SE458367B - Stav foer oeverfoering av en foerutbestaemd maengd bakterier jaemte saett haerfoer - Google Patents

Description

458 567 10 15 20 25 so 35 2 nämnes McFarland-standard).

Mueller-Hinton- En platta, som innehåller agar bestryks sedan med bakteriebuljong- suspensionen med användning av en bomullslapp. När in- okulatet har torkat appliceras en pappersskiva, som inne- håller ett antibiotiskt eller kemoterapeutiskt medel, på agarn. Plattorna inkuberas över natten och det område runt varje skiva där bakterietillväxt saknas, mäts. Detta område är känt som inhiberingszonen och används för att bestämma vilket antibiotika som är användbart för att bekämpa den särskilda bakterien.

För att Kirby-Bauer-tekniken skall vara noggrann måste det finnas ungefärligen l x 108 CFU/ml i det medium som stryks ut på agarplattan. Vanligen bestäms tillväxt- nivàngenonrvisuell jämförelse med den ovan beskrivna McFarland-standarden. Tidrymden för att nå denna bakterie- koncentration kan variera från 2 till 8 h beroende på bakterien. Om bakterien tillåts växamed mer än l x 108 CFU/ml och blir grumligare än McFarland-standarden, mäste mediet spädas för att vara ekvivalent med standarden.

En annan metod för att bestämma känsligheten hos bak- terier för olika antibiotika kallas för MIC-testet (MIC = = Minimum Inhiberande Koncentration). Detta test diskute- ras i Current Techniques for Antibiotics Susceptibility Testing, Albert Balows, 1974, sid 77-87. Denna metod in- begriper framställning av en serie koncentrationer av ett antibiotika, antingen i ett flytande eller fast medium, som underhåller tillväxten av tas. Flytande medier fördelas fasta medier hälls vanligen i att iordningställa ett omrâde den bakterie som skall tes- lämpligen i provrör och petriskålar. Det är praxis av antibiotikakoncentrationer spädningar för att genomföra testet. Varje provrör eller petriskâl inokuleras med bak- terien ifråga. i form av en serie tvåfaldiga Efter en inkubationsperiod observeras bak- terietillväxten eller frånvaron av bakterietillväxt för varje antibiotikakoncentration. På detta sätt bestäms MIC för antibiotikan till den närmsta utspädningen vid använd- ning i serie. Detta är den noggrannaste metoden för att bestämma den inhiberande koncentrationen. Denna metod blev- lO 15 20 25 30 35 458 367 3 emellertid inte populär förrän nyligen då det mödosamma spädningsarbetet förenklades. Den utspädda antibiotikan inokuleras vid MIC-testet med bakterie i ett visst kon- centrationsomrâde, dvs vanligen 105 - 106 CFU/xnl. Buljong, som innehåller bakterier som odlats till ekvivalens med McFarland-standarden, dvs ungefärligen 1 x 108 CFU/ml, späds för att erhålla denna koncentration.

De ovan angivna känslighetstesterna, liksom andra tester för att bestämma typen av bakterie eller dess känslighet gentemot antibiotika, kräver att en viss för- utbestämd bakteriemängd utnyttjas vid testet för att in- okulera de plattor, på vilka pappersskivan skall placeras när det är fråga om Kirby-Bauer-testet eller för att in- okulera det utspädda antibiotikat när det är fråga om MIC-testet. Detta krävs för att testet skall vara nog- grant. Om en mindre bakteriekoncentration används vid testet, skulle resultatet indikera att bakterien är mera känslig för att antibiotika: än vad den faktiskt ar. om ä andra sidan bakterien föreligger i en högre koncentra- tion, skulle testresultatet indikera att en högre koncen- tration av antibiotikat krävs för att inhibera tillväxt av bakterien. Båda indikationerna skulle vara felaktiga.

Förattde ovannämnda testernaellermotsvarandetester skall utföras, är det nödvändigt att en laboratorietekni- ker tar ett bakterieprov från 4-5 bakteriekolonier från den agarplatta, på vilken bakterien har odlats, och place- rar provet i ett buljongodlingsmedium, såsom beskrivits ovan, i 2-8 h. Mediumet kontrolleras periodiskt för att bestämma huruvida bakteriekoncentrationen är ekvivalent med McFarland-standarden eller ej. Vid en visuell under- sökning av mediumet finner man att vissa bakteriekulturer inte har växt till rätt koncentration, medan andra har växt förbi den riktiga koncentrationen. Det förra fallet erfordrar att laboratorieteknikern låter bakterien växa längre, medan det senare fallet erfordrar en spädning för att återföra koncentrationen till samma koncentration som hos standarden. Alla dessa åtgärder är mödosamma och tidsödande. 458 367 10 15 20 25 30 35 4 Föreliggande uppfinning hänför sig till en stavanord- ning, som medger upplockning av en viss förutbestämd bakteriemängd fràn bakteriekolonier. Den upplockade bak- teriemängden kan därefter inokuleras på ett tillväxt- begränsande medium, som kommer att beskrivas närmare nedan. Staven enligt uppfinningen kännetecknas därav, att den väsentligen utgöres av ett stavliknande organ, som har en toppände och en undre spets för kontakt med bakteriekolonin, vilken undre spets har minst en ränna i spetsens understa ände, vilken ränna har förmåga att indraga en förutbestämd bakteriemängd genom kapillärverkan.

Uppfinningen hänför sig även till ett sätt att upp- plocka en förutbestämd bakteriemängd från ytan av en koloni av nämnda bakterier, kännetecknat därav, att spetsen hos ett stavliknande organ med en toppände och en undre spets för kontakt med bakteriekolonin, vilken undre spets har minst en ränna i spetsens understa ände, bringas i kontakt med nämnda yta, varigenom en förutbestämd bak- teriemängd indrages i rännan genom kapillärverkan.

Ytterligare kännetecken hos uppfinningen framgår av de efterföljande patentkraven.

Den med hjälp av staven och sättet enligt uppfin- ningen upplockade, förutbestämda bakteriemängden inokuleras med fördel på ett odlingsmedium av det särskilda slag som beskrivs närmare i det följande.

Detta medium medger odling av bakterier, men begränsar den koncentrationsnivà vartill bakterierna tillväxer.

Närmare bestämt medger detta vattenhaltiga medium odling av minst en art från två olika släkten av aeroba, patogena, snabbväxande bakterier från en begynnelsepopulation till en bestämd slutpopulation, vid vilken tillväxten av bak- terien i huvudsak upphör på grund av näringsbrist i medi- umet. Bakterien förblir lívsduglig i mediumet i minst 18 h. Mediumet innefattar en vattenlösning, som inbegriper en kolkälla, en kvävekälla, vitaminer och mineralämnen i tillräcklig mängd för att åstadkomma nämnda tillväxt och i en form, som är användbar för bakteriernas tillväxt. 10 15 20 25 30 35 458 367 5 De bakterier, för vilka mediumet är användbart, är aeroba bakterier, dvs de som utnyttjar syre för sin till- växt. Bakterierna är också patogena i det att de förorsakar sjukdomar och de är snabbväxande i det att de har genera- tionstid av 50 min eller mindre.

Mediumet är användbart vid både gram-negativa och gram-positiva, aeroba, patogena, snabbväxande bakterier.

Typen och mängden av de olika beståndsdelarna i mediumet skiljer sig emellertid vanligen för gram-positiva och för gram-negativa bakterier, och den tidsperiod som krävs för att erhålla erforderlig koncentration för de gram-positiva tenderar att vara längre än den för gram-negativa bakte- rier.

Odlingsmediet är användbart för odling av minst en art från två olika släkten av aeroba, patogena bakterier. Nor- malt kan mediumet odla minst en art från två släkten av gram-positiva bakterier eller minst en art från minst två släkten av gram-negativa bakterier. Bland gram-positiva, aeroba bakterier finns tvâ släkten, som inbegriper de bak- terier, vilka förorsakar de flesta sjukdomar, för vilka normal bakterie- och känslighetstestning utföres. Dessa släkten är Staphylococcus och Streptococcus. Om mediet kan odla arter från vart och ett av dessa båda släkten, kan man enkelt testa bakterierna för att bestämmacnndenär gram- positiv eller gram-negativ med användning av ett gram- färgningstest. Om bakterien är gram-positiv används me- diumet för odling av grampositiva bakterier och bakte- rien odlas till den önskade nivån, såsom till ekvivalens med McFarland-standarden.

Om bakterien konstateras vara gram-negativvidanvänd- ning av gramfärgningstestet, kan bakterien höra till ett mycket större antal släkten. 16 släkten representerar de bakterier som befunnits förorsaka 99 % av de sjukdomar som orsakas av gram-negativa, aeroba bakterier.Dessagram- negativa släkten inbegriper: Escherichia, Shigella, Edward- siella, Salmonella, Arizona, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Yersinia, Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella och Pasterurella. 458 367 10 15 20 25 30 35 6 Bakterierna tillväxer i mediet från en viss popula- som normalt uttrycks såsom CFU enligt definitionen ovan och som normalt hänförs till populationen i en viss volym av mediet, dvs CFU/ml. Begynnelsekoncentrationen kan vara så låg som l CFU, men är normalt och föredraget minst s x 106 cpu/ml. tion, Att man startar med en lägre begynnelsepopulation eller -koncentration gör inte att bakterierna tillväxer i mediet till en väsentlig annorlunda slutpopulation eller -koncentration än vid högre begynnelsekoncentration, men påverkar den tid det tar för att slutkoncentrationen skall uppnås. Om inkubationstiden skall regleras, måste sålunda begynnelsekoncentrationen regleras. Den slutkoncentration vartill bakterierna skall odlas benämnes den stationära fasen.

Såsom diskuterats ovan, varierar tiden för att nå en koncentration ekvivalent med McFarland-standarden i enlig- het med förfarandet från 2 till 8 h, varvid de flesta bakterier tar minst 5 - 6 21 för att nå denna koncentra- tion. Med det tillväxtbegränsande mediet när bakterierna företrädesvis slutkoncentrationen eller den stationära fasen inom 5 h. Om bakterierna när den stationära fasen på 2 h med det tillväxtbegränsade mediet, förblir bakte- rierna vid denna fas även cm man inte kontrollerar mediet under 5 h och ingen spädning erfordras för att erhålla en koncentration, som är ekvivalent med McFarland-stan- darden. 5 När den stationära fasen eller slutkoncentrationen är uppnådd upphör i huvudsak bakterierna: tillväxt. Detta beror på utarmning av minst ett näringsämne, som är kri- tiskt för den kontinuerliga tillväxten av bakterien och inte på bildning av toxiska biprodukter från bakterien, vilka stoppar tillväxten och kan förorsaka att popula- tionen minskar väsentligt. Med de standardmedier, som använts tidigare och som beskrivs i Kirby-Bauer- -förfarandet, bestäms den bakteriepopulation som skall näs för att tillväxten skall upphöra av toxiska biproduk- ter från bakterien. Denna bakteriepopulation ligger över 10 l5 20 25 30 35 458 567 McFarland-standarden.

Slutkoncentrationen eller den maximala stationära fasen erhålles på grund av utarmning av ett eller flera näringsämnen. Vid denna punkt planar antalet livskraftiga CFU/ml ut och förblir i huvudsak oförändrat under minst 18 h. Bakterierna förblir livskraftiga under en tidsperiod, som är användbar för att utföra de olika tester som skall utföras på bakterien, såsom beskrivits ovan. Normalt är den tidsperiod, under vilken bakterierna är livsdugliga, minst 18 h.

Den önskade slutkoncentrationen för de flesta bakte- rier ligger mellan 6 x 107 och 3,0 x 108 CFU/ml. Detta är ekvivalent med 0,5 McFarland-standarden. Medlet kan modi- fieras för att ge andra önskade koncentrationsnivåer.

Mediet innehåller olika typer och mängder av bestånds- delar beroende på den önskade slutkoncentrationen av bak- terierna och den typ av bakterie som odlas. I samtliga fall förefinnes en kolkälla och kvävekälla, som tillför kol och kväve i en form, som är användbar vid bakterieod- lingen. Normaltförefinnesävenvitaminerocnndneralämnen.Så- som påpekats, är emellertid mängden av en eller flera av dessa beståndsdelar begränsad för att åstadkomma att bak- terien når en förutbestämd slutkoncentration och därefter i huvudsak upphör att tillväxa.

För de gram-negativa bakterierna inbegriper ett föredraget medium cirka 0,42-0,70 mg kol per milliliter medium. Kolet föreligger i en form, som är användbar för bakterieodling. Denna form har befunnits vara den, vari kol föreligger i pepton eller en motsvarande form. Det föredragna mediet inbegriper också 0,09-0,15 mg kväve per milliliter medium i en form, som motsvarar det kväve som finns i pepton. Det föredragna mediet har ett pH-värde av cirka 7-8. Vid proteospepton är kolhalten cirka 0,16-O,27 mg kol per milliliter medium, kvävehalten är 0,035-0,056 mg kväve per milliliter medium och kolet och kvävet föreligger i den form som de finns i proteospepton eller i en motsvarande form. En typisk analys av peptonen anges nedan: 458 567 8 Procent Pegton Pr0fB0S29Ei0D Totalt kväve 16,16 ' 14,37 Primärt proteos N 0,06 A 0,60 Sekundärt proteos N 0,68 4,03 5 Pepton N 15,38 9,74 Ammoniak N ' 0,04 0,00 Fri amino 3,20 2,66 Amia N 0,49 0,94 Mono-amino N 9,42 7,61 10 Di-amino N 4,07 4,51 Tryptofan 0,29 0,51 Tyrosin 0,98 2,51 Crystin 0,22 0,56 Organiskt svavel 0,33 0,60 15 Oorganiskt svavel _ 0,29 0,04 Fosfor 0,22 0,47 Klor - 0,27 3,95 Natrium 1,08 2,84 Kalium _ 0,22 0,70 20 Kalcium 0,058 0,137 Magnesium 0,056 0,118 Mangan noll 0,0002 Järn 0,0033 0,0056 Aska 3,53 9,61 25 Eterlösligt extrakt 0,37 0.32 Reaktion, pH 7,0 L 5,8 pH 1 % lösning i destillerat vatten efter autoklavering 15 min vid 121°c. 10 15 20 25 30 35 458 367 9 Den föredragna sammansättningen innehåller de vita- miner och mineralämnen som återfinnas i pepton eller protecspepton. Två särskilt föredragna sammansättningar, vilka har befunnits vara användbara vid odling av gram- negativa bakterier till en slutkoncentration av från 6 x 107 till 3 x 108 CPU/ml på mindre än 5 h, innefattar en blandning av 1000 ml vatten innehållande 0,8 g pepton eller 0,3 g proteospepton, 0,03 g dextros, 2,5 g dikalium- fosfat, 1,25 g monokaliumfosfat och 5,0 g natriumklorid.

Fosfaterna tillsätts som buffertmaterial för att hålla kompositionen vid ett pH-värde av cirka 7,0. Euffring är nödvändig vid vissa bakterier. De ovannämnda båda samman- sättningarna skapar ett medium, på vilket arter från de flesta av släktena hos de gram-negativa, aeroba, patogena bakterierna kan odlas till de ovan beskrivna CFU/ml-områ- dena på 5 h om bakteriens begynnelsekoncentration är till- räcklig, dvs minst cirka 5 x 106 CFU/ml.

Såsom påpekats, är det föredragna kol- och kvävekäl- lorna pepton och proteospepton för de gram-negativa bakte- rierna. Neopepton, trypton och polypepton kan också använ- das, men man har funnit att dessa inte alstrar tillväxt till nivån hos McFarland-standarden inom samma tidrymd och att de inte tillhandahåller de rätta näringsämnena för att odla vissa gram-negativa bakterier i väsentlig omfattning.

Dessa material är därför användbara för ett mera begränsat antal bakterier. Kombinationerna av sådana material med pepton eller proteospepton kan emellertid användas för att skapa ett medium, som är användbart vid ett större antal bakterier.

Ett föredraget medium för användning vid gram-positiva bakterier inbegriper en lösning av 1000 ml vatten innehål- lande 1,7 g tryptikas, 0,3 g fyton, 0,25 g dextros, 0,5 g natriumklorid och 0,23 g dikaliumfosfat.

Alla de olika medierna används genom att inokulera mediet med bakterien och inkubera mediet under 2-8 h. 458 567 10 15 20 25 30 35 10 Genom att utnyttja staven enligt uppfinningen kan sålunda en viss förutbestämd bakteriemängd upplockas från en bakteriekoloni och därefter överföras till det ovan beskrivna tillväxtbegränsande mediet. Detta medger att även tidrymden för bakterieodlingen kan förutbe- stämmas. För att erforderlig växt skall ske inom den föredragna tidrymden av 5 h för de gram-negativa bakte- rierna måste begynnelsepopulationen vara minst cirka s x 106 cFu/ml.

Med hjälp av en anordning, som innefattar (a) ett kärl, som innehåller ett förråd av odlingsmedium med förmåga attt odla bakterien från begynnelsepopulationen till en förutbestämd slutpopulation och vilket kärl har en öppning; (b) en stav enligt uppfinningen inuti kärlet för att erhålla en känd bakteriemängd från minst en tillväxtkoloni av bakterien utanför kärlet och för att inokulera odlingsmediet; och (c) avtagbara medel för att täcka öppningen i kärlet för att bevara steri- liteten inuti kärlet, för att medge avlägsnande av nämnda bakterieerhållande medel för att erhålla nämnda kända bakteriemängd från bakteriekolonin utanför kärlet, vilken bakterie används för att inokulera mediet, samt för att tillsluta kärlet under inkuberingen av det inoku- lerade mediet, åstadkommes en anordning för odling av bakterier från en begynnelsepopulation till en bestämd slutpopulation, vid vilken tillväxten av bakterien i huvudsak upphör på grund av brist på näringsämne.

En sådan anordning, som innefattar staven enligt uppfinningen, skall beskrivas mera i detalj med hänvis- ning till de bifogade ritningarna. På dessa är fig l en sektionsvy med delarna isärförda av anordningen.

Pig 2 är en perspektivvy av anordningen med delarna sektionerade. Fig 3 är en vy av en del av staven enligt uppfinningen. Fig 4 är en vy av staven i fig 3 med in- förlivade bakterier. Fig 5 är en sektionsvy av anord- ningen strax efter inokulering av odlingsmediet med 1D 15 20 25 30 35 458 367 ll bakterier. Fig 6 är en sektionsvy av anordningen längs linjen 6-6 i fig 5. Pig 7 är en sektionsvy av anordningen ¿ efter inokulering av inkubering till den maximala sta- r tionära fasen eller det förutbestämda odlingsstadiet.

Fig 8 visar en sektion av anordningen i fig 7 längs J linjen 8-8. l Anordningen inbegriper ett kärl eller en hylsa 1, som är gjord av transparent, deformerbart material, såsom polypropen, polyamid, cellulosaacetatbutyrat eller olika polyestrar. Inuti hylsan l finns en glas- ampull 2, som inrymmer det tillväxtbegränsande mediet 3, såsom beskrivits ovan. Glasampullen, som skall be- skrivas senare, är spröd, dvs den bryts sönder när den deformerbara hylsan l pressas samman. Intill ampullen 2 hos anordningen finns en stav 4, som innehåller en av- smalnande ränna 5, vilken skall beskrivas mera i detalj i samband med fig 3 och 4. Staven 4 används för att plocka bakterier från de olika bakteriekolonierna och är utformad för att införa en förutbestämd bakteriemängd från kolo- nierna till den avsmalnande rännan 5. Staven 4 är fäst till ett lock 6. Både locket 6 och staven 4 är gjorda av plastmaterial, såsom polypropen. På insidanav locket6 finns tvâ âsar 7 och 8, vilka medger aseptisk tätning mellan locket 6 och hylsan l. Detta hindrar andra mikroorganismer från att intränga i hylsan l innan anordningen inokuleras samt under inkubationen. I locket 6 finns också tre stycken utsprâng 9, av vilka två visas i fig l. Dessa utsprâng skyddar hålet lO i locket 6 från att blockeras av krossat glas från ampullen 2 (som bildas när anordningen aktiveras) när den deformerbara hylsan l deformeras för att pressa ut eller utsöndra bakterierna och mediet 3 via hålet 10. Hålet lo är täckt med en tryckhäftande klisterremsa lllnedeuiflik 12 under tiden före användning av anordningen och till dess att inkubationen av anordningen är avslutad. Vid denna tid- punkt avlägsnas klisterremsan ll så att hålet 10 exponeras.

Detta medge: utsöndring eller utpressning av mediet 3 och 458 367 10 15 20 25 30 35 12 bakterier från hylsan l.

Fig 2 visar anordningen i dess normala form före användning, utom att den tryckhäftandc klisterremsan ll inte finns med. Såsom framgår av fig 2 är staven 4 be- lägen intill ampullen 2 och åsarna 7 och 8 är belägna intill den övre delen av hylsan l. Hålet 10 visas per- spektiviskt med den tryckhäftande klisterremsan ll av- lägsnad. Utsprången 9 är inte synliga i figuren. Glas- ampullen 2 har normalt dimensionerna 35,6 mm X 6,3 mm och innehåller cirka 0,6 ml odlingsmedium. Hylsan 1 är normalt 43,0 mm lång och 8,6 mm i diameter.

Ett viktigt drag hos anordningen är staven 4 med den av- smalnande rännan 5 . Rännan 5 visas mera i detalj i fig 3. Såsom framgår av fig 3 är rännan 5 avsmalnande. Rännan är utformad för attåstadkommakapillärverkan,varigenmnbakteriernaskjuts in i rännan 5. När bakterierna skjuts in genom att föra staven 4 vinkelrät mot kolonins yta så att den större än- den av den avsmalnande rännan 5 först bringas i kontakt börjar bakterierna att röra sig uppför rännan och luft bortgår från rännans avsmalnande ände. Vid en viss förutbestämd niv föras i rännan, med kolonin, å kan ytterligare bakterier inte in- eftersom bakterier som kontinuerligt tvingas in i rännan 5 rör sig ut vid rännans 5 topp i stället för att röra sig upp till den avsmalnande änden hos rännan 5. Fig 4 visar schematiskt bakterier 13 i rän- nan 5 vid den normala, fyllda nivån hos rännan. Rännan 5 är utformad för att tillåta en viss bakteriepopulation att införas i rännan. Denna population är vanligen ekvi- valent med åtminstone 5 x 106 bakterier per milliliter när bakterierna placeras i mediet hos anordningen. smalnande ränna, som är cirka 0,43 mm djup, En av- 0,25 mm bred tillåter den ovan- nämnda upptagningen. Rännan kan modifieras för att in- rymma andra önskade bakteriepopulationer. vid sin största ände och 3,1 mm lång, Användningen av anordningen kommer nu att beskrivas med hänvisning till fig 5-8. Fig 5 visar schematiskt i sektion an- 10 20 25 30 35 458 367 13 1 ordningaijstefterinokuleringavanordningenmedanvändning 1 avstaven4.Incket6haravlägsnatsfrànhylsanl,ochstaven4 harviadenavsmalnanderännæuSplockatuppen tillräcklig bakteriemängd för att inokulera anordningen, vanligen minst 5 x 106 bakterier, från 4-5 bakteriekolonier. Loc- ket 6 har satts på och via staven 4 och rännan S har bak- terierna placerats intill ampullen 2. Såsom visas i fig 5, har ampullen 2 krossats genom att deformera hylsan och bakterierna 13 anges schematiskt i det tillväxtbegränsan- de mediet 3. I denna form inkuberas anordningen normalt vid cirka 35°C erfordrar cirka 5 h för att uppnå den förutbestämda, före- under 2-8 h. Det föredragna odlingsmediet 8 dragna bakteriemängden, dvs från 6 x 107 till 3 x 10 I CFU/ml.l2fig Gvisas anordningen enligt fig 5 i sektion ; vid begynnelsestadiet av inkubation och fig 6 visar hyl- san l, som innesluter den krossade ampullen 2, odlings- mediet 3 och bakterierna 13.

Efter inkuberingen har anordningen den i fig 7 visade formen. I detta fall är anordningen precis som förut, bortsett från att bakteriepopulationen 13 har ökat betyd- ligt. Fig 8 är en sektion av anordningen i fig 7 vid detta stadium. Pig 7 illustrerar anordningen vid använd- ning efter inkubering och visar att remsan ll har avlägs- nats och att anordningen nu är färdig för utpressning av de odlade bakterierna via hålet 10. Anordningen hålles med hålet 10 nedåt, hylsan l pressas samman och deforma- ras och bakterierna 13 och mediet 3 pressas ut via hå- let lO. Krossat glas från ampullen 2 förhindras från att sätta igen hålet medelst utsprången 9.

Den avsmalnande rännan 5 i staven 4 kan varieras för att effektuera ett bakterieinokulat av annan storlek, så att den upplockade bakteriepopulationen är större eller mindre än den ovan beskrivna. Andra konfigurationer än en avsmalnande ränna kan användas vid föreliggande upp- finning så länge staven eller upplockningsorganet har för- måga att upprepat plocka upp en förutbestämd bakteriemängd.

Anordningen medger odling av bakterier från en viss för- utbestämd nivå, som bestäms av upplockningsorganet, till 458 367 10 20 25 30 35 14 en slutnivâ, som bestäms av det tillväxtbegränsande me- diet, på en viss tidrymd, vilken tidrymd bestäms av be- gynnelsepopulationen, det tillväxtbegränsande mediets sammansättning samt typen av bakterie. Vid användning i ett Kirby-Bauer-test eller MIC-test, föredrages det att anordningen odlar bakterierna på 5 h till en koncentra- tion av från cirka 6 x lO7 till 3 x 108 CFU/ml.

Den visade anordningen innehåller det tillväxtbe- gränsande mediet 3 i en glasampull 2. Andra modifieringar kan göras för att uppnå samma resultat. Så t ex kan an- ordningen utgöras av enbart en gängad hylsa med ett skruvlock, varpå staven är fäst. I detta fall föreligger det tillväxtbegränsande mediet inuti hylsan och inokule- direkt när locket sätts på hylsan. Bakterierna ploc- upp med staven och när staven placeras i mediet skru- ras kas vas locket åter på. Andra modifieringar inses av fack- mannen på området och innefattas i de efterföljande pa- tentkraven.

Den i fig l visade anordningen är gjord genom att gjuta och forma de olika glas- och plastkomponenterna.

Ungefär 0,6 ml av mediet 3 placeras i glasampullen 2 som värmeförseglas och ângsteriliseras under lO min vid l2l°C.

Hylsan 1, locket 6 och remsan ll gassteriliseras med etylenoxid under 3 h vid 38°C och luftas sedan under 8 h.

Den förseglade och steriliserade glasampullen 2 införas aseptiskt i hylsan l, locket 6 sätts på och remsan ll pressas på plats. Z I de efterföljande exemplen hänvisas till följande material och bakterier, vars källa anges nedan. I exemp- len hänför sig "odlingsanordning" till en anordning med de ovan beskrivna dimensionerna.

Trypton, ett enzymatiskt hydrolysat av kasein, Difco, Inc., Detroit, Michigan, USA.

Pepton, ett enzymatiskt hydrolysat av kasein, Difco, Inc., Detroit, Michigan, USA: A Dextros, Difco, Inc., Detroit, Michigan, USA.

Polypepton, ett enzymatiskt hydrolysat av kasein och djurvävnad, Bioquest, Inc., Baltimore, Maryland, USA. 10 15 20 25 30 35 458 367 15 Neopepton, ett enzymatiskt hydrolysat av protein, Difco, Inc., Detroit, Michigan, USA.

Proteospepton, ett enzymatiskt hydrolysat av protein, Difco, Inc., Detroit, Michigan, USA.

Salmonella typhimurium, American Type Culture Collec- (ATCC) Nr. 19028.

Shigella Sonnei, (ATCC 25331).

Enterobacter cloacae (ATCC 23355) och St. Paul Ramsey tion, Hospital, St. Paul, Minnesota, USA.

Klebsiella pneumoniae, (ATCC 23357) och St. Paul Ram~ sey Hospital, St. Paul, Minnesota, USA.

Proteus vulgaris (ATCC 6380).

Proteus mirabilis, St. John's Hospital, St. Paul, Minnesota and St. Paul Ramsey Hospital, St. Paul. Minne- USA.

Serratia marccscens (ATCC 8100) och St. Paul Ramsey sota, Hospital, St. Paul, Minnesota, USA.

Providencia species, University of Minnesota, Minne- apolis, Minnesota, USA.

Citrobacter species, University of Minnesota, Minne- apolis, Minnesota, USA.

Edwardsiella, University of Minnesota, Minneapolis, Minnesota, USA.

Arizona, University of Minnesota, Minneapolis, Minne- sota, USA.

Yersinia, University of Minnesota, Minneapolis, Minnesota, USA.

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) St. Paul Ramsey Hospital, St. Paul, Minnesota, USA.

Escherichia coli (ATCC 25922) och St. Paul Ramsey Hospital, St. Paul, Minnesota, USA.

Acinetobacter calcoaceticus, St. Paul Ramsey Hospital, St. Paul, Minnesota, USA.

Proteus morganii, St. Paul Ramsey Hospital, St. Paul, USA.

Enterobacter aerogenes, St. Paul Ramsey Hospital, Minnesota, St. Paul, Minnesota, USA. - 458 10 20 25 367 16 Pasteurella (species), St. Paul Ramsey Hospital, St. Éaul, Minnesota, USA.

'CDC Group II F, St. Paul Ramsey Hospital, St. Paul, Minnesota, USA.

Moraxella, St. Paul Ramsey Hospital, St. Paul, Minnesota, USA.

Citrobacter freundii, St. Paul Ramsey Hospital, St. Paul, Minnesota, USA.

EXEMPEL l Anordningar med de ovan beskrivna specifikationerna inokulerades med olika bakterier med användning av den avsmalnande rännan på staven hos anordningen. En begynnel- sekoncentration noterades för bakterien. Det tillväxtbe- gränsande mediet, som var inrymt i ampullen hos varje an- ordning, innehöll följande: 0,8 g pepton 0,03 g dextros 2,5 g dikaliumfosfat \ l,25 g monokaliumfosfat 5,0 g natriumklorid Lösningar av mediet innehållande 0,2 g pepton och 1,6 g pepton iordningsställdes ocksâ.

Fyra andra tillväxtbegränsande medier användes, vilka inbegrep proteospepton, trypton, neopepton och polypepton.

Dessa insattes i stället för peptonen i ovanstående samman- sättning. De resulterande begynnelsekoncentrationerna be- stämdes och var, räknat i CFU/ml, såsom anges i tabell l.

Värdena avser medelvärdet för 15 prover, dvs 5 prover för var och en av de tre sammansättningarna för varje medium. 458 567 17 »CH H CHN »CH H :HH »CH H H.H »CH H C_m~ »CH H H_C »CH H C_H, »CH H HH »CH H MHN »CH H HHH coumwmwfiøm »CH H ».m »CH H C.H »CH H C.C »CH H C_~ COQNGNONZ. .umH»xCHww Hm> »CH H C_H »CH H C.N »CH H C_~ »CH H H_m »CH H m.H »CH H C_~ »CH H C.m »CH H @.C »CH H »Hm »CH H CHH mmwmwmw H ÅAMQHÉ...

Noa NoH Noa Noa Noa Noa Noa Noa Nofl Noa Noa Noa X X uwumHøxosH nun umnmcøH w©um> >m ©mcxmm>< .nm>o uuH>Hmcm Eomww um mcHm»ummHuwuxmm m.» H_m H.~ m.H C.H C.C C.m CH» CHH »_H C_C H_N COUQÜWMOÜ&O.HÛ »CH H NCH »CH H CCH »CH M mHm »CH H.H_~ »CH H m_H »CH H CHC .»CH H C.C »CH H C.N »CH H C.H »CH H m.» »CH H m.H »CH H »_~ »CH H C_m »CH H C.H mmmmmm nHnmwHs> wzuuonm wHHmnnmm mHcHmnww dfifiøflmonmznw mcoHHn< nmvomnonaHu mmcosoøswmm mHHwcoeHmm CHHHn~HHz CCCHCHC mHocøuH>onm nmßomnonwucm Cafimflmnmax HHHCwHnm HHoo wHsoHnmnCmm 458 367 10 ß: UI 20 18 BXEMPEL 2 Följande material löstes i 1000 ml avjoniserat vat- ten och ångsteriliserades vid l2l°C i l5 min: 0,8 g pepton 0,03 g dextron 2,5 g dikaliumfosfat 1,25 g monokaliumfosfat 5,0 g natriumklorid Mediumlösningar innehållande 0,2 g pepton och l,6 g pepton iordningställdes också. Odlingsanordningar iord- ningställdes sedan med användning av vart och ett av me- dierna. Med utnyttjande av staven 4 hos odlingsanordningen plockades bakterier från 4-5, l8-25 h gamla bakteriekolo- nier av de olika bakterier, som anges i tabell 2. Fem od- lingsanordningar användes för varje bakterie för att er- hålla ett medelvärde för fem prover för varje bakterie.

Fjorton olika bakterier testades. Sålunda utnyttjades 70 stycken odlingsanordningar vid testet för vart och ett av de tre medierna. Varje odlingsanordning blandades un- der l0 s och inkuberades vid 35°C. Antalet livsdugliga bakterier räknades vid 0, 4, 5 och 6 h. Resultaten anges i tabell 2. 458 367 19 ' TABELL 2 6 Antal (x 107 CFU/ml) Bakterier Eid (h) Q 2 3 Q 3 g 1,5 q Escheríchia coli 0 1,6 1,äh 2,8 ß o,u 5,2 11,6 5 3,7 10,2 lU,ß 6 1,3 7,6 15,4 Shigella sonnei 0 H,2 3,62 1,2 ll 5,7 14,1! 15,8 5 8,1 17,0 19,8 6 6,0 12,2 21,0 Klebsiella pneumoniae O 2,6 2,86 2,6 4 5,3 13,4 11,6 5 u,9 13,6 13,6 6 u,9 12,0 16,0 Enterobacter cloacae 0 5,3 H,R 3,9 'å å” ååå šåå 2 6 afu 19,6 3826 -Providencia species 0 7,3 6,1U 9,1 ß 11,6 22,2 30,2 5 13,2 27,ü 38,6 6 13,2 22,8 39,8 Proteus mirabilis 0- ll ,2 11 ,66 S, lt 4 8,9 21,ß 21,ë 5 8,6 19,8 33,2 _ 6 9,7 2u,o 37,2 Salmonella typhimurium 0 2,3 2,32 3,8 , u 6,6 1É,ä 27,8 5 7 1 1 31 Q 6 6:8 1920 3312 Pseudomonas aeruginosa 0 1,0 0,7 0,5 ïš š'š ååä íårë 6 5,3 2614 29,2 Citrobacter species 0 3,8 31,0 6,6 'å 3% 33% šäå 6 1226 3111 3216 Arizona 0 1,1 1,H6 2,0 U H,l 15,2 16,0 5 u,9 16,0 21,8 6 u,9 17,6 26,2 458 367 '20 TABELL 2 (fortsättning) Antal (x 107 CFU/ml) 0,8 g 1,6 g 0,2 g Tid (h) Bakterier ons/Ö Edwardsiella Yersinia nU-HHSS Serrati marcescens Ûus/D Proteus vulgaris EXEMPEL 3 Exempel 2 upprepades, utom att pepton utbyttes mot polypepton. Resultaten anges i tabell 3.

TABELL 3 Antal (X 107 CFU/ml) 0,8 g 1,6 g 'Tid (h) Bakterier _ 0,2 g ons/D Escherichia coli 86|4Û oh. 56 Shigella Sonnei ÛhHSrD Klebsiella pneumoniae 458 367 21 »TABELL 3 (fortsättning) Antal (x 107 CPU/ml) §5§gg5¿g5 Tid_¿¿¿ 0,2 § 0,8 3 1,6 5 Enterobacter cloacae 0 3,2 3,2 1,3 ~ M 16,2 19,0 8,1 5 15,8 12,8 13,2 6 11,6 13,6 16,8 Providencia species 0 - - - (fel på inokulatetl U - - - 2 _ 5 _ _ _ 5 _ _ _ Proteus mirabilis 0 0,H6 0,U6 0, Ä 2,7 3,86 3, 5 7,6 1H,6 13, 6 7,5 10,6 11, Salmonella typhimurium 0 1,3 1,H 0, U 6,8 6,9 7, 5 10,0 11,8 10, 6 9,0 lU,l ll, Pseudomonas aeruginosa 0 5,8 7,7 5, Ä 8,0 8,3 ll, 5 - 22,2 zh, 6 7,5 20,3 23, Citrobacter species O l5,U 21,6 3U,2 M 16,6 22,0 22,2 5 1u,8 31,H 25,6 6 15,2 27,2 30,4 Arizona 0 3,7 4,0 3,2 H 5,3 6,6 5,6 5 6,6 13,2 12,5 Edwardsiella 0 Ingen tillväxt U Ingen tillväxt 5 Ingen tillväxt 5 Ingen tillväxt Yersinia 0 u,u 2,85 5,7 Ä U,ß 5,0 10,7 5 310 9,73 17,2 6 8,6 11,0 18,6 Serratia marcescens . 0 Ä,ü ü,6 H,l u 13,6 11,1 8,8 5 15,2 1u,h 10,1 6 15,u 15,0 13,6 .E oxoaocn o-q.=u> .bqggvfl w 458 367 22 TABELL 3 (fortsättning) Antal (x 107 CPU/ml) gšgterier Tid (6) o,2 g' o,s q 1,6 6 Proteus vulgaris O 4,5 2,64 1,4 É 6,9 7,92 4,2 5 15,5 15,4 11,3 6 16,5 8,0 15,3 EXEMPEL 4 Exempel 2 upprepades , utom att pepton utbyttes mot neopepton. Resultaten anges i tabell 4. ækn \D TABELL 4 Antal (X 1o7 cßu/ml) Bakterier Tid (h) 0,2 g 0,8 g 1,6 g Escherichia coli 0 0,8ü 1,0 0,5 H 0,5ü 0,6 0,3 § 1,8 _1,96 1,1 b 1,3 14,0 3,0 snlgeila sonnei o 1,8 .0,8 0,7 H 3,3 2,3 1,0 5 11,6 6,2 11,2 6 6,3 6,1 11,0 Klebsiella pneumoniae - 0 0,2 0,13 0,1 11 3,7 2,5 11.0 5 7,2 2,5 &,0 . 6 5,3 5,8 8,2 Enterobacter cloacae 0 Ingen tillväxt Å Ingen tillväxt 5 Ingen tillväxt 6 Ingen tillväxt Providencia species 0 0 U - 0,2 ' 6 ~ u _ O' 5 _ _ Û;7 6 1.19 _ 118 Proteus mir-anus o 2,0 1,0 11,2 1 6,3 8,5 6,8 5 1o,o 17,6 16,0 6 10,5 21,8 22,2 458 367 23 *TABELL 4 (fortsättning) Antal (x 107 can/ml) Bakteriër Tid (h) 0,2 g 0,8 g 1,6 3 salmonella cypn1mur10m 0 3,3 2,“ß 2,6 0 7,2 8,92 8,0 5 13,2 17,2 19,0 6 12,6 16,6 18,0 Pseudømonas aeruginosa O 0,2 0,16 0,2 H 1,8 5,9 4,9 5 5,3 9,5 9,5 5 7,2 18,0 16,0 Citrobacter species: 0 5,5 7,52 13,0 _ 1 7,0 7,01 _ 5 12,2 21,6 27,2 s 15,6 30,2 31,h Årizüna 'Û 3," 3,0 2,06 Ä 6,3 5,5 7,6 5 7,9 13,0 11,8 6 9,8 16,H 17,4 Yersinía 0 “,9 6,2" 5,0 u 6,0 10,7 10,8 5 9,7 15,5 15,0 6 10,u 20,6 21,0 Edwardsiella 0 Inga värden - U ' Inga värden 5 Inga värden 6 Inga värden Serratia marcescens 0 3,5 3,16 5,1 M 8,7 10,1 9,8 5 11,3 _ll,6 12,3 6 9,7 12,7 12,8 Proteus vulgaris 0 2,ü 3,56 2,0 Ä 5,5 12,5 8,1 5 8,6 23,8 16,H 6 10,7 20,1 23,2 EXEMPEL 5 Exempel 2 upprepades, utom att pepton utbyttes mot trypton. Resultaten anges i tabell 5. 458 367 2'4 TABE LL .å Antal (X 107 CFU ml) 0,3 9 0,2 g Tid (h) Bakterier On. EJCU Escherichia coli ÛhfiCJ/Ö Shigella sonnei ÛUSrD Klebsiella pneumoniae 0.456 Enterobacter cloacae O-Mxsrß Providencia species Proteus mirabilis Salmonella typhimurium 2 11; 13,0 2,52 11,0 10,u 3,4 10,0 11,0 01456 Pseudomonas aeruginosa 368Û 111 ÛuCJrO Citrobacter species nuurJrO Arizona .fa Bakterier Edwardsiella Yersinía Serratia marcescens Proteus vulgaris EXEMPEL 6 25 TABELL 5 Tid (h) O'\\J'\J='CJ O'\\J1-¥='O ChUï-DO O\\J'|J='O 458 567 1 6 _ -'.__fl MFP' TOIUP' l-“l-'l-l I\J(IJUJY°' Uïl-'UIUJ GDUJÖTU -EUJUJI-l unww wwfiw -- ON O'J\-OJ='C\ (fortsättning) §§;a1 0,2 q 0,8 q- o,78 0,85 2,3 1,9 3,1 2,3 2,9 2,8 2 0 1 58 5,1 518 6,1 8,42 7,1 12,8 3,2 fl,98 16,6 20,8 19,2 25,4 23,2 29,8 1,46 1,1 8,0 16,2 10,0 16,5 5\'I°I tucatuca cn::o\o xpzm Exempel 2 upprepades, utom att pepton utbyttes mot proteospeptøn. Resultaten anges i tabell 6.

Bakterier Escherichia coli Shigella sonnei Klebsiella pneumoniae Enterobacter cloacae TABELL 6 Tid (h) ßUïäO ChU1-B-'Ö GUI-PO O"\\J'1šO An:a1 (X 107 cF0/m1) 0,2_g 0,8 ¶ l,6¿g 2,2 1,78 1,9 -10,0 15,4 14,5~ 7,4 .22,0 22,0 7,6 20,4 29,0 6,9 6,38 4,6 14,0 23,2 20,6 13,4 20,0 20,8 13,8 25,4 33,4 4,1 3,52 3,5 12,6 15,2 15,4. 12,0 26,0 23,4 13,4 21,2 17,8 4,2 0,0 4,3 12,2 24,2 17,6 13,0 28,3 27.0- - 458 367 26 TABELL 6 (fortsättning} Antal (x 107 cFU/ml) 0,2 g Bakterier 0,8 9 1.6 9 Tid (h) OHfiSrO Providencia species Proteus mirabilis 01.456 Salmonella typhimurium Ons/U Pseudomonas aeruginosa ÛuRJ/D Citrobacter species OHHEJ/O Arizona Guns/O Edwardsiella hva-SG Yersinia Serratia marcescens ÛhHK/G Proteus"vu1gar1s 10 15 20 25 30 35 458 367 27 EXEMPEL 7 Resultaten som erhölls med det tidigare beskrivna mediet jämfördes med de resultat som erhölls med användning av ett konventionellt buljongmedium, dvs tryptisk sojabuljong och standardförfarande. lOO odlings- anordningar iordningställdes, vilka innehöll samma medium sOm angivits i exempel 2. 100 kliniska bakterieisolat, som erhållits från patienter, odlades med användning av dessa odlingsanordningar och den standardodlingsteknik som etablerats för Kirby-Bauer-testet. De testade bakte- rierna inbegrep: Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter calocoaceticus Proteus mirabilis Proteus morganii Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Serratia marcescens Pasteurella (species) CDC Group II F Moraxella Citrobacter freundii 4 till S isolerade kolonier berördes med odlings- anordningens stav och staven användes för att inokulera odlingsmediet i odlingsanordningen. Enheterna inkubera- des vid 3S°C i en inkubator av märket 3M modell lO7 under 4 h. Klisterremsförseglingen på locket avlägsnades hos odlingsenheten och 6-8 droppar bakteriesuspension för- delades pâ en bomullslapp.Lappenströksi.Briktningaröveren Hueller-Hinton-agarplatta och Kirby-Bauer-testet fullfölj- des i enlighet med ovan angivna National Clinical Committee for Laboratory Standards (NCCLS) of the United States of America, Antibiotics Susceptibility Standard. En jämförelse gjordes mellan resultaten för den antibiotiska känslighet som erhållits med användning av föreliggande odlings- -medium-anordning samt med användning av standardteknik 458 367 10 15 20 28 för bakterieodling. Resultaten var jämförbara.

EXEMPEL 8 Följande material löstes i 1000 ml avjoniserat vatten och ângsteriliserades vid 12100 under 15 min: 1,7 g Tryptikas 0,3 g Fyton 0,25 g Dextros o, 5 g Nacl 0,25 g KZHPO4 Odlingsanordningarna som användes i detta exempel var polyprapenhylsor, såsom beskrivits ovan, med mediet placerat direkt inuti. Hylsorna tillslöts med ett plast- lock innehållande ett "Tyvec"-filter. Mediet inokulerades med användning av en trådögla med Staphyloccocus aureus- bakterier, som erhållits från 4-5 kolonier av nämnda bak- terie på en aqarplatta. Odlingsanordningarna blandades under 10 s och inkuberades sedan vid 35°C. Antalet livs- dugliga bakterier beräknades vid O, 1, 2,5, 4,5, 5,5, 6,5, 11,5, 13,5, 23,5 och 31 h. Resultaten visade att det ur- sprungliga antalet var l x 104 och att vid 11,5 h antalet hade ökat till cirka 1,7-1,9 X 108 CFU/ml samt att antalet inte minskade väsentligt från detta värde under de reste- rande intervallerna.

Claims (6)

10 15 20 25 30 35 458 367 29 PATENTKRAV

1. Stav för upplockning av en förutbestämd bakterie- mängd från ytan av minst en koloni av nämnda bakterier, k ä n n e t e c k n a d därav, att staven väsentligen utgöres av ett stavliknande organ, som har en toppände och en undre spets för kontakt med bakteriekolonin, vilken undre spets har minst en ränna i spetsens understa ände, vilken ränna har förmåga att indraga en förutbe- stämd bakteriemängd igenom kapillärverkan.

2. Stav enligt kravet l, k ä n n e t e c k - n a d därav, att minst en av rännorna är en avsmal- nande ränna.

3. Stav enligt kravet l, därav, att toppänden inbegriper medel för att k ä n n e t e c k - n a d frigörbart ingripa med och täcka en öppning i ett kärl när staven placeras däri.

4. Sätt att upplocka en förutbestämd bakteriemängd från ytan av en koloni av nämnda bakterier, k ä n n e ~ t e C k n a t därav, att spetsen hos ett stavliknande organ med en toppände och en undre spets för kontakt med bakteriekolonin, vilken undre spets har minst en rânna i spetsens understa ände, bringas i kontakt med nämnda yta, varigenom en förutbestämd bakteriemängd indrages i rännan genom kapillärverkan. '

5. Sätt att inokulera ett kärl, som innehåller ett vätskemedium i ett utrymme av kärlet, med en förutbe- stämd bakteriemängd, k ä n n e t e c k n a t därav, att en förutbestämd bakteriemängd upplockasp enligt sät- tet i krav 4; att bakterierna, via nämnda stavliknande organ, placeras intill medíumet i kärlet, och att bak- terierna och nämnda medium bringas i kontakt med varandra.

6. Sätt enligt kravet 5, k ä n n e t e c k n a t därav, att den förutbestämda bakteriemängden som upp- 6 plockas är ekvivalent med minst 5 x 10 bakterier per milliliter när bakterierna är i kontakt med mediumet.