvs tänder och epiteser). Intresset har fokuserats pä villkoren för en adekvat anpassning av den nguka vävnaden till det penetrerande elementet. Empiriskt har det visat sig att en noggrann kirurgisk teknik med minimal rörelse vid gränssnittet. genom en tät. vidhäftning av den mjuka vävnaden till det underliggande benet. kan ge adekvata förhållanden för kliniska percutana och permucosala imp1antat/förankringsenheter.

I studier av relationen mellan titanytor och epitelium och anslutbara vävnader har större delen av observationerna pä människor blivit utförda i prov frän den orala kaviteten (Sanz et al., 1991; Seymour et al., 1989; Tonetti et al., 1993) och fràn den craniofaciala regionen (hörhjälpmedel med benkonduktivitet) studerad i (Holgers 1994). I en ljusmikroskop och ultrastrukturell studie av orala implantat (Sanz et al., 1991) visade sig de inflammatoriska infiltrationerna vara sar i den icke- infekterade periimplantatvävnaden. När gingivitis emellertid observerades var de inflammatoriska infiltrationerna större, dominerade av de mononuklenära cellerna och plasmacellerna. (Seymour et al., 1989) karakteriserade mucosan runt. Brànemarks osseointegrerade titanimplantat. Proverna erhälls fràn frisk mucosa eller med kliniska tecken pà inflammation (gingivites).

Författaren rapporterade närvaron av inflammationer i bada situationerna (frisk gingiva eller gingivitis) men fann större inflammatoriska infiltrationer och högre cellantal när kliniska tecken pä gingivitis var närvarande.

Författaren drog den slutsatsen att mucosal reaktion var ett stabilt och väl kontrollerat svar. Liknande upptäckter rapporterades kring kliniskt fhngerande benförankrade percutana implantat (Holgers, 1994), som föreslog att en 515 481.9 immulogisk kompensation för förlusten av barriärfunktion föreligger vid implantat med kliniskt irriterat skinn.

Relationen epiteliala celler och ytan pä implantat säväl som de gängse observationerna pà epiteliala nedsänkningar har antagits spela en viktig roll för funktionen hos implantat, bade i orala. och percutana applikationer. I kontrast till observationerna pa dentala implantat (Listgarten och Lai, 19975; Schröder et al., 1981) sägs ingen nära kontakt mellan epitelium/collagenous-vävnad och ytan pä percutana titanimplantat (Holgers et al, 1995).

Som slutsats indikerar dessa observationer att maskin- tillverkade tfitanimplantat i nguka vävnader pà människor omges av inflammatoriska celler som verkar att åstadkomma en skyddsbarriär som skulle kunna kompensera för en icke- optimal epitelial barriär.

Analys pà ett àtervunnet osseointegrerat kliniskt titanimplantat (3 manader) (Lausmaa, J. 1988) avslöjar en ökad oxidtjocklek (med en faktor 2-3) jämfört med ett icke implanterat prov. En liknande "in vivo" oxidtillväxt har rapporterats tidigare. Genom användning av Auger elektronspectroskop, Mc Queen et al., (1982) observerades det att efter 6 är i ett mänskligt käkben det ursprungliga 50 Å tjocka oxidlagret pà titanimplantatsytorna hade ökat till ett 2000 Å tjockt oxidlager.

Sundgren et al. (1986) undersökte gränssnittet. för ben- titan och ben-rostfritt stal i människokroppen och kom fram till att bade tjockleken och uppbyggnaden av oxidlagren pä implantaten hade ändrats under tiden för implantation. Beroende pà lokaliseringen, kvarblev tjockleken opàverkad (cortical-ben) eller ökade 3-4 ganger (ben-marrow). I bàda fallen infördes Ca och P i oxiderna. 515 4s¿O För titanimplantaten uppträdde oxidationsprocessen over en längre tidsperiod (flera är).

I en ljusmikroskopstudie av Sennerby et al. (1991), analyserades sju kliniskt stabila (1-16 är) osseointeg- rerade dentala implantat morfometriskt. Den större delen av implantaten var ii kontakt med mineraliserat ben (56- 85%), oavsett observationsperioden. Carlsson et al. (1994) uppskattade vävnaden runt implantat med olika skrovligheter och insatta experimentellt i inflammerade knän. Blästrad titan och hydroxyapatit-belagda implantat kom i kontakt med ben varigenom jämna titanimplantat ofta omgavs av fibrös vävnad.

Sennerby et al. (1991) undersökte strukturen pà gräns- snitten omkring sju kliniskt stabila dentala implantat (1- 16 är) genom morfometri. I omräden med mineraliserat ben nära titanytan observerades ett icke-mineraliserat amorft lager. En elektron tunnväggsbegränsningsliknande linje observerades mellan det mineraliserade benet och den 100- 400 nm breda amorfa zonen.

Ultrastrukturella observationer utfördes pä metallen-benet vid gränssnittet för implantat insatta i tibia pà patien- ter med artrosis och reumatisk artritis (7-20 mänader) (Serre et. al., 1994). Implantaten hvar alla skruvformade och av rent titan bestående implantat och de var samtliga "osseointegrerade". Ingen skillnad mellan ultrastrukturen pà gränssnittet mellan normalt ben och implantat jämfört med gränssnittet för artrotic och artrific ben observerades. Heterogeniteten i gränssnitten kunde också bekräftas i denna studie fastän den 100-400 nm breda amorfa zonen, rapporterad av Sennerby et al. (1991), icke förelag. 513 48121 I en ultrastrukturell studie av gränssnittet av ett plasma-sprayat dentalimplantat av titan insatt i en människa (ITI), (flemmerle och Vogel, 1996), noterades tva olika. interferella. strukturer. Bàde benkristallerna upp- komna pä implantatytan och en granular elektron-tät substans anbringad mellan den plasma-sprayade belaggningen och benet. observerades. Roher“ et. al., (1995) undersökte icke-avkalkade histologiska sektioner frän 12 ossiointe- grerade med titanplasmaspray-belagda (TPS) och TPS-behand- lade med hydroxyapatit använda implantat (IMTEC) fràn en patient. Samtliga implantat blev framgångsrika och stabila efter 1 är när proven àtervanns. Bàda implantattyperna användes med samma framgång och inga morfologiska diffe- renser observerades mellan de tva implantattyperna.

Avsikten med föreliggande uppfinning är att àstadkomma en hög grad av ben-till-implantatkontakt. hos ett titanimplantat medelst en ytmodifiering i enlighet med patentkravets 1 kännetecknande del.

Uppfinningen baseras pà en omfattande experimentiell studie som Lnnyttjar olika modifierade titanytor. I det följande summeras de experimentiella procedurerna.

Detaljer kan framgå i en avhandling, (C.LarssonI The Interface between bone and metals with different surface properties) inkluderande följande rapporter; ~ I. C. Larsson, P. Thomsen, J. Lausmaa, M.. Rodahl, B.

Kasemo och L. E. Ericson. Bengensvar till ytmodi- fierade titanimplantat. Studier pà elektropolerade implantat med olika oxidtjocklekar och morfologi.

Biomaterial 1994 (15) 13, 1062-1074.

II. C. Larsson, P. Thomsen, B-O Aronsson, M. Rodahl, J.

Lausmaa, B. Kasemo och L.E. Ericsson. Bengensvar pä ytmodifierade titanimplantat” Studier pà det tidiga 515 48122 vavnadssvaret till maskinbearbetade och elektropole~ rade implantat med olika oxidtjocklekar. Biomaterial 1996 (17) 6, 605-616.

III. C. Larsson, P. Thomsen och L.E. Ericson. Ultrastruk- turen pà interface-zonen mellan ben och ytmodifierad titan (i manuskript).

IV. C. Larsson, P. Thomsen, B-O Aronsson, M. Rodahl, J.

Lausmaa, B. Kasemo och L.E. Ericson. Bengensvar till ytmodifierade titanimplantat. Studier pà vav- nadsgensvaret efter 1 år itill maskinbearbetade och elektropolerade implantat med olika tjocklekar.

Journal of Materials Science: Materials in Medicine, submitted.

V. C. Larsson, P. Thomsen, J. Lausmaa, P. Tengvall, B.

Walivaara, M. Rodahl, B. Kasemo och L.E. Ericson.

Bengensvar till ytmodifierade titanimplantat. Studier pà tidigt vavnadssvar till olika ytkarakteristiker (i manuskript).

Gängade skruvformade implantat tillverkades med maskin- bearbetning avi ren titan (grad I, 99,7%) (Permascand, Ljungaverk, Sverige).

Implantatytorna. modifierades med olika preparations- tekniker (summerade i tabell I nedan). Samtliga implantat har en längd av 4 mm och en diameter av 3,75 mm.

Cirkulara, skivformade implantat (diameter 10 mm, tjocklek 1,8 mm), tillverkades med maskinbearbetning fràn en titanstàng (99,7%) (Permascand, LJungaverk, Sverige).

Dessa implantat användes för studier pà protein-adsorption "in vitro" och inflammation i mjuka vävnader. 513 48213 Teknikerna för' preparation cxíu ytmodifikation av de tre typerna av implantat (maskinbearbetad, elektropolerad, och elektropolerad plus eloxidering) användes i de tillhörande experimenten a) och b) som de beskrives i detalj i tabellerna I och Il nedan.

Under elektropolerings-tekniken användes provet som en anod i en elektrokemisk cell. Genom att variera elektrolytsammansättningen och processparametrarna (temperatur, spänning och ström) i cellen kan olika ytbe- handlingar utföras, inkluderande elektrokemisk polering (elektropolering) och anodisk oxidation (eloxidering).

Elektropolerings-tekniken, som fungerar som en styrd elektrokemisk upplösning av ytan (Landolt, 1987), utfördes vid 22,5 \7 i en elektrolyt bestäende av en blandning av 540-600 ml metanol, 350 ml butanol och 60 ml perklorsyra med en fastställd temperatur pà -30%) Varje prov polerades i 5 minuter, vilket bedöms vara tillräckligt för att avlagsna mindre än 100 pm av material frán ytan.

Elektropoleringsproceduren utfördes för att pwoducera en jämn, spegellik ytfinish. Den har även effekten att avlägsna plastiskt deformerade amorfa ytlager som resulterar frän maskinbearbetning av materialet. Efter elektropolering sköljdes proven noggrant i metanol för att avlägsna elektrolytrester.

Anodisk oxidation (eloxidering) (Ross, 1975) utfördes vid 80 V i en elektrolyt med M ättikssur syra i rums- temperatur. Denna procedur producerade en ljus, gràaktig och purpurfärgad färgsättning pä ytan, beroende pà att ljusinterferens utbildades i den tjocka oxiden. Det är väl etablerat att anodisk oxidtjocklek är linjär beroende pà den applicerade spänningen, med en växande konstant a z 2- 3 nm/V för titan, beroende pà experimentella förhållanden. 513 481 24 De anodiserade proven skoljdes noggrant i avjoniserat vatten följt av skoljning i etanol.

Scanning Auger Elektronspektroskopi (AES; Perkin-Elmer PHI 660, Eden Prairie, USA) användes for att. analysera den ytelementära sammansättningen. Oxidtjockleken uppskattades frän AES-djupprofilanalys. Åtminstone tvà olika fläckar (diameter 100 pm), lokaliserade vid eæi gängade delen av provet, analyserades. Djupprofiler erholls vid 2 punkter (diameter 10 pm).

AES oversiktsspektra erholls fràn tva områden med diameter 200 pm pa ett prov av skivformade, maskinbearbetade, elektropolerade och elektropolerade och eloxiderade titanimplantat.

Skannande elektronmikroskopi (SEM; JEOL JSM-T-300, och Zeiss DSM 982 Genini) användes för att erhàlla en översiktsbild av yttopografin. Atomär kraftmikroskopi (AFM; Nanoscope III, Digital Instruments, USA) användes for en mer detaljerad karakterisering av yttopografin och grovheten. Ytgrovheten (Rmj och ytareaforstoring (Amñ) räknades fram genom användning av dataprogram for AFM- instrumentet.

Kontaktvinklarna. mättes med användning av Ramé-Hart goniometer, modell 100. Framätgàende och bortledande kon- taktvinklar bestämdes för titan (kontroll), elektropo- lerade och elektropolerade plus eloxiderade prover, bade med Millipore filtrerat vatten och med metylen¿jodid. En droppe (5 pl) av vätskan placerades pä tre olika ställen pà varje prov. Bàde hogra och vänstra vinklarna pa droppen uppskattades och genomsnittsvärdena beräknades. Proven rengjordes (i anslutning till de konventionella rengöringsstegen med trikloretylen, acetone och etanol) med 95% etanol och lufttorkad inom 30 minuter fore analys. 513 48215 Ytenergin beräknades och föredragna värden pà ytspänning för 'vatskorna i. rumstemperatur' (Wu, 1982), användes för vatten och metylen-jodid.

Implantaten rengjordes ultrasoniskt. i trikloretylen; aceton; och metanol. Efter ytmodifiering (elektropolering och/eller eloxidering), utsattes alla implantaten för ett slutligt ultrasoniskt rengöringssteg i etanol (70%).

Slutligen blev implantaten antingen autoklaverade i 120°C i minuter eller y-bestràlade vid 28.9 kGy i 25 timmar vid °C. De väteperoxid-behandlade implantaten behandlades vid mM Hßk i 40 timmar vid 8°C efter den ultrasoniska ren- göringsproceduren. Ingen tillhörande sterilisering utför- des.

De skivformade implantaten rengjordes ultrasoniskt i trikloretylen; aceton; etanol. Efter ytmodifiering (elektropolering och/eller eloxidering), utsattes samtliga implantat för ett slutligt ultrasonsikt rengöringssteg i etanol.

Rätt-plasma erhölls frän tvà ràttor och användes i experimenten med protein-adsorption.

Femton Sprague-Dawley-rättor, som vägde omkring 250 gram, användes íïn“ att studera cellrekrytering (N31 vidhäftning till titanytor i mjuka vävnader.

Kirurgin utfördes enligt procedurerna som beskrivits tidigare, (rapporterna I-V) och inplantationen utfördes bilateralt i de närbelägna tibial-benen. Efter genomträng- ning genom skinn och periosteum, lyftes en flik för att exponera benarean. Varje djur mottog således ett implantat av varje typ. 513 481 26 Efter det. att. djuret. dödats avlägsnades implantaten och omgivande vävnad "en bloc", dessutom nedsänkt i glutaraldehyd över natten och därefter* postfixerad i 1% osmium tetroxide, i tva timmar. Efter avhydratisering bäddades de oavkalkade proverna in i LR White® (The London Resin Co Ltd, Hampshire, England).

I studier av protein adsorption "in vitro" uppsamlades, separerades (SDS-PAGE) och visualiserades (Western blot) ytadsorberade proteiner. I korthet placerades skivorna i 99,5% etanol, bearbetades ultrasoniskt i 99,5% etanol, tvättades tre gànger och fick sedan ligga i 99,5% etanol fram till användningen. Före inkubation med proteiner, placerades proverna i sneril-filtrerad HBSS med kalcium.

Rätt-plasma inkuberades pà tre ytor av varje slag (maskinbearbetad, elektropolerad och elektropolerad plus eloxiderad titan) under 1 minut vid 37°C. Därefter sköljdes de löst vidhängande proteinerna bort och de ytadsorberade proteinerna avlägsnades med renande SDS (2%) tillsammans med enzym-inhiberande medel. Den totala mängden av samlade proteiner analyserades med BCA "Protein Assay Reagent" (Pierce, USA) som använder spektrometri (562 nm) och med rätt-albumin som standard. GEL-elektrofores med förblandad Tris-glycine (4-15%), gradient acryl amide geler (BioRad, Minibrodean II), genomfördes för att separera proteinerna.

Efter separationerna överfördes proteinerna till nitrocellulära membran (70 V, 3 timmar, Tris-glycin-SDS- buffer) följt av blockering av ospecificerad antikropp som bunden genom inkubation i 3% gelatin i Tris-NaCl-buffert, pH 7,5. För att detektera specifika proteiner pa membranet utfördes 3 inkubationssteg (60 minuter, rumstemperatur) i Tris-NaCl-Tween-buffer.

Det primära steget inkluderade kanin-anti-rättfibronectin (FN), get-anti-rattfibrinogen (fraktion 1) (FBN; fàr-anti- ratt-albumin (ALB); fàr-anti-ràtt-immunoglobulin (Ä (IgG). 515 481 27 Det andra steget inkluderade biotinylerad àsne-anti-fär IgG; biotinylerad get-anti-kanin IgG och det tertiära steget innefattade streptavedin förbundet med alkalisk fosfat. i Tris-NaCl-Tween (TTBS)-buffer. Visualisering av de etiketterade proteinerna (proven och standard) utfördes genom inkubation i BCIP/NPT.

Implanteringen av implantat i nguk vävnad utfördes enligt de tidigare beskrivna. procedurerna (Lindblad M. et al., 1997). I korthet sövdes 15 Sprague-Dawley-ràttor som vägde omkring 250 gram, med en i.p. injektion (0,1 ml/100 g b.wt ) med en 12112 lösning av natriumpentobarbital (Apoteksbolaget, Sverige; 60 mg/ml), 0,9% saltlösning och diazepam (Apozepam®, Apothekarnes Laboratorium AS, Norge; mg/ml).

Rättorna rakades pà ryggen och rengjordes med 2% Jodopax® i etanol. Snitt, omkring 15 mm lànga och 10 mm isär, utfördes i ryggens skinn utefter mittlinjen. Subkutana fickor formades medelst trubbig dissekering och implantatskivor placerades i fickorna med hjälp av ett par titankniptänger. I sex rattor utfördes tre snitt längs varje sida om mittlinjen. Dessa råttor mottog tva av varje typ av implantat; ett av dessa tvä implantat sköljdes i steriliserings-HBSS-bufferten (Hanks balanserade saltlösning med CaCl¿ 2,9 g/l, pH 7,4) varefter det andra implantatet. sköljdes ii steril saltlösning. De andra nio ràttorna mottog tre implantat, ett av' varje typ, vilka sköljdes i saltlösning före inplaceringen. Skinnet tillslöts med icke-àterabsorberbar sutur. Efter 1 (n=6), 3 (n=6) ocrx 7 (n=3) dagar rengjordes skinnet. pà ryggsidan hos bedövade ràttor och rättorna dödades med en i.p. överdos av pentobarbital. Suturerna avlägsnades och sárytorna drogs försiktigt isär med kniptängerna.

Implantatet avlägsnades och placerades i en steril polystyren vavnadsodlingsskàl, innefattande 500 ;U_ steril 51328481 HBSS (med kalcium) och förvarad pä is. Det kvarvarande innehállet (utsvettningen) av kaviteten samlades med sköljning, genom användandet av upprepade aspirationer (5 gånger) av 500 pl (total volym) steril HBSS (med kalcium).

Varje ätervunnen exudering (utsvettning) förvarades pä is tills bestämningen av cellräkning och celltyper.

Exuderingen färgades med Türk-lösning och proportionen pä olika celltyper bestämdes. Det totala medelvärdet pä antalet celler som fanns i exuderingen beräknades frän sex (1 och 3 dagar) och tre (7 dagar) ràttor per tidsperiod och de procentuella medelvärdena pà olika celltyper beräknades pä samma sätt.

Bestämningen av mängden av DNA associerad med implan- tatytorna utfördes med en fluorescens-provare (Labarca C.

Och Paigin K. 1980). I korthet. placerades, efter äter- vinningsproceduren, varje implantat i 500 pl 5 >< 102 M saltaktig fosfat~buffer med 2 x 108 M EDTA och 2 M NaCl.

Därefter nedfrystes implantaten vid -20°C. Efter upptining och ultrasonisk behandling av cellerna pà implantaten (omkring 15 sekunder vid varje sida av implantatet), tillfördes 200 pl av lösningen till 5 x 101 M saltaktig fosfat-buffer med 2 M NaCl komplementerad med 1 pg ml” av flourescensmarkeringen Hoechst 33258 (Sigma, USA) vid rumstemperatur (15-30 minuter). Proven mättes i en luminescens-spektrometer med excitiations- och emissions- våglängder pä 360 respektive 450 nm. Den totala mängden av DNA bestämdes ur standardkurvor (0,025-2,5 pg DNA per ml).

Det totala medelvärdet av DNA-mängden associerad med implantatytorna beräknades frän sex (1 och 13 dagar) och tre (7 dagar) ràttor per tidsperiod.

Bassektioner med 10-15 pm tjocklek preparerades frán implantat-/ben-proverna (Donath och Breuner, 1982), och undersöktes, med användning av en Leitz Microvid-utrust- 5132¿s1 ning ansluten till en persondator. Mätningar utfördes direkt i mikroskopet. Kontakt-förhållandet mellan implan- tatytan och benvävnaden beräknades. Pa liknande sätt beräknades proportionen av' benvävnad inom gängorna längs implantatet. Värdena är angivna som procent ben i direkt kontakt med implantatet (refererat till säsom ben-kontakt) och procent av den totala arean inom gängorna som upptages av xnineraliserat. ben (refererat. till son: benarea). Alla fem konsekutiva gängorna (med nummer 1 och 2 lokaliserade i kortex) beräknades. I ettàrsstudien blev värdena för de 3 bästa konsekutiva gängorna även presenterade. Det genom- snittliga värdet för respektive implantattyp vid respek- tive tidsperiod beräknades och jämfördes. Efter polymeri- sationen blev inbäddade implantat delade longitudinellt medelst sågning. Ena halvan användes för att preparera grundsektionerna. (Donath cxüi Breuner, 1982) sonl användes för morfometrisk analys (rapporterna I-II, IV-V) som beskrives i ovan. Den andra halvan användes för prepara- tionen av sektioner för ljus- och elektronmikroskopi (rapporterna I, IV). Implantatet separerädes noggrant frän den plastiskt inbäddade vävnaden (Sennerby et al., 1992; Thomsen och Ericson, 1985). Kaviteten som formats efter implantatavlägsnandet fylldes med plastisk harts och poly- meriserades innan sektionerna. för' LM (aproximativt. 1 pm tjock) blev snittade med glasknivar. I dessa sektioner valdes lämpliga omráden för ultramikrotomi. Ultratunna sektioner kontrastade med uranyl acetat och blycitrat undersöktes i Philips EM 400 eller Zeiss CEM 902 elektron- mikroskop.

I det följande skall uppfinningen närmare beskrivas i anslutning till nedanstående tabeller och med hänvisning till figurerna 1 - 6, varvid figur 1 visar elektronmikroskopbilder av implantat med olika ytbehandling, 5133481 figur 2 visar AFM-bilder av implantat med olika ytbehandling, figur 3 visar det totala antalet celler i exudater runt implantat med olika ytbehandling, figur 4 visar DNA-innehåll pä implantat med olika ytbehandling. figur 5 visar genomsnittlig benkontakt för implantat med olika ytbehandling, och figur 6 visar morfometri för implantat med olika ytbehandling.

En sammanfattning av resultaten fràn _ytkarakteristikerna pà de olika proven (rapporterna I-V) presenteras i tabell I.

Maskinbearbetad (kontroll), elektropolerad, elektropolerad plus eloxiderad (21 nm tjock oxid) och elektropolerad plus eloxiderad (180 nm tjock oxid) användes i rapporterna I och III. De maskinbearbetade titanimplantaten (kontroll) hade typiska bearbetningsspär* pà 1-10 um. De elektropolerade implantaten hade en mycket jämn, spegel- liknande yta utan nägra framträdande ytsärdrag varken vid liten eller hög förstoring. De eloxiderade (21 nm) proven syntes också _jämna. medan den eloxiderade (180 nm) hade porösa regioner oregelbundet distribuerade över den jämna ytan vilket gjorde implantatytans grovhet heterogen (pä 1 um-skala). Km-värdena som erhålles genom AFM presenteras i tabell I.

Maskinbearbetad (kontroll), maskinbearbetad plus eloxiderad (180 nm tjock oxid) elektropolerad, och 513 48131 elektropolerad plus eloxiderad (180 nm tjock oxid) användes i rapporterna I och III.

De maskinbearbetade (kontroll) och maskinbearbetade plus eloxiderade ytorna hade liknande ytutseende med typiska bearbetningsspär pà. 1-10 pm. Den maskinbearbetade plus eloxiderade ytan visade även en ytterligare, oregelbunden ytgrovhet pà submikronivà. Den elektropolerade ytan syntes mycket _jämn medan den elektropolerade plus eloxiderade ytan presenterade en heterogen yta med oregelbundenheter distribuerade i form av jämna och grova (10-100 um stora) områden. Inga maskinbearbetningsspär var synliga pà ytorna pä de tvà grupperna av implantat som hade blivit elektropolerade. Rm;värdena som erholls med AFM presente- ras i tabell I. SEM-bilder visas i figuren 1 (elektropolerade + eloxiderade implantat, a-c; maskinbearbetade -+ eloxiderade implantat, d). AFM-bilder visas i figuren 2 (elektropolerade + eloxiderade implan- tat, a= grov del, b= jämn del; maskinbearbetat + eloxide- rat implantat, C).

Rapport V I denna rapport. användes maskinbearbetade, med glimurladdning renade och termiskt oxiderade, med glimurladdning renade och nitrerade och med väteperoxid behandlade implantat.

Den maskinbearbetande (kontroll) ytan hade de karakte- ristiska spàren, 1-10 pm breda, som beskrivits ovan. De tva grupperna som blev plasma-renade och därefter oxiderade och respektive nitrerade hade liknande yttopografi. Den underliggande kornstrukturen kunde ses fastän spar fràn bearbetningsproceduren var klart synliga.

De väteperoxid-behandlade implantaten visade tydliga spar 513 48132 fràn bearbetningsproceduren och hade ullig yta som reflekterade etsningsaktiviteten fràn behandlingen.

Ytkomposition och tjocklek på ytlager Resultaten av AES-analysen är sammanfattad i tabell I.

Rapporterna I, III.

Samtliga prov hade en relativt konsistent ytsammansattning oberoende av preparation. Alla spektra dominerades av framträdande Ti-, O- och C-signaler och spàrmängder av Ca, S, Si, P, Cl och Na detekterades. Ca och S upptrader mer frekvent pà kontrollproven än de pà elektrokemisk vag preparerade proverna. Lägre nivà av C och andra föroreningar upptäcktes pà cha eloxiderade (80 \O proven.

Djupprofilanalysen resulterade i oxidtjocklekar av 4, 4-5, 21 och 180 nm för kontrollproverna, de elektropolerade, elektropolerade/ /eloxiderade (10 V) respektive elektropolerade/eloxide-rade (80 V) implantatproverna.

Rapporterna II-IV Oberoende av _ytpreparation hade alla. prov relativt. lika ytkomposition med starka Ti-, O- och C~signaler i spektrat. Kolföroreningen varierade mellan de olika proven fràn z34 at % för maskinbearbetade och maskinbearbetade- eloxiderade prover till ~25 at % för de tva elektropole- rade proven. Spàrmängder Ca, S, P, Si detekterades (fåtal procent).

Rapport V Pà andra prover var Ti, O eller N/O och C dominanta element. Alla proverna visade relativt laga nivàer (10-15 at %) av kolförorening pà ytorna jämfört med andra studier (typiskt 30 at % eller mer)(Lausmaa J. 1996). Oxiderna pà 513 48133 de glimurladdningsoxiderade respektive IDO? behandlade kontrollproverna blev nästan stokiometrisk titandioxid och av motsvarnde tjocklek (4-7 nm).

I ytterl igare försök: De diskformade implantaten användes för studier pa protein-adsorption och inflammation i m_j uka vävnader bestaende av en TiO2 ytoxid som täckes av varierande mängder av kolväten och andra spar av föroreningar. För det mask inbearbetade kontrollprovet , detekterades kolnivaer kring 50%, och runt 4% Ca och mindre spar av S och P. För det elektropolerade provet detekterades omkring % C och spar av Ca, S och Cl. Det elektropolerade plus eloxiderade provet hade kolnivaer kring 20%, och omkring 6% Ca och spar av S, Cl, Si och Fe. Bortsett fran variationerna i kolnivaerna, hade de skivformade proverna en liknande ytkomposition som de motsvarande ytorna pa de gängade implantaten som användes i tidigare studier (rapporterna I-V) _ Kontaktvinklar och ytenergi Kontaktvinklarna mättes pa de cirkulara diskformade implantaten eftersom det inte är möjligt att mäta kon- taktvinkeln pa ett skruvformat implantat (tabell II och III). Kontaktvinkeln (H20 ökande) var lägre för de elektro- polerade plus eloxiderade implantaten än för de maskinbe- arbetade och elektropolerade proverna. Beroende pa porosi- teten pa den elektropolerade plus eloxiderade ytan kan kapillära krafter sprida vattnet, och pa sa sätt ge en lägre vattenkontaktvinkel (Andrade, 1985). Den elektropo- lerade plus eloxiderade ytan hade den största hysteresen ~(skillnaden mellan ökande och minskande vinkeln) när man matte med metylen-jodid. Ökad ytgrovhet och skillnader i topografin kan leda till en ökad hysteres. Eftersom alla 515 48134 ytor har en liknande kemisk sammansättning kommer alla ytor' att. ha samma "reella" kontaktvinkel fastän yttopo- grafin vill påverka det uppmätta värdet.

VÄVNADS-GENSVARET Proteinadsorption in vitro Våra observationer visar att det finns endast små skillna- der' i proteinadsorption-mönstret. mellan de maskinbearbe- tade, elektropolerade och elektropolerade plus eloxiderade titanytorna. Den totala mängden av adsorberad plasma- protein var liknande på de tre ytorna. Proteinkoncentra- tionerna som erhålles för maskinbearbetad titan 1,15 mg/Ml, elektropolerade titan 1,05 mg/ml respektive elektropolerade plus eloxiderade skivor 1,25 mg/ml.

Dessutom var innehållet av selekterade plasmaproteiner, albumin, fibrinogen, fibronektin och IgG lika.

Inflammatoriska reaktioner i mjuka vävnader Det totala antalet celler i exuderingarna och associerade med ytorna i de maskinbearbetade, elektropolerade och elektropolerade plus eloxiderade diskarna är visade efter olika tider for implantation i figurerna 3 respektive 4.

I figur 3 visas det totala antalet celler (x1O4 per ml) i exudater runt maskinbearbetade, elektropolerade och elektropolerade plus eloxiderade titanskivor som är erhållna från sidkantfickor i vävnad på råttor efter 1 - 7 dagar. Genomsnitt +/- s e H = förinkuberade i HBSS; S = förinkuberat i saltlösning.

I figur 4 visas DNA innehåll på maskinbearbetade, elektropolerade och elektropolerade plus eloxiderade titandiskar som hämtats från kantfickor i vävnader i 515 481 ràttor efter 1-7 dagar. Genomsnitt +/- s e H = förinkuberad i HBSS; S = preinkuberad i saltlösning.

Det framgår att antalet celler minskar med ökande observationsperioder vid alla implantattyper. Inga större skillnader i absolut totalt cellantal detekterades mellan ytorna. Maskinbearbetat titan som förinkuberats i saltlösning var ett större undantag som visade det högsta cellantalet bland alla prover.

Med ett större undantag, var mononukleara celler (monocyter/macrofager, lymfocyter) dominerande i exude- ringarna kring implantaten vid alla tidsperioder (Id: maskinbearbetad Ti 33% (HBSS) och 33% (saltlösning), elektropolerad 47% (HBSS) och 50% (saltlösning), elek- tropolerad plus eloxiderad 47% (HBSS) och 55% (saltlösning) 3d2) maskinbearbetad 'Ti 81% (saltlösning), elektropolerad 87% (saltlösning), elektropolerad plus eloxiderad. 82% (saltlösning), 7dI maskinbearbetad Ti 89% (saltlösning), elektropolerad 100% (saltlösning), elektropolerad plus eloxiderad 94% (saltlösning). I kontrast till andra implantat, har maskinbearbetat titan en markerat lägre proportion av mononukleara celler efter ld, och en motsvarande högre proportion av PMN. Denna diskrepans observerades inte vid andra tidpunkter. Ingen skillnad :i proportion av celler i. exudaten observerades mellan implantat som hade inkuberats i HBSS eller saltlösning.

Morfologi och morfbmetri Ûbservationer med ljusmikroskopi 513 4836 Rapport I Efter 7 veckor fyllde omoget ben med vävd karaktär de kortikala gängorna runt alla implantat. Vid denna tidsperiod hade de endast elektropolerade implantaten mindre endosteal intramodullär nerväxt i benet än de maskinbearbetade och de elektropolerade plus eloxiderade (180 nm tjocka oxiden) implantaten. De elektropolerade plus eloxiderade implantaten hade den högsta benkontakten, 50% i forhällande till 20%, for de enbart elektropolerade.

Efter 12 veckor, var den generella organisationen av benet runt implantaten densamma som observerades efter 7 veckor.

Endast. en mindre okning :i benkontakten mellan 7 och 12 veckor upptäcktes for de elektropolerade plus eloxiderade implantaten, varvid emellertid för de tvä elektropolerade proven med en tunn oxid den ökade benkontakten hade nätt samma nivä som det elektropolerade provet med tjock oxid.

Rapporterna II, IV Efter 1 vecka var det kortikala benet i allmänhet i nära kontakt med de maskinbearbetade och maskinbearbe- tade/eloxiderade implantattyperna. Båda de elektropolerade implantattyperna hade lägre värde for ben-implantatkontakt vid denna tidsperiod (< 5%).

Vid 3 veckor hade nybildat ben fràn endosteum nätt implantatet och fyllde gängorna vilka initialt sköt in i kaviteten i märgen. Inga kvantitativa skillnader upptäcktes mellan grupperna.

Vid 6 veckor hade det elektropolerade implantatet en lägre benkontakt än det elektropolerade plus eloxiderade implantatet säväl som de maskinbearbetade implantaten, se figurerna 5 och 6 som visar genomsnittlig benkontakt (%), 513 4837 n=8, for de olika gängorna (1-5, vid 6 veckor (handling II), resp. morfometri (%) och genomsnittlig benkontakt och benarea efter 1 är. De elektropolerade implantaten visade också den lägsta mängden ben inom gängorna. De tvä typerna av maskinbearbetade implantat omgavs av vidare benkrage än de elektropolerade implantaten. I allmänhet. var benet i storre utsträckning i direkt kontakt med implantatytorna.

Efter 1 är var nästan alla gängor fyllda med laminärt ben och implantatytorna var i nära kontakt med det omgivande benet (60-70%), se figur 6. Bensvaret till de olika implantattyperna var lika. Bensvaret, kring den elektropolerade implantatgruppen var ekvivalent med de andra grupperna efter 1 är.

Rapport V Efter 1 vecka var det kortikala benet ofta i nära kontakt med implantaten fastän inga nya benformationer kunde ses vid skärkanten pà cortex. Inga kvantitativa skillnader sägs mellan grupperna.

Vid 3 veckor nädde nytt format ben frän endosteun implantatet. och fyllde gängorna som initialt. var fyllda med marrow-vävnad. Markerade kännetecken pä resorption och osteoid karakteriserade ytan pà det kortikala och trabekulära benet som vetter mot implantatytan. Även vid denna, tidpunkt kunde inga skillnader detekteras i benkontakten eller benarean mellan grupperna.

Vid 6 iveckor fanns inga kvalitativa eller kvantitativa skillnader mellan grupperna. Benet var i stor utsträckning i direkt kontakt med implantatytorna och dessa observationer liknade den som observerades i rapport II. 513 48138 Ultrastrukturella observationer Rapport III En generellt lägre grad av mineralisering upptäcktes kring de elektropolerade implantaten och tillsammans med den jämna fïakturkonturen gjordes produktionen av Ldtratunna sektioner liksom tolkningen av gränssnitten lättare. Det fanns konstant ett lager' av' amorft. material mellan det mineraliserade benet och implantatytan (0,2 pm brett). De elektropolerade plus eloxiderade implantaten (tjock oxid) var mer svära att undersöka (likadant för de maskinbearbe- tade implantaten) eftersom en separation av implantatet frän den plastiskt inbäddade vävnaden oftast resulterade i en rubbning av interface-vävnaden. Benet runt de elektropolerade plus eloxiderade implantaten hade i allmänhet. ett :mycket högre innehäll. av' benmineral än de enbart elektropolerade implantaten. Ett amorft lager upptäcktes även runt dessa implantat, generellt nagot tjockare än för de enbart elektropolerade implantaten.

Närvaron av tunnväggiga begränsningar som bildar gränsen for det. mineraliserade benet. mot implantatet. upptäcktes vanligtvis runt. de elektropolerade plus eloxiderade implantaten med tjock oxid.

Diskussion Den relativa vikten av olika ytegenskaper för biologiskt genomförande av implänterat biomaterial är i. stort. sett okänt. Strategin som valdes i arbetet var att systematiskt ändra ytegenskaperna pà titanimplantat och därefter värdera det biologiska svaret pà en djurmodell. 513 4sgg Ytkemin, topografin och mikrostrukturen for titanytor har varierats pà ett. välkontrollerat sätt i denna tes. Det finns flera sätt att modifiera de olika egenskaperna även om det är svårt att hälla alla parametrarna kontrollerade.

Biokompatibilitet och modifierade titanytor Implantering av icke-biologiska material i biologiska omgivningar leder till en tids- och delvis material- beroende sekvens av inflammatoriska och reparativa pro- cesser, fastän, sàsom betraktats i ovanstående intro- duktion, de olika materialrelaterade faktorerna som påverkar dessa svar inte kan fullt förstås är det tydligt att. proteinadsorption och cellulär vidhaftning till materialytor är väsentliga komponenter för vävnadssvaren.

I tidigare studier i detta laboratorium (betraktad i ovan- stàende introduktion), har de mjuka vävnadsreaktionerna runt maskinbearbetade titanytor karakteriserats, inklude- rande den cellulära distributionen och strukturen pà titan-metall-gränssnitten i experimentella och mänskliga applikationer.

I experimentella studier "in vivo" och i olika "in vitro"- modeller, har ytans vätningsformäga, kemiska komposition, monster för protein-adsorption och influensen frän exogena stimulantia funnits pàverka den inflammatoriska celluppbyggnaden, distributionen och det sekretoriska gensvaret. Dessutom med bakgrunden fràn en tidig (och transient) distribution av mononukleära och multinukleära celler pà den maskinbearbetade titanytan under de inflammatoriska händelserna som foregàr benformationen i gränssnittet (Sennerby et al. , 1993 a; Sennerby et al. , 1993 b) har studier pà protein-adsorption och cellulär uppbyggnad och vidhäftning till ytmodifierade titanimplantat initierats. 515 481,0 Observationerna fràn innevarande experiment pà "in vitro" plasmaproteinadsorption och cellulär återuppbyggnad och vidhäftning i nguka vävnader pà ràttor indikerar att inga större skillnader observerades vid ett fàtal utvalda tidpunkter, bortsett fràn de skilda ytegenskaperna som exhibierades av' de 1naskinbearbetade, elektropolerade och elektropolerade titanskivorna. Vi har ingen förklaring till det. relativt. högre cellantalet. vid maskinbearbetat titan efter" 1 dag, li överensstämmelse med andra. nyligen genomförda observationer (Thomsen et al., i nmnuskript), var de maskinbearbetade titanproverna associerade både med ett relativt större inflöde och association av celler till ytorna efter 1 dag än de andra materialen, Dessutom indikerar vara data att denna inflammatoriska respons är högre om implantaten är för-inkuberade i saltlösning än HPSS (med kalcium). Dessutom blev den inflammatoriska exudaten kring de maskinbearbetade implantaten associerade med en markerat högre proportion av PMN. Intressant är att guldimplantat med mindre inflammatoriska celler i exudaten än hydroxyerat och metylbehandlat guld, blev associerat med en likadan, relativt högre PMN predominans efter 1 dag (Lindblad et al, 1997).

Föreliggande resultat tillsammans med tidigare experi- mentiella och kliniska studier som använder maskinbear- betade implantat i mjuk vävnad, ger en indikation om att även de elektropolerade och elektropolerade plus eloxiderade implantaten tillhör en grupp av material med biokompatibla egenskaper för mjuk vävnad.

Osseointegratíons-processen Osseointegrations-processen och modifierade titaqytor 513 481 41 Det systematiska tillvägagängssättet enligt rapporterna I- V gjordes med syftet att värdera om och hur variationer hos egenskaperna pä metallimplantatytorna ocksa kunde inducera en variation i benlreaktionerna, såsom utvärderas genom ljusmikroskopisk morfometri och ultrastrukturell analys. Säledes skulle tjocklek, morfologi, topografi och kemisk komposition pà ytlager avsiktligt kunna varieras i mer eller mindre grad. Dä det maskinbearbetade titanet konstituerar implantat pä vilka ytmodifikatoner har gjorts och eftersom det dessutom finns en stor volym av vetenskapliga data pà materialet samt biologiska och kliniska egenskaper för dessa maskinbearbetade titanimplantat blir de alltid inkluderade som en referens i separata experiment.

Trots en omfattande användning av maskinbearbetade titanimplantat i ben har mekanismerna for att uppnä osseointegration varit mindre väl forstàdda. Tidigare experimentiella studier som använder samma experimentella modeller som i denna tes (Sennerby et al., 1993a; Sennerby et al., 1993b) att implantatytan inte tjänar som en fast- sättning for osteoblaster och inga bevis erhållits som indikerar att mineralisering initieras pä ytan: i stället observerades benformation efter 3 dagar i endosteum frän vilket bensträngar skjöt ut mot implantatet, och efter 7 dagar säsom solitära öar inom gängorna. I bada lokalite- terna uppträdde mineralisering genom deposition av mineral i den collagena matrisen. Benet växte således mot implan- tatytan och den collagena matrisen for gränssnittet blev den sista delen av omgivande benet som blev mineraliserat.

Efter längre tidsperioder, indikerar observationer fran djurexperiment. och mänskliga àtervinningsstudier (betraktade i introduktionen ovan) att osseointegration av icke-funktionella och funktionellt belastade maskinbearbe- tade, gängade titanimplantat kännetecknas morfologiskt av en hog mängd av remodellerat ben inuti gängorna, en hog 513 481 42 ben-implantat-kontakt och en separation av mineraliserat ben fràn implantatytan genom en tunn zon av amorft material.

Sammanfattningsvis kan man finna att ytmodifierade titanimplantat. bedömda i. innevarande studie (rapporterna I-V) väsentligen delar de biologiska egenskaperna med maskinbearbetat titan? tidigare benformation fortsätter mot implantatytan och vid senare tidsperioder blev samtliga implantat osseointegrerade.

Ett större undantag var den relativt laga benkontakten som observerades vid elektropolerade implantat i den tidigare fasen (rapporterna I-II). En möjlig förklaring till denna observation kunde vara existensen av ett initialt, större avstànd mellan de elektropolerade implantaten och den omgivande vävnaden (beroende pà borttagande av mindre än 100 pm (w 50 pm)) av implantatytan under den elektrokemiska processen). Den lägre graden av benförmation runt endast elektropolerade prov efter 6 veckor i jämförelse med de elektropolerade plus eloxiderade proverna. kan emellertid inte förklaras av skillnaden i möjliga initiala avstànd mellan implanttytan och vävnaden. Det kan antas att kombinationen av en heterogen submikrogrovhet (jämn/grov; 75%/25%), ökad oxidtjocklek (180 nm) och därmed en ökad kristallinitet pà den elektropolerade plus eloxiderade ytan är fördelaktiga egenskaper associerade med de elektropolerade plus eloxiderade implantaten. Denna kombination av egenskaper har inte utnyttjats tidigare som del av ett implantatelement utan rapporter i litteraturen indikerar endast att t.ex. graden av kristalliniteten skulle kunna (sasom en ensam egenskap) päverka cellbeteendet.

I studier "in vitro" befanns en ökad kristallinitet (under det att man häller oxidtjocklek- och grovhets-parametrarna 513 481 43 konstanta) utgöra influens pà fenotypiska uttryck för osteoblaster (Boyan et al., 1995). "In vitro"-studie har även visat att grovheten pä substratkulturen päverkar osteoblastliknande cellförökning; differentiation och matrisproduktion (Martin et al., 1995). Dessutom svarar celler vid olika skeden pà differentiering "in vitro" olika pà samma yta (Boyan et al., 1995; Schwartz et al., 1996). Därför är det om man extrapolerar "in vivo"- förhållandena möjligt att titan-ben interaktionen kunde bli olika vid tidigare och senare tidsperioder beroende pä tidsberoende ändringar i gränssnittet för typerna pä celler som finns närvarande och deras mognadsgrad.

Fastän motstridiga data finns i litteraturen indikerar tidigare studier "in vivo" att en ökad ytgrovhet (>1um- nivä) kan befrämja ben-adaption till titanytor (Buser et al., 1991; Coldberg et al., 1995; Gotfredsen et al., 1995). Det är därför intressant, pà basis av innevarande ettàrsdata (rapport IV), att för det första, alla ytor (maskinbearbetade, maskinbearbetade plus eloxiderade, elektropolerade, elektropolerade plus eloxiderade), och vilka är relativt _jämna _jämfört, med sandblästrade eller plasmasprayade ytor, uppvisade en hög grad av ben-till- implantat-kontakt och en hög proportion av ben inom gängorna, och för det andra att de morfometriska värdena var lika med eller högre än de värden som erhölls för relativt grövre ytor i. andra studier som använder samma experimentiella modell (Wennerberg, 1996). Vi har ingen klar förklaring till dessa observationer. En möjlig förklaring är att den jämna elektropolerade ytan har uppnätt en tjockare oxid och därmed en ändrad topografi under den längre implantationsperioden (1 är). Nägot bevis att sädana processer kan vara operativa är konstaterandet, "i mänskliga ätervinnande-studier, att tjockleken pà oxiden har växt med tiden (Lausmaa, 1988; Mc Queen et al., 1982; Sundgren et al., 1986). En annan möjlighet är att 513 48144 omfattningen av benformationen och mineraliseringen runt de maskinbearbetade och ytmodifierade titanimplantaten blev pàverkade av jonfrigörning. Titan-joner (Ti“) har en dos-relaterad inhiberingseffekt pà kalciumhalten "in vitro" (Blumenthal och Cosma 1989). Jonfrigöringen värderas "in vitro" frän titanmaterials-avklingningen med tiden beroende pà självpassivation (Healey och Ducheyne, l992a; och Healey och Ducheyne, 1992b). Därför beroende pà en relativt. tunnare oxid kan vi inte exkludera att de endast elektropolerade implantaten åh* associerade :maj en högre jon-frigörelse.

En annan hypotes är att titan-ytoxiden, genom dess förmåga att binda kalcium skulle kunna ge favör àt mineralisering, vilket i sin tur skulle kunna vara fördelaktigt för benformningen (Hanawa, 1990). Det har emellertid inte visats att detta skulle ha en effekt pà osteoblast- vidhäftning, proliferation, sekretion av extracellulär matris och mineralisering av titan-interface zonen.

Tidigare "in vivo" data (Sennerby et al., 1993a; Sennerby et al., 1993b) och innevarande data (rapporterna I-V) indikerar inte att detta är giltigt under "vivo"- förhållandena.

Emellertid attraherar den negativa _jonen TiO2 katjoner, liksom 't.ex. kalcium, och det har föreslagits att kal- ciumbindning kan vara en mekanism genom vilken proteiner adsorberas till TiO2 (liksom hydroxyapatit) (Ellingsen, 1991). Förbehandling av TiO2 genom adsorption av lantanum- joner orsakar en ökad adsorption av proteiner, sammanfallande med ett lägre bengensvar hos ràttor och kaniner (Ellingsen och Pinholt, 1995). Som tillägg härtill har förbehandling av titanimplantat med fluorid-joner visats för att öka utdragnings-värdena (Ellingsen, 1995).

Således kan en kemisk modifikation av 'titanytan pàverka benvävnadsgensvaret, möjligen genom adsorption av 512» 48145 till understödd av "in proteiner ytan. Denna hypotes är huvudsakligen att närvaro av som har TiOz 1 försökf i vitro"-studio bindes till Sålunda skulle zonen, kalcium bunden till TiO2 kunna befrämja adsorptionen av sulfaterad glycosaminoglycans (Collis och Embery, 1992). visat condroitin-4-sulfat kalciumjoner. amorfa Sammantaget, har kemiska modifikationer av titanoxidytan befunnits påverka adsorption av' makromolekyler på ytan, såväl som vävnadsgensvaret. Det. finns ännu inget. bevis, emellertid, att de positiva effekterna på bengensvaret är beroende på en process av benformering och mineralisering vilken är riktad utåt från THIL-ytan. En ändamålet att ytterligare modellera bengensvaret kan vara att selektivt adsorbera/inkorporera till ytan skulle pàverka benföregàngareceller/osteoblaster och höja mineralisation.

Emellertid ytterligare infallsvinkel med molekyler som kunna sedan interaktionerna mellan proteinerna, celler och. en sådan kemiskt behandlad yta skulle kunna påverkas inte bara av kemiska egenskaper på ytan utan även av ytans submikrogrovhet, måste en optimering av både kemiska och ytgrovhets-parametrar övervägas när nya 1-implantat konstrueras. Föreliggande uppfinning är inte begränsad att användas som en implantatyta som sådan, utan kan användas som en grund för sàdana ändamål, Pä basis av tillgänglig litteratur (genomgången i ovan) och kunskap kan den slutsatsen dras att integrationen av titanimplantat och ben och bibehållande av denna integra- tion är förutsättningar för de kliniskt dokumenterade längtidsfunktionerna och de höga framgångsvärdena.

Emellertid innebärf kinetiken hos osseointegrations- processen som beskrivits ovan att den tidigare fasen av läkning för den adekvata stabiliteten skulle kunna bli speciellt kritiskt i situationer med sämre benkvalitet och andra negativa 'värdfaktorer. Experimentiella studier med 515 48146 gängade titanimplantat i mer eller mindre kompromissbara lokalar implantatbäddar (tidigare bestràlning av vävnader och lokala inflammationer och osteopenia) stöder detta f antagande (Sennerby och Thomsen, 1993; Öhrnell et al., 1997). Dessutom har studier av patienter med reumatoid artritis visat en reducerad mekanisk kapacitet (minskning i vridmomenthàllfastheten) i ben-titanenheten i jämförelse med patienter med osteoartertis (Brànemark, 1996).

Pa basis av innevarande resultat under den tidigare fasen med läkning föreslas det att maskinbearbetade och elektro- polerade c.p. titanimplantat, med poly-kristallin, tjocka oxider och en mikroporös grovhet. pà submikronivä kunde blir intressanta material att utvärdera under kliniska förhållanden. Det är emellertid klart att även en adekvat remodellering av ben runt, implantaten erfordras för att befrämja en lángtidsstabilitet. Det är därför av intresse att i vàr làngtidsstudie (1 àr) (rapport IV) de experi- mentiella resultaten visar att alla fyra typerna av gängade titanimplantat, bortsett fràn ytmodifikation (maskinbear-betad, maskinbearbetad och eloxiderad, elektropolerad, elektropolerad och eloxiderad), har en hög grad av ben-till-implantat-kontakt och en hög proportion av moget, lamillärt ben inom gängorna. Sàlunda blir implantat. med en likadan kemisk komposition, utan markerade skillnader i oxidtjocklek, yttopografi och grovhet, i lika hög grad osseointegrerade under lang tid i experimentella förhallanden.

Exemplen som ges i ovanstående har visat att det är möj- ligt att producera titanimplantat med ytmodifikationer som varierar med avseende pà oxidtjocklek, sammansättning, topografi, grovhet och mikrostruktur. Pa basis av resultaten i, avhandlingen en/ Larsson (1997) sà kan det sammanfattas att 515 4817 * i jämförelse med endast elektropolerade implantat (som har en mycket jämn yta med en tunn, icke-kristallin oxid) och maskinbearbetade implantat, implantat som ytmodifiera- des med eloxidation för ernäende av en tjockare oxid (180- 2OO nm), erhöll ökad kristallinitet och ökad grovhet pà submikrometerskalan.

* En hög grad av benomgivning, och i kontakt med implan- tatet, upptäcktes för alla titanimplantat, oavsett ytmodifikation. Sammantaget indikerar observationerna med ljusmikroskopi, morfometri och multrastrukturella medel att processen med osseointegration är i grunden lika för maskinbearbetade och ytmodifierade titanimplantat.

* Resultaten av de küologiska experimenten visar att en kombination av ökad oxidtjocklek, oxidkristallinitetr och grovhet pá submikroskalan är fördelaktiga egenskaper för det 'tidiga, gensvaret, speciellt. i _jämförelse med tunna, jämna, icke kristallinska oxidytor.

* En hög grad av ben-till-implantat-kontakt. och en hög proportion av lamellärt ben inom gängorna pä implantaten observerades efter 1 àr, bortsett fràn ytmodifikation (maskinbearbetning, maskinbearbetning plus eloxidering, elektropolering och elektropolering plus eloxidering). Det senare resultatet indikerar att kombination av ytegen- skaper (ökad oxidtjocklek, ökad kristallinitet och grovhet pà submikroskalan) pa eloxiderade implantat har lika làngtidsbiologiska egenskaper i ben som de kliniskt använda maskinbearbetade titanimplantaten.

Sammantaget indikerar vara observationer att en titanyta med en kombination av ytegenskaper (ökad oxidtjocklek, ökad kristallinitet och grovhet pä submikroskalan), upp- näddes i de innevarande experimenten med eloxidering, 515 48 38 konstituerar ett viktigt element 1 implanterade anord- ningar. 513 481 49 uflxo xwcflfifimuwflux -wxufl .mu> m.o~ w.m~ ß .cm :uo v>v nmñncmzwn -fifimuwe uuoem _UmuwEuowøU uxwflummflm Hu .omv uæum NH - .U«xo»mQ-wum> Mw.m NÅWN m RZMP ^>v wXÅ-.vifilßfiv vfixo cflH~mum>ux-oxo« .mu> .ufipuflc :oo -flfimuoe xm:«Hfiøum>ux>Hom Aflmvu zoo o »um ofl omHmuummn-> mmcflcvumfiussflfiø v. šv 33623 vxzvšvzv Ufixo cflfifiøumfiuxlmxofl mß.o ~.o« w n :uo Umcou Sååå: xmfiifimfläfiom Sv U »ä 2 ufiflöwwn; mmšcuufiuzeflu vflxo cfififluumflux wuxufl _mu> ~.mfl m.w~ m u vfiu nuo m v>v .fifluuwe uuoeø _umuweuowwn Uxwfluwmfim .flw .øuv o æuø mm omHmuumwn-> umumnumwncflxmmz .>o»mv °.~. .>n»mv >.»~H _>H _HHv ufixo xmcfififimumfinx w«>Huo .nsflï w.° .=s«D >.~ oow-omfl »az nuo Hu .mv cmuwcfixofiw .mu>HHmuwE xm:flHHmum«ux>Hom m.mN m.~m u »um ~.m~ umummfififluwummcm +øn~mHoaouuxoHm uflxo xmcfifiHmum«ux-wxuv m.o m.~ m-m Aøz zoo Hu _>H .Hwv _mu>H~muwE xm:flHHdumflux>Hom .m .nov .U »um m.w~ umuwmflvfluwuwmcm oøuwfioaouuxwfim _ v>H _HHv ufixo xm«HHøumfiux.-wxuH .mu> o.mH æ.ov oo~-owfl .Mm nuo Ho .m .m .muv øøumoflxofiw .fifimuwe wuoem .umumewoumu uxmfluwmflm .øz »ua H.fl .U nun mm nnummflfifluuummcm .oouwnuøwncwxmmz . m :oo «w ufixo xmcflfifløumfiux -wxufi .mu> _m .m .nov .oz »un m.m v>H _H~v -fifimuwe mnosm .wmuweuowwc uxmfiummfim m.oH m.om m-m Hu »un >.H .uæuø v.vm vmuomflfifluwummcm nmuwnumwncfixmm Ammumcmv uflxo xmcflfifimumflux - wa oæfl .Hu :oo nov AHHH .Hv m«>Hmc .mu>H~muoe xmc«HHmumvux>Hom U »uu o«-«m oøuowflflfluoummcm umuwøflmxoflw +ømum«oQopUxw~m uflxo xm:«flHmum«Hx-wxu« - m.H HN ^~o :oo Mm .w .nov ^HHH .Hv .mu>H~øuwE xmcvfifimumvuxæflom U »uu oß-mm umuwmflfifiumummcm Umuøflflxofiw +Om~m~0QO~uxo~m vøz nuo øfixo xm:«HHmum«»1-wxuH I >.~ m-« fiu .m .vw .m .nov _mu>HHmuwE xmc«HHmumfiux>~om U »um om-mm uøuumflfiflwuummcm AHHH _Hv UmumHOm0uuxuHm UfixocHHHmumvux-wxufl .uou>HHmuuE vøz zoo mwuoem .cmuweuouwo pxmfiummfim - mm w HU .m vw .m.muv AHHH _Hv U *Um om-m« omuwm¿HH»wUwm:m vmuwumwncvxmaz .uwpflcfififimumfiux Aëcv xoflxuofiu .mcv~o:u_: nvxo zuo usuxsuumouxvz w .uuflod menu -u«uuvc\U«xo cofluncfleøucoo cofluomflflfigwuw coflunänaæx .~mucø~as« now cwxHum«»muxmumxu> :www cwumu HDWUM >fl UCHCUUGMCMEEMM .H HHODNH. 513 481 50 Tabell II. Genomsnittsvârdet för de tre åtgärderna (droppar pá en skiva) presenteras. Värdet för varje droppe (genomsnittsvàrdet för högra och vänstra sidan av droppen) presenteras inom parenteser.

Preparation PQO avancering 130 minskning CH¿g CHfl¿àtergàng (kontakt- (kontakt- avancering (kontakt~ vinklar) vinklar) vinklar) (kontakt- vinklar) Maskin- 41.2 - 47 42 bearbetad (37, 44.5, 42) (l8,<10, 13) (43,46,53) (39.5, 40.5, 45.5) Elektro- polerad 39.5 - 35 32 (38.5, 37.5, 42,5) (12.5, 14.5,<1Ü)(37.5, 32, (31, 30.5, 36.5) 33.5 Elektro- 22 <1O 42.5 32 polerad och eloxiderad (23, 22, 20.5) (<10,<10,<10) (45.5, 38.5 (35,32,5 29) 43.5) Tabell III: Ytenergin för olika prov Preparation Yta energi Polär Dispersion dyne/cm komponent komponent Maskínbearbetad 58.1 33.6 24.4 Elektropolerad 61.3 32.2 29.1 Elektropolerad 68.6 42.8 25.8 och eloxiderad

Claims (6)

513 481 P.ans. 9701872-5 PATENTKRAV

1. Ett implantatelement för permanent förankring i benväv- nad i vilken åtminstone ytan avsedd att vetta mot vävnaden i implantatregionen är utförd av titan med en titanoxidyta k ä n n e t e c k n a t därav, att implantatytan modifi- eras med eloxidering för att uppnå en titanoxidtjocklek om approximativt 10-200 nm, och en ändrad ytstruktur i form av en ökad ytoxid-kristallisering, jämfört med ytoxidkris- talliseringen hos en maskinbearbetad titanyta, och en grovhet på submikroskalan inom området 10 nm till ett få- tal pm för att åstadkomma en hög grad av ben-till-implan- tat-kontakt.

2. Ett implantatelement enligt patentkrav 1 k ä n n e - t e c k n a t därav att implantatytan modifieras medelst väte-peroxidbehandling.

3. Ett implantatelement enligt patentkrav 1 k ä n n e - t e c k n a t därav ytoxid-kristalliseringen är polykris- tallin.

4, Ett implantatelement enligt patentkrav 1 k ä n n e - t e c k n a t därav att den eloxiderade ytan utgör en he- terogen yta med oregelbundet distribuerade jämna och grova areOr.

5. Ett implantatelement enligt patentkrav 4 k ä n n e - t e c k n a t därav att de grova areorna är 10-100 pm StOIa.

6. Ett implantatelement enligt patentkrav 4 k ä n n e - t e c k n a t därav att området mellan de jämna och grova areorna är större än 1 och företrädesvis omkring 3,