RU2813802C1 - Химерный фермент на основе L-метионин-гамма-лиазы, слитой с VHH антителом М456, и фрагмент ДНК, кодирующий указанный фермент - Google Patents
Химерный фермент на основе L-метионин-гамма-лиазы, слитой с VHH антителом М456, и фрагмент ДНК, кодирующий указанный фермент Download PDFInfo
- Publication number
- RU2813802C1 RU2813802C1 RU2022134110A RU2022134110A RU2813802C1 RU 2813802 C1 RU2813802 C1 RU 2813802C1 RU 2022134110 A RU2022134110 A RU 2022134110A RU 2022134110 A RU2022134110 A RU 2022134110A RU 2813802 C1 RU2813802 C1 RU 2813802C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mgl
- sequence
- methionine
- lyase
- gamma
- Prior art date
Links
- 108010043135 L-methionine gamma-lyase Proteins 0.000 title claims abstract description 43
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title description 3
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract 2
- 101150064085 megL gene Proteins 0.000 claims description 11
- 241000193470 Clostridium sporogenes Species 0.000 claims description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 14
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 14
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 9
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 8
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000224527 Trichomonas vaginalis Species 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000588919 Citrobacter freundii Species 0.000 description 3
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 3
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 3
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 2
- 241000224432 Entamoeba histolytica Species 0.000 description 2
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- 102000007665 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Human genes 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 2
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 2
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 2
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 229940007078 entamoeba histolytica Drugs 0.000 description 2
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 101150017331 mgl gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 2
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 description 1
- TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-N 2-oxobutanoic acid Chemical compound CCC(=O)C(O)=O TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607519 Aeromonas sp. Species 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 1
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108010041308 Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000014429 Insulin-like growth factor Human genes 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 150000008546 L-methionines Chemical class 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000005411 L01XE02 - Gefitinib Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 101100512778 Porphyromonas gingivalis (strain ATCC BAA-308 / W83) mgl gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 description 1
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 1
- 229920004929 Triton X-114 Polymers 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000012152 bradford reagent Substances 0.000 description 1
- BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N chembl1095986 Chemical class C1[C@@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]1C(N[C@H](C2=CC(O)=CC(O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)=C2C=2C(O)=CC=C(C=2)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2NC(=O)[C@@H]3C=4C=C(C(=C(O)C=4)C)OC=4C(O)=CC=C(C=4)[C@@H](N)C(=O)N[C@@H](C(=O)N3)[C@H](O)C=3C=CC(O4)=CC=3)C(=O)N1)C(O)=O)=O)C(C=C1)=CC=C1OC1=C(O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]5[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O5)O)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)C4=CC2=C1 BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 229940121647 egfr inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229960002584 gefitinib Drugs 0.000 description 1
- XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N gefitinib Chemical compound C=12C=C(OCCCN3CCOCC3)C(OC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical group 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005987 sulfurization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен химерный рекомбинантный белок MGL-M456 для терапии онкологических заболеваний, состоящий из L-метионин-гамма-лиазы, слитой с VHH антителом BCD090-М456. Также предложена генетическая конструкция, кодирующая указанный химерный белок. Группа изобретений может быть эффективно использована для терапии онкологических заболеваний. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.
Description
Изобретение относится к фармакологии и биотехнологии и может быть использовано в медико-биологической промышленности и для терапии онкологических заболеваний.
Цель данного изобретения - получение химерного фермента, потенциально способного к таргетной терапии онкологических заболеваний.
Разработан химерный белок: L-метионин-гамма-лиаза (МГЛ) [1,2] сшитая с VHH антителом на ERBB3: MGL-BCD090-M456. Разработан способ получения препарата на его основе: биосинтеза, выделения, очистки. Основные физико-химические характеристики показывают наличие растворимой формы белка в препарате.
МГЛ (КФ 4.4.1.11) является пиридоксаль-5'-фосфат - зависимым ферментом, катализирующим реакцию γ-расщепления L-метионина с образованием метилмеркаптана, иона аммония и α-кетобутирата:
МГЛ также катализирует реакцию γ-расщепления L-цистеина и его S-замещенных производных, а также реакции α- и β-замещения в молекулах L-метионина, L-цистеина и их аналогов [3]. Фермент был обнаружен в бактериях Pseudomonas putida, Citrobacter freundii, Aeromonas sp., Clostridium sporogenes, Phophyromonas gingivalis, Brevivacterium linens BL2, а также у простейших эукариот Trichomonas vaginalis [4] и Entamoeba histolytica [5]. Однако стационарные кинетические параметры определены лишь для ферментов из P. putida [6, 7], Т. vaginalis [4] и С.freundii [8].
Известны штаммы, которые используют для получения рекомбинантной МГЛ из таких бактерий как P. putida и Т. vaginalis, имеется патент на получение рекомбинантной МГЛ из P. putida [9]. В патенте [10] заявлена возможность улучшения свойств МГЛ при помощи изучения структуры белка и основанной на этом белковой инженерии. В работе [11] обнаружен ген megL, кодирующий МГЛ в бактериях семейства Enterobacteriaceae. В патенте Soda, et al 1999 [9] заявлена возможность получения рекомбинантной МГЛ с использованием гибридной плазмиды pYH301, в которой ген megL из P. putida расположен под контролем Plac промотора. Способ выделения и очистки фермента не заявлен, стабилизирующие агенты не применяются. Согласно данного патента инкубация на 37°С в присутствии изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) 1 мМ в течение 17 часов штамма Escherichia coli JM109. содержащего плазмиду pYH301, приводит к получению биомассы, бесклеточный экстракт которой, обладает целевой активностью 0,81 ед/мг.
Противоопухолевая активность МГЛ показана в публикациях [2, 12-16].
В патенте Roger G Harrison 2004 г. [17] заявлена возможность получения химерно слитых белков МГЛ с коньюгатами, связывающимися с рецепторами ростовых факторов. В качестве лигандов для распознавания гиперэкспрессированых на опухолевых клетках рецепторов были предложены урокиназа, эпидермальный ростовой фактор, трансформирующий ростовой фактор альфа, инсулина-подобный фактор роста, интерлейкин-4, интерлейкин-6, фактор роста тромбоцитов, фактор роста фибробластов, ламинин, фактор роста эндотелий сосудов, аннексин V, различные антитела и фрагменты лигандов. Применение однодоменных антител на рецептор из ERBb семейства в данном документе не описано.
Гиперэкспрессия семейства рецепторов эпидермального фактора роста, в том числе EGFR, - очень распространенный маркер опухолевых клеток [18, 19].
В нашей работе был сделан химерный белок: МГЛ слитая с антителом BCD090-М456 [20] (далее MGL-456). Антитело BCD090-M456 специфично связывается ERBB3 [20, 21].
Смысл применения антител в составе химерного белка с МГЛ состоит в том. что можно создать безметиониновую зону в организме вокруг раковых клеток в сóлидных (твердых) опухолях. В таких условиях отпадает необходимость транспорта МГЛ внутрь раковой клетки. Применение MGL-456 может синергично усилить эффект других химиотерапевтических препаратов. Например, известно, что химерная МГЛ с S3 лигандом на EGFR вызывает угнетение сигнального пути ERK и имеет синергию с гефитинибом (ингибитором EGFR) [22]. Кроме того, синергический эффект показан в патенте Манухова и др. 2020 г. [23], где изложен способ выделения и очистки МГЛ. Согласно этому документу для биосинтеза МГЛ (кодируется природным геном без модификаций в гетерологичной системе Е. coli) требуется добавление в среду сульфата аммония, очистка включает в себя стадию соосаждения спиртом, а применение в качестве антиракового препарата наиболее успешно в комбинации с доксорубицином. Модификация препарата с целью его таргетирования к раковым клеткам в данном патенте не рассматривается.
Ближайшим аналогом генетической конструкции является патент Soda et al 1996 г [22], где приведена последовательность рекомбинантной МГЛ из Pseudomonas putida. Ключевое отличие нашей генетической конструкции состоит в гомологичном гене МГЛ из С.s porogenus и следующим за ним в одной рамке считывания последовательности гена камелоидного антитела.
Ближайшим аналогом MGL-456 является патент [17], где было сделано коньюгирование L-метионин-гамма-лиазы из Pseudomonas putida с урокиназой. В отличии от [17] в нашей работе используется L-метионин-гамма-лиаза из С. sporogenus и однодоменное антитело с большей специфичностью по отношению к рецептору эпидермального фактора роста.
Задачей заявляемой группы изобретений является разработка нового химерного белка, перспективного для использования в качестве таргетного препарата в антираковой терапии,
Задача решена путем:
- разработки штаммов-продуцентов, несущих ген, кодирующий химерный белок-МГЛ слитый с VHH антителом М456 на С-конце и (вариант) с гистидиновой меткой (6 гистидинов), соединенной с геном МГЛ через последовательность TEV-протеазы на N-конце;
Проблема, решаемая данной группой изобретений, состоит в разработке таргетных препаратов, необходимых для снижения общей токсичности при химиотерапии. Техническим решением является создание плазмидных конструкций, содержащих заявляемую последовательность или ее гомолог, отличающийся вследствие вырожденности генетического кода, получение штамма продуцента на основе этих плазмид и демонстрация возможности выделения и очистки целевого белка.
Получение химерного белка МГЛ-456 в общем виде.
Получение генетической конструкции, кодирующей MGL-456 происходит путем амплификации гена megL, кодирующего L-метионин-гамма-лиазу из С. sporogenes [24], а также последовательности, кодирующей М456 [21] с последующим клонированием в плазмидном векторе. К 5'-концу megL гена с помощью ПЦР с последующей сборкой по Гибсону добавляется последовательность, кодирующая антитела.
Генетическая конструкции гибридной плазмиды, обеспечивающей биосинтез MGL-456, содержит ориджин репликации, ген устойчивости к канамицину и трансляционно слитую последовательность природной последовательности гена megL и VHH-антитела М456.
Изобретение проиллюстрировано фигурами 1 и 2 в виде карты гибридных плазмид, которые обеспечивают получение химерного белка для очистки с помощью ионно-обменной или никель-аффиной хроматографии соответственно. В этих плазмидах под контроль Т7 промотора клонированы гены megl-M456 и HisTev-megl-M456 соответственно.
Заключение.
В данной работе был разработаны химерный белок MGL-456, отработана технология его биосинтеза и хроматографической очистки. В результате достигнута цель - получена генетическая конструкция, кодирующая модифицированный фермент, обладающий потенциальным таргетным и цитостатическим свойством по отношению к опухолевым клеткам.
Пример 1.
Получение генетической конструкции, кодирующей MGL-456 на базе гибридных плазмид рЕТ 28a::megL_sporogenes, содержащий ген L-метионин-гамма-лиазы из С.sporogenes [24], а так же плазмиды pSol-SUMO-VHH456 [21].
Ген, кодирующий химерный белок - МГЛ слитый с VHH антителом получается путем клонирования. К 3'-концу megL гена с помощью кругового ПЦР с последующей сборкой по Гибсону добавляется последовательность антитела. Праймера пишутся так, чтобы получились перекрывающиеся концы. После этого две получившиеся цепочки ДНК лигируются с помощью сборки по Гибсону.
Генетическая конструкции гибридной плазмиды, обеспечивающей биосинтез MGL-456. содержит ориджин репликации, ген устойчивости к канамицину и трансляционно слитую последовательность природной последовательности гена megL и VHH-антитела М456. Карта гибридной плазмиды представлена на фигуре 1. Карта была построена с помощью программного обеспечения SnapGene Viewer (США).
Создание штамма-продуцента производилось путем химической трансформации клеток Е. coli BL21(DE 3) лигазной смесью, полученной на шаге, описанном выше. Получившиеся клоны были проверены с помощью определения последовательности по Сэнгеру.
Для биосинтеза используют среду, не содержащую NaCl (типа Rich medium) [25].
Очистка рекомбинантного белка MGL-456 из полученной биомассы проходит в соответствии с [24].
Полученный в результате раствор целевого белка, имеющий чистоту не менее 99% по МГЛ-456 может храниться как минимум 5 дней в темном месте при температуре 4°С.
Пример 2.
Получение генетической конструкции, кодирующей MGL-456 с HisTag-TEV меткой для никель-афинной очистки осуществляется с использованием гибридной плазмиды рЕТ 28a::megL_sporogenes, содержащий ген L-метионин-гамма-лиазы из С.sporogenes [24], а так же плазмиды pSol-SUMO-VHH456 [21].
Ген, кодирующий химерный белок - МГЛ слитый с VHH антителом и последовательнстью HisTag - TEV, получается путем клонирования. Сначала к гену megL с помощью лигирования по Гибсону и кругового ПЦР добавляется на N-конец последовательность HisTag-TEV, затем ставится два ПЦР - круговой на плазмиды с megL и для создания вставки в виде антитела на С-конец МГЛ. Праймера пишутся так, чтобы получились перекрывающиеся концы. После этого две получившиеся цепочки ДНК лигируется с помощью сборки по Гибсону. Карта гибридной плазмиды представлена на фигуре 2. Карта была построена с помощью программного обеспечения SnapGene Viewer (США).
Генетическая конструкции гибридной плазмиды, обеспечивающей биосинтез MGL-456, содержит ориджин репликации, ген устойчивости к канамицину и трансляционно слитую последовательность 6 His, сайта TEV протеазы, природной последовательности гена megL и VHH-антитела М456.
Создание штамма-продуцента производилось путем химической трансформации клеток Е. coli BL21(DE 3) лигазной смесью, полученной на шаге, описанном выше. Получившиеся клоны были проверены с помощью определения последовательности по Сэнгеру.
Для биосинтеза используют среду, не содержащую NaCl (типа Rich medium) [25].
Очистка рекомбинантного белка MGL-456 из полученной биомассы проходит в несколько стадий. Клетки биомассы лизируют в присутствии PMSF и пиродоксаль-фосфата на поточном дезинтеграторе. Полученный в результате лизиса клеточный дебрис, мембранную фракцию и нерастворимые белки штамма-продуцента отделяют осаждением с помощью ультрацентрифугирования (100000 g, 1 час). К осветленному лизату добавляют имидазола до 10 мМ и наносят batch-методом на NiNTA (Cytiva, США) смолу. Избавления от нецелевых белков проводят промывкой колонки буфером с 20 мМ имидазолом. Перед элюцией целевого белка проводят промывку сорбента с нанесенным белком с помощью Triton-X114 с целью очистки целевого белка от липополисахаридов штамма-продуцента. Элюцию целевого белка проводят в том же буфере с добавлением 400 мМ имидазола.
На следующем шаге концентрацию белка измеряют с помощью реактива Брэдфорда и добавляют TEV - протеазу из расчета 1 мг протеазы на 100 мг белка. Расщепление белка идет всю ночь на +4°С. На следующий день ставят диализ в мешках на 30 кДа против буфера с 10 мМ имидазола в течении 10 часов. После этого белок повторно наносится на NiNTA сорбент и элюируется. Полученная фракция белка без HisTag снова диализуется в течении ночи.
Метионазную активность MGL-456 определяют с помощью модифицированного метода Ристона [26] в последовательных ферментативной и колориметрической реакциях на реактив Несслера, дающего возможность определения концентрации аммиака, образующегося после распада метионина.
Полученный в результате раствор целевого белка, имеющий чистоту не менее 99% по MGL-456 и может храниться как минимум 5 дней в темном месте при температуре 4°С.
Использованные источники информации:
1. Anufrieva NV, Morozova ЕА, Kulikova VV, Bazhulina NP, Manukhov IV, Degtev DI, Gnuchikh EY, Rodionov AN, Zavilgelsky GB, Demidkina TV. Сульфоксиды - аналоги L-метионина и L-цистеина как пролекарства против грамположительных и грамотрицательных бактерий. Acta Naturae. 2015, 7(4): 128-35.
2. Hoffman R.M. Development of recombinant methioninase to target the general cancer-specific metabolic defect of methionine dependence: a 40-year odyssey. Expert opinion on biological therapy. - 2015. - T. 15. - №. 1. - C. 21-31.
3. Tanaka, H., Esaki, N. & Soda, K. A versatile bacterial enzyme: 1-methionine γ-lyase. Enzyme Microb. Technol. 1985, 7, 530-537.
4. McKie, A.E., Edlind, Т., Walker, J., Mottram, J.M. & Coombs, G.H. The Primitive protozoon trichomonas vaginalis contains two methionine g-lyase genes that encode members of the g-family of pyridoxal 5'-phosphate-dependent enzymes. J. Biol. Chem. 1998, 273, 5549-5556.
5. Tokoro, M., Asai, Т., Kobayashi, S., Takeuchi, Т., Nozaki, T. Identification and characterization of two isoenzymes of methionine gamma-lyase from Entamoeba histolytica: a key enzyme of sulfur-amino acid degradation in an anaerobic parasitic protist that lacks forward and reverse trans-sulfuration pathways. J. Biol. Chem. 2003, 278, 42717-42727.
6. Esaki, N., Nakayama, Т., Sawada, S., Tanaka, H., and Soda, K. Proton nmr studies of substrate hydrogen exchange reactions catalyzed by L-methionine.gamma.-lyase. Biochemistry. 1985, 24, 3857-3862.
7. Inoe, H., Inagaki, K., Adachi, N., Tamura, Т., Esaki, N., Soda, K. & Tanaka, H. Role of tyrosine 114 of L-methionine gamma-lyase from Pseudomonas putida. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000, 64, 2336-2343.
8. Манухов И.В., Мамаева Д.В., Морозова Е.А., Расторгуев С.М., Фалеев Н.Г., Демидкина Т.В., Завильгельский Г.Б. Биохимия. 2006 апрель; 71(4); 842-851. Манухов И.В., Мамаева Д.В., Морозова Е.А., Расторгуев С.М., Фалеев Н.Г., Демидкина Т.В., Завильгельский Г. Б. L-метионин-гамма-лиаза Citrobacter freundii: клонирование гена и кинетические параметры фермента. Биохимия. 2006, 71(4):842-851.
9. United States Patent 5,861,154. Inventors: Soda, et al. January 19, 1999. Recombinant L-methionine gamma.-lyase.
10. United States Patent 7,118,903. Inventors: Inagaki, et al. October 10, 2006. L-methionine gamma-lyase with modified function.
11. Manukhov IV, Mamaeva DV, Rastorguev SM, Faleev NG, Morozova EA, Demidkina TV, Zavilgelsky GB. A gene encoding L-methionine gamma-lyase is present in Enterobacteriaceae family genomes: identification and characterization of Citrobacter freundii L-methionine gamma-lyase. J Bacteriol. 2005, 187(11):3889-93.
12. Tan Y., Xu M., Tan X.-Z., Tan X., Wang X., Saikawa Y., Nagahama Т., Sun X., Lenz M., Hoffman R.M. Overexpression and large-scale production of recombinantl-methionine-a-deamino-y-mercaptomethane-lyase for novel anticancer therapy. 1997. Protein. Exp.Purif 9, 233-245.
13. Yoshioka Т., Wada Т., Uchida N., Maki H., Yoshida H., Ide N., Kasai H., Hojo K., Shono K., Maekawa R., Yagi S., Hoffman R.M. Anticancer efficacy in vivo and in vitro, synergy with 5-fluorouracil, and safety of recombinant methioninase. 1998. Cancer Res. 58, 2583-2587.
14. Tan Y., Xu M., Hoffman R.M. Broad selective efficacy of rMETase and PEG-rMETase on cancer cells in vitro. Anticancer Res. 2010, 30, 793-798.
15. Pokrovsky VS, Yu Anisimova N, Zh Davydov D, Bazhenov SV, Bulushova NV, Zavilgelsky GB, Kotova VY, Manukhov IV. Methionine gamma lyase from Clostridium sporogenes increases the anticancer effect of doxorubicin in A549 cells and human cancer xenografts. Invest New Drugs. 2019 Jun 15. doi: 10.1007/s10637-018-0619-4.
16. Pokrovsky V.S., Anisimova N.Yu., Davydov D.Zh., Bazhenov S.V., Bulushova N.V., Zavilgelsky G.B., Kotova V.Y., I.V. Manukhov. Methionine dependence of cancer and aging: methods and protocols. R.M. Hoffman, Editor. Chapter 18. Methionine gamma lyase from Clostridium sporogenes increases the anticancer effect of doxorubicin in A549 cancer cells in vitro and human cancer xenografts. Springer Nature. Springer Science+Business Media, LLC, Humana Press. ISBN 978-1-4939-8795-5. 2019.
17. WO 2004112717A3 2004. Conjugate for the specific targeting of anticancer agents to cancer cells and production thereof. Inventors: Roger G Harrison, Thomas J Pento.
18. Yarden, Y., Pines, G. The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology. Nat Rev Cancer 2012, 12, 553-563. https://doi.org/10.1038/nrc3309.
19. Ciardiello F., Tortora G. EGFR antagonists in cancer treatment. New England Journal of Medicine. 2008. 358(11) 1160-1174.
20. Eliseev, I.E.; Ukrainskaya, V.M.; Yudenko, A.N.; Mikushina, A.D.; Shmakov, S.V.; Afremova, A.I.; Ekimova, V.M.; Vronskaia, A.A.; Knyazev, N.A.; Shamova, O.V. Targeting ErbB3 Receptor in Cancer with Inhibitory Antibodies from Llama. Biomedicines 2021, 9, 1106. https://doi.org/10.3390/biomedicines9091106.
21. 'Однодоменное антитело, специфически связывающее рецептор ErbB3 человека, без канонической дисульфидной связи' Патент РФ №272185 от 25.05.2020 Юденко А.Н., Елисеев И.Е., Украинская В.М.
22. Japan patent JPH09182592A Inventors: Kenji Soda, Hidehiko Tanaka, Hiroyuki Inoue, Manabu Sugimoto, Kenji Inagaki, Nobuyoshi Ezaki. 1996. Recombinant 1-methionine-gammay-lyase'
23. Bondarev N. et al. MGL S3 Chimeric Enzyme Drives Apoptotic Death of EGFR-Dependent Cancer Cells through ERK Downregulation. International Journal of Molecular Sciences. 2022. - T. 23. - №. 21. - C. 12807.
24. Патент РФ №2733440 от 04.06.2020 «Способ получения фермента метионин-гамма-лиазы, противоопухолевое лекарственное средство ГЛФ МГЛ на основе этого фермента и применение этого средства для торможения роста опухоли (варианты)».
Авторы: Манухов И.В., Баженов С.В., Гнучих Е.Ю., Покровский B.C., Давыдов Д.Ж., Котова В.Ю., Булушова Н.В., Завильгельский Г.Б.
25. Studier F.W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 2005, 41, 207-234.
26. Wriston, J.C. Asparaginase. Methods in Enzymology. 1970, 17A, 732-742.
--->
Перечень последовательностей
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="МГЛ-VHH456.xml"
softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0"
productionDate="2022-12-09">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>
<FilingDate></FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>-</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Российский биотехнологический
университет (РОСБИОТЕХ)</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>BIOTECH University</ApplicantNameLatin>
<InventorName languageCode="ru">Бондарев Николай
Антонович</InventorName>
<InventorNameLatin>Bondarev Nikolai Antonovich</InventorNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Химерный фермент на основе L-
метионин-гамма-лиазы слитой с VHH антителом 456, фрагмент ДНК,
кодирующий указанный фермент</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>532</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..532</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MENIEKMGFATKAIHGGHIGDKQFGSLATPIYQTSTFIFDSAEQGGRRF
AGEESGYIYSRLGNPTSTEVENKLALLEGGEAAVVAASGMGAIAASLWSALKSGDHVVASDTLYGCTFAL
LNHGLTRYGVEVTFVDVSNLDEVKNALKPNTKVVYLETPANPTLKVTDIRKISNMVHESNKECFVFVDNT
FCTPYIQRPLELGADVVVHSATKYLNGHGDVIAGFAVGKEEFINQVKLFGIKDMTGSVTGPFESFLIIRG
MKTLQLRMEKHCSNAMEVAKFLESHPAVEKVYYPGLESFEYYQLAREQMKLPGAMISFELKGGVEEGKIV
MNNVKLATLAVSLGDSETLIQHPASMTHSPYTAEERKAAGISDGLVRLSVGLEDAEDIIDDLKQALDLIV
KQVQLVQSGGGLVQSGGSLKLSCVASGGPFSTYLMGWFRQAPGKEREFVTAISRSGLNTYYADSVKGRFT
ISRDNAKNTVYLQMHSLKPEDTAVYHCAARRGGTNSGSYYFDRPAVSDEYDLWGQGTLVTVSS</INSDS
eq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1599</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1599</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atggagaatattgaaaaaatggggtttgccacaaaggctatacatggag
gacatataggagataaacagtttggttcattagcaacaccaatatatcaaacatctacatttatatttga
ttctgcagagcaggggggaagaagatttgcaggagaagaaagtggatatatatattcaaggttaggtaat
cctacatctacagaagtagagaataaattggctttgttagaaggtggagaagcagctgttgtagcagcat
caggtatgggtgctatagcagcatctttatggtcagctttaaagtcaggagatcatgtagttgcatcaga
tactttatatgggtgcacatttgcactattaaatcatggattaacaagatatggagtagaggttacattt
gtagatgtatctaatttagatgaggtaaagaatgcattaaaaccaaatactaaagtagtttatttggaaa
ctccagctaatccaacactaaaggttactgatattagaaagatatcaaatatggttcatgagagcaataa
agagtgttttgtttttgttgataatactttttgtacgccatacatacaaagaccattagaattaggtgct
gatgtggttgtacattctgctactaaatatttaaatggtcatggtgatgttatagctggatttgcagtag
gaaaagaagaatttataaatcaagttaaattatttggcataaaagatatgacaggatcagttacaggacc
tttcgagtcattcttaataataagaggaatgaaaacattacaattaagaatggaaaaacattgcagtaat
gctatggaagtagcaaagtttttagaatcacatccagcagttgaaaaagtttattatccaggattggaaa
gctttgaatactatcagcttgctagagagcagatgaaattacctggtgctatgatttcctttgagttaaa
gggtggagtagaagaaggaaaaatagttatgaataatgttaaattagcaactcttgcagtaagtcttgga
gattcagaaacactaattcagcatccagcatcaatgacacattctccttatacagcagaagaaagaaaag
cagctggtataagtgatggattagtaagattatctgtaggtcttgaagatgcagaagatataatagatga
tttaaaacaagctttagatttaatagttaagcaggtgcagctggtgcagtctgggggaggattggtgcag
tctgggggctctctgaaactctcctgtgtagcctctggaggccccttcagtacgtatttgatgggctggt
tccgccaggctccagggaaggagcgtgagtttgtcacagctattagcaggagtggccttaacacatacta
tgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacacggtgtatctgcaaatg
cacagcctgaaacctgaggacacggccgtttatcactgtgcagcccgtcgaggtggcactaatagtggta
gttactacttcgaccgccccgcggtctcagatgagtatgacttgtggggccaggggaccctggtcaccgt
ctcctcataa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (2)
1. Химерный рекомбинантный белок MGL-M456 для терапии онкологических заболеваний, состоящий из L-метионин-гамма-лиазы, слитой с VHH антителом BCD090-М456, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID №1, соответствующей аминокислотной последовательности МГЛ из Clostridium sporogenes, к С-концу которой добавлена последовательность VHH антитела BCD090-M456.
2. Генетическая конструкция, кодирующая химерный белок по п. 1, характеризующаяся тем, что имеет нуклеотидную последовательность, указанную в списке последовательностей под номером SEQ ID NO: 2, в которой последовательность гена megL С. sporogenes трансляционным слиянием соединена с последовательностью, кодирующей VHH антитело BCD090-M456, или последовательность, отличающуюся от последовательности SEQ ID NO: 2, вследствие вырожденности генетического кода.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2813802C1 true RU2813802C1 (ru) | 2024-02-19 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004112717A3 (en) * | 2003-06-17 | 2008-10-30 | Roger G Harrison | Conjugate for the specific targeting of anticancer agents to cancer cells and production thereof |
| RU2721854C1 (ru) * | 2018-12-27 | 2020-05-25 | федеральное государственное бюджетное учреждение высшего образования и науки "Санкт-Петербургский национальный исследовательский Академический университет имени Ж.И. Алферова Российской академии наук" | Однодоменное антитело, специфически связывающее рецептор ErbB3 человека, без канонической дисульфидной связи |
| RU2733440C2 (ru) * | 2018-06-04 | 2020-10-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Способ получения фермента метионин-гамма-лиазы, противоопухолевое лекарственное средство ГЛФ МГЛ на основе этого фермента и применение этого средства для торможения роста опухоли (варианты) |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004112717A3 (en) * | 2003-06-17 | 2008-10-30 | Roger G Harrison | Conjugate for the specific targeting of anticancer agents to cancer cells and production thereof |
| RU2733440C2 (ru) * | 2018-06-04 | 2020-10-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Способ получения фермента метионин-гамма-лиазы, противоопухолевое лекарственное средство ГЛФ МГЛ на основе этого фермента и применение этого средства для торможения роста опухоли (варианты) |
| RU2721854C1 (ru) * | 2018-12-27 | 2020-05-25 | федеральное государственное бюджетное учреждение высшего образования и науки "Санкт-Петербургский национальный исследовательский Академический университет имени Ж.И. Алферова Российской академии наук" | Однодоменное антитело, специфически связывающее рецептор ErbB3 человека, без канонической дисульфидной связи |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BONDAREV N. et al. MGL S3 Chimeric Enzyme Drives Apoptotic Death of EGFR-Dependent Cancer Cells through ERK Downregulation. Int J Mol Sci. 2022 Oct 24;23(21):12807. doi: 10.3390/ijms232112807. ZANG X.P. et al. Targeting a methioninase-containing fusion protein to breast cancer urokinase receptors inhibits growth and migration. Anticancer Res. 2006 May-Jun;26(3A):1745-51. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210009981A1 (en) | Nitrilase mutant, construction method therefor, and application thereof | |
| CN103975069B (zh) | 通过使用AlkB烷烃1-单加氧酶氧化烷烃的方法 | |
| JP2022502039A (ja) | タンパク質精製方法 | |
| CN107614689A (zh) | 用于将非天然氨基酸并入蛋白质中的平台 | |
| KR102638596B1 (ko) | 활성화된 포르밀글리신-생성 효소 및 그것의 생산 및 사용 방법 | |
| JP6638086B2 (ja) | フルクトースからアロースを生産する菌株およびこれを用いたアロース生産方法 | |
| US8080387B2 (en) | Method for preparing soluble and active recombinant proteins usins PDI as a fusion partner | |
| CN114107353A (zh) | 一种高效表达多肽毒素的质粒及其制备方法与应用 | |
| RU2813802C1 (ru) | Химерный фермент на основе L-метионин-гамма-лиазы, слитой с VHH антителом М456, и фрагмент ДНК, кодирующий указанный фермент | |
| MXPA00004007A (es) | Procedimiento para la produccion de proteinas plegadas y secretadas en forma natural. | |
| CN108300725B (zh) | 可溶性单链抗体超抗原融合基因及蛋白和其制备与应用 | |
| CN113388559A (zh) | 一种用于谷胱甘肽合成的重组大肠杆菌及其应用 | |
| Sculaccio et al. | Selenocysteine incorporation in Kinetoplastid: Selenophosphate synthetase (SELD) from Leishmania major and Trypanosoma brucei | |
| WO2022142251A1 (zh) | 一种以双醋瑞因为供体的酶促合成乙酰辅酶a的方法 | |
| RU2816486C2 (ru) | Химерный фермент МГЛ-S3 - метионин-гамма-лиаза, слитая с S3 доменом белка VGF из Vaccinia virus, способ получения МГЛ-S3 и противоопухолевый препарат на основе этого фермента | |
| CN103266126A (zh) | 一种酶法生产磷酸肌酸的方法 | |
| CN104962573A (zh) | Pgⅱ与mbp融合蛋白的可溶性分泌表达及其应用 | |
| WO2023004772A1 (zh) | 果糖胺脱糖酶载体、表达果糖胺脱糖酶的转基因细胞系和基因工程菌及果糖胺脱糖酶的应用 | |
| RU2650871C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, обеспечивающая синтез барназы в клетках escherichia coli, штамм escherichia coli - продуцент барназы и способ получения барназы. | |
| CN113789293B (zh) | 一种高产天然水蛭素的大肠杆菌工程菌株及其应用 | |
| RU2426780C2 (ru) | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК p6E-tTF, КОДИРУЮЩАЯ ВНЕКЛЕТОЧНЫЙ И ТРАНСМЕМБРАННЫЙ ДОМЕНЫ ТКАНЕВОГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА И ШТАММ E.coli BL21[DE3]/p6E-tTF-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ТКАНЕВОГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА | |
| Eid | Enzymes chimériques pour la catalyse énantiosélective de réactions en cascade | |
| JP2018000174A (ja) | ヒトＦｃＲｎをコードするポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドを利用したヒトＦｃＲｎの製造方法 | |
| KR20210148288A (ko) | 생체내 리폴딩된 항체 단편의 클로닝 및 발현 | |
| CN116217699A (zh) | 一种高效表达羊生长激素的方法 |