RU96112197A - Гены рецептора трансферрина haemophilus - Google Patents

Claims (41)

1. Очищенная и выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая фрагмент белка рецептора трансферрина штамма Haemophilus, имеющий консервативную аминокислотную последовательность, которая является консервативной для бактерий, продуцирующих белок рецептора трансферрина, где указанная консервативная аминокислотная последовательность имеет последовательность, содержащуюся внутри аминокислотных последовательностей пептидов, представленных в табл. 2 и 3 для штамма Eagan Haemophilus influenzae типа b, и соответствующих пептидов других штаммов Haemophilus influenzae.

2. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, где указанная консервативная аминокислотная последовательность включает LEGGFYGP (SEQ ID 74) или LEGGFYG (SEQ ID 85).

3. Очищенная и выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок рецептора трансферрина штамма Haemophilus, или его фрагмент или аналог, обладающие активностью белка рецептора трансферрина, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты характеризуется тем, что она представляет собой ДНК-последовательность, выбранную из группы, включающей в себя:
(а) любую из ДНК-последовательностей, представленных на рисунках 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 (SEQ ID 1, 2, 3, 4, 105, 108, 110, 112, 114) для специфических штаммов Haemophilus influenzae, и соответствующие ДНК-последовательности других штаммов.

(в) ДНК-последовательность, кодирующую одну из аминокислотных последовательностей, представленных на рисунках 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10 или 11 (SEQ ID 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 106, 107, 109, 111, 113, 115) для специфических штаммов Haemophilus influenzae, и ДНК-последовательности, кодирующие соответствующие аминокислотные последовательности других штаммов Haemophilus influenzae;
(с) ДНК-последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с любой из ДНК-последовательностей, определенных по п. (а) или (b).

4. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 3, где указанная ДНК-последовательность, определенная по п. (с), имеет по крайней мере около 90% последовательности, идентичной любой из ДНК-последовательностей, определенных по п. (а) или (b).

5. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 3 или 4, кодирующая лишь белок Tbp1 штамма Haemophilus influenzae.

6. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 3 или 4, кодирующая лишь белок Tbp2 штамма Haemophilus influenzae.

7. Вектор, адаптированный для трансформации хозяина, и включающий в себя молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-6.

8. Вектор по п. 7, имеющий специфические идентифицирующие характеристики плазмиды DS-712-1-3(АТСС, входящий 75603) или плазмиды JВ-1042-7-6(АТСС, входящий 75607).

9. Экспрессирующий вектор, адаптированный для трансформации хозяина, и включающий в себя молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1 - 6, и экспрессирующие элементы, правильно присоединенные к молекуле нуклеиновой кислоты, для экспрессии хозяином указанного белка рецептора трансферрина штамма Haemophilus, или его фрагмента или аналога.

10. Экспрессирующий вектор по п. 9, где указанная молекула нуклеиновой кислоты кодирует, по существу, весь белок рецептора трансферрина штамма Haemophilus.

11. Экспрессирующий вектор по п. 9, имеющий специфические идентифицирующие характеристики плазмиды JВ-1424-2-8 (АТСС, входящий 75937), плазмиды JВ-1600-1 (АТСС, входящий 75935), или плазмиды JВ-1468-29 (АТСС, входящий 75936).

12. Трансформированный хозяин, содержащий экспрессирующий вектор по любому из пп. 9-11.

13. Хозяин по п. 12, выбранный из группы, состоящей из JВ-1476-2-1, JВ-1437-4-1 и JВ-1607-1-1.

14. Хозяин по п. 12, представляющий собой штамм Haemophilus, генетически модифицированный указанным экспрессирующим вектором.

15. Рекомбинантный белок рецептора трансферрина или его фрагмент или аналог, обладающие активностью белка рецептора трансферрина, продуцируемые трансформированным хозяином по любому из пп. 12-14.

16. Выделенный и очищенный белок Tbp1 штамма Haemophilus, свободный от белка Тbр2 штамма Haemophilus.

17. Выделенный и очищенный белок Тbр2 штамма Haemophilus, свободный от белка Tbp1 штамма Haemophilus.

18. Белок Tbp1 или Тbр2 по п. 16 или 17, где указанным штаммом Haemophilus является штамм Haemophilus influenzae.

19. Белок Тbр1 или Тbр2 по п. 18, где указанным штаммом Haemophilus является штамм Haemophilus influenzae типа b, или нетипируемый штамм Haemophilus influenzae.

20. Пептид, имеющий не менее 6 аминокислот и не более 150 аминокислот, и содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую части только белка рецептора трансферрина штамма Haemophilus, или его аналога, обладающего активностью белка рецептора трансферрина, где штамм Haemophilus является штаммом Haemophilus influenzae типа b, выбранным из группы, состоящей из DL63, MinnA, Eagan и других штаммов типа b, а указанный белок рецептора трансферрина имеет аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей, представленных на рисунках 3, 4 и 5 (SEQ ID/) 5, 6, 7, 8, 9, 10) или соответствующих аминокислотных последовательностей других штаммов типа b; или штамм Haemophilus является нетипируемым штаммом Haemophilus influenzae, выбранным из группы, состоящей из РАК 12085, SВ12, SВ29, SВ32, SВ33, и других нетипируемых штаммов, а указанный белок рецептора трансферрина имеет аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей, представленных на рисунках 6, 7, 8, 9, 10 и 11 (SEQ ID 106, 107, 109, 111, 113, 115), и соответствующей аминокислотной последовательности других нетипируемых штаммов.

21. Пептид по п. 20, включающий в себя аминокислотную последовательность, которая является консервативной среди бактерий, продуцирующих белок рецептора трансферрина.

22. Пептид по п. 21, включающий в себя аминокислотную последовательность, которая является консервативной для штаммов Haemophilus.

23. Пептид, имеющий не менее 6 аминокислот и не более 150 аминокислот, и содержащий аминокислотную последовательность, которая является консервативной для бактерий, продуцирующих белок рецептора трансферрина, и которая представляет собой LEGGFYGP (SEQ ID 74) или LEGGFYG (SEQ ID 85).

24. Пептид, имеющий не менее 6 аминокислот и не более 150 аминокислот, и содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из последовательности, представленной в табл. 2 или 3 для штамма Eagan Haemophilus influenzae типа b, и соответствующих аминокислотных последовательностей других штаммов Haemophilus influenzae.

25. Иммуногенная композиция, включающая в себя по крайней мере один активный компонент, выбранный из группы, включающей в себя:
(А) очищенную и выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-6, кодирующую белок рецептора трансферрина штамма Haemophilus, или его фрагмент или аналог, обладающие активностью белка рецептора трансферрина;
(В) рекомбинантный белок рецептора трансферрина или его фрагмент или аналог, обладающие активностью белка рецептора трансферрина по п. 15;
(С) выделенный и очищенный белок Tbp1 штамма Haemophilus, свободный от белка Тbр2 штамма Haemophilus.

(D) выделенный и очищенный белок Tbр2 штамма Haemophilus, свободный от белка Тbр1 штамма Haemophilus.

(Е) пептид по любому из пп. 20-24; и
(F) живой вектор для доставки рецептора трансферрина хозяину, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. (А); и его фармацевтически приемлемый носитель, причем по крайней мере один из указанных активных компонентов продуцирует иммунный ответ при введении его хозяину.

26. Иммуногенная композиция по п. 25, изготовленная в виде вакцины для in vivo -введения в целях защиты от болезней, вызываемых бактериальными патогенами, продуцирующими рецепторы трансферрина.

27. Живой вектор для доставки белка рецептора трансферрина хозяину, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-6.

28. Живой вектор по п. 27, выбранный из Salmonella ВСG, аденовируса, поксвируса, вируса осповакцины и полиовируса.

29. Живой вектор по п. 27 или 28, где указанный вектор является полиовирусом, а молекула нуклеиновой кислоты кодирует фрагмент белка рецептора трансферрина, имеющий аминокислотную последовательность LEGGFYGP (SEQ ID 74) или LEGGFYG ( SEQ ID 85).

30. Плазмидный вектор, имеющий специфические идентифицирующие характеристики плазмиды рТ7ТВР2А (АТСС, входящий 75931), плазмиды рТ7ТВР2В (АТСС, входящий 75932), плазмиды рТ7ТВР2С (АТСС, входящий 75933), или плазмиды рТ7ТВР2D (АТСС, входящий 75934).

31. Штамм Haemophilus, не продуцирующий белок рецептора трансферрина.

32. Штамм по п. 31, включающий в себя ген, кодирующий рецептор трансферрина, который является функционально инертным.

33. Штамм по п. 32, где указанный ген является функционально инертным посредством инсерционного мутагенеза.

34. Штамм по п. 31, который является аттенюированным штаммом Haemophilus.

35. Живой вектор по п. 27, который является аттенюированным штаммом по п. 34.

36. Способ получения выделенного и очищенного белка Тbр1 или белка Тbр2 штамма Haemophilus, предусматривающий следующие стадии:
(а) получение рекомбинантного хозяина, экспрессирующего в тельцах включения, либо белок Tbр1, либо белок Тbр2;
(b) культивирование указанного хозяина с получением клеточной массы;
(с) разрушение клеточной массы с получением клеточного лизата;
(d) фракционирование клеточного лизата с получением первого супернатанта и первого осадка, причем первый супернатант включает в себя, по существу, большую часть растворимых белков хозяина;
(е) отделение указанного первого супернатанта от указанного первого осадка;
(f) селективную экстракцию первого осадка для удаления, в основном, всех растворимых белков хозяина и мембранных белков хозяина с получением второго супернатанта и экстрагированного осадка, содержащего тельца включения;
(g) отделение указанного второго супернатанта от указанного экстрагированного осадка;
(h) солюбилизацию экстрагированного осадка с получением солюбилизированного экстракта; и
(i) фракционирование солюбилизированного экстракта с получением фракции, содержащей белок Тbр1 или Тbр2.

37. Способ по п. 36, где указанный клеточный лизат подвергают фракционированию посредством центрифугирования.

38. Способ по п. 36 или 37, где указанная стадия селективной экстракции первого осадка включает в себя экстракцию по крайней мере одним детергентом.

39. Способ по любому из пп. 36-38, где указанный солюбилизированный экстракт подвергают фракционированию посредством гель-фильтрации с получением фракции, содержащей белок Тbр1 или Тbр2.

40. Способ по п. 39, предусматривающий далее диализ фракции, содержащей белок Тbр1 или Тbр2 для удаления по крайней мере одного указанного детергента с получением далее очищенного раствора белка Тbр1 или Тbр2.

41. Способ по любому из пп. 36-40, где указанным штаммом Haemophilus является штамм Haemophilus influenzae.