SE445833B - Halvester av organisk tvabasisk syra och 7-ketokolesterol eller 7-hydroxikolesterol - Google Patents

Description

10 15 20 8004125-4 z (II) vari R2 har angiven betydelse; framställas genom partiell förest- ring av 7~ketokolesterol med reaktiva derivat av motsvarande organiska, tvåbasiska syra med den allmänna formeln: 0 O H II HOC - R2 - COH (IV) vari RZ har angiven betydelse, såsom bärnstenssyra, adipinsyra, glutarsyra, ftalsyra, etc., i närvaro av en tertiär amin, såsom pyridin, trietylamin, dimetylanilin, etc.

Dessa reaktiva derivat av organiska tvåbasiska syror är exempelvis syraanhydrider och syrahalider och de mängder därav, som skall användas, är vanligen 1,0 - 3,0 mol per mol 7-keto- kolesterol. Reaktíonstemperaturen är vanligen 60 - l50°C.

Halvestrarna av organiska tvåbasiska syror och 7-keto- kolesterol kan även framställas genom oxidation med hjälp av ett oxiderande medel med kromsyragrupp av halvestern av orga- nisk tvåbasisk syra och kolesterol, som kan erhållas genom reak- tion av kolesterolanalog med reaktiva derivat av motsvarande tvåbasiska syror med formeln (IV). Det oxiderande medlet med kromsyragrupp är exempelvis vattenfri kromsyra, t-butylkromat eller ett dikromat, såsom kaliumdikromat, natriumdikromat.

Den mängd därav, som skall användas, är vanligen 3,0-15 mol per mol halvester av organisk tvâbasisk syra och kolesterol.

Reaktíonen utföres i ett lösningsmedel, t ex en organisk syra, såsom ättiksyrn, propionsyra, eller ättiksyraanhydrid eller ett inert lösningsmedel, såsom koltetraklorid, kloroform, metylcn- diklorid, bensen eller liknande, som innehåller angivna orga~ 10 15 20 25 8004125-4 niska syra. Reaktionstemperaturcn är i allmänhet S0-100OC, ehuru den varierar beroende på det använda oxidationsmedlet.

I det fall då t-butylkromat användes, är den exempelvis kok- punkten för det använda lösningsmedlet och vid vattenfri krom- syra eller ett salt av dikromsyra är temperaturen lämpligen 40-7o°c.

Halvestrar av organisk tvâbasisk syra och 7-hydroxiko- lesterol med den allmänna formeln: š\T/\\/”\í/ ligg /\* o 0 f \ II II uo-c-RZ-co/// OH (Ill) vari R2 har angiven betydelse, kan vidare framställas genom att motsvarande halvester av organisk tvåbasisk syra och Fketohflesterol eller salter därav utsättes för reduktion med en komplex metall- hydrid, såsom natriumborohydrid, kaliumborohydríd eller litium- aluminiumhydrid, i ett lösningsmedel, såsom vatten, metanol, etanol, dioxan, tetrahydrofuran, etc. Mängden komplex metall- hydrid, som skall användas, är 1,0 - 10,0 mol per mol halvester av organisk tväbasísk syra och 7-ketokolesterol. Det finnes icke någon speciell begränsning av reaktionstemperaturen, men reak- tionen genomföres vanligen under kylning vid OOC eller upp till rumstemperatur.

På så sätt erhållna halvestrar av organisk tvâbasisk syra och 7-ketokolesterol och 7-hydroxikolesterol kan enligt ford- ringarna på vanligt sätt lätt bringas till fysiologískt godtag- bara salter därav, t ex alkalisalter, såsom kalium- och natrium- salter, jordalkalisalter, såsom kulciumsalt, ammoniumsalt och salter av organisk bas, såsom trietylamin, trietanolamin, etc.

De är alla nya föreningar, som icke är publicerade i den tidi- gare litteraturen och som uppvisar utomordentliga verkningar vid immunodepression, speciellt vid cell-förmedlad immunodcpres- sion, och ínflammationshämning och de är dessutom lösliga i vatten, sa att de är mycket lämpliga såsom läkemedel. 10 8004125-4 ' 4 Experímontella värden på föreliggande föreningars använd- barhet visas i det *Eöljnndez (1) Immunítetsnedsättnnde verkan (försök in vítro) Enligt PHA-metoden av Cooparband øch medarbetare [The Journal of Immunology, lgg, (J), 154 (19721] provades föreliggande före- ningar pâ 50-procentig ínhibitionskoncentration vid PHA-reaktío- nen. De uppnådda resultaten visas i tabell 1. Verkan av IRA (immunoreglerande a-globulín) som uppnâddes enligt en metod av Occhino och medarbetare [The Journal of lmmunology, llg, (3), 685 (1973l7 visas även såsom jämförelseprovníng. Bland dessa föreningar användes de i esterform i emulsion under användning av en sampolymer av polyeten-fiolypropen med en molekylvíkt av 8350 såsom ytaktivt medel och de i saltform användes såsom vat- tenhaltíga lösningar.

Tabell 1 Immunitetsnedsättande verkan Koncentratíon för 50-procentíg inhi- _ber1ng ( pg/ml) P r 0 V 7-ketcko1esterylväte- succínat 4 7-ketokolesterylväte- ftalat 4 Natrium-7-ketokolestery1- succinat 4 * Ammonium-7-ketokolesteryl- succinat 4 7-hydroxikolesterylväte- succínat 3 natrium-7-hydroxikolesteryl- succinat J 76-hydroxikolesterylväteftulat Q Natrium-7ß-hydroxiko1esteryl- ftnlnt 4 IRA (jämförclseprov) 20 10 20 30 40 s 8004125-4 (2) Immunítetsnedsättande verkan (försök in vivo) Djurförsök utfördes med föreliggande föreningar.

Under användning av 25 möss, som uppdelades i fem grupper vardera bestaende av 5 möss, adminístrcrades proverna, inklusive ett kontrollprov, genom intravenös injektion under 20 dygn i följd för undersökning av verkan av varje prov på ett hudtrans- plantationstest: Grupp 1: 7-hydroxikolesterylvätesuccinat (8 mg/kg, dygn); Grupp 2: 7-ketokolesterylvätesuccinat (10 mg/kg, dygnl; Grupp 3: natrium~7-hydroxikolesterylsuccinat (8 mg/kg, dygn); Grupp 4: natrium-7-ketokolesterylsuccinat (10 mg/kg, dygnl; Grupp 5: en fysiologisk natriumkloridlösning i vatten såsom kontrollprov.

Esterproverna användes i form av emulsion under användning av angivet ytaktivt medel och saltproverna användes såsom de direkt lösts i vatten. Varje prov gjordes fysiologiskt isoto- niskt med en slutkoncentration av 3 víktprocent. Varje prov adminístrerades en gång 24 h före pâbörjandet av transplantations- testen och därefter en gång per dygn under 20 dygn.

Enligt ytlig iakttagelse efter 20 dygn uppvisade grupperna som utsatts för administrering av föreliggande föreningar ett ympöverlevnadsförhållande av ca 80-90 % i motsats till 0 % vid kontrollprovningen. Dessa resultat visar den farmakologiska effektiviteten hos föreliggande föreningar såsom immunitetsned- sättande medel. (3) Antiinflammatorisk verkan.

Under användning av råttor administrerades vart och ett av derivaten av 7~hydroxikolesterol och 7-ketokolesterol, som vi- sas i tabell 3, íntraperítonealt i 5 råttor i varje grupp i en dos av 50 mg/kg (fysíologiskt isotonisk, vattenhultíg lösning med en koncentration av 2,0 viktprocent) och 1 h efter adminis- treringen inympades subkutant i var och en 0,05 ml 1-procentíg, vattenhaltig karragenínlösning, såsom inflammationsframkallande substans vid bakre fotdynan.

Efter 1 h från inympningen av karragenin mättes stor- leken hos det ödem som framkallats på fotdynan med hjälp av en differentíalvolymmätare för jämförelse med volymen hos kontroll- gruppen, som givits fysiologisk natriumklorídlösning i vatten.

Resultaten visas i tabell 2. De administrerade esterprover- na var i form av emulsion under användning av en fosfolipid så- 10 15 20 soo412s-4 6 som ytaktivt medel och saltproverna var i form av fysíologislt isotonisk lösning.

Tabell Z Antíinflammatorisk verkan Svällningsgrad P r Û V hos ödem (5) Kontroll S2 7-ketokelesterylvätesuccinat 30 7-ketokolesterylväteftalat 28 Natrium-7-ketokolesterylsucçinat 50 Ammonium-7-ketokolesterylsuccínat 30 7~hydroxikolesterylvätesuccinat 29 Natrium-7-hydroxikolesterylsuccinat 28 7ß-hydroxikolesterylväteftalat 30 Natrium-7B-hydroxíkolesterylftalat 31 (4) Mängd och metod för administrering Föreningarna med den allmänna formeln (I) enligt uppfin- ningen, som undersöktes genom djurförsök på effektiv dos för 50 % vid immunitetsnedsättande verkan och vid antiinflammato- risk verkan är vid terapeutisk användning lämpligen i form av injicerbara preparat och den önskvärda dosen därav vid injektio- nen är 10 - 1000 mg total mängd/kg. Dessa föreningar är även verksamma vhiextern och oral administrering, men doserna är i dessa fall 40 - 2000 mg total mängd/kg. När de användes externt, kan den totala dosen vara liten, emedan de kan verka topiskt.

När föreningarna användes för injektion, användes de före- trädesvis såsom en 0,1- till 1-procentig vattenhaltig lösning och vid estertyp användes föreningarna i form av en fysiologiskr isotonisk, vattenhaltig dispersion emulgerad med hjälp av ett lämpligt ytaktivt medel.

När de administreras i form av en vattenhultig lösning, är tillsatsen av ett känt stabíliseringsmedel för steroider, t ex albumin, mycket lämplig. Det är tillräckligt att tillsätta detta i en mängd av 0,1 - 5 viktprocent till den vattcnhultiga lösningen. 10 15 20 25 30 40 '8004125-4 '7 I Tillsatsen av propylenglykol, polyetylenglykol eller glycerol såsom lösningshjälpmedel är dessutom gynnsam. Det är tillräckligt att tillsätta detta i en mängd av 0,1 - 8,0 vikt- procent tillden vattenhaltiga lösningen.

Vid oral administrering kan föreningarna enligt uppfin- ningen beredas till tabletter eller vätskepreparat lämpliga för oral administrering på ett för fackmannen känt sätt.

Vid extern administrering kan de påföras genom beredning av dem till salvor på ett för fackmannen känt sätt. Detta administreringssätt är verksamt, eftersom preparatet verkar di- rekt på den påverkade delen. (5) Provning av akut toxicitet Provningen av den akuta toxiciteten genomfördes under an- vändning av råttor, varvid varje grupp bestod av.5 råttor vardera vägande ca 200 g; 7-ketokolesterylvätesuccinat, 7-ketokolesteryl- väteftalat, natrium-7-ketokolesterylsuccinat, ammonium-7-keto- kolesterylsuccinat, 7-hydroxikolesterylvätesuccinat, 7ß-hydroxi- kolesterylväteftalat, natrium-7-hydroxikolesterylsuccinat och natrium-76-hydroxikolesterylftalat provades. Var och en av före- ningarna av salttyp bereddes till en fysíologiskt isotonisk, vattenhaltig lösning och var och en av föreningarna av estertyp dispergerades med ett ytaktivt medel och bereddes till en lik- formig dispersion genom behandling med ultraljud. Var och en av dem administrerades därefter intraperitonealt i en mängd av 250 mg/kg, 500 mg/kg, 750 mg/kg eller 1000 mg/kg. Efter 5 dygns observation hade icke någon råtta dött.

Såsom beskrivits har föreningarna enligt uppfinningen prak- tiskt taget icke någon toxicitet och icke heller någon antigen- egenskap, så att de kan användas såsom utomordentlíga, immuni- tetsnedsättande eller antiinflammatoriska medel.

Sättet att framställa föreningarna enligt uppfinningen vi- sas i följande exempel. q Exempel 1. I 50 ml pyridin löstes 5 g 7-ketokolesterol och 1,8 g bärnstenssyraanhydrid tillsattes. Blandningen uppvärmdes till 90°C under 8 h och fick stå över natten vid rumstempera- tur. Reaktionsblandningen hälldes i 500 ml iskallt vatten och surgjordes med saltsyra, isolerade kristaller frånfiltrerades, löstes i etanol, avfärgades genom tillsats av aktivt kol och filtrerades därefter. Vatten sattes till filtratet och de iso- lerade kristallerna fränfiltrerades. Kristallerna omkristalli- 15 20 25 30 8004125-4 8 serades1n*vattenhaltig etanol; varvid erhölls 5,4 g fjällíknande, krístullintI7-kvtnkolcstcrylvätosuccinnt; smältpunkt 187,5- -1s9,s°c. “ I ' Elementaranalysz _C31H4805 Teoretiskt värde (%): C 74,36, H 9,66 c 74,54, H _9,s9 (KBI-tab1ett): 1 om fFörsöksvärde (%): exe Infrarödabsorptionsmaxima 1735, 1705, 7670, 1170 cm' Exempel 2. I S0 ml pyrídin löstes 5 g 7-ketokolesterol och 2,7 g ftalsyraanhydrid tillsattes. Blandningen behandlades på samma sätt som i exempel 1, varvid erhölls 5,8 g 7-ketokolesterylväte- ftaiat; smä1cpunkt'16s,s - 171,o°c.

Elementaranalys: C35H4805 Teoretiskt värde (%): C 76,61, H 8,82 Försöksvärde (%)=i c 76,80, H 8,79 * Infrarödabsorptíonsmaxima. (KBr-tablett) 1735, 1705, 167o,“117o cm'1 Exempel 3 . I 22 ml metanol suspenderades 733 mg 7-ketokoleste~ rylvätesuccínat och 3,38 ml metanollösning innehållande 1 % natriummetylat tillsattes under omröríng vid rumstemperatur.

Omröringen fortsattes i 20 min vid rumstemperatur. Efter full- hordad reaktion avdestillerades metanolen under förmínskat tryck, varvid erhölls 718 mg natrium-7-ketokolesterylsuccinat i form av ett vitt pulver.

Exempel 4. I 5 ml metanol suspenderades 100 mg 7-ketokoleste- rylvätesuccinat och 1,6 ml metanollösning innehållande 0,5 % natriumhydroxíd tillsattes under blandning. Blandníngen behand- lades därefter på samma sätt som i exempel 3, varvid erhölls 100 mg natríum-7-ketokolesterylsuccinat i form av ett vitt, pulver.- Exempel 5. I S ml metanol suspenderades 100 mg 7-ketokolesteryl- vätesuccínat och torr ammoníakgas infördes för mättning under omröring. Blandningcn behandlades pâ samma sätt som i exempel .3, varvid erhölls 98 mg ammonium-7-kctokolesterylsuccinat i form av ett vitt pulver.

Exempel 6. I 10 ml koltetraklorid löstes 2,0 g kolesterylväte- succínat under häftig omröríng av lösningen vid SOOC och en blandning av t-butylkromat (9 ggr i mol räknat) i 20 ml kol- tetraklorid, 6 ml ättíksyra och 3 ml ättiksyraanhydrid till- sattes droppvis så småningom. Efter 10 h häftig omröríng vid -8004125-4 80OC tilläts reaktíonsblandningen stå över natten vid rumstempe- ratur. Under omröring och iskvlning blandades reaktíonsbland- ningen därefter sd smaningom med 45 ml 10-procentig, vattenhal- tig oxalsyralösning och vidare med 1,5 g oxalsyra och omröringen fortsattes under iskylning i Z h och därefter vid rumstemperatur i Z h. Koltetrakloridskíktet avskíldes därefter, förenades med den extraktlösning, som erhållits genom extraktíon av vattenskik- tet 5 ggr med vardera 10 ml koltetraklorid, tvättades med vatten, befriades fràn vatten med vattenfritt natriumsulfat och utsattes därefter för dostillatíon för avlägsnande av koltetrakloriden.

Den erhållna återstoden omkristallíserades ur vattenhaltig etanol, varvid erhölls 830 ml 7-ketokodesterylvätesuccinat. Infraröd- absorptionsspektrum för denna produkt motsvarade den för före- ningen som erhållits i exempel 1. 7 Exempel 7. 2,5 g kolesterylvätesuccinat omrördes tillsammans med 60 ml ättíksyra vid 54 - ÖOOC, varvid 125 mg vattenfri kromsyra tillsattes 12 ggr med 10 min mellanrum. Efter kraftig omröring vid 54 - 60OC under ytterligare 2,5 h kyldes reaktionsblandningen åter till rumstemperatur, blandades med 0,5 ml 95-procentíg eta- nol under omröring och därefter tillsattes så småningom 20 ml vatten och blandningen fick stå över natten vid 5-10°C. Den iso- lerade krístallina produkten frånfiltrerades, tvättades med en kall, 50-procentíg, vattenhaltig ättiksyralösning och torkades därefter. Den erhållna produkten omkristallíserades ur vatten- haltíg etanol, varvid erhölls 800 mg 7-ketokolesterylväte- succinat. Infrarödabsorptionsspektrum för denna produkt mot- svarar det för den produkt som erhållits i exempel 1.

Exempel 8. I 100 ml metanol löstes 3,75 g natrium-7-ketokoleste- rylsuccinat. Under omnöring och iskylning tillsattes så småningom 820 mg natriumborohydrid och omröringen fortsattes under ískyl- ning i'10 - 15 min och ytterligare vid rumstemperatur under 1 h.

Sedan överskott natriumborohydrid hade sönderdelats genom till- sats av 2 ml ättiksyra späddes reaktionsblandningon med 150 ml vatten och surgjordes med ättiksyra; isolerade kristaller ut- vanns genom filtrering. De erhållna kristallerna omkristallíse- rades ur cyklohoxan, varvid erhölls 3,43 g nálformat, kristal- lint 7-hydroxikolesterylvätesuccínat; smältpunkt 150-154°C.

Denna produkt var en blandning av 7d-hydroxiísomer och 7ß-hydroxi- isomer i en proportion av 1: ca 3. 75-hydroxíisnmeren var i majoritet. 8ÛÛ4125~4 10 Elelnentarzxnzllys: CSWHSOÛS _ _ Teoretiskt värde C%): C 74,06, H 10,02 Försöksvärde (%) 2 C 74,21, H 9,96 Infrarödabsorptíonsmaxíma (KBr-tablett) 3500, 1730, 1705, 1105 cm°1 Exemgel 9. Genom behandling av 1,0 g 7-hydroxíko1estery1väte- succínat på samma sätt som i exempel 3 erhölls 983 mg natrium- salt därav í form av vitt pulver.

Exemgel 10. Genom behandling av 1,6 g natríum-7-ketokolesteryl~ 5 ftalat på samma sätt som i exempel 8 erhölls 1,3 g 7-hydroxí- kolesterylväteftalat. Produkten utsattes för fraktíonerad om- kristullisation ur n~propanol] varvid erhölls 129 mg 7a-hydroxí- isomer och 792 mg 76-hydroxíisomer. 7 7o~hydroxíísomer: Smältpunkt 176 - 177°C (sönderdelníng) Elementaranalysz CSÖHSOOS Teoretiskt värde 11); c 76,s3,l H 9,15 Försöksvärde (%): C 76,15, H 9,21 Infrarödabsorptíonsmaxíma (KBr-tablett) 5370, 1715, 1700, 1300 cm"1 7ß-hydroxíísomer: 7 Smältpunkt 149 - 1530C (sönderdelning Elementaranalys: CBSHSOOS Teoretiskt värde (%]: C 76,33, H 9 Försöksvärde (%) ' : C 76 61 H 9 Infrarödabsorptionsmaxíma (KBT-tablett): 3320, 1720, 1630, 1285 cm“1 Exemgel 11 . Genom behandling av 400 mg 7ß-hydroxíkolesteryl- 10 väteftalat på samma sätt som i exempel J erhölls 395 mg natrium- salt därav i form av vitt pulver.

Claims (3)

1* aoo412s-4 Pategíšrax I.

Huívester av organisk tvábusisk syra Och 7-ketoko1e5te~ 7-hydrnxíkolesterol med den allmänna formeln: rol eller \_/\/'\\¥/' ; å I o'rd\lj)\ .-'\\É Nl* «}':-J o o I

3. J u n \\\ HÜC-RZ-CÛ R1 vari R betecknar =O eller -OH och R7 betecknar en alkylengrupp med 1-5 kolatomer eller en fenylengrapp, och fysíologiskt godtag- bara salter därav.