SE452020B - Medium for bakterieodling fran en begynnelsepopulation till en bestemd slutpopulation av ca 6 10?727 till 3 10?728 cfu/ml - Google Patents

Description

452 020 10 15 20 25 30 35 2 nämnas McFarland-standard). En platta, som innehåller Mueller-Hinton-agar bestryks sedan med bakteriebuljong- suspensionen med användning av en bomullslapp. När in- okulatet har torkat appliceras en pappersskiva, som inne- håller ett antibiotiskt eller kemoterapeutiskt medel, på agarn. Plattorna inkuberas över natten och det område runt varje skiva där bakterietillväxt saknas, mäts. Detta omrâde är känt som inhiberingszonen och används för att bestämma vilket antibiotika som är användbart för att bekämpa den särskilda bakterien.

För att Kirby-Bauer-tekniken skall vara noggrann 8 cpu/ml i det medium som stryks ut på agarplattan. Vanligen bestäms tillväxt- mäste det finnas ungefärligen l x 10 nivångenomvisuell jämförelse med den ovan beskrivna McFarland-standarden. Tidrymden för att nå denna bakterie- koncentration kan variera från 2 till 8 h beroende på bakterien. Om bakterien tillåts växamedmerän.LxlO8CFU/ml och blir grumligare än McFarland-standarden, måste mediet spädas för att vara ekvivalent med standarden.

En annan metod för att bestämma känsligheten hos bak- terier för olika antibiotika kallas för MIC-testet (MIC = = Minimum Inhiberande Koncentration). Detta test diskute- ras i Current Techniques for Antibiotics Susceptibility Testing, Albert Balows, 1974, sid 77-87. Denna metod in- begriper framställning av en serie koncentrationer av ett antibiotika, antingen i ett flytande eller fast medium, som underhåller tillväxten av den bakterie som skall tes- tas. Flytande medier fördelas lämpligen i provrör och fasta medier hälls vanligen i petriskålar. Det är praxis att iordningställa ett område av antibiotikakoncentrationer i form av en serie tvåfaldiga spädningar för att genomföra testet. Varje provrör eller petriskàl inokuleras med bak- terien ifråga. Efter en inkubationsperiod observeras bak- terietillväxten eller frånvaron av bakterietillväxt för varje antibiotikakoncentration. Pâ detta sätt bestäms MIC för antibiotikan till den närmsta utspädningen vid använd- ning i serie. Detta är den noggrannaste metoden för att bestämma den inhiberande koncentrationen. Denna metod blev 10 15 20 25 30 35 452 020 3 emellertid inte populär förrän nyligen då det mödosamma spädningsarbetet förenklades. Den utspädda antibiotikan inokuleras vid MIC-testet med bakterie i ett visst kon- centrationsomrâde, dvs vanligen 105 - 106 CFU/ml. Buljong, som innehåller bakterier som odlats till ekvivalens med McFarland-standarden, dvs ungefärligen l x 108 CFU/ml, späds för att erhålla denna koncentration.

De ovan angivna känslighetstesterna, liksom andra tester för att bestämma typen av bakterie eller dess känslighet gentemot antibiotika, kräver att en viss för- utbestämd bakteriemängd utnyttjas vid testet för att in- okulcra de plattor, på vilka pappersskivan skall placeras när det är fråga om Kirby-Bauer-testet eller för att in- okulera det utspädda antibiotikat när det är fråga om MIC-testet. Detta krävs för att testet skall vara nog- grant. Om en mindre bakteriekoncentration används vid testet, skulle resultatet indikera att bakterien är mera känslig för att antibiotikat än vad den faktiskt är. Om å andra sidan bakterien föreligger i en högre koncentra- tion, skulle testresultatet indikera att en högre koncen- tration av antibiotikat krävs för att inhibera tillväxt av bakterien. Båda indikationerna skulle vara felaktiga.

Förattde ovannämnda testernaellermotsvarandetester skall utföras, är det nödvändigt att en laboratorietekni- ker tar ett bakterieprov från 4-5 bakteriekolonier från den agarplatta, på vilken bakterien har odlats, och place- rar provet i ett buljongodlingsmedium, såsom beskrivits ovan, i 2-8 h. Mediumet kontrolleras periodiskt för att bestämma huruvida bakteriekoncentrationen är ekvivalent med McFarland-standarden eller ej. Vid en visuell under- sökning av mediumet finner man att vissa bakteriekulturer inte har växt till rätt koncentration, medan andra har växt förbi den riktiga koncentrationen. Det förra fallet erfordrar att laboratorieteknikern låter bakterien växa längre, medan det senare fallet erfordrar en spädning för att återföra koncentrationen till samma koncentration som hos standarden. Alla dessa åtgärder är mödosamma och tidsödande. 455 10 15 20 25 30 35 2 0129 4 Man har nu upptäckt ett medium, på vilket bakterier kan odlas men\ülketbegränsar den koncentrationsnivå var- till bakterierna tillväxer. Närmare bestämt har man upp- täckt ett vattenhaltigt medium, som har förmåga till od- ling av minst en art från minst två olika släkten av aeroba, patogena, snabbväxande bakterier frán en begyn- nelsepopulation till en bestämd slutpopulation av ca 6 X 107 till 3 X 108 cru/m1, via vi1ken bakteriens ti11- växt i huvudsak upphör på grund av brist på näringsämne i mediet, vari bakterien förblir livsduglig under minst 18 h, och att mediet inbegriper en vattenlösning, som innehåller ca 0,42-0,70 mg kol per milliliter medium och ca 0,09-0,15 mg kväve per milliliter medium i den form vari nämnda näringsämnen föreligger i pepton, eller ca 0,16-0,27 mg kol per milliliter medium och ca 0,035- -0,056 mg kväve per milliliter medium i den form vari nämnda näringsämnen föreligger i proteospepton, samt vitaminer och mineralämnen i tillräcklig mängd för att åstadkomma nämnda odling och i en form, som är användbar av bakterien för nämnda odling.

De bakterier, för vilka mediumet är användbart, är aeroba bakterier, dvs de som utnyttjar syre för sin till- växt. Bakterierna är också patogena i det att de förorsakar sjukdomar och de är snabbväxande i det att de har genera- tionstid av 50 min eller mindre.

Mediumet är användbart vid både gram-negativa och gram-positiva, aeroba, patogena, snabbväxande bakterier.

Typen och mängden av de olika beståndsdelarna i mediumet skiljer sig emellertid vanligen för gram-positiva och för gram-negativa bakterier, och den tidsperiod som krävs för att erhålla erforderlig koncentration för de gram-positiva tenderar att vara längre än den för gram-negativa bakte- rier.

Odlingsmediet är användbart för odling av minst en art från tvâ olika släkten av aeroba, patogena bakterier. Nor- malt kan mediumet odla minst en art från två släkten av gram-positiva bakterier eller minst en art från minst två 10 15 20 25 30 35 452 029 5 släkten av gram-negativa bakterier. Bland gram-positiva, aeroba bakterier finns tvâ släkten, som inbegriper de bak- terier, vilka förorsakar de flesta sjukdomar, för vilka normal bakterie- och känslighetstestning utföres. Dessa släkten är Staphylococcus och Streptococcus. Om mediet kan odla arter från vart och ett av dessa båda släkten, kan man enkelt testa bakterierna för att bestämmammndenär'gram- positiv eller gram-negativ med användning av ett gram" färgningstest. Om bakterien är gram-positiv används me- diumet för odling av grampositiva bakterier och.bakte~ rien odlas till den önskade nivån, såsom till ekvivalens med McFarland-standarden.

Om bakterien konstateras vara gram-negativvidanvänd- ning av gramfärgningstestet, kan bakterien höra till ett mycket större antal släkten. 16 släkten representerar de bakterier som befunnits förorsaka 99 % av de sjukdomar som orsakas av gram-negativa, aeroba bakterier.Dessagram~ negativa släkten inbegriper: Escherichia, Shigella, Edward- siella, Salmonella, Arizona, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Yersínia, Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella och Pasterurella.

Bakterierna tillväxer i mediet från en viss popula- tion, som normalt uttrycks såsom CFU enligt definitionen ovan och som normalt hänförs till populationen i en viss volym av mediet, dvs CFU/ml. Begynnelsekoncentrationen kan vara så låg som l CFU, men är normalt och föredraget minst 5 x lO6 CFU/ml.

Att man startar med en lägre begynnelsepopulation eller -koncentration gör inte att bakterierna tillväxer i mediet till en väsentlig annorlunda slutpopulation eller -koncentration än vid högre begynnelsekoncentration, men påverkar den tid det tar för att slutkoncentrationen skall uppnås. Om inkubationstiden skall regleras, måste sålunda begynnelsekoncentrationen regleras. Den slutkoncentration vartill bakterierna skall odlas benämnes den stationära fasen. 10 15 20 25 30 35 452 020 6 Såsom diskuterats ovan, varierar tiden för att nå en koncentration ekvivalent med McFarland-standarden i enlig- het med förfarandet från 2 till 8 h, varvid de flesta bakterier tar minst 5 - 6 11 för att nå denna koncentra- tion. Med det tillväxtbegränsande mediet när bakterierna företrädesvis slutkoncentrationen eller den stationära fasen inom 5 h. Om bakterierna när den stationära fasen på 2 h med det tillväxtbegränsade mediet, förblir bakte- rierna vid denna fas även om man inte kontrollerar mediet under 5 h och ingen spädning erfordras för att erhålla en koncentration, som är ekvivalent med McFarland-stan- darden.

När den stationära fasen eller slutkoncentrationen är uppnådd upphör i huvudsak bakteriernas tillväxt. Detta beror på utarmning av minst ett näringsämne, som är kri- tiskt för den kontinuerliga tillväxten av bakterien och inte på bildning av toxiska biprodukter från bakterien, vilka stoppar tillväxten och kan förorsaka att popula- tionen minskar väsentligt. Med de standardmedier, som använts före föreliggande uppfinning och som beskrivs i Kirby-Bauer-förfarandet, bestäms den bakteriepopulation som skall näs för att tillväxten skall upphöra av toxiska biprodukter från bakterien. Denna bakteriepopulation ligger över McFarland-standarden.

Slutkoncentrationen eller den maximala stationära fasen erhålles på grund av utarmning av ett eller flera näringsämnen. Vid denna punkt planar antalet livskraftiga CFU/ml ut och förblir i huvudsak oförändrat under minst 18 h. Bakterierna förblir livskraftiga under en minst 18 h lång tidsperiod, som är användbar för att utföra de olika tester som skall utföras på bakterien,sàsmnbeskrivitsovan.

Den önskade slutkoncentrationen ligger mellan 6 x 107 och 3,0 x l08 CFU/ml, vilket är ekvivalent med 0,5 McFarland-standarden.

Mediet innehåller olika typer och mängder av bestånds- delar beroende på den önskade slutkoncentrationen av bakte- rierna och den typ av bakterie som odlas. I samtliga fall 10 15 20 25 30 35 452 020 7 förefinnes en kolkälla och kvävekälla, som tillför kol och kväve i en form, som är användbar vid bakterieodlingen och även vitaminer och mineralämnen. Såsom påpekats, är emel- lertid mängden av en eller flera av dessa beståndsdelar begränsad för att åstadkomma att bakterien när den förut- bestämda slutkoncentrationen och därefter i huvudsak upp- hör att tillväxa.

För de gram-negativa bakterierna inbegriper mediumet ca 0,42-0,70 mg kol per milliliter medium i en form, som är användbar för bakterieodling, dvs den, vari kol före- ligger i pepton. Mediet inbegriper också 0,09-0,15 mg kväve per milliliter medium i en form, som motsvarar det kväve som finns i pepton. Det föredragna mediet har ett pH-värde av ca 7-8. Vid proteospepton är kolhalten ca 0,16-0,27 mg kol per milliliter medium och är kväve- halten 0,035-0,056 mg kväve per millilíter medium samt föreligger kolet och kvävet i den form som de finns i proteospepton. En typisk analys av peptonen anges nedan: EQEEAE 232392 ålïiäsßlsæšæ Totalt kväve 16,16 14,37 Primärt proteos N 0,06 0,60 sekundärt proteos N 0,68 4,03 Pepton N 15,38 9,74 Ammoniak N 0,04 0,00 Fri amino 3,20 2,66 Amid N 0,49 0,94 Mono-amino N 9,42 7,61 Di-amino N 4,07 4,51 Tryptofan 0,29 0,51 Tyrosin 0,98 2,51 Crystin 0,22 0,56 Organiskt svavel 0,33 0,60 Oorganiskt svavel 0,29 0,04 Fosfor 0,22 0,47 Klor 0,27 3,95 Natrium 1,08 2,34 452 020 10 15 20 25 30 35 8 Procent Pegton Proteosgegton Kalium 0,22 0,70 Kalcium 0,058 0,137 Magnesium 0,056 0,118 Mangan noll 0,0002 Järn 0,0033 0,0056 Aska 3,53 9,61 Eterlösligt extrakt 0,37 0,32 Reaktion, pH 7,0 6,8 pH l % lösning i destillerat vatten efter autoklavering 15 min via 121°c.

Den föredragna sammansättningen innehåller de vita- miner och mineralämnen som âterfinnes i pepton eller proteospepton. Två särskilt föredragna sammansättningar, vilka har befunnits vara användbara vid odling av gram- negativa bakterier till en slutkoncentration av från 6 x 107 till 3 x 108 CPU/ml på mindre än 5 h, innefattar en blandning av 1000 ml vatten innehållande 0,8 g pepton eller 0,3 g proteospepton, 0,03 g dextros, 2,5 g dikalium- fosfat, 1,25 g monokaliumfosfat och 5,0 g natriumklorid.

Fosfaterna tillsätts som buffertmaterial för att hålla kompositionen vid ett pH-värde av cirka 7,0. Buffring är nödvändig vid vissa bakterier. De ovannämnda båda samman- sättningarna skapar ett medium, på vilket arter från de flesta av släktena hos de gram-negativa, aeroba, patogena bakterierna kan odlas till de ovan beskrivna CFU/ml~omrâ- dena på 5 h om bakteriens begynnelsekoncentration är till- räcklig, dvs minst cirka 5 x 106 CFU/ml.

Såsom påpekats, är det föredragna kol- och kvävekäl- lorna pepton och proteospepton för de gram-negativa bakte- rierna. Neopepton, trypton och polypepton kan också använ- das, men man har funnit att dessa inte alstrar tillväxt till nivån hos McFarland-standarden inom samma tidrymd och att de inte tillhandahåller de rätta näringsämnena för att odla vissa gram-negativa bakterier i väsentlig omfattning. 10 15 20 25 30 35 452 G20 9 Dessa material är därför användbara för ett mera begränsat antal bakterier. Kombinationerna av sådana material med pepton eller proteospepton kan emellertid användas för att skapa ett medium, som är användbart vid ett större antal bakterier.

Ett föredraget medium för användning vid gram-positiva bakterier inbegriper en lösning av 1000 ml vatten innehål- lande 1,7 g tryptikas, 0,3 g fyton, 0,25 g dextros, 0,5 g natriumklorid och 0,25 g dikaliumfosfat.

Alla de olika medierna används genom att inokulera mediet med bakterien och inkubera mediet under 2-8 h.

I de efterföljande exemplen hänvisas till följande material och bakterier, vars källa anges nedan. I exemp- len hänför sig "odlingsanordning“ till en anordning med de nedan beskrivna dimensionerna.

Trypton, ett enzymatiskt hydrolysat av kasein, Difco, Inc., Detroit, Michigan, USA.

Pepton, ett enzymatiskt hydrolysat av kasein, Difco, 5 Inc., Detroit, Michigan, USA: Dextros, Difco, Inc., Detroit, Michigan, USA.

Polypepton, ett enzymatiskt hydrolysat av kasein och djurvävnad, Bioquest, Inc., Baltimore, Maryland, USA.

Neopepton, ett enzymatiskt hydrolysat av protein, Difco, Inc., Detroit, Michigan, USA.

Proteospepton, ett enzymatiskt hydrolysat av protein, Difco, Inc., Detroit, Michigan, USA.

Salmonella typhimurium, American Type Culture Collec- (ATCC) Nr. 19028 .

(ATCC 25331).

Enterobacter cloacae (ATCC 23355) och St. Paul Ramsey Hospital, St. Paul, Minnesota, USA.

(ATCC 23357) och St. Paul Ram- sey Hospital, St. Paul, Minnesota, USA.

(ATCC 6380).

Proteus mirabilis, St. John's Hospital, St. Paul, tion, Shigella Sonnei, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris Minnesota and St. Paul Ramsey Hospital, St. Paul. Minne- sota, USA. 452 G20 10 15 20 25 30 10 Serratia marcescens (ATCC 8100) och St. Paul Ramsey Hospital, St. Paul, Minnesota, USA.

Providencia species, University of Minnesota, Minne- apolis, Minnesota, USA.

Citrobacter species, University of Minnesota, Minne- apolis, Minnesota, USA.

Edwardsiella, University of Minnesota, Minneapolis, Minnesota, USA.

Arizona, University of Minnesota, Minneapolis, Minne- sota, USA.

Yersinia, University of Minnesota, Minneapolis, Minnesota, USA.

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) St. Paul Ramsay Hospital, St. Paul, Minnesota, USA.

Escherichia coli (ATCC 25922) och St. Paul Ramsey Hospital, St. Paul, Minnesota, USA.

Acinetobacter calcoaceticus, St. Paul Ramsey Hospital, St. Paul, Minnesota, USA.

Proteus morganii, St. Paul Ramsey Hospital, St. Paul, Minnesota, USA.

Enterobacter aerogenes, St. Paul Ramsey Hospital, St. Paul, Minnesota, USA.

Pasteurella (species), St. Paul Ramsey Hospital, St. Paul, Minnesota, USA.

CDC Group II F, St. Paul Ramsey Hospital, St. Paul, Minnesota, USA.

Moraxella, St. Paul Ramsay Hospital, St. Paul, Minnesota, USA.

Citrobacter freundii, St. Paul Ramsey Hospital, St. Paul, Minnesota, USA. l0 15 20 25 30 35 ll Vid de efterföljande exemplen utnyttjades odlings- anordningar, vilka inbegrep ett kärl eller en hylsa av transparent, deformerbart material, såsom polypropen, polyamid, cellulosaacetatbutyrat eller olika polyestrar.

Inuti hylsan fanns en glasampull, som inrymde ett till- växtbegränsande medium. Glasampullen var spröd och kunde brytas sönder när den deformerbara hylsan pres- sades samman. Bredvid ampullen i hylsan fanns en stav med en längsgående avsmalnande ränna. Staven används för att plocka bakterier från de olika bakteriekoloni- erna och var utformad för att införa en förutbestämd bakteriemängd från kolonierna till den avsmalnande rännan. Staven var fäst på ett lock. Båda locket och staven bestod av plastmaterial, som polypropen. På in- sidan av locket fanns två àsar, vilka gav aseptisk tätning mellan locket och hylsan. Detta hindrade andra mikroorganismer från att intränga i hylsan före in0kule~ ringen av anordningen samt under inkubationen. I locket fanns också tre utsprång, som skyddade hålet i locket från att blockeras av krossat glas från ampullen. Hålet i locket var täckt med en tryckhäftande klisterremsa under tiden före användning av anordningen och till dess att inkubationen av anordningen var avslutad. Vid denna tidpunkt avlägsnades klisterremsan så att hålet i locket frilades. Detta medger utsöndring eller utpress- ning av mediet och bakterier frân hylsan.

Glasampullen hade dimensionerna 35,6 mm x 6,3 mm och innehöll ca 0,6 ml odlingsmedium. Hylsan var 43,0 mm lång och 8,6 mm i diameter.

Den avsmalnande rännan i staven var utformad för att åstadkomma kapillärverkan, varigenom bakterierna skjuts in i rännan. När bakterierna skjuts in genom att föra staven vinkelrät mot kolonins yta så att den större änden av den avsmalnande rännan först bringas i kontakt med kolonin, börjar bakterierna att röra sig uppför rännan och luft bortgår från rännans avsmalnande ände. Vid en viss förutbestämd nivå kan ytterligare 10 15 20 25 30 2 020 12 bakterier inte införas i rännan, eftersom bakterier som kontinuerligt tvingas in i rännan rör sig ut vid rännans topp i stället för att röra sig upp till den avsmalnande änden hos rännan. Rännan var utformad för att tillåta en viss bakteriepopulation att införas i rännan. Denna population är vanligen ekvivalent med åtminstone 5 x 106 bakterier per milliliter när bakte- rierna placeras i mediet hos odlingsanordningen. Den avsmalnande rännan var ca 0,43 mm djup, 0,25 mm bred vid sin största ände och 3,1 mm lång.

EXEMPEL 1 Anordningar med de ovan beskrivna specifikationerna inokulerades med olika bakterier med användning av den avsmalnande rännan på staven hos anordningen. En begynnel- sekoncentration noterades för bakterien. Det tillväxtbe- gränsande mediet, som var inrymt i ampullen hos varje an- ordning, innehöll följande: 0,8 g pepton 0,03 g dextros 2,5 g dikaliumfosfat 1,25 g monokaliumfosfat 5,0 g natriumklorid Lösningar av mediet innehållande 0,2 g pepton och 1,6 g pepton iordningsställdes också.

Fyra andra tillväxtbegränsande medier användes, vilka inbegrep proteospepton, trypton, neopepton och polypepton.

Dessa insattes i stället för peptonen i ovanstående samman- sättning. De resulterande begynnelsekoncentrationerna be- stämdes och var, räknat i CFU/ml, såsom anges i tabell l.

Värdena avser medelvärdet för 15 prover, dvs 5 prover för var och en av de tre sammansättningarna för varje medium. 452 020 »OH H O.~ »OH H H.H »OH H HHH »OH H O_m~ 3 »OH H H.O »OH H O.H.

»OH H m.m »OH H m_~ »OH H H.H mmmmmmwwmm »OH »HN »OH O.m »OH ».O »OH OO.m »OH O.O »OH O.~ Goumømowz ëíšfi .umHux6Hmw um> »OH H O.m »OH H O.~ »OH H O.~ »OH H Hhm »OH H OHH »OH H O.~ »OH H O.m »OH H OHO »OH H m.m »OH H OHH Coumwus H QQMQAB »OH »OH wow »ofl »OH »OH ßofi Noa »OH wofl wofi »ca PWUÜHflMOHMfi ßnwñ» .MWQÜHHGH Ümvnnwxr xwfl ÜMCVMÜWPÉ .cø>0 nuH>Hmcm Eomwm um mcuwuummHHmuxmm O.» H.m =.~ m.: m.H O.H 0.0 OH» O.H »Hm OHO H.~ :ou m mowponm »OH H NHH »OH H m.H »OH H OHM »OH H.H.~ »OH H m.H »OH H OOH »OH H O.O »OH H O.~ »OH H O.= »OH H m_» »OH H O.H »OH H »_~ »OH H O.m »OH H O_H mmmmwm nHnmwHø> Osøuonm mHpmHHwm mflcflmnmw dHHuHOønø:om mco~Hn< Hw»oOnoH»Ho wmmosoøzwmm wHHmcoEHmm OHHHOOHH: OOOOOHO mHO:OøH>oHm umuomnonmucm mfifløfiwnwfix «HHOwHnw HHOO øHzuHHonomm 452 020 10 20 1 4 EXEMPEL 2 Följande material löstes i 1000 ml avjoniserat vat- ten och ångsteriliserades vid l2l°C i 15 min: 0,8 g oepton 0,03 g dextron 2,5 g dikaliumfosfat 1,25 g monokaliumfosfat 5,0 g natriumklorid Mediumlösningar innehållande 0,2 g pepton och 1,6 g pepton iordningställdes också. Odlingsanordningar iord- ningställdes sedan med användning av vart och ett av me- dierna. Med utnyttjande av staven hos odlingsanordningen plockades bakterier från 4-5, 18-25 h gamla bakteriekolo~ nier av de olika bakterier, som anges i tabell 2. Fem od- lingsanordningar användes för varje bakterie för att er- hålla ett medelvärde för fem prover för varje bakterie.

Fjorton olika bakterier testades. Sålunda utnyttjades 70 stycken odlingsanordningar vid testet för vart och ett av de tre medierna. Varje odlingsanordning blandades un- der lO s och inkuberades vid 35°C. Antalet livsdugliga bakterier räknades vid 0, 4, 5 och 6 h. Resultaten anges i tabell 2. 452 020 15 'TABELL 2 Antal (x 107 CFU/ml) 012 g g 018 g Tid Qy Bakterier ÛIIHCJrD Escherichia coli Ousó Shigella sønnei Oas/D Klebsiella pneumoníae ousrnv Enterobacter cloacae -Providencia specïes Ohqpfiz Proteus mirabilis Ûhfls/O Salmonella typhimurium Ûusö Pseudomonas aeruginosa ÛuCJrO Citrobacter species Onwflíu Arizona 1,6 g Antal (x 107 CFU/ml) 0.2 9 0,8 9 16 TABELL 2 (fortsättning) Tid (h) 1452 B29 Bakterier 70 2 2 1 08" 52H-v 5 t g slövlhfilvo' 938Ö rlrr lir: :fbr o )6 1657 2011 3789 f O: o huv I 1880 Bfimfl INUÜ 0w33 m ml lll 1 S // w m t C nïönu n»8 9. 9. fo/O Y 9 Qvflucßoz ,b nn» šuvläib WN æOJ 0950 Sootsïß J.3|n/.~|00v m. 70 8 Û I. I. oc 'QWI I I lvl...- .I I rrtr ærhæ LQ66 1932 u 1 f 0957 1991 3172 2665 911 112 122 n xO 1 1 Q w fx W 1. nu 9 nuR.0~I 7å1h.0 nvo/Oøo 235”. gon? _1238 7533 pl Lmz 11,010: ulfulf 'YO-nl r r..| ,.r ra. t t.flm. 1flmflmwH +. a A I l.ln3b 117Lonu .J:u7Ll 2.¿^¿^r oo:J§1b 1.G1b +. b 0 a a m t O .l 3 \: t h Ohwâíb Ohufiíb Ohwfiíb Ohwäíb Unwäib Ohqníb Onqfiíb u æ M .( f g E d s n B 1 k a Ü T .d n C D.. e a e t i S P M O n P u 1 m m. m u s u ut w S P 7. M C n n a w ß 1 a m P 1 1 e . 1 S a 1 w u 1. W m r h 1 e m v e +. e c a l .l a ru X D.. .l .l l . e S .l .l S E E e I Wu l .1 M n t u P P e h ß s .l ä 6 M Y .C .D a S r t E 1. k M i. e W r r 0 X 0 a E ä m d e 8 P E P B E Y S P 452 020 17 'TABELL 3 (fortsättning) Antal (x 107 CFU/ml) Bakterier Tid (h) 0,2 g 0,8 g. 1,6 g Enterobacter cloacae 0 3,2 3,2' 1,3 Ä 16,2 19,0 8,1 5 15,8 12,8 13,2 6 11,6 13,6 16,8 Providencia species 0 - - ~ (fel pâ inokulatetl 4 - ~ - _ _ 5 _ _ _ 2 6 _ _ _ Proteus mirabilis 0 0,U6 0,46 0,3U U 2,7 3,36 3,6 5 7,6 14,6 13,o 6 7,5 10,6 11,h Salmønella typhimurium 0 1,3 1,H 0,91 - H 6,8 6,9 7,H 5 10,0 11,8 10,7 6 9,0 10,1 11,0- Pseudomonas aeruginosa 0 5,8 7,7 5,6 n 8,0 8,3 11,0 5 - 22,2 24,8 6 7,5 20,3 23,6 Citrobacter species 0 15,4 21,6 30,2 Ä 16,6 22,0 22,2 5 1ü,8 31,0 25,6 6 15,2 27,2 30,H Arizona 0 3,7 0,0 3,2 U 5,3 6,6 5,6, 5 6,6 13,2 12,5 6 7,0 20,8 17,2 Edwardsiella 0 Ingen tillväxt Ä Ingen tillväxt 5 Ingen tillväxt 6 Ingen tillväxt _ YCPSÅHÃB. 0 ugn 597 U ü,U 5,0 10,7 5 8,0 9,73 17,2 6 8,6 11,0 18,6 Sernatia marcescens _ 0 N,ü ü,6 ü,1 u 13,6 11,1 8,8 5 15,2 14,0 10,1 6 15,n 15,0 13,6 452 020 Bakterier Proteus vulgaris EXEMPEL 4 Exempel21qgmepades,utomatt peptøn utbyttes neopepton. Resultaten Bakterier Escherichia coli Shigella sonnei Klebsiella pneumoniae Enterobacter cloacae Providencia species Proteus mirabilis 18 TABELL 3 (førtsättning) Anta1 (X 107 cFu/m1) Tid (hu o,z g o,a g « 1,6 9 o 4,5 2,64 1,4 4 6,9 7,92 4,2 5 15,5 15,4 11,3 s 16,5 1e,o 15,3 mot anges i tabell 4.

TABELL 4 Anta1 (X 107 csu/m1) Tid (6) o,2 g o,e g 1,6 g 3 Wii å'2 Såå 5 1:8 1:96 1:1 6 1,3 4,0 3,0 M 3,3 2,3 1,0 5 ü,6 6,2 4,2 6 6,3 6,1 H,0 3 å? 2"? 3% s 712 zfs fiflo , 6 5,3 5,8 8,2 O Ingen tillväxt U Ingen tillväxt 5 Ingen tillväxt 6 Ingen tillväxt u 0,7 " o] 5 1,11 - 0,7 6 .lrg " 1,8 z w ëf: 3 5 5 10,0 17f6 1610 6 10,5 21,8 22,2 452 020 19 'TABELL 4 (fortsättning) Antal (X 107 CFU/ml) Bakterier Tid (h) 0,2 g' 0,8 g 1,6 3 Salmonella typhimurium 0 3 3 2 “3 2 5 4 7,2 8,92 8:0 6 12,6 16,6 18,0 'Pseudomonas aeruginosa 0 0,2 0,15 0,2" u 1,8 5.9 H,9 5 5,3 9,5 9,5 6 7,2 18,0 16,0 Citrobacter speciesf 0 5,U 7,62 13,0 - . n 7,3 7,UU - 5 12,2 2ß,6 27,2 6 15,6 30,2 31,H Ari ona 0 3 Ü 3 0 2;5 z u 613 sfls 7,6 5 7,9 13,0 11,8 5 9,8 16,4 17,H Yersínia 0 Ü,9 Öyzu 610 u 6,0 10,1 10,0 5 9,1 15,5 16,0 6 10,u 20,6 21,0 Edwardsiella 0 Inga värden Ä Inga värden 5 Inga värden 6 Inga värden Serratia marcescens 0 3,5 3,16 5,1 u 0,7 10,1 9,8 5 11,3 11,6 12,3 6 9,7 12,7 12,8 Proteus vulgaris 0 2,U 3,56 2,0 U 5,5 12,5 8,1 5 8,6 23,8 16,4 6 10,7 28,H 23,2 EXEMPEL S Exempel 2 upprepades, utom att pepton utbyttes mot trypton. Resultaten anges i tabell 5. 452 020 20 TABELL 5 7 Antal (x 10 CPU m¿) 0,8 Q 1,6 g 0.2 g Tid (h) Bakterier ÛÜ. ...J/O Escherichia coli OhwCJrÖ Shigella sonnei 0456 Klebsiella pneumoniae OHHEJKU Enterobacter cloacae Ons/O Providencia species 0.456 Proteus mirabilis ou-.Dó Salmonella typhimurium 01456 Pseudomonas aeruginosa 01.456 Citrobacter species 011956 Arizona 452 020 21 'TABELL 5 (fortsättning) Antal (x 1o7 cFu/m1) Bakterier Tid (h) 0,2 g 0,8 g Å,6 g Edwardsiella 0- 0,73 0,55 1:5 U 2,3 1,9 3,2 5 3,1 2,3 3,9 6 2,9 2,8 u,8 Yersinia 0 2,0 1,59 2,7 U 5,1 5,8 10,0 5 6,1 8,142 13,6 6 7,1 12,8 18,3 Serratia marcescens O 3,2 ü,98 3,0 M 16,6 20,8 15,6 5 19,2 25,u 21,h 6 23,2 29,8 25,8 Proteus vulgaris 0 1,N6 1,1 1,0 8 8,0 16,2 13,3 5 10,0 16,5 18,o 6 1o,o 25,7 22,3 EXEMPEL 6 Exempel 2 upprepades, utom att pepton utbyttes mot proteospepton. Resultaten anges i tabell 6.

TABELL 6 >Antal (x 107 CFU/ml) ëëëååšisš Tid (h) 0,2 g o,a g 1,6 g 10,0 15,0 10,5 1,U 22,0 22,0 7,6 2o,u 29,0 6,38 23,2 20,8 25,1 3,52 15,2 26,0 21,2 0,8 28,2 28,3 27,0 Escherichia coli .B -n Shigella sonnei FPJF' I. -u -ø -Q LIJRIÄ) á-vcn ÄJÖCTWI) ï-ÉÉU] -ÉIÛÉ Klebsiella pneumoniae i-'I-JH UJNJ: LAJIUIDJ: LUUJÉCÄ |-~u www-n w-oww l-'IUP Enterobacter cloacae C\U'ICO O\\J1J='O O\\J'l-='O O\\J1-l'-'O FIF' OMR) J'-°@O\l-' (ID-BOV) LUND-J UPQN-lr -QLUKHUU LUGJO ï ¶ 'Ü Ü 452 020 22 TABELL 6 (fortsättning) Antal (x 107 CPU/ml) 1,6 g Qrzq 918 g' Tid (h) Bakterier C456 Providencia species Proteus mírabilís Salmonella typhimurium ÛhHCJrO ÛuEJrO _ Pseudomonas aeruginosa ÛhHRJ/D Citrobacter species nuHHCJrO Arizona OUvSfD Edwardsiella 0.456 Yersinia Serratia marcescens Oas/O Proteus vulgaris 10 15 20 25 30 35 452 B20 23 EXEMPEL 7 Resultaten som erhölls med mediet enligt förelig- gande uppfinning jämfördes med de resultat som erhölls med användning av ett konventionellt buljongmedium, dvs tryptisk sojabuljong och standardförfarande. 100 odlings- anordningar iordningställdes, vilka innehöll samma medium som angivits i exempel 2. 100 kliniska bakterieisolat, som erhållits från patienter, odlades med användning av dessa odlingsanordningar och den standardodlingsteknik som etablerats för Kirby-Bauer-testet. De testade bakte- rierna inbegrep: Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter calocoaceticus Proteus mirabilis Proteus morganii Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae '” Serratia marcesêens Pasteurella (species) CDC Group II F Moraxella Citrobacter freundii 4 till 5 isolerade kolonier berördes med odlings- anordningens stav och staven användes för att inokulera _ odlingsmediet i odlingsanordningen. Enheterna inkubera- des vid 3S°C i en inkubator av märket 3M modell 107 under 4 h. Klisterremsförseglingen på locket avlägsnades hos odlingsenheten och 6-8 droppar bakteriesuspension för- delades på en bomullslapp.Lappenströksi Briktningaröveren Hueller~Hinton-agarplatta och Kirby-Bauer-testet fullfölj- des i enlighet med ovan angivna National Clinical Committee for Laboratory Standards (NCCLS) of the United States of America, Antibiotics Susceptibility Standard. En jämförelse gjordes mellan resultaten för den antibiotiska känslighet som erhållits med användning av odlingsmedium-anordningen enligt uppfinningen samt med användningav'standardteknik 10 15 20 452 020 24 för bakterieodling. Resultaten var jämförbara.

EXEMPEL 8 Följande material löstes i 1000 ml avjoniserat vatten och ångsteriliserades vid l2l°C under 15 min: 1,7 g Tryptikas 0,3 g Fyton 0,25 g Dextros 0,5 g NaC1 0,25 g KZHPO4 Odlingsanordningarna som användes i detta exempel var polypropenhylsor, såsom beskrivits ovan, med mediet placerat direkt inuti. Hylsorna tillslöts med ett plast- lock innehållande ett "Tyvec"-filter. Mediet inokulerades med användning av en trådögla med Staphyloccocus aureus- bakterier, som erhållits från 4-5 kolonier av nämnda bak- terie på en agarplatta. Odlingsanordningarna blandades under 10 s och inkuberades sedan vid 35°C. Antalet livs- dugliga bakterier beräknades vid 0, l, 2,5, 4,5, 5,5, 6,5, 11,5, 13,5, 23,5 och 31 h. Resultaten visade att det ur» sprungliga antalet var 1 x 104 och att vid 11,5 h antalet hade ökat till cirka 1,7-1,9 x 108 CFU/ml samt att antalet inte minskade väsentligt från detta värde under de reste- fä! rande intervallerna.

Claims (3)

1. 0 15 20 25 452 020 25 PATENTKRAV l. Medium för bakteriodling, k ä n n e t e c k - n a t därav, att det är ett vattenhaltigt medium med förmåga att odla minst en art från minst två olika släkten av aeroba, patogena, snabbväxande bakterier från en begynnelsepopulation till en bestämd slutpopu- iatiøn av ca e x m7 till 3 x 108 CPU/mi, vid vilken bakteriens tillväxt i huvudsak upphör på grund av brist på näringsämne i mediet, vari bakterien förblir livs- duglig under minst 18 h, och att mediet inbegriper en vattenlösning, som innehåller ca 0,42-0,70 mg kol per ml medium och ca 0,09-0,15 mg kväve per ml medium i den form vari nämnda näringsämnen föreligger i pepton, eller ca O,l6~0,27 mg kol per ml medium och ca 0,035- -0,056 mg kväve per ml medium i den form vari nämnda näringsämnen föreligger i proteospepton, samt vitaminer och mineralämnen i tillräcklig mängd för att åstadkomma nämnda odling och i en form, som är användbar av bak- terien för nämnda odling.

2. Medium enligt kravet l, k ä n n e t e c k - n a t därav, att det inbegriper en vattenhaltig lös- ning av pepton, vilken är buffrad för att upprätthålla ett pH-värde av ca 7-8.

3. Medium enligt kravet l, k ä n n e t e c k - n a t därav, att det inbegriper en vattenhaltig lös- ning av proteospepton, vilken är buffrad för att upp- rätthålla ett pH-värde av ca 7-8.