SE459556B - Anvaendning av immobiliserat pepsin foer avlaegsnande av immunkonplex ur blod - Google Patents

Description

459 556 antages att immunkomplexen förorsakar allvarliga symptom genom olika mekanismer, t ex genom acceleration av finbrinoid- avsättningen på de skadade vävnaderna.

För behandling av dessa immunkomplexsjukdomar användes allmänt fysioterapi och plasmaersättningsterapi samt medicinsk behandling med steroider, immunsuppressiva medel, anti- inflammatoriska medel och liknande. Plasmaersättningsterapi är en av de mest tillförlitliga behandlingsmetoderna för av- lägsnande;av immunkomplex, som är en patogen faktor, men för- delarna med denna metod utnyttjas icke tillräckligt på grund av svårigheten att anskaffa det plasma som erfordras för plasma- ersättningen.

Omfattande undersökningar har genomförts för utveckling av en behandlingsmetod, som har samma verkan som plasma- ersättningsterapi utan att kräva plasma för ersättning. Man har härvid funnit, att pepsin och ett pepsinlíknande enzym i leukocyter sönderdelar immunkomplex specifikt inom ett neutralt pH-område utan att normala plasmaproteiner pâverkas. Pâ basis av denna upptäckt utvecklades ett behandlingsmedel för immun- komplexsjukdomar, vilket innehåller detta enzym såsom verksam beståndsdel; se japanska patentansökan 18429/1981 (PCT/JP82/ 00037). Föreliggande uppfinning utgör en förbättring av denna kända teknik, varvid immunkomplex kan avlägsnas utan att plasmaproteiners inre funktioner skadas genom att man behandlar plasma från en patient lidande av en immunkomplexsjukdom med immobiliserat pepsin.

Uppfinningen avser sålunda användning av pepsin eller ett pepsinliknande enzym härrörande från däggdjursleukocyter för framställning av ett material, innefattande det verksamma medlet immobiliserat på en farmaceutiskt godtagbar bärare, avlägsnande av immunkomplex ur blod eller plasma. för Eftersom huvudändamålet med plasmaersättningsterapi att avlägsna icke-dialyserbara patogena substanser ur en patients plasma, särskilt immunkomplex, kan behandling av patients plasma med det ovan angivna immobiliserade pepsinet ha samma verkan som plasmaersättning utan att plasmat behöver ersättas. Plasma från en patient med en immunkomplexsjukdom kan t ex underkastas extrakorporeal cirkulation genom'att plasmat - 459 556 ledes genom en kolonn fylld med det ovan angivna immobiliserade pepsinet, varvid endast immunkomplex avlägsnas ur plasmat utan att 'andra plasmaproteiner pâverkas. Eftersom man enligt uppfinningen icke behöver använda ersättningsplasma (fràn patienten eller någon annan person), behöver man dessutom icke riskera att biverkningar uppträder, såsom serumhepatit eller skadlig reaktion på grund av blodinkompatibilitet.

Det enligt föreliggande uppfinning använda pepsinet är ett känt enzym (Journal of Clinical Investigations, vol 27, p 818, 1§4Ä). Det immobiliserade pepsinet kan erhållas genom att man enligt någon lämplig metod renar pepsinogen förekomman- de i magsäcken, blodet, urinen, etc hos olika djur. Det renade pepsinogenet fixeras på en lämplig bärare, varefter det immobiliserade pepsinogenet aktiveras genom en syrabehandling.

Såsom pepsin för framställning av det immobiliserade pepsinet föredrages pepsin härrörande från människor, eftersom detta pepsin är säkrast och mest verksamt, men pepsin härrörande från andra djur än människor kan också användas, Såsom bärare för immobiliseringen föredrages bärare med liten förmåga att adsorbera proteiner, såsom Sepharose® (ett välkänt adsorptionsmedel från Pharmacia Fine Chemicals AB), agaros, glaspärlor, etc. ännu mera föredrages användning av pepsin immobiliserat på innerytan av fil- termembrafiet i en konstgjord dialysator, eller alternativt använ- des såsom bärare ett rör, såsom ett nylonrör, på vilket pepsin fixeras direkt. Kända metoder kan användas för immobiliseringen.

Man kan också använda ett immobiliserat enzym innefattande ett pepsinliknande enzym fixerat på en lämplig bärare, varvid de nade pepsinliknande enzymet erhålles genom att en ka av homogeniserade leukocyter från ett däggdjur ledes genon en kolonn av DEAE-cellulosa, som har bragts i jämvikt med O,1M acetat- o buffert (pH 5,3), varvid det pepsinliknande enzymet ads G-100 (ett välkänt adsorptionsmedel från Pharmacia Fine Chemicals AB), som har fått svälla i 0,9%-ig fysiologisk saltlösning.

Enligt den metod som har beskrivits av Seijfers et al.

(American Journal of Physiology, vol. 206, p. 1106, 1964) kan d t e immobiliserade enzymet t.ex. framställas genom att humanurin ledes I). genom en kolonn av DEAE-cellulosa, som har bragts i jämvikt me 459 556 4 0,1M acetatbuffert (pH 5,3), onnen. varvid pepsinogen adsorberas på ko- Pepsinogenet elueras sedan med samma buffert innehållande 0,3M natriumklorid. Eluatet koncentreras, och koncentratet renas ytterligare med hjälp av gelkromatografi med användning av Sephadex® G-100, som har fått svälla i 0,9%-ig fysiologisk saltlösning. Den renade produkten kopplas till Sepharose® genom användning av cyan- bromid så att immobiliserat pepsinogen erhålles. Pepsinogenet ak- lveras därefter under sura betingelser.

Enligt föreliggande uppfinning är det lämpligt att använda vad som kallas extrakorporeal cirkulation, där blodet från en patient lidande av en immunkomplexsjukdom ledes till en krets utanför kroppen. Antingen behandlas hela blodet med det ovan beskrivna immobilíserade pepsínet, eller så behandlas endast plasma separerat från blodet medelst en plasmaseparator med det immobiliserade pepsinet, varefter det behandlade plasmat åter förenas med de avskilda blodcellkomponenterna. lade blodet återföres till kroppen.

Det sålunda behand- Bebandlingen med det immobili- serade pepsinet genomföres företrädesvis pâ ettdera av följande sätt: (1) plasma avskilt i en plasmaseparator ledes genom en kclonn e . . @ q fylld med pepsin, som har fixerats pa Sepnarose -partiklar ler L. liknande; (2) blod eller plasma ledes genom ett inåligt rör, som uppbär imobiliserat pepsin på innerytan. Behandlingen är emeller- tid icke begränsad till dessa metoder.

För den extrakorporeala cirkulationen av blod är det lämpligt att använda en apparat bestående av en pump f r pumpning av blodet, en plasmaseparator för separation av plasma Ph ö rån blcdceller, och a en regulator för reglering av dessa anordning r. En användbar så- dan apparat är en apparat av typen konstgjord lever arbetande med perfusion av avskilt plasma [Noboru Inoue: Chiryogaku ( v01. s, p. 477, 1980]. vid detta fërfaranae an än es i" 1-100 mg, företrädesvis 5-50 mg, immobiliserat blod, men mängden immobiliserat pepsin kan varie beroende på halten immunkomplex. Föreliggande u ras i detalj i följande utföringsexempel.

L-:l Exempel 1. Destillerat vatten satt -es till 150 ml Sepharcse 43 (ett välkänt adsorptionsmedel från Pharmacia Fine Chemicals AE) till en total volym av 300 ml. Den resulterande blandningens pä- värde inställdes på 11,0 med 6N natriumhydroxidlösning. Till ' 5 459 556 blandningen sattes darefter 300 ml 2,5%-ig cyanbromidlösning, och den resulterande blandningens pH-värde hölls mellan 11,0 och 11,5 under 30 minuter, under det att temperaturen hölls vid 16°C.

Sepharose®-adsorptionsmedlet tvättades med destillerat vatten och med 0,1M natriumbikarbonatlösning för avlägsnande av cyanbromiden.

Både vattnet och natriumbikarbonatlösningen hade i förväg kylts till 5°C. Sepharose®-adsorptionsmedlet suspenderades sedan i 300 ml av samma lösning. Till 300 ml av suspensionen sattes 100 mg pepsinogen från humanurin, och blandningen fick reagera under för- siktig omrörning vid SOC under 16 timmar för framställning av immo- biliserat pepsinogen. Det immobiliserade pepsinogenetvaktiverades därefter vid pH 2,0 under 10 minuter så att det omvandlades till immobiliserat pepsin (1 mg per ml harts). 100 ml av det immobi- liserade pepsinet packades i en glaskolonn (4 x 8 cm). 100 ml hepariniserat plasma från patienter med reumatoid artrit och patienter med systemisk lupus erytematosus, vilka pa- tienter hade påvisats ha immunkomplex i blodet, leddes genom kolon- nen med immobiliserat pepsin med en hastighet av 30 ml per timme (kolonnen hade i förväg värmts till en temperatur av 37°C}. Med användning av aggregat av humant IgG såsom standardsubstans be- stämdes halterna av immunkomplex i plasmat före och efter behand- lingen genom hemolysreaktion av erytrocyter från får i när'aro av komplgment från marsvin enligt den metod som har beskrivits av Fust et al. (Atherosclerosis, vol. 29, p. 181, 1978). Dessutom bestämdes halterna av albumin och 7-globulin i plasmat före och efter behandlingen genom elektrofores med användning av ett cellu- losaacetatmembran (Ikagaku-jikken Koza, Lectures on Experiments in Medical Chemistry, vol. 5, p. 201, 1973). De erhållna resul- taten är sammanställda i tabellerna 1 och 2 nedan.

Vid båda sjukdomarna minskade halten immunkcmplex i plasm t, när plasmat leddes genom kolonnen av immobiliserat pepsin, under det att de normala plasmaprcteinerna icke undergick några föränd- ringar. 459 556 6 Tabell 1 Sjukdom Plasma Immunkomplex-halt nr (ng/ml) Före behandling Efter behandling Éeumatoid artrit 1 184 63 2 125 <5O 134 <50 Systemïsk']upus _ _- erytematosus 1 403 '123 ' 253 71 3 196 <50 Tabell 2 Sjukdom Plasma Albumin Y-globulin , nr (9/dl) (g/dl) § före be- efter be- före be- efter be-É handling handling handling handling § Reumeteia ererie 1 4,3 I , 0,8 f 2 4,9 , 1,0 1,0 ' _; 3 5,0 , 1, 1,2 Systemisk lupus 1 4,8 1,3 1,3 É erytematosus 2 5,0 I 1,3 1'3 É 3 5,1 5,1 1,2 1,2 i Exemgel 2. S00 mg aminopropylerade glaspärlor suspenderades i 10 ml vatten, och den resulterande susçensionens pä-värde inställ- des på 10 med en SN vattenlösning av natriumhydroxid- Till suspen- sionen sattes 15 ml tetrahydrofuranlösning innehållande 1,5 g cyan- bromid, och blandningen hölls vid pH 10 under en tid av 10 minuter, under det att en SN vatt enlösning av natriumhydroxid tillsattes med lämpliga mellanrum. Glaspärlorna uppsamlades genom filtrering och tvättades med O,1H natriumbikarbonatlësning. De sålunda behandlade glaspärlorna suspenderades i en lösningsmedelsblandning bestående av 25 ml 0,1M vattenlösning av natriumbikarbonat och 25 ml metanol, vi kan blandning innehöll 3 mol metyl-11-aminoundekanoat-hydroklo- rid. _ . . o l . H Suspensionen fick reagera vid 4 C over natten, varvid gn- . 7 459 556 värdet hölls vid värdet 9. Glaspärlorna uppsamlades genom filtre- ring, tvättades med vatten och metanol, och suspenderades i 20 ml absolut metanol. Till den erhållna suspensionen sattes 1 ml hyd- razinhydrat, och blandningen omrördes under 3 timmar. Glaspärlorna tvättades med i tur och ordning metanol, 0,1N saltsyra och vatten.

Därefter suspenderades pärlorna i 20 ml IN saltsyra: Till suspen- sionen sattes 280 mg natriumnitrit, och blandningen fick reagera under omrörning vid OOC under 20 minuter.

Efter avslutad reaktion tvättades glaspärlorna med en liten mängd vatten, varpå de suspenderades i 20 ml 0,1M vattenlösning av natriumbikarbonat (pH 8). 50 mg svin-pepsinogen tillsattes och löstes i suspensionen, och blandningen fick reagera under omrörning vid 4oC över natten. Det sålunda erhållna immobiliserade pepsino- genet aktiverades vid pH 2 genom värmning under 10 minuter för om- vandling till immobiliserat pepsin. Detta suspenderades i 10 ml 0,15M fysiologisk saltlösning och packades i en glaskolonn (1 x 8 cm). 10 ml hepariniserat plasma innehållande immunkomplex från patienter lidande av reumatoid artrit eller systemisk lupus ery- tematosus leddes genom den fyllda kolonnen med en hastighet av 3 ml per timme. På samma sätt som i exempel 1 bestämdes immunkomp- lexhalten i plasmat och halterna av andra plasmaproteiner före och efter behandlingen. Resultaten är sammanställda i tabellerna 3 och 4 nedanfê vid båda sjukdomarna minskade immunkomplexhalten i plasmat, Fl när plasmat leddes genom kolonnen med immobiliserat pepsi , unde I! det att de normala plasmaproteinerna icke undergick några föränd- ringar. 459 5-56 s Tabell 3 Sjukdom Plasma Immunkomplex-halt nr (ng/ml) före behandling efter behandling Reumatoid artrit 1 193 58 167 65 - 143 <50 Systemisk_lupus 1 353 134 erytematosus 2 296 -_-38 _ 199 <50 Tabell 4 S.uk¿On Plasma Albumin 1-globulin 3 ” nr (9/dl) (Q/dl) före be- efter be- före be- efter be handling handling handling handling Reumatoid artrit 4,8 0,9 0,9 2 , 4,7 ,O 1,0 , 5,0 1, 1,0 Systemršk lupus 1 , 4,3 1,2 1,2 erytematosus 5,1 5,] 1,2 1,2 , 5,0 1,2 1,2 Exemoel 3. Ett nylonrör med en längd av 15 cm och en inner- _________ diameter av 3 mm nedsänktes i ett vattenbad termostaterat till 35°C. Rörets inre fylldes därefter med 4,5N saltsyra, tion fick äga rum under 15 minuter. och reak- Rörets insida tvättades med destillerat vatten och med 0,2M natriumbikarbonatlösning (pH 9,4).

Rörets inre fylldes därefter med en lösning av 5% glutaraldehyd i ion fick äga rum under 20 mi- Rörets inneryta tvättades därefter med tillräckligt med 0,05M fosfatbuffert (pH 8,0), oc den ovan angivna lösningen, och reakt nuter. h en lösning av 5 mg uropepsincgen från råtta i fosfatbufferten cirkulerades genom röret med en has- tighet av 0,2 ml per minut under 2 timmar för fixering av pepsino- ' 9 459 556 genet på rörets inneryta. Rörets inneryta aktiverades därpå genom behandling med saltsyralösning (pH 2) under 10 minuter för omvand- ling av pepsinogenet till immobiliserat pepsin.

Enligt den metod som har beskrivits av Suzuki et al., Folia Pharmacologica Japonica, vol. 68, p. 572 (1972) injicerades anti- ràttnjurserum från kanin intravenöst till hanråttor av Wistar-stam i en dos av 5 ml/kg för framkallande av nefrit. Man använde 6 råttor i varje grupp. 21 dygn efter det att nefriten hade fram- kallats infördes tvâ med heparin behandlade injektionsnålar i .als- venen hos varje råtta och fästes däri. En extrakorgcreal k bildades genom att de två injektionsnålarna hopkopplades me s det ovan beskrivna röret, och cirkulation fick äga rum med en has- tighet av 2 ml/timme under 4 timmar. Kontrollförsök genomfördes på samma sätt med användning av ett rör som icke innehöll något immobiliserat pepsin. På samma sätt som i exempel 1 bestämdes immunkomplexnalterna i blodet efter den extrakorporeala cirkulatio- nen. Resultaten är sammanställda i nedanstående tabell 5.

Immunkomplexhalten i blodet minskade kraftigt, när blodet fick cirkulera genom ett rör, på vars inneryta peçsin var immobil;~ sei-at.

Tabell 5 " _; Immunkomplex-halt I (tg/ml) xancrolibenandiing 283 I 29 Behandling med immobiliserat pepsin 195 É 11* * p < 0,05 Exemgel 4. En plasmaseparator av filtreringstyp med ihåliga trådar av cellulosaacetat anslöts till kubitalvenen hos var och en av 5 vuxna hundar bedövade med pentobarbital (kroppsvikt 10-15 kg).

Den i exempel 1 framställda kolonnen av immobiliserat pepsin an- slöts till en hepariniserad perfusionskrets för plasma, och plasmat infördes i kretsen med en reglerad strömningshastighet av 30 ml per timme med hjälp av en pump med reglerbar strömningshastighet (Perista-pump Ato). Efter passagen genom kolonnen av immobiliserat pepsin förenades plasmat med de tidigare avskilda blodcellkomponen- terna,och blodet àterfihfles till kroppen genom en extrakorporeal cirkulationskrets bildad med kubitalvenen på andra sidan. Lösligt 459 556' 10 immunkomplex (framställt vid ett förhållande mellan humant IgG och anti-human-IgG kaninantikropp av 4:1) injicerades intravenöst i lârvenen i en dos av 40 mg/kg på en tid av 3 timmar med hjälp av en kontinuerlig ínfusionsspruta (Truth typ A-II). Z genomfördes på samma sätt med anv Kontrollförsök u . ® andning av en Sepharose -kolonn fri från immobiliserat pepsin. Tre timmar efter det att den extra- korporeala cirkulationen hade påbörjats bestämdes immunkomplexhal- ten i plasmat på samma sätt som i ešempel 1. nedanstående tabell 6.

Resultaten visas i När plasmat leddes genom kolonnen av immobiliser at peçsin, minskade immunkomplexhalten i plasmat kraftigt.

Tabell 6 I Immunkomplex-halt (ng/ml) Kontrollbehandling 343 i 27 aannaiing med imnobiiiserat pepsin 105 É 11** ** p < 0,01 Exemsel S. 100 mg humant gastriskt pepsinogen fixerades med användning av cyanbromid på innerytan av ett fil termembran i en konstgjord dialysator med ihåliga fibrer (Dow-à Ccrdis) och akti- verade§¿därefter med saltsyra med pH 2,0 under 10 minuter för om- vandling till immobiliserat pepsin. 200 ml (5 fall) hepariniserat blod innehållande immunkomplex cirkulerades genom den konstgjorda dialysatorn med en hastighet av 10 ml per minut. Kontrollförsök genomfördes på samma sätt med användning av en konstgjord dialysa- tor som icke innehöll något immobiliserat pepsin. Efter 2 timmars cirkulation avskildes plasmat, och immunkomplexhalten bestämdes enligt den metod som anges i exempel 1. De erhållna resultaten visas i nedanstående tabell 7.

När blodet fick cirkulera genom dialysatorn innehållande immobilïserat pepsin, minskade immunkomplexhalten i blodet kraftigt.

Tabell 7 F Immunkomplex-halt (pg/ml) Kontrollbehandling . 203 i 19 Behandling med immobiliserat pepsin 128 i 17* * p < 0,05

Claims (6)

- 459 556 11 Såsom framgår av ovanstående exempel minskar det immobiliserade pepsinet mängden immunkomplex i blod utan att på något sätt påverka normala plasmaproteiner. Immunkomplex i blodet hos en patient med en immunkomplexsjukdom kan därför avlägsnas utan att blodets fysiologiska funktioner skadas genom att blod eller plasma från patienten behandlas med det immobi- liserade pepsínet, varefter det behandlade blodet eller plasmat áterföres genom perfusion till patientens kropp. Detta är ytterst betydelsefullt, eftersom det innebär att användning av det immobiliserade pepsinet och förfarandet för avlägsnande av immunkomplex kan ge samma resultat som erhålles genom plasma- ersättningsterapi utan att plasma för ersättning erfordras. P a t e n t k r a v

1. Användning av pepsin eller ett pepsinliknande enzym härrörande från däggdjursleukocyter för framställning av ett material, innefattande det verksamma medlet immobiliserat på en farmaceutiskt godtagbar bärare, för avlägsnande av immunkomplex ur blod eller plasma.

2. Användning enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d a v att det;verksamma medlet är pepsin härrörande från humanurin.

3. Användning enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d a v att det verksamma medlet är pepsin härrörande fràn ett annat djur än människa.

4. Användning enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k - n a d a v att bäraren är Sepharose , agaros eller glas- pärlor.

5. Användning enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k - n a d a v att bäraren innefattar ett filtermembran i en konstgjord dialysator.

6. Änvändning enligt krav I eller 2, k ä n n e t e c k - n a d a v att bäraren innefattar en inneryta av ett rör. q-