SE447308B - Forfarande vid immunologisk analys, tillsatsmedel for ett testprov vid forfarandet och diagnostiskt reagens for testprovet - Google Patents

Description

447 308 J' 2 J eller två lägre alkylgrupper, som företrädesvis uppvisar upp till 2 kolatomer, varvid metyl föredras. Den lägre alkylgruppen i di- lägrealkylsulfoxiden uppvisar företrädesvis upp till 2 kolatomer och är isynnerhet metyl. Representativa exempel på föreningar med formeln I och di-lägrealkylsulfoxiden är karbamid, N-metylkarbamid, N,N'-dimetylkarbamid, N-metylformamid, N,N-dimetylformamid, N,N- -dietylformamid, N-metylacetamid, N,N-dimetylacetamid, N,N-dietyl- acetamid, dimetylsulfoxid, dietylsulfoxid med flera. Dessa förenin- gar kan användas ensamma eller i kombination med varandra. En sär- skilt lämplig kombination är den mellan karbamid och N,N-dimetyl- formamid.

Enligt uppfinningen kan ovannämnda icke specifika agglu- tinering förhindras genom att utföra latexagglutineringsreaktionen i närvaro av en eller flera av föreningarna I och di-lägrealkylsulf- oxider, varigenom falskt positiva resultat vid latexagglutinerings- reaktionen undviks och testets tillförlitlighet påtagligt förbätt- ras. Det enligt uppfinningen föreslagna reagenset är företrädesvis närvarande i latexagglutineringsreaktionssystemet (efter samman- blandning med ett testprov) i en koncentration av ca 1-13 viktpro- cent, i synnerhet i en mängd av ca 1-7 viktprocent. Detta procenttal liksom för övrigt även alla nedan angivna procenttal är beräknade på vikten med avseende på volymen.

Uppfinningen avser vidare ett tillsatsmedel för ett test- prov vid ett förfarande enligt ovan, varvid testprovet inkuberas tillsammans med latexpartiklar sensibiliserade med en antigen el; ler antikropp och eventuellt agglutinering observeras, vilket till- satsmedel innehåller ca 4-52% av en eller flera av föreningarna enligt ovan i en buffertvätska uppvisande ett pH av ca 6-9 och en elektrolytkoncentration av ca 0,05-0,3 M.

Slutligen avser uppfinningen ett diagnostiskt reagens för ett sådant testprov, vilket reagens innehåller ca 2-52% av en eller flera föreningar av ovan angivet slag och ca 0,4-1,4% latex- partiklar sensibiliserade med en antigen eller antikropp.

Föreliggande uppfinning kan tillämpas på varje reaktion för att detektera immunologiskt aktiva substanser som finns i uri- nen eller kroppsvätskor (såsom serum och plasma) hos dägggjur, isynnerhet hos människan, genom användning av agglutineringen med latexpartiklar sensibiliserade med en antigen eller antikropp sva- rande mot substanserna. Representativa exempel på sådana immuno- løgiskt aktiva fsuhstanser är sermsproteiner, såscrx humanimrmnoglobulm Q, 447 508 3 .r _» huaninnmnoglobulin M, humaninnmnoglobulin A, humanalbumín, hnanfibronßgefl (fibrinogen, fibrin och sönderdelningsprodukter därav), d-fetopro- tein, C-reaktivt protein, 82-mikroglobulin, myoglobin m.fl., hor- moner såsom humanplacentagonadotropin (fortsättningsvis förkortat HCG), humanplacentalaktogen, insulin, steroider med flera, immuno- globulinfraktioner, isynnerhet specifika antikroppar tillhörande immunoglobulin G eller immunoglobulin M (t.ex. antiviral antikropp och reumatoid faktor) och liknande.

Den enligt uppfinningen föreslagna tillsatsen kan överfö- ras till latexagglutineringsreaktionssystemet genom att den sättes till ett diagnostiskt medel innehållande sensibiliserade latexpar- tiklar eller genom att sättas till ett utspädningsmedel för ett testprov. Uttrycket "ett reagens för latexagglutineringsreaktion" avser därför att innefatta det diagnostiska medlet (dvs testrea- gens) innehållande de sensibiliserade latexpartiklarna, utspädnings- medlet för ett testprov och liknande.

Latexpartiklarna, som sensibiliseras med antigenen eller antikroppen svarande mot de immunologiskt aktiva substanserna kan vara vilka som helst latices, som används för latexagglutinerings- test och kan exempelvis utgöras av latices på basis av homopoly- merisst och sampolymerisat av styren eller derivat därav (t.ex. metylstyren, etylstyren och klorstyren), olefiner (t.ex. eten och propen), akrylsyra eller estrar därav (t.ex. metylakrylat och etyl- akrylat), metakrylsyra eller derivat därav (t.ex. etylmetakrylat, akrylonitril och akrylamid), diener (t.ex. butadien, kloropren och isopren), vinylklorid, vinylidenklorid och vinylacetat. Bland des- sa föredras särskilt latices av homopolymerisat eller sampolymeri- sat av styren, klorstyren, akrylsyra, vinyltoluen och metylmetakry- lat. Dessa latices används företrädesvis med en partikelstorlek upp till ca 1 pm, isynnerhet en partikelstorlek av ca 0,01-1,0,um och allra helst en partikelstorlek av ca 0,1-O,6,um.- Behandlingen för att sensibilisera latexpartiklarna med antigenen eller antikroppen svarande mot de immunologiskt aktiva substanserna kan utföras på i och för sig känt sätt. Behandlings- betingelserna varierar i viss mån beroende på de fysikaliskt-ke- miska egenskaperna hos den sensibiliserande substansen och latex- partiklarna och när exempelvis latexpartiklarna skall sensibilise- ras med en antikropp är det lämpligt att gå till väga på nedan be- skrivet sätt. Antiserum underkastas utsaltning på konventionellt sätt för erhållande av gamma-glubolinfraktionen, som därefter lö- 447 308 .r ~0 ses i en 0,005-0,2 M buffert med pH ca 7-9 i en koncentration av ca 0,01-1%. Som buffert användes företrädesvis glycinbuffert, fos- fatbuffert, boratbuffert och Goods buffert, såsom en buffert av N-2-hydroxietylpiperadin-N'-2-etansulfonsyra (fortsättningsvis förkortat HEPES) och N-tris(hydroximetyl)metyl-2-aminoetansu1fon- syra (fortsättningsvis förkortat TES). En suspension av latexpar- tiklar i en koncentration av ca 0,1-10% sättes till lösningen, som därefter inkuberas vid rumstemperatur under ca 1-6 timmar el- ler vid ca 37-GOOC under ca 0,5-3 timmar genom att få stå eller un- derkastas omröring för sensibilisering av latexpartiklarna och blandningen underkastas därefter centrifugering. De sålunda erhåll- na, sensibiliserade latexpartiklarna suspenderas på nytt i en buf- fert, till vilken den enligt uppfinningen föreslagna substansen ' redan satts för erhållande av reagenset för diagnosen. Som buffert användes företrädesvis ovannämnda glycinbuffert, fosfatbuffert, boratbuffert eller Goods buffert, såsom HEPES- och TES-buffertar med ett pH av ca 7-9. Föredragna koncentrationer av den enligt upp- finningen föreslagna tillsatta substansen och de sensibiliserade “ latexpartiklarna i det diagnostiska medlet kan väljas inom ett om- råde ca 2-52% respektive ca 0,4-1,4%, beroende på om ett testprov är utspätt eller ej före latexagglutineringsreaktionen. När det diagnostiska medlet skall blandas med ett testprov spätt med ett konventionellt utspädningsmedel, innehåller det diagnostiska medlet företrädesvis den enligt uppfinningen föreslagna tillsatsen i en koncentration som är ca 4 gånger ovannämnda koncentration i latex- agglutineringsreaktionssystemet (ca 1-13%, isynnerhet ca 1-7%) och de sensibiliserade latexpartiklarna föreligger i en koncentration av ca 0,9-1,4%. För det diagnostiska medlet, som direkt skall upp- blandas med ett icke utspätt testprov, användes företrädesvis med- let innehållande den enligt uppfinningen föreslagna tillsatsen i en koncentration ca 2 gånger ovannämnda koncentration (ca 1-13%, isynnerhet ca 1-7%) och de sensibiliserade latexpartiklarna i en mängd av ca 0,4-0,7%.

När den enligt uppfinningen föreslagna tillsatsen sättes till ett utspädningsmedel för ett testprov kan vilken som helst konventionell buffert för utspädning av ett testprov användas, såsom glycinbuffert, boratbuffert, fosfatbuffert, Goods buffert, HEPES- och TES-buffertar m.fl., som baskomponent och den kan lämp- ligen användas vid ett föredraget pH-omrâde av ca 6-9 och en elekt- rolytkoncentration av ca 0,05-0,3 M. Särskilt lämplig är en 0,1 M 447 308 Särskilt lämplig är en 0,1 M glycizibuffert (pH 8,2) och enfifl M HEPES-buffert (pH 7,5). Företrädesvis innehåller en sådan buffert den enligt uppfinningen föreslagna tillsatsen i en koncentration av ca 4 gånger ovannämnda koncentrationsomrâde (ca 1-13%, isynner- het ca 1-7%).

Ovannämnda reagens för diagnosen kan om så önskas innehål- la ca 0,01-0,2% serumalbumin, företrädesvis koserumalbumin, och ca 0,02-0,2% av ett konserveringsmedel, såsom natriumazid.

Med användning av ovannämnda reagens genomföres latexagg- lutineringsreaktionen, som innefattar inkubation av ett testprov och de sensibiliserade latexpartiklarna för att få till stånd agg- lutineringen av latexpartiklarna, i närvaro av den enligt uppfin- ningen föreslagna substansen. Reaktionen kan utföras medelst i och för sig känd teknik, såsom enligt glidmetoden beskriven i t.ex.

Am.J.Clin.Pathol. ââ, 305-316 (1972) och provrörsmetoden beskriven i t.ex. Am.J.Obstet.Gynecol. lål, nr. 6, 701-702 (1978).

Testprovet i form av urin, serum eller plasma kan förbe- handlas med användning av ett lämpligt filter eller direkt utsät- tas för reaktionen utan föregående filtrering.

Genom tillämpning av uppfinningen kan den icke specifika agglutineringen vid latexagglutineringsreaktionen på ett påtagligt sätt förhindras, varigenom testresultatens tillförlighet starkt förbättras.

Uppfinningen belyses närmare i efterföljande exempel.

Samtliga angivna procenttal hänför sig till vikten per volym, om ej annat anges.

Exempel 1 glycin 3,75 g karbamid 60 g natriumazid 0,5 g Ovan angivna ingredienser löstes i 400 ml destillerat vat- ten och lösningens pH inställdes på 8,2 genom tillsats av 1N Na0H, varefter destillerat vatten tillsattes till en totalvolym av 500 ml för erhållande av en utspädningsvätska för ett testprov.

Exempel 2 HEPES 11,9 g N,N-dimetylforamid 100 g natriumazid 015 9 Ovan angivna ingredienser löstes i 400 ml destillerat vat- 447 308 J' wF ten och lösningenspfl inställdes på 7,5 genom tillsats av 1N NaOH, varefter destillerat vatten tillsattes till en totalvolym av 500 ml för erhållande av en utspädningsvätska för ett testprov.

Exemgel 3 glycin 7,5 g N,N-dimetylformamid 75 g natriumazid 1 0,5 g Ovan angivna ingredienser löstes i 400 ml destillerat vat- ten och lösningens pH inställdes på 8,6 genom tillsats av 1N NaOH, varefter destillerat vatten tillsattes till en totalvolym av 500 ml för erhållande av en utspädningsvätska för ett testprov.

Exemgel 4 HEPES 5,95 g dimetylsulfoxid 100 g natriumazid 0,5 g Ovan angivna ingredienser löstes i 400 ml destillerat vat- ten och lösningens pH inställdes på 7,2 genom tillsats av 1N NaOH, varefter destillerat vatten tillsattes till en totalvolym av 500 ml för erhållande av en utspädningsvätska för ett testprov.

Exemgel 5 HEPES 11,9 g karbamid 50 g N,N-dimetylformamid 50 g natriumazid 0,5 g Ovan angivna ingredienser löstes i 400 ml destillerat vat- ten och lösningens pH inställdes på 7,5 genom tillsats av 1N NaOH, varefter destillerat vatten tillsattes till en totalvolym av 500 ml för erhållande av en utspädningsvätska för ett testprov.

Exemgel 6 glycin 3,75 g N,N-dietylformamid 50 g natriumazid 0,5 g Ovan angivna ingredienser löstes i 400 ml destillerat vat- ten och lösningens pH inställdes på 8,0 genom tillsats av 1N NaOH, varefter destillerat vatten tillsattes till en totalvolym av 500 ml för erhållande av en utspädningsvätska för ett testprov.

Exemgel 7 ' glycin 7,5 g N,N-dietylacetamid 50 9 natriumazid I 0:5 9 447 308 Ovan angivna ingredienser löstes i 400 ml destillerat vatten och lösningens pH inställdes på 7,8 genom tillsats av 1N NaOH, varefter destillerat vatten tillsattes till en totalvolym av 500 ml för erhållande av en utspädningsvätska för ett testprov.

Exempel 8 HEPES 11,9 g dietylsulfoxid 30 g natriumazid 0,5 g Ovan angivna ingredienser löstes i 400 ml destillerat vatten och lösningens pH inställdes på 7,5 genom tillsats av 1N NaOH, varefter destillerat vatten tillsattes till en totalvolym av 500 ml för erhållande av en utspädningsvätska för ett testprov.

Exempel 9 HEPES 11,9 g N-metylkarbamid . 75 g natriumazid 0,5 g Ovan angivna ingredienser löstes i 400 ml destillerat vatten och lösningens pH inställdes på 8,2 genom tillsats av 1N NaOH, varefter destillerat vatten tillsattes till en totalvolym av 500 ml för erhållande av en utspädningsvätska för ett testprov.

Exemgel 10 glycin 3,75 g N-metylformamid 100 g natriumazid 0,5 g Ovan angivna ingredienser löstes i 400 ml destillerat vatten och lösningens pH inställdes på 8,6 genom tillsats av 1N NaOH, varefter destillerat vatten tillsattes till en totalvolym av 500 ml för erhållande av en utspädningsvätska för ett testprov.

Exemgel 11 glycin 3,75 g N-metylacetamid 75 g natriumazid 0,5 g _ Ovan angivna ingredienser löstes i 400 ml destillerat vatten och lösningens pH inställdes på 8,6 genom tillsats av 1N NaOH, varefter destillerat vatten tillsattes till en totalvolym av 500 ml för erhållande av en utspädningsvätska för ett test- prov. 447 308 f 8 _» Exemgel 12 HEPES 11., 9 g karbamid 60 g N,N-dimetylformamid 50 g natriumazid 0,5 g Ovan angivna ingredienser löstes i 400 ml destillerat vatten och lösningens pH inställdes på 7,5 genom tillsats av 1N Na0H, varefter destillerat vatten tillsattes till en totalvolym av 500 ml för erhållande av en utspädningsvätska för ett test- prov.

Exemgel 13 (1) Anti-C-reaktivt proteinserum erhållet genom att immunisera kaniner underkastades utsaltning med användning av ammoniumsulfat på konventionellt sätt under bildning av Y-globu- linfraktion, som efter dialys löstes i en 0,01 M fosfatbuffert med pH 8,2 för erhållande av en 0,2-procentig Y-globulinlösning.

Till 10 ml av denna lösning sattes en lika stor volym 2-procen- tig polystyrenlatexdispersion (partikelstorlek 0,2 }nn, disperge~ rad med en 0,01 M fosfatbuffert med pH 8,2) och latexpartiklarna sensibiliserades vid 37°C under 2 timmar under omskakning då och då. Efter separering i centrifug vid 12 000 varv/minut under 15 minuter erhölls latexpartiklar sensibiliserade med anti-C-reaktivt proteinantikropp som fällning. (2) glycin 3,75 g karbamid 30 g N,N-dimetylacetamid 25 g koserumalbumin 0,25 g natriumazid 0,25 g Ovan angivna ingredienser löstes i 400 ml destillerat vatten och lösningens pH inställdes på 8,2 genom tillsats av 1N NaOH, varefter destillerat vatten tillsattes till en totalvolym av 500 ml för erhållande av en lösning, i vilken de under (1) ovan framställda, sensibiliserade latexpartiklarna dispergerades i en koncentration av 0,6% för erhållande av ett diagnostiskt medel för mätning av C-reaktivt protein, innehållande anti-C- reaktivt proteinantikroppsensibiliserad latex. Detta medel kunde användas för agglutineringsreaktioner utan spädning av ett test- prov. 447 308 Exemgel 14 (1) Anti-humanfibrinogenserum erhållet genom att immu- nisera kaniner underkastades utsaltning med användning av ammo- niumsulfat på konventionellt sätt under bildning av gamma-globu- linfraktion, som efter dialys löstes i en 0,01 M fosfatbuffert med pH 8,0 för erhållande av en 0,2-procentig gamma-globulin- lösning. Till 10 ml av denna lösning sattes en lika stor volym av en 2-procentig polystyrenlatexdispersion (partikelstorlek 0,25 pm, dispergerad med en 0,01 M fosfatbuffert med pH 8,2) och latexpar- tiklarna sensibiliserades vid rumstemperatur under 6 timmar under omskakning då och då. Efter separation i centrifug vid 10 000 varv/minut under 15 minuter erhölls latexpartiklar sensibilisera- de med anti-humanfibrinogenantikropp som fällning. (2) HEPES 5,95 g karbamid 25 g N,N-dimetylformamid 25 g koserumalbumin 0,25 g natriumazid 0,25 g Ovan angivna ingredienser löstes i 400 ml destillerat vat- ten och lösningens pH inställdes på 7,5 genom tillsats av 1N NaOH, varefter destillerat vatten tillsattes till en totalvolym av 500 ml för erhållande av en lösning, i vilken de under (1) ovan fram- ställda, sensibiliserade latexpartiklarna dispergerades i en kon- centration av 0,6% för erhållande av ett diagnostiskt medel för mätning av fibrinogen, fibrin och sönderdelningsprodukter därav.

Detta medel kunde användas för agglutineringsreaktioner utan späd- ning av ett testprov.

Exemgel 15 glycin 3,75 g N,N-dimetylformamid 10 g natriumazid 0,5 g Ovan angivna ingredienser löstes i 400 ml destillerat vat- ten och lösningens pH inställdes på 7,5 genom tillsats av 1N NaOH, varefter destillerat vatten tillsattes till en totalvolym av 500 ml för erhållande av en lösning, vilken de i exempel 13(1) fram- ställda, sensibiliserade latexpartiklarna dispergerades i en kon- centration av 0,6% för erhållande av ett diagnostiskt medel för 447 308 I 10 _, mätning av C-reaktivt protein. Detta medel kunde användas för agg- lutineringsreaktioner utan spädning av ett testprov.

Exemgel 16 g (1) Human-Y-globulin (Cohn's fraktion II) löstes i en 0,01 M fosfatbuffert med pH 8,0 i en koncentration av 0,3%. Till 10 ml av den sålunda erhållna lösningen sattes en lika stor volym 2-pro- centig polystyrenlatexdispersion (partikelstorlek 0,15 pm, disper- gerad med en 0,01 M fosfatbuffert med pH 8,0) och latexpartiklarna sensibiliserades vid 56°C under 2 timmar under skakning då och då.

Separation i centrifug vid 15 000 varv/minut under 30 minuter gav human-gamma-globulinsensibiliserade latexpartiklar för detektering av reumatoidfaktorn som fällning. (2) glycin 3,75 g N,N-dimetylformamid 30 g koserumalbumin 0,25 g natriumazid 0,25 g Ovan angivna ingredienser löstes i 400 ml destillerat vat- ten och lösningens pH inställdes på 8,0 genom tillsats av 1N NaOH, varefter destillerat vatten tillsattes till en totalvolym av S00 ml för erhållande av en lösning, i vilken de under (1) ovan fram- ställda, sensibiliserade latexpartiklarna dispergerades i en kon- centration av 0,6% för erhållande av ett diagnostiskt medel för de- tektering av reumatoidfaktorn._Detta medel kunde användas för agg- lutineringsreaktioner utan spädning av ett testprov.

Exemgel 17 (1) 2 mg HCG (5 000 IU/mg) löstes i 1 ml koksaltlösning, blandades med 1 ml av Freunds kompletta adjuvans och användes för att immunisera kaniner med tre veckors intervall 4 gånger för er- hållande av anti-HCG-serum. Sålunda erhållet antiserum utsaltades med användning av ammoniumsulfat på konventionellt sätt för er- hållande av en gamma-globulinfraktion, som efter dialys löstes i en 0,01 M fosfatbuffert med pH 8,2 för erhållande av en 0,2-pro- centig gamma-globulinlösning. Till 10 ml av den sålunda erhållna gamma-globulinlösningen sattes en lika stor volym 2-procentig polystyrenlatexdispersion (partikelstorlek 0,3 pm, dispergerad med en 0,01 M fosfatbuffert med pH 8,2) och latexpartiklarna sen- sibiliserades vid 37°C under 2 timmar under skakning då och då. 447 308 1 11 -# Efter separering med centrifug vid 9000 varv/minut under 15 minu- ter erhölls latexpartiklar sensibiliserade med anti-HCG-antikropp som fällning. (2) glycin 3,75 g karbamid 75 g N,N-dimetylacetamid 50 g koserumalbumin 0,5 g natriumazid 0,5 g Ovan angivna ingredienser löstes i 400 ml destillerat vat- ten och lösningens pH inställdes pâ 8,2 genom tillsats av 1N NaOH, varefter destillerat vatten tillsattes till en totalvolym av 500 ml för erhållande av en lösning, i vilken de anti-HCG-antikropp- sensibiliserade latexpartiklarna framställda under (1) ovan disper- gerades i en koncentration av 1% för erhållande av ett diagnostiskt medel innehållande anti-HCG-antikroppsensibiliserad latex för kont- roll av graviditet. Vid användning blandas detta medel med ett test- prov utspätt med ett konventionellt utspädningsmedel.

Exemgel 18 HEPEs 5,95 g karbamíd 30 g N,N-dimetylformamid 25 g koserumalbumin 0,25 g natriumazid 0,25 g Ovan angivna ingredienser löstes i 400 ml destillerat vat- ten och lösningens pH inställdes på 7,5 genom tillsats av 1N NaOH, varefter destillerat vatten tillsattes till en totalvolym av 500 ml för erhållande av en lösning, i vilken de anti-HCG-antikropp- sensibiliserade latexpartiklarna framställda i exempel 17(1) dis- pergerades i en koncentration av 0,6% för erhållande av ett diag- nostiskt medel för kontroll av graviditet. Denna produkt kan an- vändas för agglutineringsreaktioner utan spädning av testprovet.

Testexemgel 1 0 De i exempel 13 (1) framställda antikroppsensibilisera- de latexpartiklarna dispergerades i en 0,1 M glycinbuffert (pH 8,2) innehållande 0,1% koserumalbumin och 0,1% natriumazid till en 1,2-procentig dispersion. Cirka 50lnl av ett humanserumprov som skulle testas droppades på en rengjord glasplatta och därtill sattes ca 25 Pl av var och en av utspädningsvätskorna beskrivna 447 508 ' 12 i exempel 1-5 och som kontrollvätskor en 0,1 M glycinbuffert med pH 8,2 innehållande 0,1% natriumazid (fortsättningsvis be- nämnd utspädningsvätska G) och en 0,1 M HEPES-buffert med pH 7,5 innehållande 0,1% natriumazid (fortsättningsvis benämnd utspäd- ningsvätska H), varefter tillsattes 25 pl av ovan beredda, sensi- biliserade latexsuspension och skakning företogs under 3 minuter, varefter blandningen undersöktes med avseende på förekomsten av agglutination. Även i ett system, i vilket man ej utnyttjade en utspädningsvätska för ett testprov, tillsattes ca 50 pl av det diagnostiska medlet för mätning av C-reaktivt protein erhållet i exempel 13 (2) till ca 50/pl av ett serumprov och företogs om- skakning. Efter 3 minuter undersöktes blandningen med avseende på förekomsten av agglutination. Resultaten framgår av nedanstående tabell 1. 447 308 15-” m a b' e 1 1 1 " Detektering av C-realítivtgorotein prov nr näesysfem' 12545e7e91o 1112 Utspädníngsvätska för I testprov: utspädningsvätska G + + + + + + + - i + - - utspädningsvätska H + + + + + + + - i i - - Exempel 'I + _+ + + + i + - - - - - Exempel 2 _ + '+ + + + + + - - - - - Exempel 3 + + + + +. i + - - - - - Exempel 4 + + + + + t + - - - - - Exempel 5 + + + + + i + - - - - - Ilxempel 15 (2) + + + + + i + - - - - - Kapillärmetod + + + + i'- i- -1- - ~ - - - +.: positivt; i : tveksamt-positivt; - : negativt.

(Samma gäller även i 'efterföljande tabeller) Såsom framgår av resultaten i tabell 'l förekom, när ingen karbamid, N,N-dimetylformamid, NJV-dimetylacetamíd eller dimetylsulfoxíd fanns närvarande i utspädningsvätskan för ett testprov eller latexdispersionen, flera falskt-positiva fall än vad fallet var vid jämförelse med de diagnostiska resulta- ten med den konventionella kapillärsedimentationsmetoden. Å andra sidan uppvisade i systemen med användning av utspädnings- vätskor-na enligt exempel 'I - 5 och det diagnostiska medlet för mätning av C-reaktivt protein erhållet i exempel 15 (2) resul- taten god överensstämmelse med de, som uppnàddes medelst kapillärsedimentationsmetoden.

Testexempel 2 Cirka SO/ul av ett humansemzmprov droppades på en ren- gjord glasplatta och ca 50 /ul av den anti-humanfibrinogenanti- kroppsensibiliserade latexpartikeldispersionen erhåller. i exempel 14 (2) tillsatt s, varefter 'blandningen skakades 'under 2 minuter och därefter undersöktes med avseende på förekomsten av agglutinering. För kontrolländamàl dispergerades för sig 'de sensibiliserade latexpartiklarna i form av en fiállning er- hållen i exempel 11+ (1) i en 0,05 M HEPES-buffert med pH ?, 5 innehållande 0,05 % koserumalbumin och 0,05 % natriumazid vid en koncentration av 0,6 % för erhållande av en suspension av _ Kontroll - 447 308 .r ;~ 19- _ ïanti-humaníibrínogenantikroppsensibiliserade latexpartiklai' och testades på samma *sätt för jämförelseändamål. Resulta- ' ten framgår av nedanstående tabell 2.

T a b e l l 2 Detektering av fibrin- och fibrinogensöndezvdelníngs- = produkter Använt diagnostiskt Pm' m” medel 'l 2 5 il- '5 6 7 8 Q '10 '11 '12 Exempel 14 (2) - + + - - - + - .i + - + + + - - + + + ' + - Såsom framgår av tabell 2 återfinns två fall, som gav olika resultat, nämligen prov nr 4 och 8. Eftersom dessa pro- ver ej absorberades ens vid behandling med anti-humanfibrino- genantikropp bedömdes det att de erhållna resultaten med an- vändning av kontrollprovet visade falskt positivt utslag.

Testexempel å Cirka EÖ/ul av ett humansenmprov droppades på en ren- gjord glasplatta och ca SO/ul av den human-y -globulinsensibi- liserade latexpartikeldispersionen erhållen i exempel '16 (2) tillsattes, varefter blandningen omskakades under 2 minuter och därefter undersöktes med avseende på förekomsten av agglu- tinering. För kontrolländamål dispergerades för sig de sensi- 'biliserade latexpartiklarna i form av en íällning erhàllen i exempel '16 (1) i en 0,111 glycinbuffert med pH 8,0 innehållan- de' 0,05_ % køsemmaibumin och 0,05 % natriumazid vid en kun- centration av 0,6 % för erhållande av en suspension av human- -y-globulinsensibiliserade latexpartiklar, som användes för jämförelseändamål. De erhållna resultaten framgår av nedanstå- ende tabell 5.

T a b e 1 1 å Detektering av reumatoidfaktor Använt diagnostiskt Pmv nr medel 2 3 1+ 5 6 7 8 9 10 '11 12 Exempel 16 (2) + - - i - - + - Kontroll J + + + - + + + - + + - Såsom framgår av tabell 5 finns tvâ fall där resultaten i.. __..- .dum -..-_..._.......... .1|....-..._-...._.- . ... i. .. _ 447 308 15, v .

J' ïvar olika, nämligen prov nr 5 och 9. När dessa prover testa: des för att undvika inverkan av serumkomponenterna genom tjugufaldig utspädning medanvändning av ett konventionellt utspädningsmedel, visade båda dessa fall samma resultat, näm- ligen negativt utslag. Genom att använda det diagnostiska med- let enligt uppfinningen blir det sålunda möjligt att mäta reumatoidfaktorn utan att späda serumprovet.

Testexempel 4 De anti-HCG-antikroppsensibiliserade i latex-partiklarna erhåIhuü.exempel 17 (1) dispergerades i en 0,1 M glycinbuf- _ fert med pH 8,2 i en koncentration av 1 %. Som testprov använ- des 1O urinprover från icke gravida kvinnor, vilka prover upp- visade en tendens att förorsaka icke specifik agglutinering.

Som utspädningsvätska för varje testprov användes utspädnings- vätskorna i exempel 1 -*5 och som kontrollprov användes ovan- nämnda utspädningsvätskor G och H. Två droppar av urinprovet droppades på en rengjord glasplatta och en droppe av varje ut- spädningsvätska tillsattes och omrördes, varefter en droppe av ovannämnda anti-HCG-antikroppsensibiliserade latexsuspension tillfördes och omskakning företogs under-ä minuter. Resultaten av undersökningen beträffande förekomsten av agglutinering framgår av efterföljande tabell 4.

Såsom framgår av tabellen uppnàddes med testet, när utspäaningsvaeskan för ett tescprov ej innehöll kal-hanna, N,N- -dimetylformamid, NJI-dimetylacetamid eller dimetylsulfoxid, dvs i båda fallen med utspädningsvätskorna G och H, att tes- tet indikerade graviditet i 10 av 10 fall inklusive de tvek- samt positiva fallen. Detta beror pà den icke specifika agglu- tineringsreaktionen trots att proverna togs från en icke gra- vid kvinna. ' När å andra sidan utspädningsvätskorna framställda i exempel 1 - 5 användes gav samtliga fall negativa reaktioner, dvs ingen enda felaktig diagnos.

Med användning av var och en av utspädningsvätskorna i exempel 1 - 5 testades därefter sensibiliteten i latexaggluti- neringsreaktionen för standardlösningar med varierande nivåer av 0,5 - 5 000 IU/ml och urinprover tagna i tidig graviditet vart och ett innehållande låg halt av HCG (ca 1 IU/ml).

Resultaten framgår av efterföljande tabell 5. 447 sus 16: 'Testexempel 2 ' I ' "" I enlighet med tillvägagångssättet beskrivet i test- exempel 4 och med användning av utspädningsvätskorna erhåll- navi exempel 1, 2 och 5 och som kontroller utspädningsvätskor- - na G och H utfördes latexagglutineringsreaktion för diagnos av havandeskap med användning av urinprover från 200 icke gravida kvinnor. .

Såsom framgår av efterföljande tabell 6 fanns 6 posi- tiva fall och 20 tveksamt positiva fall med utspädningsvätskan G samt 7 positiva fall och 15 tveksamt positiva fall med ut- spädningsvätskan. E, medan samtliga fall uppvisade negativt ut-_ slag näæ utspädningsvätskorna från exempel 1 , 2 och 5 använ- des. ' Testexempel 6 I enlighet med tillvägagàngssättet beskrivet i test- exempel 4 och med användning av var och en av utspädnings- vätskorna erhållna i exempel ”l , 2 och 5 som utspädningsmedel för testfprover utfördes latexagglutineringsreaktioner för diagnos av havandeskap med användning av urinprover -fràn 200 kvinnor, som genom kliniska diagnoser bedömts som gravida.

.Med samtliga utspädningsvätskor visade samtliga fall posi- .tiva resultat helt i överensstämmelse med den kliniska diagnosen.

Testexempel fZ _ Enligt tillvägagângssättet beskrivet i testexampel 45 och med användning av utspädningsvätskorna framställda i exempel 1, 2 och 5 som utspädningsvätskor för testprover ut- fördes latexagglutineringsreaktioner på urinprover från 50 icke gravida kvinnor och från 50 kvinnor, som erhållit posi- tiv graviditetsdiagnos; Med samtliga utspädningsvätskor visade alla urinprover från icke gravida kvinnor negativa resultat och alla urinprover från gravida kvinnor positiva resultat. 447 308 171; _ Tabell 4 Jämförelse mellan utspädníngsvätskor .för testprover testade på Iminprover från icke-gravida kvinnor Uyspädningsvätska Pgov nr for testprov q 2 5 4 5 6 7 8 9 10 Utspädnings- . vätska G i 'i i + ï + f i + _ + Utspädníngs- vätska H + i i + i + + i + + Exempel 'I - - - - - - - - - - Exempel 2 - - - - - - - - - - Exempel 5 - - - - - - - - - - Exempel 4 - - - - - - - - - - Exempel 5 - - - - - - - - - - T a b e l l å Jämförelse mellan utspädníngsvätskor för test- prover testade på standard-HCG-lösningar och “ínprwer från kvimfišsšääåflïåštšfiåašfåšsïâštpmver TeStPfW vätsí; Ex, m, m. Ex.

G H 'l 2 5 LI- 5 0,0 - - - - - - '- Q å i i I i i i i Standard 'l + + + + + + + HCG 2 + + + + + + + (IU/ml) 5 + _ + + + + + + 2 OOO + + + + + + + 5 OOO + + + + + + + 5 OOO + + + + + + + Urinprover A + + + + + + + från_ tidigt B + + + + + + + havande- C + + + + + +' + skap D _+ + + + + + + (ca 'l IU/ml) E + I + + + + + + 447'sos .r 18, frateli e Jämförelse mellan utspädningsvätskor för testprover testade på urinprover från 200 icke gravida kvinnor Testresultat Utspädningsvätska. (antal fall) f" . . k t .

Or testprov positiva šgâiââïa negativa Utspädningsvätska G 6 20 - 174 Utspädnjngsvätska H 7 '15 178 mempei 1 ' o ' o 200 Exempel 2 0 0 _ 200 Exempel 5 O O 200 Testexempel 8 _ De anti-HCG-antikroppsensibiliserade latexpartiklarna framställda i exempel 17 (1) dispergerades i en 0,05 M borat- 'buffert med pH 7, 5 innehållande 0,1 % natriumazid vid en kon- centration av 'l % för erhållande av ett diagnostiskt medel för latexagglutineringsreaktion för kontroll av havandeskap. Med användning av urinprover av samma -slag som i testexempel 4 och utspädningsvätskor för testprover enligt exempel 1 - 5 utför- des latexagglutineringen genom tillsats av -1 droppe (ca 25 /ul) avvarje utspädningsvätska till 2 droppar (ca 50 /ul) urinprov, varefter tillsattes 1 droppe (ca 25 /ul) av det diagnostiska - medlet erhållet enligt ovan för bedömning av effekterna av utspädningsvätskorna. _ Resultaten framgår av nedanstående tabell 7, av vil- ken kan utläsas att nänutspädningsvätskan för ett testprov ej innehöll karbamid, N JNT-dimetylformamid, ILN-dimetylacetamid eller dimetylsulfoxid, dvs i fallen med utspädningsvätskorna G och H, visade resultaten '10 positiva utslag för graviditet av_ 10 möjliga inklusive tveksam: positiva fall med båda utspädnings- vätskorna, detta till följd av den icke specifika agglutine- ringsreaktionen trots att proverna togs från icke gravida kvin- nor. i Vid användning av utspädningsvätskor framställda en- ligt exempel 'I - 5 erhölls däremot negativa resultat i samtli- ga fall, dvs ingen diagnos var felaktig.

Med användning av utspädningsvätskorna enligt exempel 447 308 , flgf ~ 'l - 5 genomfördes latexagglutineringsreaktionerna med urinpro- ver från 200 icke gravida kvinnor och 200 gravida kvinnor.

Med samtliga utspädningsvätskor erhölls för samtliga urinpro- ver-negativa utslag för icke gravida kvinnor och positiva ut- slag för samtliga gravida kvinnor. I Tabell Jämförelse mellan utspädningsvätskor för test- prover testade på urinprover från icke gravida kvinnor Urin _nr Utspädningsvätska för testprov 1 2 5 4 5 6 7 8 9 10 Utspädningsvätska G i i i i f- i + Utspâdningsvätska E i i + i + i + + Exempel 1 - - - - - -_- - - - - Exempel 2- - - - - - - - - - - Exempel 5 - - - - - - - - - - Exempel 4 - - - - - - - - - - Exempel 5 - - - - - - - - - -' Testexempel Q 2 droppar (ca 50 /ul) av ett urinprov droppades på en rengjord glasplatta och 1 droppe (ca 25 /ul) av en 0,1 M gly- cinbuffert med pH 8,2 innehållande 0,1 % natriumazid tillsat- tes ooh blandningen omrördes. 'I droppe (ca 25 /ul) av det diagnostiska medlet för kontroll av havandeskap innehållande de anti-HCG-antíkroppsensibíliserade latexpartiklarna erhåll- na i exempel 1? (2) tillsattes och det hela omskakades under 3 minuter, varefter blandningen bedömdes med afseende pà före- komsten av agglutinering.

När latexagglutineringsreaktionen utfördes på varje urinprov från 200 icke gravida kvinnor och 200 kvinnor, som ' på. klinisk väg bedömts gravida, uppvisade samtliga urinpro- ver från icke gravida kvinnor negativa resultat och samtliga urinprover för gravida kvinnor positiva resultat» Testexempel 10 . 2 droppar (ca 50 /ul) av ett urinprov droppades på en rengjord glasplatta och 2 droppar (ca 50 /ul) av det diagnostis- ka medlet för kontroll av havandeskap innehållande de anti- .HCG-antikroppsensibiliserade lateamartiklarna erhållna i 447 ans J' eQ, " exempel 18 tillfördes och det hela omskakadens under 5 minuter, varefter blandningen bedömdes' med avseende på förekomsten av agglutinering.

När latexagglutineringsreaktionen utfördes med varje iurinprov från 200 icke gravida kvinnor och 200 kvinnor som på klinisk väg bedömts gravida; visade samtliga urinprover från icke gravida kvinnor negativt utslag och samtliga prover från gravida kvinnor positiva utslag.

Testexempel 11 - 2 droppar (ca SO/ul) av ett urinprov droppades på en _rengjord glasplatta och 1 droppe (ca ZB/ul) av utspädnings- 'vätskan för ett testprov erhållet i exempel 'lO tillfördes och omrördes, varefter 1 droppe (ca 25/11) av ett latexreagens er- hållet genom att díspergera de anti-HCG-sensibíliserade latex- partiklarna erhållna i exempel 1? (1) i en 0,1 M glycinbuffert med pH 7,8 vid en koncentration av 'I % tillsattes och det hela skakades om under 5 minuter. Blandningen undersöktes därefter med avseende på förekomsten av agglutinering.

När latexagglutineringsreaktionen utfördes för varje urinprov från 200 icke gravida kvinnor och från 200 kvinnor, som på klinisk väg bedömts gravida, visade samtliga urinprover från icke gravida kvinnor negativa utslag och samtliga prover från gravida kvinnor positiva utslag.

Claims (8)

2' 447 ana Patentkrav

1. «1. Förfarande vid immunologísk analys innefattande inkubation av ett testprov med partiklar sensibilíserade med en antigen eller antikropp och observation av eventuell resulterande agglutinering. k ä n n e t e c k n a t av att reaktionen utföres i närvaro av en eller flera föreningar valda ur gruppen bestående av en förening med formeln R2 Rl-con / \\\ R3 där R1 är en väteatom, en lägre alkylgrupp eller en amino- grupp som kan vara substituerad med en lägre alkylgrupp och R2 och R3 vardera betecknar en väteatom eller en lägre alkylgrupp, och en di-lägrealkylsulfoxid.

2. Förfarande enligt krav 1. k ä n n e t e c k n a t av att koncentrationen av nämnda förening är ca 1-13%. räknat på hela reaktionssystemet.

3. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t av att koncentrationen av nämnda förening är ca 1-7%.

4. Tillsatsmedel för ett testprov vid ett förfarande vid immunologisk analys enligt krav 1, varvid testprovet inkuberas tillsammans med latexpartiklar sensibiliserade med en antigen eller antikropp och eventuell agglutinering observeras. k ä n n e t e c k n a t av att tillsatsmedlet innehåller ca 4-52% av en eller flera föreningar valda ur gruppen bestående av en förening med formeln 1 //'R2 R -CON \\\ R3 där R1 är en väteatom. en lägre alkylgrupp eller en amino- ïvflir 447 sus A22 grupp som kan vara substituerad med en lägre alkylgrupp. och R2 och R3 vardera betecknar en väteatom eller en lägre alkylgrupp, och en di-lägrealkylsulfoxid, i en buffertvätska uppvisande ett pH av ca 6-9 och en elektrolytkoncentration av ca 0.05-0.3 H.

5. Tillsatsmedel enligt krav 4. k ä n n e t e c k n a t av att det innehåller såväl urea som N.N-dimetylformamid som nämnda förening.

6. Diagnostiskt reagens för ett testprov vid ett förfarande vid immunologisk analys enligt krav 1. varvid testprovet inkuberas tillsammans med latexpartíklar sensibiliserade med en antigen eller antikropp och eventueäííagglutinering obser- veras. k ä n n e t e c k n a t av att det innehåller ca 2-52% av en eller flera föreningar valda ur gruppen bestående av en förening med formeln R2 Rl-cou / \ RH där RI är en väteatom, en lägre alkylgrupp eller en amino- gruPP. som kan vara substituerad med en lägre alkylgrupp. och R2 och R3 vardera betecknar en väteatom eller en lägre alkylgrupp, och en di-lägrealkylsulfoxid. och ca 0.4-1.4: latexpartiklar sensibiliserade med en antigen eller antikropp.

7. Diagnostiskt reagens enligt krav 6, k ä n n e t e c k - n a t av att latexpartiklarna är en polystyren.

8. Diagnostiskt reagens enligt krav 6. k ä n n e t e c k - n a t av att nämnda förening är N.N-dimetylformamid och latexpartiklarna är sensibiliserade med anti-C-reaktiv proteínantikropp. få;