SE460576B - Mot graensskiktspolymerisation med hjaelp av fosfolipid stabiliserad insulinpreparation - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 460 576 ,-,,»WW_fl 2,n, kända insulinpreparat i detta sammanhang är rikligt dokumenterade i litteraturen, jfr. t.ex. Diabetologia 19 (1980), l - 9. A För att lösa detta problem har man föreslagit användning av sura insulinlösningar innehållande glutaminsyra eller aspara- ginsyra, jfr. Diabetes 30 (1981), 83. Insulin är emellertid ke- miskt instabilt i syra, till och med vid temperaturer under kropps- temperatur. Man har vidare föreslagit användning av insulinprepa- rat innehållande non-joniska ytaktiva ämnen, jfr. västtysk patent- ansökan nr P 2 952 119. Non-joniska ytaktiva ämnen kan emellertid betraktas såsom icke önskvärda i läkemedel avsedda för parenteral användning.

Sådana olägenheter elimineras enligt föreliggande uppfin- ning, vilken avser hittills okända, upplösta insulinpreparat, i vilka insulinet är väsentligt mindre benäget att undergå icke- -kovalent gränsskiktpolymerisation under de betingelser, som före- ligger i kontinuerlig insulintillförselapparatur, än vad som är fallet med konventionella insulinpreparat.

Det har nu överraskande visat sig, att insulinlösningar stabiliseras mot gränsskiktpolymerisation, när minst en fosfo- lipid är närvarande i lösningen. D De fosfolipider, som är närvarande i insulinlösningarna enligt föreliggande uppfinning, kan anges med hjälp av den all- männa formeln I H-çfl-OR' ca-oR" H-cn-o-P(o)(oH)-oR"' (I) vari R' och R" är desamma eller olika och vardera betecknar väte, alkylkarbonyl, alkenylkarbonyl, alkadienylkarbonyl, alkatrienyl- karbonyl eller alkatetraenylkarbonyl, med det förbehållet, att både R' och R" icke samtidigt betecknar väte, och R"' beteck- nar en hydrofil grupp, t.ex. 2-(trimetylammonio)etyl, 2-aminoetyl, 2-karboxi-2-aminoetyl, 2,3-dihydroxipropyl eller 2,3,4,5,6-penta- hydroxicyklohexyl. Ovannämmda alkylkarbonyl-, alkenylkarbonyl-, alkadienylkarbonyl-, alkatrienylkarbonyl- och alkatetraenylkarbo- nylgrupper kan innehålla från-ca 8 till ca 22 kolatomer, och en- ligt en utföringsform av föreliggande uppfinning innehåller de från ca 12 till ca 22 kolatomer.

Föreliggande uppfinning avser följaktligen en stabiliserad insulinlösning innehållande vatten, upplöst insulin, en eller 10 15 20 ZS 30 35 3 460 sve flera fosfolipider med formeln I och eventuellt ett zinksalt, ett konserveringsmedel, ett medel, som gör lösningen isotonisk, en buffertsubstans och andra fysiologiskt acceptabla föreningar, som är kända som tillsatsmedel för insulinlösningar, och liknande.

En föredragen undergrupp av föreningar med formeln I är föreningar, vari R' och R" vardera betecknar alkylkarbonyl. En ytterligare föredragen undergrupp av föreningar med formeln I är föreningar, vari R"' betecknar 2-(trimetylammonio)etyl, vilka föreningar är kända som lecitiner. Dessutom föredras föreningar med formeln I, vari R' och R" vardera betecknar alkylkarbonyl med från ca 8 till ca 16 kolatomer eller från ca 12 till ca 16 kolatomer, och R"' betecknar 2-(trimetylammonio)etyI. Den mest föredragna undergruppen av föreningar med formeln I är föreningar, vari R' och R" vardera betecknar oktanoyl. Föreningar med fer- meln I, vari R' och R" vardera betecknar oktanoyl, föredras, ef- tersom de icke tycks bilda liposomer och dessutom för att de icke vid lägre koncentrationer, t.ex. under ca 160 ug/ml, tycks bilda miceller. , Den mängd av en fosfolipid med formeln I som är nödvändig för Stabilisering av en insulinlösning ligger företrädesvis inom området från ca 10 till ca 200 ug/ml, mera föredraget från ca 10 till ca 100 ug/ml, speciellt från ca 25 till ca 75 ng/ml, mest föredraget från ca 30 till ca S0 ug/ml, insulinlösning. Koncent- rationen av upplöst insulin i lösningarna enligt föreliggande uppfinning ligger inom området från ca S till ca 1000 intsr- nationella enheter (I.U.) per ml eller till och med högre.

Några av de stabiliserade insulinlösningar, som framställes enligt fölande exempel, kan innehålla liposomer. Det ar emeller- tid osannolikt, att sådana liposomer innehåller insulin, då de är bildade före tillsatsen av insulin. Om liposomcr är närvarande i insulinlösningarna enligt föreliggande uppfinning, är det före- draget, att insulinet i huvudsak är utanför sådana liposomer.

Uttrycket i huvudsak betecknar, att företrädesvis mera än 90 pro- cent, dock helst mera än 99 procent, av insulinet är utanför eventuellt närvarande liposomer.

Kända liposomer innehållande insulin, jfr. t.ex. europeisk patentansökan nr 32 622, kan skiljas från föreliggande uppfinning sàvål genom deras syfte som på grund av att närvaron av insulin inne i en eventuellt närvarande liposomvesikel i insulinlösning- 10 15 20 ZS 30 35 :j 4eois7e " arna enligt föreliggande uppfinning uteslutande är tillfällig.

Under det att insulinlösningarna enligt föreliggande uppfin- ning är avsedda för parenteral administration, är oral administ- ration den primära anledningen till inkapsling av insulin i lipo- somer. Ett ändamål med liposomer innehållande insulin är att skydda insulinet mot icke önskvärt kemiskt angrepp, t.ex. kemisk nedbrytning av insulinet i magen, om insulinet administreras oralt.

Artiklarna avseende liposomer innehållande insulin hänför sig inte i något avseende till fysikalisk stabilisering av insulin- lösningar mot gränsskiktpolymerisation. I kända liposomer inne- hållande insulin är viktförhållandet mellan fosfolipiden och in- sulin t.ex. inom området från ca l:0,0l till l:0,00l, medan vikt- förhållandet för insulinlösningarna enligt föreliggande uppfin- ~ "ning ligger inom området från ca 1:5 till ca l:l0 000, företrädes- vis från ca 1:10 till ca l:l000.

Västtysk offentliggörande skrift nr 2 652 636 avser ett för- farande för stabilisering av känsliga proteiner genom tillsats av skyddsföreningar med amfofil struktur. I motsats till vad som gäller enligt föreliggande uppfinning uppnås stabiliseringen en- ligt ovannämnda offentliggörande skrift genom inkapsling av det känsliga proteinet för att undvika kontakt med vatten. Insulin är dessutom, enligt terminologin i nämnda offentliggörande skrift, icke att betrakta som ett känsligt protein.

Ett ändamål med föreliggande uppfinning är att hålla insu- linet i kontakt med vatten, dvs. i lösning, i det att insulinet hindras från att komma i kontakt med andra grånsytor. lnsulinlösningarna enligt föreliggande uppfinning innehål- ler företrädesvis ox-, svin- eller humaninsulin.

Enligt en föredragen utföringsform innehåller insulinlös- ningen enligt uppfinningen zink. Mängden zink skall dock väljas på ett sådant sätt, att det icke sker någon utfällning. God sta- bilitet mot gränsskiktpolymerisation uppnås i insulinlösningar, vari förhållandet mellan den molära koncentrationen av zinkjoner, som står till förfogande för insulinet, och den molära koncentra- tionen av insulin beräknat som hexamer insulin ligger inom områ- det från ca l,S till ca 4,6, företrädesvis från ca 3 till ca 4,5, mest föredraget från ca 3,6 till ca 4,3. Föredragna zínksalter är lösliga zinksalter såsom zinkacetat eller -klorid. Om insulin- lösningen enligt föreliggande uppfinning innehåller föreningar, 10 15 20 ZS 30 35 - f-íÚ-ï ) H3: nå? -i4eo s7s tä som bildar komplex med insulin, såsom en aminosyra, t.ex. glycinïf eller histidin, eller en hydroxikarboxylsyra, t.ex. citronsyra, ff står enbart en del av det totala zinkinnehållet till förfogande gf för insulinet.

Ett exempel på framställning av insulinlösningar enligt uppfinningen omfattar upplösning av insulin, t.ex. kristallint zinkinsulin, exempelvis högrenat insulin såsom "monokomponent"- -insulin, jfr. brittisk patentskrift nr 1 285 023, i vatten i närvaro av syra, t.ex. saltsyra. Separat framställes en vatten- baserad lösning av ett konserveringsmedel, t.ex. fenol, en alkyl- fenol såsom kresol, eller p-hydroxibensoesyrametylester, och lös- ningen innehåller om så önskas även ett medel, som gör lösningen isotonisk, såsom natriumklorid eller glycerol. Konserveringsme- delslösningen kan vidare innehålla en buffertsubstans såsom nat- riumortofosfat, natriumcitrat, natriumacetat eller TRIS (tris(hy- droximetyl)aminometan). Den resulterande konserveringsmedelslös- ningen sättes därefter, om så önskas, till den sura insulinlös- ningen följt av tillsats av en bas, t.ex. en natriumhydroxidlös- ning, för inställning av pH-värdet på neutralt värde. I samband med föreliggande uppfinning avser uttrycket neutralt ett pH-värde inom området från ca 6,5 till ca 8. Fosfolipiden med formeln I kan sättas till insulinlösningen som en lösning eller kolloid lösning, som framställes genom att fosfolipiden med formeln I löses eller suspenderas i vatten och, om så erfordras, genom att en eventuell suspension underkastas ultraljudbehandling före blandningen med insulinlösningen. Fosfolipidlösningen kan, om så önskas, innehålla en buffertsubstans och ett konserveringsmedel.

Efter inblandning av fosfolipiden kan insulinpreparatets pH-värde inställas på neutralt värde. Den resulterande insulinlösningen fylles slutligen upp till den beräknade volymen genom tillsats av vatten, steriliseras därefter genom filtrering och överföres se- dan aseptiskt till sterila flaskor med lock, vilka därefter till- slutes. V föreliggande uppfinning avser även ett förfarande för fram- ställning av insulinlösningar enligt uppfinningen, vilket förfa- rande utmärkes av att insulin blandas med en förening med for- meln I och eventuellt med ett zinksalt, ett konserveringsmedel, ett medel, som gör lösningen isotonisk, och en buffertsubstans i IIÅYVSTO SV Vfltfßfl. 10 IS 20 ZS 30 35 460 576 ° 7,, Några föreningar med formel I är kända, och de resterande7ÄÜ föreningarna med formel I kan framställas analogt med framställ- DV ningen av kända föreningar.

Ytterligare detaljer för genomförande av föreliggande upp- finning ges i följande exempel, som emellertid inte får tolkas så, att de på något sätt begränsar uppfinningens omfattning. Det in- sulinutgångsmaterial, som användes i exemplen, innehåller från ca 20 till ca 35 ug zink per mg kväve. Bestämningen av stabilitets- faktorn framgår av det följande.

För bestämning av insulinlösningarnas stabilitet gentemot gränsskiktpolymerisation utsättes lösningarna för ett stabilitets- test under forcerade betingelser på följande sätt: 12,5 ml:s glasflaskor innehållande 10 ml testprov förses var och en med en gummipropp och placeras vertikalt i en skak- apparatur (saluföres av Heto, Danmark), som är fullständigt ned- sänkt i ett vattenbad, vilket hålles vid 41°C +/- 0,l°C. Glasflas- korna utsättes för horisontella, skakande rörelser med en frekvens och en amplitud på 100 rpm respektive 50 mm.

Testprovernas opalescens bestämmes med regelbundna tids- intervall på en "Fischer DRT 1000 nefelometer" (saluföres av Fischer, Canada). Grânsskiktpolymerisation anses ha ägt rum, när grumligheten överstiger 10 NTU ("nephelometric turbidity units").

Stabilitetsfaktorn beräknas som förhållandet mellan den tid som förlöper, innan gränsskiktdenaturering sker i testprovet, och motsvarande tid för ett jämförelseprov, som har framställts på samma sätt som testprovet, med det förbehållet att någon förening med formeln I icke har tillsatts.

Exempel l S00 mg semisyntetiskt humaninsulin löses i 10 ml 0,045 N saltsyra, och 359 mg p-hydroxibensoesyrametylester upplöst i 300 ml destillerat vatten tillsättes. Dessutom tillsättes 476 mg natriumacetattrihydrat, 2,46 g natriumklorid och 4,73 ml av en 0,2 N natriumhydroxidlösning upplöst i 15 ml destillerat vatten. 9 mg dimyristoyl,L-alfa-fosfatidylkolin suspenderas i 10 ml av en lösning av 70 mg natriumklorid, 13,6 mg natriumacetat och 10 mg p-hydroxibensoesyrametylester i destillerat vatten. Kväve bubblas genom uppslamningen, som behandlas med ultraljud i ett ultraljud- bad i 2 timmar. Den resulterande kolloida lösningen sättes under omröring till insulinlösningen. pH-värdet inställes på 7,45 med 10 IS 20 25 'ššëëröfßW*@ä§fiëäÉ***%§§å§y%%*%%2'låäáæwflesahßæßfip 7 460 sve " 0,2 N saltsyra eller en 0,2 N natriumhydroxidlösning, och destil-00 lerat vatten tillsättes till en volym av 350 ml. Den erhållna insulinlösningens stabilitetsfaktor är högre än l2S.

Exempel 2 9,65 g svininsulin löses i 400 ml 0,02 N saltsyra, och 5,0 g kristallin fenol och 40 g vattenfri glycerol tillsättes, och dessutom tillsättes destillerat vatten till en volym av 2200 ml. pH-värdet inställes på 7,45 med en 0,2 N natriumhydroxid- lösning. 125 mg distearoyl,L-alfa-fosfatidylkolin löses genom försiktig uppvärmning i 2 ml etanol (96%) och sprutas under kraf- tig omröring via en kanyl ned i 100 ml destillerat vatten med en temperatur av 70°C. Den resulterande, grumliga lösningen behandlas under 15 minuter med ultraljud medelst en högenergiultraljudsond, varpå den resulterande, kolloida lösningen under omröring sättes till insulinlösningen, och destillerat vatten tillsättes till en volym av 2500 ml. pH-värdet inställes, om så erfordras, på 7,45.

Stabilitetsfaktorn är högre än 30.

Exempel 3-8 Insulinlösningar framställes pa ett sätt som är analogt med det i Exempel l beskrivna sättet med det förbehållet, att de an- vända fosfolipiderna är lecitiner, vari de hydrofoba delarna, dvs. R' och R", är identiska och är såsom anges i Tabell I.

Resultaten framgår också av Tabell I.

Tabell I Exempel Insulin- Stabilitets- nr R' °ch RO' art faktor 3 myristoyl svin över 120 4 palmitoyl svin 104 5 stearoyl svin över ll7 6 lauroyl human över 133 7 myristoyl human över 133 8 palmitoyl human 75 Exempel 9 En insulinlösning framställes på ett sätt som är analogt med det i Exempel l beskrivna sättet med det förbehållet, att den använda fosfolipiden är ägglecitin och det använda insulinet är svininsulin. Stabilitetsfaktorn är 96. .. , .g _ a maa... 10 15 20 25 30 '"fï%@ß ßfläßvàïzff 460 576 Exempel l0-14 Insulinlösningar framställes på ett sätt som år analogt med det i Exempel l beskrivna sättet med det förbehållet, att svininsulin är tillsatt i en mängd, som ger de i Tabell II an- givna slutkoncentrationerna. Resultaten framgår också av Tabell II.

Tabell II Exempel Insulin, Stabilitets- nr l.U./nl faktor 10 20 över 120 ll 40 över 120 12 100 97 13 200 79 14 S00 S3 Exempel 15 r 1,50 g svininsulin löses i 6,5 ml 0,2 N saltsyra, och vat- ten tillsättes till en volym av S0 ml. 1,0 g p-hydroxibensoe- syrametylester och 1,78 g natriumfosfat löses i 900 ml destille- rat vatten, och insulinlösningen tillsättes. pH-värdet inställes på 7,45 med en 0,2 N natriumhydroxidlösning. En kolloid dimyri- stoyl,L-alfa-fosfatidylkolinlösning, som har framställts på ett sätt som är analogt med det i Exempel 2 beskrivna sättet, tillsät- tes tillsammans med destillerat vatten till en volym av 1000 ml för åstadkommande av en fosfolipidslutkoncentration av S0 ug/ml.

Stabilítetsfaktorn är över 30.

Exempel 16 En ínsulinlösning framställes på ett sätt som är analogt med det i Exempel 15 beskrivna sättet med det förbehållet, att den slutliga lösningen innehåller 20 I.U. insulin per ml. Stabi- litetsfaktorn år över 17.

Exempel 11 En insulinlösning framställes på ett sätt son är analogt med det i Exempel 15 beskrivna sättet med det förbehållet, att den slutliga insulinkoncentrationen är S00 I.U./ml, och det slutliga innehållet av dimyristoyl,L-alfa-fosfatidylkolin är S0 ug/ml. Stabilitetsfaktorn är över 30.

Exempel 18-20 lnsulinlösningar framställes på ett sätt son är analogt med det i Exempel 2 beskrivna sättet, med det förbehållet, att 10 15 ä@~ 9 460 576 dimyristoyl,L-alfa-fosfatidylkolflxanvänts i en mängd för astad- _; kommande av den i Tabell III angivna slutkoncentrationen. Resul- taten framgár också av Tabell III.

Tabell III Exempel Dimyristoylförening, Stabilitets- nr ng/ml faktor 18 1 1,3 19 10 1,8 20 FO ,över 33 Exemgel Zl Dioktanoyl,L-alfa-fosfatidylkolin löses i destillerat vat- ten och sättes, i tillräcklig mängd för åstadkomande av en slut- koncentration av 30 ug/ml, till en insulinlösning, som har fram- ställts analogt med insulinlösningen i Exempel l. Stabilitetsfak- torn är över 63.

Exemgel 22 3,65 g semisyntetiskt humaninsulin löses i 100 ml 0,02 N saltsyra och 2,0 g kristallin fenol. Tillsats göres av 16 g vattenfri glycerol och 0,3 ml zinkkloridlösning innehållande 4 procent zink, och vidare tillsättes destillerat vatten till en pH-värdet inställes på 7,45 med en 0,2 N nat- S0 mg díoktanoyl,L-alfa-fosfatidylkolin löses i destillerat vatten och sättes till lösningen. Destille- rat vatten tillsättes till en volym av 1000 ml. Stabilitetsfak- torn är 65. volym av 900 ml. riumhydroxídlösning. ghåëgasxgfïšf _ , ,....:@å'~.ff5; _ ffl-ê -'>.'>\. ^ än' my. f., a, <- "f=f-.>.=~. ^' ' . » Lw»

Claims (7)

1, Fyeikaliekt otabilieerad, vattenbaeerad ineulinlöoning, eon eventuellt innehlller zink, ett konaerveringeldel, ett medel, eon gör löeningen ieotoniek, och en bufferteubetane, kinntecleod av att den innehaller Iran 10 till 200 uglnl av en Ioefolipid ned den allmänna formeln I H-CH-OR' I CB-0R" (I) l n-cn-o-lwo» win-on' ' ' vari R' och R" är deeanna eller olika och vardera betecknar vite, alkylkarbonyl med 8-22 kolatoner, alkenylkarbonyl med B-22 kolato- mer, alkadienylkarbonyl med 8-22 kolatomer, alkatrienylkarbonyl med 8-22 kolatomer eller alkatetraenylkarbonyl med 8-22 kolatoner, med det förbehållet, att bade R' och R" eamtidigt icke betecknar väte, och R"' betecknar en hydrofil grupp i for: av 2-(trinetyl- ammonio)etyl, 2-aminoetyl, 2-karboxi-2-aminoetyl, 2,3-dihydro:i- propyl eller 2,3,4,5,6-pentahydroxicyklohexyl, varvid viktförhal- landet mellan foefolipiden och ineulinet ligger inom omradet frin

1. 1:5 till 1:10 000.

2. Ineulinlöening enligt krav 1, kínnetectnad av att on löeningen innehåller lipoeoner, den övervägande delen av ineulinet icke finne inuti daeea lipoaoner.

3. Inaulinlöening enligt vilket eon helet av de töregaende kraven, kínnetocknad av att R"' betecknar 2~(trinetylan- nonio)etyl.

4. lneulinlöening enligt krav 3, Iinnetectnad av att R' och R" vardera betecknar alkylkarbonyl innehallande fran 0 till 16 kolatomer.

5. lneulinlöening enligt krav 4, linnetectnedt av att R' och R" vardera betecknar alkylkarbonyl innehållande från 12 till 18 kolatoner.

6. Xneulinlöening enligt vilket eon helet av kraven 1-4, kínnetockned av att R' och R" vardera betecknar oktanoyl.

7. lneulinlöening enligt vilket eon helet av de Iöreglende kraven, kinnetoclnod av att förhtllandet mellan den nolara kon- centrationen av zinkjoner, eoa atar till förfogande för inaulinet, och den molira koncentrationen av ineulin beräknat eon hexanert ineulin ligger inom onradet fran 1,5 till 4,6.