KR830002844B1 - 수용성 콜레스테롤 유도체의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

수용성 콜레스테롤 유도체의 제조방법

본 발명은 신규의 콜레스테롤 유도체, 보다 상세하게는, 7-케토콜레스테롤 및 7-히드록시콜레스테롤의 유기 이염기산 반에 스테르류, 이의 생리적으로 허용되는 염류 및 이들 화합물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명사들은 이에 앞서 인체 혈청의 Cohnn's IV-1 paste에서 단리시킨 면역억제 활성물질이 7-케토콜레스테롤 및 7-히드록시콜레스테롤 임을 발견하고, 이들 화합물의 약리시험의 결과, 이들이 면역억제제 특히 세포성 면역억제제로서 유효하며, 또 항염증 치료제로서도 유효함을 발견해 내었다. (일본국 공개특허 공고번호 제 104,735호/1978년)

7-케토콜레스테롤 및 7-히드록시콜레스테롤은 물에 난용성인 화합물이기 때문에 본발명자들은 의약품으로서 제제 기술적으로 극히 가치가 있는 이들화합물의 수용성 유도체를 개발하기위하여 광범위한연구를 행한 결과 하기 일반식(1)로 표시되는 7-케토콜레스테롤 및 7-히드록시콜레스테롤의 유기이 염기산 반네스테르 및 약치적으로 허용되는 이들의 염을 제조하는데 성공하여 본 발명을 완성하였다.

(식중, R₁는=0 또는 -OH를 의미하고, R₂는 C₁~C₅알킬렌기 또는 페닐렌기를 의미한다)

7-케토콜레스테롤 및 7-히드록시콜레스테롤은 물에 난용성인화 합물이기 때문에 본 발명자들은 의약품으로서 제제 기술적으로 극히 가치가 있는 이들 화합물의 수용성유도체를 개발하기 위하여 광범위한 연구를 행한 결과, 하기 일반식 (Ⅰ )로 표시되는 7-케토콜레스테롤 및 7-히드록시콜레스테롤의 유기이 염기산반에스테트 및 약리적으로 허용되는 이들의 염을 제조하는데 성공하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규의 7-케토콜레스테롤 및 7-히드록시콜레스테롤의 유기 이염기산 반에스테르 이들의 생리적으로 허용되는 염류 및 이들의 제조방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 기타의 목적과 효과들에 대하여 하기의 서술내용으로부터 상세하게 이해할 수 있을 것이다.

본 발명의 방법에 의하면, 하기 일반식 (Ⅱ )로 표시되는 7-케토콜레스테롤의 유기이염기산 반에스테르는 7-케토콜레스테롤을 피리딘, 트리에틸아민, 디메틸아닐린 등의 제3급아민 존재하에서 호박산, 아딘핀산, 글루타르산, 프탈산 등의 하기 일반식 ( Ⅳ)로 표시되는 상응하는 유기이염기산의 반응성 유도체와 부분에스테르화반응을 수행함으로서 제조할 수가 있다.

(식들중, R₂는 상기에서 정의한 바와 같다)

상기 유기 이염기산의 반응성 유도체로서는 예를 들면, 산무수물과 산할로겐화물을 열거할 수가 있으며 이의 사용량은 통상 7-케토콜레스테롤 1몰에 대하여 1.0내지 3.0몰이다. 반응온도는 통상 60내지 150℃이다.

7-케토콜레스테롤의 유기이염기산 반에스테르는 콜레스테롤유연체를 일반식 (Ⅳ)으로 표시되는 상응하는 이염기산과 반응시킴으로서 얻을 수 있는 콜레스테르의 유기이염기산 반에스테르를크롬산 기산화제에 의해 산화시킴으로서 또한 제조할 수가 있다. 크롬산기산화제로서는 무수크롬산, t-부틸크롬산 에스테르 또는 중크롬산칼륨, 중크롬산나트륨 등과 같은 중크롬삼 염 등을 열거할 수가 있으며 이의 사용량은 통상 콜레스테롤이 유기이염기산 반에스테르 1몰에 대하여 3.0내지 15몰이다. 반응은 용매 중에서 수행하는데 반응용매로서는 초산, 프로피온산, 무수초산 등의 유기산 또는 상기 유기산을 함유하는 사염화탄소클로로포름, 염화메틸렌, 벤젠 등의 불활성용매를 열거할 수가 있다. 반응온도는 통상 30내지 100℃이며, 또 사용하는 산화제에 따라 다른데, 이를테면 t-부틸크롬산에스테르를 사용하는 경우에는 통상 사용하는 용매의 비점 온도이고, 무수크롬산 및 중크롬산염을 사용하는 경우는 40내지 70℃가 바람직하다.

다음에 일반식(Ⅲ)으로 표시되는 7-히드록시콜레스테롤의 유기 이염기산 반에스테르는 7-케토콜레스테롤의 상응하는 유기이염기산 반에스테르 또는 그의 염을 몰, 메탄올, 에탄올, 디옥산, 테트라히드로푸란 등의 용매 중에서 수소화붕소나트륨, 수소화붕소칼륨 또는 수소화 리튬알루미늄 등의 착금속수소화물에 의한 환원반응을 수행함으로서 제조할 수가 있다.

(식중, R₂는 상기에서 정의한 바와 같다)

착금속수소화물의 사용량은 7-케토콜레스테롤의 유기 이염기산반에스테르 1몰에 대하여 1.0 내지 10.0몰이다. 반응온도는 특히 한정되어 있지는 않으나 통상 0℃로 냉각하내지는 실온에서 수행한다.

상기와 같이 얻을 수 있는 7-케토콜레스테롤 및 7-히드록시콜레스테롤의 유기 이염기산반에스테르는 소망에 따라서 통상의 방법에 의해 칼륨, 나트륨과 같은 알카리금속염, 칼슘과 같은 알카리토금속염, 암모늄염 또는 트리에틸아민, 트리에탄올과 같은 유기염기와 같은 생리적으로 허용되는 염류로 유도할 수가 있으며, 이들은 모두 문헌미재의 신규의 화합물로서 면역억제작용, 특히 세포성 면역억제작용 및 항염증작용이 우수한 것 외에도 수용성을 나타내기 때문에 의약품으로서 극히 유용하다.

다음에 본 발명에 따른 화합물류의 유용성에 관한 실험 데이터를 기재한다.

(1) 면역억제작용(시험관내의 실험)

Cooparband씨 외의 PHA법[면역학지, 109권, (1), 154페이지 (1972)]에 의해 본 발명에 따른 화합물류의 PHA 반응의 50%억제농도를 조사하여 그 결과를 제1표에 기재하였다. 또 비교실험으로서 Occhino씨 외의 방법[면역학지, 110권, (3), 685페이지 (1973)]에 의해 얻은 IRA(Immunoregulatory α-globulin)의 효과를 나타내었다. 이들 화합물들 중에서 에스테르형태의 화합물들은 계면활성제로서 분자량이 8350인 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌의 공중합체로 현탁시킨 유제로하여 사용하였으며, 염형태의 화합물들은 수용액으로하여 사용하였다.

[제1표]

면역억제효과

(2) 면역 억제작용(시험관내 실험)

본 발명에 따른 화합물류를 사용하여 동물시험을 행하였다. 생쥐 25마리를 5군 (1군 5마리씩)으로 나누어 사용하였다. 대조시료를 포함한 시료들을 각쥐들에 20일간 연속 정맥내투여하여 피부이식 실험을 행한 결과를 검토하였다.

제1군 ; 7-히드록시콜레스테롤 호박산 반에스테르(8mg/kg/일)

제2군 ; 7-케토콜레스테롤 호박산 반에스테르(10mg/kg/일)

제3군 ; 7-히드록시콜레스테롤 호박산반에스테르 나트륨염(8mg/kg/일)

제4군 ; 7-케토콜레스테롤 호박산반에스테르 나트륨염(10mg/kg/일)

제5군 ; 대조시료로서 염화나트륨 생리수용액

에스테르시료들은 전술한 계면활성제로 현탁시킨 유제로하여 사용하였으며, 염시료들은 직접물에 용해시켜 사용하였다. 각시료는 모두 최종농도 3.0중량 %의 생리적 등장액으로 하였다. 각 시료는 이식실험개시 24시간 전에 미리 투여하고, 그후 1일 1회 20일간 투여하였다.

20일 후의 표면 관찰에 의하면, 본 발명에 따른 화합물류의 투여군은 대조화합물의 0%에 대하여 약 80내지 90%의 이식생존율을 나타내었다. 이것은 본 화합물류의 면역억제제로서의 약리효과의 유효성을 시사하는 것이다.

(3) 항염증작용

생쥐 20마리를 1군 5마리로하여, 제2표에 기재한 7-히드록시콜레스테롤 유도체 및 7-케토콜레스테롤 유도체 각각을 200mg/kg (2.0 중량% 농도의 생리적 등장 수용액)씩을 복강내투여한 후, 1시간 후에 염증유발체로서 1% 카라기닌 수용액 0.05ml를 뒷다리 피하에 투여하였다.

카라기닌의 투여 4시간 후에 다리에 생긴 부종의 크기를 보륨디퍼 렌설 미터(Volume differential meter)로 측정하여 대조의 생리식염수 투여군과 비교하였다.

결과를 제2표에 기재한다. 에스테르시료들은 계민활성제인지질의 유제로하여 투여하였으며, 염시료들은 생리적 등장액으로하여 투여하였다.

[제2표]

항염증효과

(4) 투여량 및 투여방법

본 발명에 따른 일반식 ( )화합물류의 면역억제작용, 항염증작용에 대한 50% 유효량을 동물시험에 의해 검토한 결과, 의약으로서 치료에 사용할 때의 바람직한 형태는 주사약이며, 투여량으로서는 총량 10내지 1000mg/kg이다. 또 외용제 및 경구제로서 사용하여도 유효하며, 이의 투여량은 총 40내지 2000mg/kg이다. 또 외용제로서 사용할 경우엔 국소적으로 작용할 수 있기 때문에 소량으로도 가능하다.

주사약으로서 사용하는 경우에는 본 발명의 화합물류는 0.1 내지 1% 수용액으로서 사용하는 것이 바람직하며, 본 발명의 화합물이 에스테르 형태인 경우에 있어서는 적당한 계면활성제로 유화시킨 생리 등장분산 수용액형으로하여 사용한다.

수용액으로 투여하는 경우에는 종래 공지의 스테로이드류(예, 알부민)의 안정제를 첨가하면 아주 효과가 있다. 이의 첨가량은 수용액 중 0.1내지 5중량 %의 양이면 충분하다.

또 용해 보조제로서 프로필렌글리코올, 폴리에틸렌글리코올 또는 글리세린을 첨가하는 것이 바람직하다 이의 첨가량은 수용액중 0.1 내지 80 중량 %이면 충분하다.

경구제로서 사용하는 경우는 당분야의 공지의 방법에 의해 경구토여용에 적합한 정제 또는 액제로 제제할 수가 있다.

의용제로서 사용하는 경우에 있어서도 당분야의 공지의 방법에 의해 연고제로서 제제사용할 수 있으며 이의 경우에는 환부에 직접 제제를 작용시키기 때문에 유효하다.

(5) 극성독성 시험

7-케토콜레스테롤 호박산 반에스테르, 7-케로콜레스테롤 프탈산 반에스테트, 7-케토콜레스테롤 호박산 반에스테르 나트륨염, 7-케토콜레스테롤 호박산 반에스테르 암모늄임, 7-히드록시콜레스테롤 호박산 반에스테르, 7β -히드록시콜레스테롤 프탈산반에스테르, 7-히드록시콜레스테롤 호박산 반에스테르 나트륨염 및 7β -히드록시콜레스테롤 프탈산 반에스테르나트륨염의 급성독성 시험을 체중 약 200g의 생쥐 1군 5마리를 사용하여 행하였다. 염 형태의 각 화합물들은 생리식염수에 현탁시키고, 또 에스테르 형태의 각 화합물들은 계면 활성제로 현탁시킨 다음 초음파처리에 의해 균일한 현탁액으로 한 후 250mg/kg, 750mg/kg, 1000mg/kg을 각각 복강내 투여하고 5일간 관찰을 행하였으나, 사망에는 관찰되지 않았다.

이와 같이 본 발명의 화합물은 독성이 거의 없고 또 항원성도 없기 때문에 우수한 면역억제재 또는 항염증제로서 제공될 수 있다. 하기에 실시예를 열거하여 본 발명 화합물의 제조방법을 상세하게 서술하겠다.

[실시예 1]

7-케토콜레스테롤 5g을 피리딘 50ml 중에 용해시키고, 여기에 무수호박산 1.8g을 첨가하여 90℃에서 8시간 가온하고 또 실온에서 일야 방이하였다. 다음에 이 반응액을 500ml의 빙수중에 주가하고 염산으로 산정화한 다음, 석출되는 결정을 여취하였다. 이 결정을 에탄올에 용해하고 활성탄을 첨가하여 탈색 여과후, 여액에 물을 첨가하여 석출되는 결정을 여취하였다. 이 결정을 함수 에탄올에서 재결성하여 용점이 187.5내지 189.5℃인 7-케토콜레스테롤 호박산 반에스테르의 인삼(鱗狀)결정 5.4g을 얻었다.

원소분석 : C₃₁H₄₅O₅

이론치(%) : C, 74.36, H, 9.66

실험치(%) : C, 74.54, H, 9.59

적외흡수스펙트럼(KBγ 정)

1735, 1705, 1670, 1170cm^-1

[실시예 2]

7-케토콜레스테롤 5g을 피리딘 50ml 중에 용해시키고, 무수 프탈산 2.7g을 첨가하여 실시예 1에서와 같이 처리한 결과 용점이 168.5내지 171.0℃인 7-케토콜레스테롤 프탈산 반 에스테르 5.8g을 얻었다.

원소분석 : C₃₅H₄₅O₅

이론치(%) : C, 76.61, H, 8.82

실험치(%) : C, 76.80, H, 8.79

적외흡수스펙트럼(KB 정)

1735, 1705, 1670, 1170cm-1

[실시예 3]

7-케토콜레스테롤 호박산 반에스테르 733mg을 메탄올 22ml 중에 현탁시키고, 실온에서 교반하면서 1% 나트륨 메틸라아트메 탄올용액 3.3ml를 첨가시켜 실온에서 20분간 교반을 계속 행하였다. 반응 종료후에 감압하에서 메탄올을 유기한 결과, 백색분말의 7-케토콜레스테롤 호박산 반에스테르 나트륨염 718mg을 얻었다.

[실시예 4]

7-케토콜레스테롤 호박산 반에스테르 100mg을 메탄올 5ml 중에 현탁시키고, 교반하면서 0.5% 수산화나트륨 메탄올용액 1.6ml를 첨가하여 실시예 3에서와 같은 방법으로 처리한 결과 백색분말의 7-케토콜레스테롤 호박산 반에스테르 나트륨염 100mg을 얻었다.

[실시예 5]

7-케토콜레스테롤 호박산 반에스테르 100mg을 메탄올 5ml 중에 현탁시키고, 교반하면서 건조 암모니아 가스를 도입시켜 포화시킨 다음, 실시예 3에서와 같은 방법으로 처리한 결과, 백색분말의 7-케토콜레스테롤 호박산 반에스테르 나트륨염 98mg을 얻었다.

[실시예 6]

콜레스테롤 호박산 반에스테르 2.0g을 4염화탄소 10ml 중에 용해시키고 80℃로 가온하여 맹렬하게 교반하면서 t-부틸크롬산 에스테르(9배 몰량), 4염화탄소 20ml, 초산 6ml 및 무수초산 3ml의 혼액을 서서히 적가하였다. 적가후 10시간 80℃에서 맹렬히 교반한 다음, 반응액을 실온에서 일야 방치하였다. 방치후 반응액을 빙냉교반하면서 여기에 10% 수산수용액 45ml를 서서히 첨가하고, 빙냉하에서 2시간 교반한다음, 실온에서 2시간 교반하였다. 교반후 4 염화탄소층을 분취하고, 수층을 매회 마다 4염화탄소 10ml로 3회 추출하여 얻어지는 추출액과 합친 다음, 수세하고, 무수황산나트륨으로 탈수한 다음, 4염화탄소를 유기하였다. 얻어진 잔사를 함수에탄올에서 재결정하여 7-케토콜레스테롤 호박산 반에스테르 830mg을 얻었다. 본 품의 적외선 흡수스펙트럼은 실시예 1에서 얻은 화합물의 경우와 일치하였다.

[실시예 7]

콜레스테롤 호박산 반에스테르 2.5g을 초산 60ml와 함께 54내지 60℃로 가온하고 교반하면서, 무수크롬산을 10분 간격으로 125mg씩 12회 첨가하였다. 무수크롬산척가후 54내지 60℃에서 또 2.5시간 맹렬하게 교반한 다음, 반응액의 온도를 실온으로 다시 냉각시키고, 교반하면서 95%에탄올 2.5ml를 첨가한 후 물 20ml를 서서히 첨가시키고, 5내지 10℃에서 일야 방치하였다. 석출되는 결정물을 여취하고 냉 50% 초산수용액으로 세척한 다음 건조시켰다. 다음에 함수에탄올에서 재결정시킨 결과, 7-케토콜레스테롤 호박산 반에스테르 800mg이 얻어졌다. 본 품의 적외선 흡수스펙트럼은 실시예 1에서 얻은 화합물의 경우와 일치하였다.

[실시예 8]

7-케토콜레스테롤 호박산 반에스테르 나트륨염 3.75g을 메탄올 10ml 중에 용해시키고, 냉빙교반하면서 수소화붕소나트륨 820mg을 서서히 첨가시킨다음 10내지 15분간 빙냉 교반하면서 또 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액에 초산 2ml를 첨가하여 과잉의 수소화붕소나트륨을 분해시킨 후 물 150ml로 희석시키고 염산으로 산성화하여 석출되는 결정을 여취하였다. 얻어진 결정을 시클로헥산에서 재결정하여 융점이 150내지 154℃인 7-히드록시콜레스테롤 호박산 반에스테르의 침상결정 3.43g을 얻었다. 본품은 7β -히드록시이성체와 7β -히드록시 이성체와의 혼합물이며, 이의 비율은 약 3:1이고 주로 7 β-히드록시 이성체이었다.

원소분석 : C₃₁H₅₀O₅

이론치(%) : C, 74.06, H, 10.02

실험치(%) : C, 74.21, H, 9.96

적외흡수스펙트럼(KBγ 정)

3500, 1730, 1705, 1165cm^-1

[실시예 9]

7-히드록시콜레스테롤 호박산 반에스테르 1.0g을 실시예 3에서와 같이 처리하여 백색분말의 나트륨염 983mg을 얻었다.

[실시예 10]

7-콜레스테롤 프탈산 반에스테르 나트륨염 1.6g을 실시예 8에서와 같이 처리하여 7-히드록시콜레스테롤 프탈산 반에스테르 1.3g을 얻었다. 본품을 n-프로판올에서 재결정하여 7α-히드록시 이성체 129mg 및 7β-히드록시이성체 792mg을 얻었다.

7α-히드록시 이성체

융점 : 176-177℃(분해)

원소분석 : C₃₆H₅₀O₅

이론치(%) : C, 76.33, H, 9.15

실험치(%) : C, 76.15, H, 9.21

적외선 흡수스펙트럼(KBγ 정)

3370, 1715, 1700, 1300cm^-1

7β-히드록시 이성체

융점 : 149-153℃(분해)

원소분석 : C₃₅H₅₀O₅

이론치(%) : C, 76.33, H, 9.15

실험치(%) : C, 76.61, H, 9.02

적외선 흡수스펙트럼(KB 정)

3320, 1720, 1680, 1285cm-1

[실시예 11]

7-히드록시콜레스테롤 프탈산 반에스테르 400mg을 실시예 3에서와 같이 처리하여 백색분말의 나트륨염 395mg을 얻었다.

Claims (1)

1. 7-케토콜레스테롤을 제3급 아민의 존재하에서 하기 일반식(Ⅳ )로 표시되는 유기이염기산의 반응성 유도체와 반응시켜 에스테르화 반응시킴을 특징으로 하는 하기 일반식(Ⅰ )로 표시되는 7-케토콜레스테롤유기이염기산 반에스테르의 제조방법.

   

   (식들 중에서, R₁은=0 또는 -OH기이고 R_2는C₁~C₅알킬렌기 또는 페닐렌기임).