RU2762938C2 - Вакцина против респираторного заболевания крупного рогатого скота - Google Patents

Вакцина против респираторного заболевания крупного рогатого скота Download PDF

Info

Publication number
RU2762938C2
RU2762938C2 RU2019132984A RU2019132984A RU2762938C2 RU 2762938 C2 RU2762938 C2 RU 2762938C2 RU 2019132984 A RU2019132984 A RU 2019132984A RU 2019132984 A RU2019132984 A RU 2019132984A RU 2762938 C2 RU2762938 C2 RU 2762938C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
virus
antigen
influenza
bovine
cattle
Prior art date
Application number
RU2019132984A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2019132984A (ru
RU2019132984A3 (ru
Inventor
Томас ХАЛБЕР
Лукас ХАНТИМЕР
Original Assignee
Эланко Юэс Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Эланко Юэс Инк. filed Critical Эланко Юэс Инк.
Publication of RU2019132984A publication Critical patent/RU2019132984A/ru
Publication of RU2019132984A3 publication Critical patent/RU2019132984A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2762938C2 publication Critical patent/RU2762938C2/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/295—Polyvalent viral antigens; Mixtures of viral and bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Данное изобретение относится к вакцинам для лечения респираторного заболевания крупного рогатого скота. Такие вакцины содержат комбинацию антигенов вируса гриппа D крупного рогатого скота и Mannheimia haemolytica. Инфицирование верхних дыхательных путей IDV приводит к увеличению вероятности патологии М, haemolytica в легких. Указанные вакцины могут содержать дополнительные антигены из других респираторных патогенов крупного рогатого скота. Изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica, обеспечивающей повышение активности. 8 н. и 8 з.п. ф-лы, 10 табл., 2 пр.

Description

Данное изобретение относится к вакцинам для лечения респираторного заболевания крупного рогатого скота. Такие вакцины содержат комбинацию антигенов вируса гриппа D крупного рогатого скота и антигенов Mannheimia haemolytica.
Респираторное заболевание крупного рогатого скота (РЗКРС) является наиболее значимым заболеванием, негативно сказывающимся на скотопромышленности в Соединенных Штатах, приводя к ежегодным потерям, которые по оценкам превышают один миллиард долларов. Широко используются многочисленные коммерческие вакцины с переменным составом на основе комбинаций инактивированных и модифицированных живых бактерий и вирусов; тем не менее, заболеваемость РЗКРС увеличивается в течение последних нескольких десятилетий. Считается, что стресс у животных, часто вызываемый перемещением и содержанием животных, предрасполагает крупный рогатый скот к РЗКРС. Ряд вирусов играют установленные роли в патогенезе РЗКРС, включая вирус вирусной диареи крупного рогатого скота, герпесвирус 1 крупного рогатого скота, респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота, вирус парагриппа 3 крупного рогатого скота, вирус ринита крупного рогатого скота и, возможно, вирус гриппа D (IDV) (Ferguson et al, J. Virol. 90:5636-42, 2016).
Впервые выделенный из организма свиней с острым респираторным заболеванием, предполагаемый вирус гриппа D был впоследствии идентифицирован у крупного рогатого скота во многих странах. Телята, инокулированные IDV, демонстрировали только легкое респираторное заболевание по сравнению с контролем, а репликация вируса была обнаружена в дыхательных путях, что связано со значительным увеличением числа нейтрофилов в трахее. Наибольшие вирусные титры присутствовали в носовых раковинах со снижением в тканях, находящихся ниже в дыхательных путях. IDV передавался контактирующим животным и всем инокулированным и подвергшимся воздействию сероконвертированным животным. В то время как серологические исследования свиной и человеческой сыворотки выявили низкий уровень распространенности антител (9,5 и 1,3% соответственно), в нескольких исследованиях было обнаружено, что антитела к IDV почти повсеместно распространены у крупного рогатого скота, причем до 94% новорожденных телят мясного крупного рогатого скота являются серопозитивными в отношении IDV, вероятно, благодаря наличию материнских антител. Поскольку известно, что материнские антитела создают помехи для вакцинации и развития активного иммунитета, присутствие антител во время вакцинации может снижать иммунный ответ на вакцину.
Хотя не установлено окончательно, IDV может быть частью комплекса респираторного заболевания крупного рогатого скота (КРЗКРС). Были предложены коммерческие вакцины против IDV, например, в US 9278999 и WO2014/015091, но не были введены в обращение, вероятно, частично вследствие недавнего открытия IDV и его неизвестной (и, возможно, незначительной) роли в патогенезе РЗКРС. Включение IDV в коммерческие вакцины против РЗКРС может повысить их эффективность, если инфекция IDV усугубляет заболевание, вызываемое другими респираторными патогенами крупного рогатого скота, а не IDV является оппортунистической инфекцией при РЗКРС, вызванном другими патогенами.
В данном изобретении предложена иммуногенная композиция, содержащая антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica. Комбинированная вакцина обеспечивает повышенную эффективность против РЗКРС по сравнению с моновалентными вакцинами в отдельности. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой инактивированную бактерию или экстракты из инактивированных бактерий, такие как экстракт белка наружной мембраны. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой рекомбинантно полученный антиген, такой как рекомбинантный лейкотоксин (rLKT).
В данном изобретении предложена иммуногенная композиция, содержащая антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica, при этом антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота представляет собой инактивированный вирус. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус. Антиген модифицированного живого вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус, модифицированный путем деоптимизации кодонов. Модифицированный живой вирус, модифицированный путем деоптимизации кодонов, может иметь один или более деоптимизированных геномных сегментов с последовательностью кДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19.
В данном изобретении предложена иммуногенная композиция, содержащая антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica, которая дополнительно содержит по меньшей мере один антиген из дополнительного патогена крупного рогатого скота. Дополнительным патогеном крупного рогатого скота может быть вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (BRSV), герпесвирус крупного рогатого скота (BHV), вирус парагриппа 3 (PI3), Pasteurella multocida, виды Leptospira и Histophilus somni, а также любая их комбинация.
В данном изобретении предложена вакцина против респираторного заболевания крупного рогатого скота, содержащая вирус гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica и фармацевтически приемлемый наполнитель, стабилизатор, солюбилизатор или разбавитель и, необязательно, адъювант. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой инактивированную бактерию или экстракты из инактивированных бактерий, такие как экстракт белка наружной мембраны. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой рекомбинантно полученный антиген, такой как рекомбинантный лейкотоксин. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой инактивированный вирус. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус. Антиген модифицированного живого вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус, модифицированный путем деоптимизации кодонов.
В данном изобретении предложена вакцина против респираторного заболевания крупного рогатого скота, содержащая вирус гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica и фармацевтически приемлемый наполнитель, стабилизатор, солюбилизатор или разбавитель и, необязательно, адъювант, которая дополнительно содержит по меньшей мере один антиген из дополнительного патогена крупного рогатого скота. Дополнительным патогеном крупного рогатого скота может быть вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (BRSV), герпесвирус крупного рогатого скота (BHV), вирус парагриппа 3 (PI3), Pasteurella multocida, виды Leptospira и Histophilus somni, а также любая их комбинация.
В данном изобретении предложен способ лечения респираторного заболевания крупного рогатого скота, включающий введение крупному рогатому скоту иммуногенной композиции, содержащей антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой инактивированную бактерию или экстракты из инактивированных бактерий, такие как экстракт белка наружной мембраны. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой рекомбинантно полученный антиген, такой как рекомбинантный лейкотоксин. Введение можно осуществлять перорально, интраназально, интратрахеально или путем инъекции, например, подкожно или внутримышечно.
В данном изобретении предложен способ лечения респираторного заболевания крупного рогатого скота, включающий введение крупному рогатому скоту иммуногенной композиции, содержащей антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica, при этом антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота представляет собой инактивированный вирус. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус. Антиген модифицированного живого вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус, модифицированный путем деоптимизации кодонов. Введение можно осуществлять перорально, интраназально, интратрахеально или путем инъекции, например, подкожно или внутримышечно.
В данном изобретении предложен способ лечения респираторного заболевания крупного рогатого скота, включающий введение крупному рогатому скоту иммуногенной композиции, содержащей антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica, которая дополнительно содержит по меньшей мере один антиген из дополнительного патогена крупного рогатого скота. Дополнительным патогеном крупного рогатого скота может быть вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (BRSV), герпесвирус крупного рогатого скота (BHV), вирус парагриппа 3 (PI3), Pasteurella multocida, виды Leptospira и Histophilus somni, а также любая их комбинация. Введение можно осуществлять перорально, интраназально, интратрахеально или путем инъекции, например, подкожно или внутримышечно.
В данном изобретении предложен способ лечения респираторного заболевания крупного рогатого скота, включающий введение крупному рогатому скоту вакцины против респираторного заболевания крупного рогатого скота, содержащей вирус гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica и фармацевтически приемлемый наполнитель, стабилизатор, солюбилизатор или разбавитель и, необязательно, адъювант. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой инактивированную бактерию или экстракты из инактивированных бактерий, такие как экстракт белка наружной мембраны. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой рекомбинантно полученный антиген, такой как рекомбинантный лейкотоксин. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой инактивированный вирус. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус. Антиген модифицированного живого вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус, модифицированный путем деоптимизации кодонов. Введение можно осуществлять перорально, интраназально, интратрахеально или путем инъекции, например, подкожно или внутримышечно.
В данном изобретении предложен способ лечения респираторного заболевания крупного рогатого скота, включающий введение крупному рогатому скоту вакцины против респираторного заболевания крупного рогатого скота, содержащей вирус гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica и фармацевтически приемлемый наполнитель, стабилизатор, солюбилизатор или разбавитель и, необязательно, адъювант, которая дополнительно содержит по меньшей мере один антиген из дополнительного патогена крупного рогатого скота. Дополнительным патогеном крупного рогатого скота может быть вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (BRSV), герпесвирус крупного рогатого скота (BHV), вирус парагриппа 3 (PI3), Pasteurella multocida, виды Leptospira и Histophilus somni, а также любая их комбинация. Введение можно осуществлять перорально, интраназально, интратрахеально или путем инъекции, например, подкожно или внутримышечно.
В данном изобретении предложено применение комбинации антигена вируса гриппа D крупного рогатого скота и антигена Mannheimia haemolytica при лечении респираторного заболевания крупного рогатого скота. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой инактивированную бактерию или экстракты из инактивированных бактерий, такие как экстракт белка наружной мембраны. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой рекомбинантно полученный антиген, такой как рекомбинантный лейкотоксин. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой инактивированный вирус. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус. Антиген модифицированного живого вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус, модифицированный путем деоптимизации кодонов. Лечение можно осуществлять перорально, интраназально, интратрахеально или путем инъекции, например подкожно или внутримышечно. Лечение можно осуществлять терапевтически или профилактически. Указанная комбинация может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель, стабилизатор, солюбилизатор или разбавитель и, необязательно, адъювант. Указанная комбинация может дополнительно содержать по меньшей мере один антиген из дополнительного патогена крупного рогатого скота. Дополнительным патогеном крупного рогатого скота может быть вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (BRSV), герпесвирус крупного рогатого скота (BHV), вирус парагриппа 3 (PI3), Pasteurella multocida, виды Leptospira и Histophilus somni, а также любая их комбинация.
В данном изобретении предложено применение антигена вируса гриппа D крупного рогатого скота и антигена Mannheimia haemolytica при производстве лекарственного средства от респираторного заболевания крупного рогатого скота. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой инактивированную бактерию или экстракты из инактивированных бактерий, такие как экстракт белка наружной мембраны. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой рекомбинантно полученный антиген, такой как рекомбинантный лейкотоксин. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой инактивированный вирус. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус. Антиген модифицированного живого вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус, модифицированный путем деоптимизации кодонов. Лекарственное средство можно вводить перорально, интраназально, интратрахеально или путем инъекции, например подкожно или внутримышечно. Введение можно осуществлять терапевтически или профилактически. Лекарственное средство может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель, стабилизатор, солюбилизатор или разбавитель и, необязательно, адъювант.Лекарственное средство может дополнительно содержать по меньшей мере один антиген из дополнительного патогена крупного рогатого скота. Дополнительным патогеном крупного рогатого скота может быть вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (BRSV), герпесвирус крупного рогатого скота (BHV), вирус парагриппа 3 (PI3), Pasteurella multocida, виды Leptospira и Histophilus somni, а также любая их комбинация.
В данном изобретении предложена композиция, содержащая антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica, для применения при лечении, снижении степени или предотвращении респираторного заболевания крупного рогатого скота у крупного рогатого скота. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой инактивированную бактерию или экстракты из инактивированных бактерий, такие как экстракт белка наружной мембраны. Антиген Mannheimia haemolytica может представлять собой рекомбинантно полученный антиген, такой как рекомбинантный лейкотоксин. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой инактивированный вирус. Антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус. Антиген модифицированного живого вируса гриппа D крупного рогатого скота может представлять собой модифицированный живой вирус, модифицированный путем деоптимизации кодонов. Указанную композицию можно вводить перорально, интраназально, интратрахеально или путем инъекции, например подкожно или внутримышечно. Указанная композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель, стабилизатор, солюбилизатор или разбавитель и, необязательно, адъювант. Указанная композиция может дополнительно содержать по меньшей мере один антиген из дополнительного патогена крупного рогатого скота. Дополнительным патогеном крупного рогатого скота может быть вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (BRSV), герпесвирус крупного рогатого скота (BHV), вирус парагриппа 3 (PI3), Pasteurella multocida, виды Leptospira и Histophilus somni, а также любая их комбинация.
Термин «крупный рогатый скот», употребляемый для обозначения животного, в отношении которого применяют изобретение, означает любого представителя рода Bos, включая домашний крупный рогатый скот (Bos Taurus).
В контексте данного документа термин «вирус гриппа D крупного рогатого скота» (IDV) означает РНК-вирус семейства orthomyxoviridae. IDV считается родом, отдельным от вирусов гриппа А, В и С, хотя IDV оказался наиболее близок к вирусу гриппа С.Геном IDV содержит семь линейных отрицательно-полярных одноцепочечных молекул РНК. Два репрезентативных изолята IDV описаны в Таблице 1 без ограничения заявленного изобретения. Так как IDV является РНК-вирусом, ожидается, что он будет иметь высокую частоту мутаций, приводящую к процессу, называемому «антигенным дрейфом», состоящему в небольших изменениях в геноме, результатом которых являются вирусы с отличающимися антигенными свойствами.
В контексте данного документа термин «вирус» может означать вид вируса или, взаимозаменяемо, отдельную инфекционную единицу, которая может содержать нуклеиновые кислоты, белки и липидную мембрану. Отдельную инфекционную единицу также называют «вирусной частицей» или «вирионом», причем последние термины являются синонимами.
В контексте данного документа термин «штамм» или «изолят» вируса означает набор генетически гомологичных вирионов. Два вируса считаются «гомологичными», если эти вирусы картируются на одну и ту же филогенетическую кладу. Два вируса считаются «гетерологичными», если эти вирусы картируются на разные филогенетические клады. Степень полиморфизма среди изолятов IDV еще не была оценена.
Figure 00000001
«Процент идентичности» можно определить путем расчета числа идентичных нуклеотидов в одинаковых позициях в нуклеиновой кислоте. Расчет процента идентичности включает определение оптимального выравнивания между двумя или более последовательностями. Для определения процента идентичности можно использовать компьютерные программы и алгоритмы, такие как Basic Local Alignment Search Tool (средство поиска основного локального выравнивания или BLAST). BLAST является одним из многочисленных ресурсов, предоставляемых Национальным центром биотехнологической информации США. Поскольку генетический код является вырожденным, и более чем один кодон может кодировать заданную аминокислоту, кодирующие области нуклеиновых кислот считаются идентичными, если нуклеиновые кислоты кодируют идентичные полипептиды.
В контексте данного документа термин «модифицированный живой вирус» применим к любой отдельной вирусной частице (т.е. «вириону») или множеству вирусных частиц, генетическая последовательность которых была изменена относительно генетической последовательности встречающегося в природе вируса дикого типа. Изменения включают, без ограничения, генетические мутации, такие как вставки и делеции нуклеотидов, а также транзиции и трансверсии, которые приводят к замене одного нуклеотида другим нуклеотидом. Изменения можно осуществлять путем адаптации вируса дикого типа к репликации в тканевой культуральной системе и продолжения пассирования вируса в тканевой культуральной системе, в результате чего вирус накапливает генетические мутации. Изменения также можно осуществлять, используя молекулярные технологии. Одна такая молекулярная технология включает искусственное изменение частоты использования кодонов вируса или «деоптимизацию кодонов». Подобные технологии были описаны, например, в US 8846051; US 9476032; и US 2016/024477 (US Ser. №14/777204), которые в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки.
Аттенуированные вирусы составляют подгруппу модифицированных живых вирусов. В контексте данного документа термин «аттенуированный» или «аттенуация» означает, что способность вируса вызывать или усугублять клиническое заболевание была снижена или устранена. Аттенуированный вирус все еще может инфицировать клетку-хозяина in vitro или in vivo, и эта инфекция может приводить к субклиническим эффектам в организме-хозяине, но эта инфекция не приводит к появлению одного или более клинических симптомов заболевания.
Напротив, в контексте данного документа «инактивированные» вирусы или бактерии означают патогены, которые более не могут реплицироваться в организме-хозяине. Инактивированные патогены считаются убитыми или мертвыми. Инактивацию можно осуществлять различными способами, включая, но не ограничиваясь этим, химические изменения, химические или физические изменения в структуре патогена или химические или физические изменения в геномных нуклеиновых кислотах патогена.
«Антиген» представляет собой любую молекулу, которую иммунная система организма способна специфически обнаруживать. Как правило, антиген представляет собой белок, кодируемый геномом патогена или полученный из продуктов генома патогена. Антиген может представлять собой цельный вирион или бактерию или их часть, или выделенный полипептид. Антигены могут быть получены естественным путем или рекомбинантно. Присутствие антигенов может специфически обнаруживаться поверхностными антигенными рецепторами как Т-лимфоцитов организма-хозяина, так и В-лимфоцитов организма-хозяина, и молекулами антител, синтезируемыми клетками-хозяевами. Неограничивающим примером антигена IDV может быть гликопротеин гемагглютинин-эстераза. Неограничивающими примерами антигенов Mannheimia могут быть экстракт белков наружной мембраны (т.е. смесь частично очищенных антигенов) и рекомбинантно экспрессируемый полипептид лейкотоксина.
«Иммуногенность» относится к способности антигена вызывать иммунный ответ, причем указанный иммунный ответ включает как антиген-специфические ответы, так и не-антиген-специфические ответы или естественные иммунные ответы. «Защитный иммунитет» представляет собой иммунный ответ, который может ослаблять или предотвращать клинические симптомы, когда иммунизированное животное стимулируют или подвергают воздействию патогенного штамма. Как понятно специалисту в данной области техники, защитный иммунитет может снижаться со временем или с возрастом иммунизированного животного. В контексте данного документа защитный иммунитет должен быть эффективным в течение по меньшей мере четырех месяцев, но предпочтительно по меньшей мере шести месяцев, от последней даты иммунизации. Защитный иммунитет может быть вызван однократной дозой вакцины. Можно применять вторую или дополнительную дозу для повышения или продления защитного иммунного ответа. Например, повышение защитного иммунного ответа у племенной коровы может привести к повышению уровня материнских антител у телят.
В отличие от антигена «адъювант» представляет собой неспецифический стимулятор иммунного ответа. Адъювант может стимулировать естественный иммунный ответ путем связывания и активации паттерн-распознающего рецептора (ПРР). Такими стимуляторами ПРР могут быть, например, вирусные или бактериальные нуклеиновые кислоты, липиды из бактерий или паразитов или бактериальные белки или токсины, или любой искусственно сконструированный миметик таких молекул. Адъюванты также включают, без ограничения: неорганические соединения, которые агрегируют антигены для облегчения распознавания В-лимфоцитами или поглощения фагоцитами, такие как квасцы, гидроксид алюминия, фосфат алюминия, гидроксид фосфата кальция или сульфат аммония; масла; и детергенты. Адъюванты также могут быть хозяйскими медиаторами иммунной сигнализации, такими как, без ограничения, цитокины, лимфокины, хемокины, интерфероны, анафилатоксины, факторы роста, факторы дифференцировки и молекулы адгезии.
В контексте данного документа «иммуногенная композиция» представляет собой композицию, которая вызывает иммунный ответ при введении животному. Иммуногенная композиция содержит по меньшей мере один антиген и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель, стабилизатор, солюбилизатор или разбавитель. Описание фармацевтически приемлемых наполнителей, стабилизаторов, солюбилизаторов или разбавителей можно найти, например, в "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," Lloyd V. Allen, ed., Pharmaceutical Press, London, UK, 22nd edition, 2012. Антиген может быть целым вирусом, бактерией или другим патогеном, живым или инактивированным. Антиген также может быть выделенной, очищенной или частично очищенной антигенной молекулой из вируса, бактерии или другого патогена. Антиген может быть полипептидом, полисахаридом, нуклеиновой кислотой или липидом. Антиген является по меньшей мере частично выделенным из его естественного окружения, которое может содержать факторы, могущие разбавлять, неправильно направлять или препятствовать эффективному иммунному ответу на антиген.
В контексте данного документа термин «вакцина» представляет собой иммуногенную композицию, которая стимулирует иммунную систему животного к развитию защиты, устойчивости, предотвращению или лечению симптома заболевания при введении нуждающемуся в этом животному, причем указанный симптом вызван патогенным организмом, например вирусом или бактерией. Вакцина может содержать, без ограничения, вирусные антигены или интактные вирионы, живые или инактивированные, в композиции с фармацевтически приемлемыми адъювантами, наполнителями, стабилизаторами, солюбилизаторами или разбавителями и, необязательно, адъювантом. Вакцина может содержать, без ограничения, бактериальные антигены или интактные бактерии, живые или инактивированные, в композиции с фармацевтически приемлемыми адъювантами, наполнителями, стабилизаторами, солюбилизаторами или разбавителями и, необязательно, адъювантом. Вакцина может содержать несколько антигенов из нескольких патогенов.
В контексте данного документа термины «процесс лечения», «лечить» или «лечение» включают подавление, замедление, прекращение, уменьшение, улучшение или обращение прогрессирования или тяжести существующего симптома, расстройства, патологического состояния или заболевания. Лечение можно применять профилактически или терапевтически.
В контексте данного документа термин «введение» включает, но не ограничивается этим, кожное, подкожное, внутримышечное, мукозальное, субмукозальное, трансдермальное, интратрахеальное, пероральное или интраназальное введение. Введение можно проводить путем инъекции или местного применения.
Следующие экспериментальные примеры являются иллюстративными в отношении вакцин против респираторного заболевания крупного рогатого скота. Понятно, что другие варианты реализации и применения будут очевидны для специалистов в данной области техники и что изобретение не ограничено этими конкретными иллюстративными примерами или предпочтительными вариантами реализации.
ПРИМЕР 1
В этом исследовании оценивали, развивается ли респираторный патогенез у крупного рогатого скота возрастом 6-9 месяцев при введении вируса гриппа D (IDV) с высоким титром и можно ли уменьшить этот патогенез с помощью гомологичной инактивированной вакцины.
В этом исследовании использовали в общей сложности 83 голштинских или гибридных голштинских телят возрастом приблизительно 6 месяцев. Животным давали акклиматизироваться в течение минимум 5 суток в их новом окружении на испытательной станции. Помещение для содержания состояло из изоляционного помещения ABSL-2 с автоматической линией подачи корма и открытой системой резервуаров с водой в каждом помещении. Животные соответствовали следующим критериям включения: отрицательный результат BVDV-PI по данным ушного выщипа и ИФА с захватом антигена (АСЕ); хорошее состояние здоровья на основании физикального осмотра, проведенного на 0 сутки; и сероотрицательный результат в отношении IDV. Животных случайным образом распределяли по группам обработки (Таблица 2), используя план случайного распределения. От исследовательского персонала, проводящего клинические наблюдения, собирающего образцы и анализирующего образцы, была скрыта информация относительно типа обработки. После применения каждого вида обработки (например, вакцинации) животных помещали в группу обработки таким образом, чтобы каждая группа находилась в изолированном загоне без возможности физического контакта между каждой группой обработки, за исключением телят из четвертой группы обработки (Т04), которых содержали вместе со стимулированными животными (группы Т02 и Т03).
Figure 00000002
Экспериментальная вакцина содержала инактивированный бета-проприолактоном (BPL) IDV, штамм Р/бычий/КБЛ 4-22/2012. Вакцину стандартизировали до 640 гемагглютинирующих единиц (ГАЕ) на дозу. Антиген разделяли на партии и готовили/дополняли с 30% EMULSIGEN® D. Вакцина проходила модифицированный тест на стерильность, состоящий из нанесения конечного продукта на кровяной агар, инкубации при 37°С и исследования колоний, сформированных приблизительно через 48 часов. Колонии выявлены не были, а продукт считали стерильным. Телят вакцинировали (2,0 мл) путем подкожной (ПК) инъекции в правую сторону шеи (1-дюймовая игла 20 калибра) на 0 сутки и на 14 сутки. Животных осматривали приблизительно через 1 (один) час после вакцинации для оценки ответа на вакцинацию. Никаких аномальных явлений отмечено не было.
Стимуляцию проводили на 35 сутки (возраст ~7 месяцев). На 35 сутки (35 с) каждого теленка интраназально стимулировали (5,0 мл; 2,5 мл/ноздря) IDV, штамм D/бычий/KS/14-22/2012 при 106 TCID50.
Всех животных оценивали в отношении угнетенности, состояния организма и дыхательной недостаточности на 35 сутки посредством вскрытия и делали оценку. Животных оценивали и записывали оценки перед перемещением или кормлением. Ректальную температуру тела измеряли ежесуточно в течение периода стимуляции (сутки 35-45). Температуру измеряли приблизительно в одно и то же время каждые сутки. Один образец крови брали не менее чем за 7 суток до прибытия на испытательную станцию, а остальные образцы крови для определения ингибирования гемагглютинации IDV брали на 0, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 84, 98, 112 сутки. Один образец мазка из носа брали по меньшей мере за 7 суток до прибытия на испытательную станцию, а остальные мазки из носа брали у всех животных на 35 (до стимуляции), 37, 39, 41, 43 и 45 сутки. Мазки помещали в пробирку с транспортной средой. Пробирки метили с указанием даты сбора, идентификации животного (номер ушной бирки), типа образца (носового) и номера исследования. Пробирки незамедлительно охлаждали, помещая их в кулер, содержащий пакеты со льдом. Пробирки хранили при -70°С.
На 35, 37, 39, 41, 43 и 45 сутки соответствующих животных гуманно умерщвляли для оценки поражения легких, сбора жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) и соответствующей ткани. У каждого животного удаляли легкие. Жидкость БАЛ собирали в асептических условиях из вырезанных легких. Стерильный фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) пипетировали в легкие и пипетировали обратно, аккуратно массируя легкие. Извлеченную жидкость БАЛ помещали в пробирку, которую держали на льду. Каждый образец жидкости БАЛ разделяли на две аликвоты и метили с указанием ID животного и даты получения образца. Оба набора аликвот хранили в замороженном виде (≤ -20°С).
Каждую из семи легочных долей исследовали как визуально, так и путем пальпации в отношении наличия характерных грубых поражений, связанных с IDV. Количество поражений/уплотнений в каждой легочной доле оценивали и записывали в виде действительного значения от 0 до 100% от доли. Количество поражений (оценку) в каждой доле подставляли во взвешенную формулу, чтобы рассчитать пораженный процент легких. Вес, приписываемый каждой из семи долей (в соответствии с относительной массой долей легких), является следующим: левая апикальная доля = 10%; левая сердечная доля = 10%; левая диафрагмальная доля = 25%; правая апикальная доля = 10%; правая сердечная доля = 10%; правая диафрагмальная доля = 25%; и добавочная доля = 10%. В результате добавления взвешенных процентов получили композитную оценку легочных поражений.
Ткани легкого, носовой раковины и трахеи исследовали при вскрытии в отношении наличия поражений, а часть вырезали для иммуногистохимии. Трахеобронхиальный лимфатический узел также вырезали для иммуногистохимической оценки. Все образцы окрашивали гематоксилином и эозином для структурной оценки, а также окрашивали в отношении вируса IDV, используя стандартные методы иммуногистохимии.
Назальные мазки оценивали в отношении IDV с помощью РВ-ПЦР, используя набор специфических праймеров, разработанный ветеринарно-диагностической лабораторией Университета штата Канзас (KSU). Среднее значение со стандартным отклонением значения порогового цикла (СТ) исследуемых назальных мазков экстраполировали, используя стандартную кривую известной инфицирующей дозы вируса IDV для тканевой культуры (TCID50), для получения значения вирусного титра в назальных мазках. Значение СТ экстраполировали, используя стандартную кривую известной инфицирующей дозы вируса IDV для тканевой культуры (TCID50), для получения значения вирусного титра (Таблица 3).
Жидкость бронхоальвеолярного лаважа (Таблица 4) и трахеальные мазки (41, 43 и 45 сутки) (Таблица 5) также оценивали в отношении вируса IDV с помощью РВ-ПЦР, а значение СТ экстраполировали, используя стандартную кривую известной инфицирующей дозы вируса IDV для тканевой культуры (TCID50), для получения значения вирусного титра для каждой группы образцов.
Figure 00000003
Figure 00000004
Анализ оценок поражения верхних дыхательных путей и легких, как указано выше, проводился заслепленным исследователем. Композитные оценки поражений легких приведены в Таблице 6 в виде средняя композитная оценка/число животных на группу в каждый момент времени.
Figure 00000005
Figure 00000006
Наблюдали невысокие оценки поражения легких со слабо выраженной тенденцией к небольшими различиями между вакцинированными и стимулированными животными. Для дополнительного изучения общей патологии легких, вызванной IDV, можно использовать большую статистическую мощность, а также уточнение модели стимуляции. Общие патологические исследования верхних дыхательных путей, исключительно трахеи, продемонстрировали наличие слизистого экссудата с пиковыми результатами через 4 и 6 суток после стимуляции.
Фиксированные образцы ткани из носовой раковины и трахеи обрабатывали, окрашивали гематоксилином и эозином, а затем окрашивали антителом, специфическим в отношении вируса IDV. Количество положительных образцов из общего числа животных на группу для образцов ткани носовой раковины и для образцов ткани трахеи представлено в Таблицах 7 и 8, соответственно.
Figure 00000007
Figure 00000008
Серологические титры антител оценивали на 0, 14, 21, 28, 35 и 42 сутки исследования (СИ) для серологической конверсии в вакцину. Средний геометрический титр (СГТ) титра ингибирования гемагглютинации (ИГ) сыворотки из каждой группы приведен в Таблице 9. Серологическая оценка показывает повышение титра ИГ против IDV в вакцинированных группах по сравнению с невакцинированными. Для дополнительного возможного повышения титра антител можно провести обычную оптимизацию дозы и вакцины. Для сравнения, в случае людей считается, что титр ИГ 40 (5,3 log2) в целом защищает от инфицирования вирусом гриппа А, но не полностью снимает симптомы заболевания.
Figure 00000009
Клинические проявления угнетенного состояния и оценка состояния тела были в целом обыкновенными. Стимулированные животные демонстрировали дыхательную недостаточность с пиковыми клиническими признаками на 6 сутки после стимуляции. Различий в дыхательной недостаточности между вакцинированными и невакцинированными животными не наблюдали.
Первичная цель этого исследования состояла в том, чтобы оценить, способен ли вирус гриппа D (IDV) крупного рогатого скота вызывать клинический патогенез, и выяснить, способен ли препарат гомологичной инактивированной вакцины предотвращать клинический патогенез. У животных, стимулированных IDV, репликация вируса происходила в верхних дыхательных путях согласно данным РВ-ПЦР. Кинетика репликации вируса указывает на то, что самые высокие вирусные титры приходились на 6 сутки после стимуляции. Наблюдали тенденцию к большему количеству вируса в носовых мазках, трахеальных мазках и ЖБАЛ 2-ой группы лечения (Т02) по сравнению с вакцинированными группами, при этом наибольшие различия наблюдали в трахеальных мазках и образцах ЖБАЛ. Кроме того, проводили иммуногистохимическое окрашивание IDV на фиксированных срезах тканей верхних дыхательных путей (носовые раковины и трахея). Стимулированные животные были положительными в отношении вируса IDV по результатам окрашивания, причем пять из пяти телят были положительными на 6 сутки после стимуляции. Ни одно животное, получавшее вакцину, не было положительным в отношении IDV по результатам ИГХ-окрашивания. Можно предположить, что иммунизация может ограничивать уровень вирусного распространения путем снижения вирусной нагрузки в верхних дыхательных путях. Кроме того, контактирующая контрольная группа (Т04) продемонстрировала, что вирус передавался от стимулированных животных (Т02) наивным животным, которых содержали в том же помещении.
На основании результатов этого исследования можно заключить, что IDV реплицируется в верхних дыхательных путях и вызывает легкое воспаление, на основании иммуногистохимических наблюдений. Эта вирусная инфекция может быть важным фактором комплекса респираторного заболевания крупного рогатого скота, при котором профилактическое вмешательство, такое как применение вакцины, может улучшить общее состояние здоровья крупного рогатого скота.
ПРИМЕР 2
В этом исследовании оценивали предположение, что инфекция верхних дыхательных путей, вызываемая вирусом гриппа D, предшествует или усугубляет более тяжелую вторичную инфекцию Mannheimia haemolytica.
В этом исследовании использовали в общей сложности 70 голштинских или гибридных голштинских телят возрастом 5-9 месяцев. Животным давали акклиматизироваться в течение минимум 5 суток в их новом окружении на испытательной станции. Помещение для содержания состояло из изоляционного помещения ABSL-2 с автоматической линией подачи корма и открытой системой резервуаров с водой в каждом помещении. Животные соответствовали следующим критериям включения: отрицательный результат BVDV-PI по данным ушного выщипа и ИФА с захватом антигена (АСЕ); хорошее состояние здоровья на основании физикального осмотра, проведенного на 0 сутки; и сероотрицательный результат в отношении лейкотоксина (LKT) М. haemolytica.
Экспериментальная вакцина против IDV содержала инактивированный BPL штамм IDV, штамм D/бычий/NE/103795/2012. Штамм вируса гриппа, используемый для иммунизации и стимуляции изменяли с D/бычий/KS/14-22/2012 на D/бычий/NE/103795/2012 из-за того, что последний вирус был лучше для увеличения масштабов. Вакцины стандартизировали до 1280 ГАЕ на дозу. Антиген разделяли на партии и готовили/дополняли 1:1 по массе с SEPPIC MONTANIDE ISA 201 VG. Перед применением вакцина проходила 7-суточный тест на стерильность флаконов со средой в жидкой тиогликолятной среде (FTM) и триптическом соевом бульоне (TSB).
Вакцина М. haemolytica содержала экстракт инактивированных белков наружной мембраны (БНМ) и рекомбинантный LKT (rLKT). Вакцины стандартизировали до 250 мкг БНМ и 125 мкг LKT на дозу. Антиген разделяли на партии и готовили/дополняли 1:1 по массе с SEPPIC MONTANIDE ISA 201 VG. Перед применением вакцина проходила 7-суточный тест на стерильность флаконов со средой в бульонах FTM и TSB.
Figure 00000010
Комбинированная вакцина содержала инактивированный BPL IDV, штамм D/бычий/NE/103795/2012 плюс экстракт инактивированных белков наружной мембраны (БНМ) и rLKT. Вакцины стандартизировали до 1280 ГАЕ на дозу IDV, 250 мкг БНМ и 125 мкг LKT на дозу. Антиген разделяли на партии и готовили/дополняли 1:1 по массе с SEPPIC MONTANIDE ISA 201 VG. Перед применением вакцина проходила 7-суточный тест на стерильность флаконов со средой в бульоне FTM и TSB.
Все кандидатные животные, которые соответствовали критериям отбора и критериям включения/исключения, подходили для включения. Животных случайным образом распределяли по группам обработки, используя план случайного распределения. От исследовательского персонала, проводящего клинические наблюдения, собирающего образцы и анализирующего образцы, была скрыта информация относительно типа обработки. Исследователь, который проводил оценку поражения легких, был заслеплен в отношении ID конкретного теленка во время оценки.
После прибытия на место испытаний животных содержали в трех изоляционных помещениях ABSL-2. Группы Т01, Т02, Т05, Т06 и Т07 были размещены в двух помещениях (25 животных на помещение) с равным распределением групп лечения по помещениям. Группы Т03 и Т04 были размещены в отдельном третьем помещении для предотвращения заражения наивных животных IDV, который выделяют стимулированные IDV животные. Животных смешивали в трех помещениях. После стимуляции М, haemolytica на 41 сутки исследования (СИ41) проводили повторную сортировку всего стада для равномерного распределения групп лечения (Т01-Т07) между тремя изоляционными помещениями ABSL-2 с 23-24 животными на помещение. После пересортировки получали равномерное представление каждой группы обработки (3-4 животных на группу на помещение).
Телят вакцинировали (2,0 мл) путем подкожной (ПК) инъекции в правую сторону шеи (1-дюймовая игла 18-го калибра) на 0 сутки и в левую сторону шеи на 14 сутки. Животных осматривали приблизительно через 1 (один) час после вакцинации для оценки ответа на вакцинацию. Исследуемых животных ежесуточно осматривали для определения общего состояния здоровья, начиная с -5 суток и вплоть до 48 суток. Наблюдения проводили приблизительно в одно и то же время каждые сутки. Наблюдения за здоровьем животных состояли из визуальной оценки животных в отношении показателей здоровья животных.
Стимуляцию вирусом D проводили на 35 сутки (возраст ~6-10 месяцев) для групп Т01, Т02, Т05, Т06 и Т07. На 35 сутки каждого теленка интраназально стимулировали с помощью одноразового распылителя PREVAL® (10,0 мл; 5 мл/ноздря) IDV, штамм D/бычий/NE/103795/2012 при 105,7 TCID50.
IDV получали следующим образом. В три роллерных полистироловых флакона для тканевого культивирования объемом 850 см2 высевали клетки ST-C с целевой плотностью 2 × 107 клеток/флакон (т.е. 23529 клеток/см2) в среду ЕМЕМ с 7,5% ФБС и 4 мМ L-глутамином. Роллерные флаконы центрифугировали при 0,25 об/мин при 37°С. Через 7 суток клетки инфицировали. Для инфицирования используемую среду сначала заменяли одной предварительно нагретой средой ЕМЕМ, a IDV (D/бычий/NE/103795/2012) добавляли при множественности заражения (MOI) 0,05. После дополнительных 3 суток инкубации при 0,25 об/мин и 37°С весь роллерный флакон и его содержимое собирали путем замораживания при -80°С, размораживания, и проводили асептическое распределение.
Во время сбора образцов отбирали образцы для анализа вирусных титров. Для анализа клетки ST-C высевали при 15000 клеток/лунка в 96-луночные планшеты. Через 3 суток после высевания, когда клетки были на ~95% конфлюэнтными, лунки два раза промывали ФСБ, после чего в каждую лунку добавляли 100 мкл ЕМЕМ с 0,2 мл/л гентамицина. Затем собранные образцы IDV серийно разводили 1:10 перед добавлением в каждую лунку по 100 мкл каждого разведения. После дополнительных 3 суток инкубации при 37°С и 5% СО2 планшеты фиксировали 80% ацетоном при -20°С в течение по меньшей мере 20 минут перед высушиванием при 37°С. Для окрашивания первичное антитело разводили в Д-ФСБ, добавляли в каждую лунку и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. После трех промывок в ФСБ вторичное антитело разбавляли в Д-ФСБ, добавляли в каждую лунку и инкубировали при 37°С в течение 75 минут. После двух промывок в ФСБ результаты получали визуально под флуоресцентным микроскопом и проводили расчеты по уравнению Спирмена-Карбера.
Стимуляцию Mannheimia haemolytica проводили на 41 сутки (возраст ~6-10 месяцев) для групп Т01, Т03, Т04, Т05, Т06 и Т07. На 41 сутки каждого теленка из групп Т01, Т03, Т05, Т06 и Т07 стимулировали интраназально с помощью одноразового распылителя (5,0 мл; 2,5 мл/ноздря) и интратрахеально с помощью эндоскопа (5,0 мл) в месте бифуркации гортань/трахея штаммом М. haemolytica при 109 КОЕ/мл. На 41 сутки каждого теленка из группы Т04 стимулировали интратрахеально путем определения области бифуркации трахеи и вытягивания приблизительно на 10 см и доставки 60 мл штамма М. haemolytica при 109 КОЕ/мл с помощью эндоскопа.
Ректальную температуру тела измеряли ежесуточно в течение периода стимуляции (сутки 35-48). Температуру измеряли приблизительно в одно и то же время каждые сутки.
Один образец крови брали минимум за 7 суток до прибытия в исследовательский центр, а остальные образцы крови для определения ингибирования гемагглютинации IDV и анти-М. haemolytica LKT антитела брали на -2, 14, 21, 28, 35, 41 и 48 сутки.
Один образец мазка из носа брали минимум за 7 суток до прибытия в исследовательский центр, а остальные мазки из носа брали у всех животных на 35 (до стимуляции), 37, 39, 41, 43, 45 и 47 сутки. Кроме того, мазки из трахеи получали при вскрытии на 48 сутки.
На 48 сутки указанных животных гуманно умерщвляли для оценки поражения легких, сбора жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) и сбора ткани. У каждого животного удаляли легкие, а жидкость БАЛ собирали в асептических условиях из вырезанных легких. Стерильный фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) пипетировали в легкие и собирали пипеткой, аккуратно массируя легкие. Экстракт жидкости БАЛ помещали в пробирку, которую держали на льду. Каждый образец жидкости БАЛ разделяли на две аликвоты и метили с указанием ID животного и даты получения образца. Оба набора аликвот хранили в замороженном виде (≤ -20°С).
Каждую из семи легочных долей исследовали как визуально, так и путем пальпации в отношении наличия характерных грубых поражений, связанных с М. haemolytica и/или IDV. Количество поражений/уплотнений в каждой легочной доле оценивали и записывали в виде действительного значения от 0 до 100% от доли. Количество поражений (оценку) в каждой доле подставляли во взвешенную формулу, чтобы рассчитать пораженный процент легких. Вес, приписываемый каждой из семи долей (в соответствии с относительной массой долей легких), является следующим: левая апикальная доля = 10%; левая сердечная доля = 10%; левая диафрагмальная доля = 25%; правая апикальная доля = 10%; правая сердечная доля = 10%; правая диафрагмальная доля = 25%; и добавочная доля = 10%.
При вскрытии исследовали ткани носовых раковин, трахеи, трахеобронхиального лимфатического узла и легких в отношении поражений и делали срез каждой из них. Срез делили таким образом, чтобы поместить одну половину в фиксатор (забуференный формалин или эквивалентный раствор) для иммуногистохимической оценки, а также окрасить гематоксилином и эозином для структурной оценки, а другую половину поместить в РНК-LATER® или заморозить при -70°С для ПЦР-анализа цитокинов и воспалительных генов.
Первичную переменную, оценку общего процентного поражения легких на СИ48, рассчитывали и анализировали, как в примере 1. Вторичные переменные суммировали или анализировали, в том числе суточную оценку угнетенности, суточную оценку состояния организма, суточную оценку дыхательной активности и суточную ректальную температуру тела от СИ35 до СИ48, а также смертность и исключение от СИ35 до СИ48.
Объединяли и анализировали данные по семи обработкам Т01, Т02, Т03, Т04, Т05, Т06 и Т07. В случае каждой переменной расчеты проводили для каждого животного, потому что животное было экспериментальной единицей. Все испытания проводили на уровне значимости 5%, если не указано иное.
Оценки общего процентного поражения легких на 48 сутки преобразовывали, используя arsin (кв. корень (общая процентная оценка легких)), и анализировали, используя линейный анализ смешанной модели (SAS® PROC MIXED v 9.4 или выше) с фиксированным эффектом, на обработку. Линейные контрасты проводили, используя следующие попарные сравнения:
Т01 против Т02, Т03, Т04;
Т02 против Т03, Т04;
Т03 против Т04; и
Т04 против Т05, Т06 и Т07.
Для каждой группы обработки рассчитывали средние значения, полученные методом наименьших квадратов (LSMEANs), и стандартные погрешности, а также средние арифметические значения и стандартные отклонения, и представляли обратно преобразованные результаты.
Кроме того, представляли сводные статистические данные для минимизированных фракций (MF) (R версия 3.0.3 (2014-03-06)). Распределение по частоте суточных оценок угнетенности, суточной оценки состояния организма и суточных оценок дыхательной активности получали для каждого момента времени для обработки.
Было два случая смерти из-за заболеваемости, оба в группе обработки 4. Ни в одной другой группе смертность зарегистрирована не было.
Основная цель этого исследования состояла в том, чтобы оценить показатели смертности и поражения легких в разных группах обработки и оценить предположение о том, что инфекция верхних дыхательных путей, вызванная вирусом гриппа D, предшествует более тяжелой вторичной инфекции Mannheimia haemolytica. Средние оценки поражения легких у животных, стимулированных интраназально М. haemolytica после стимуляции вирусом гриппа D, продемонстрировали более чем четырехкратное увеличение по сравнению с животными, которых интраназально стимулировали только М, haemolytica (группа Т01 = 5,6 и группа Т03 = 1,2, соответственно). Это подтверждает предположение, что инфицирование верхних дыхательных путей IDV приводит к повышению вероятности миграции М. haemolytica из верхних дыхательных путей, где он обычно колонизируется, в нижние дыхательные пути и легкие, где начинает проявляться патология.
Средняя оценка поражения легких у крупного рогатого скота, стимулированного IDV и М. haemolytica, была ниже, чем наблюдаемая в традиционной модели инфекции М. haemolytica, в которой больший объем бактерий (60 мл по сравнению с 10 мл интраназально/интратрахеально) доставляется непосредственно в легкие. Различия в степени тяжести можно объяснить снижением дозы и анатомической и механической иммунологической защитой между верхними дыхательными путями и легкими.
Figure 00000011
Figure 00000012
Кроме того, комбинированная инактивированная вакцина, содержащая антигены как IDV, так и М. haemolytica, обеспечивала статистически значимую защиту (по данным MF) при двойной стимуляции с оценкой поражения легких, которая могла бы считаться эффективной, поскольку существующие статистические критерии описывают для М. haemolytica модели, используемые для лицензирования вакцин (>0,4 MF с положительными верхней и нижней границами). Моновалентные вакцины против IDV (средняя оценка поражения легких 2,5) и М. haemolytica (средняя оценка поражения легких 0,9) обеспечивали MF выше этих критериев, но верхняя и нижняя доверительные границы не соответствовали удовлетворительным критериям. Следовательно, комбинированная вакцина против IDV и М. haemolytica является эффективным подходом для контроля респираторных заболеваний крупного рогатого скота.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ЭЛАНКО ЮэС ИНК.
<120> ВАКЦИНА ПРОТИВ РЕСПИРАТОРНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
<130> P21011
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2356
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA from influenza D virus
<400> 1
cagaggatgt caccactatt aacgctcgca aaagagtatg caaatctcac aaaggataag 60
aaatcatgca aattgctgtc gcaagggacc gtgtcaagct acaccacttt taagaaatgg 120
acaacatcga gaaaagagaa aaacccatcc cttcgaatga gatgggcaat gggaagcaag 180
ttcccaatca tggcaaacag agaaattttg gaagaagctg ggataccaga acaatgggaa 240
gggatagacc tttggtcaaa aaaggatgat gtttcaaagt tggggatggt gttagcgtct 300
cccgcagcca taacttactg gaatttttgt ggacctggag tggacaattc ttctgtaata 360
agggatgttt acaaagcaaa atttatgaaa aaagagagat ggagagagac tctgtgggga 420
ccaatgaact ttgaactggt gggtaaacaa agaagagtgg ttgaaactca accagtggaa 480
ataaaactaa accaaaaaga aataaaagaa ctaacgatgt gggttctttt tgaggatgaa 540
gcaaaccttg caagcaaatt catacaggaa aatttctcac ttgtcctgtc attaagagaa 600
ctttacaagg gaaaggcagt aaataaagat gttgcagctt ttatgattgc acaccaattt 660
tctcccgaga agaggttctt acccactttt ggccccatta gaccagaaag gatggagcta 720
ctccactgtt tagggggtga cttctggaag atagaggcag taactgcagg gagtctgaat 780
gaagaacaaa agaagagaga tgttagagca gttgccagaa aaatttgcct tagagcaagt 840
gtggacttat ttactccagc agagaagata agggactata tatcaagtgt gacaatgaga 900
tttggaacag tagaaagaac gttcgaagac gtaataagaa acagtgatga tatatctgcg 960
gaagtgacct tatgcaaagc ggcacttgga tgcgaattgg gcaaaagcat gagctttggg 1020
aatctaaatc tgaggaaagt cagtggggaa gcagaaacaa tagaaaaaac agtatattgg 1080
ggattaaagc ccataaaata caaatgctgg agaggagagg aaacatttta ttgcgaactg 1140
aggaaagtaa cttgtatgtt tagaaggtct gaaggcctag attgggctaa cattggacct 1200
ggttcacctg aagaaagaag agagctcttg gcaatggtga tgatattctg cagagatggg 1260
agattctttg aatctgcacc agttaatatt gatgaatcat tctttagaac aagactgaat 1320
aaagaaatac cttatcaata tgtgctgcta aaatgggtaa ggcaatcgag agacaacttg 1380
gatgccttgt tgagtacaag aggactgata cctgctcata ttggacaatt cggaaaagga 1440
atgggaatag atggaagtag ctcatcttct atggtttaca agggggtcat gttgtcgaaa 1500
acaccgatag acatagtgga gagcaaagag aagcacaggc tgtttttaaa tgacaatata 1560
gaagcgataa cagagagagg agcaatggtt gcatccataa tggacctatc agaggataat 1620
agagaaacat ttaacgatgt gacttttaac catgtcgact tagctgttct caaagatgaa 1680
aaaactgcaa taataaagat ctatcgatca ctggtggaaa gaataaacac tgatgatgat 1740
ggcctacctg ctttgataat gggtaaaaga tatttagagt tgtatcaatt agatgaagtg 1800
aaagacgcgg tcgggctaat accaaaacgg atgctggggg cgtattccta ccaggcaaga 1860
cagctcatac aatcgcagat caaaaatgac agttatagcc ttcctgaaat aataaaattg 1920
ctgcccttct gttacagccc tccaaagaaa atgttatttg atgggacttt ccatttcaaa 1980
aatcaaatgt atgttaggcc tgggataaac acaaaccttt tcagttttag taagaccgac 2040
aaaagcaaga tatatgtgaa cggaagcgca gtgaaaataa agcttgtgct cggagacgat 2100
gaaatggaca ccagtcttgc ctttgttgaa ggatttcaag tttgtgaata tgatccaaga 2160
gcacctttga taccaagaag agatttgaga ctgattgggt tcggaaagaa agttagagtt 2220
tttgttggtc agggacagga gaaaaccctg gtgaggacga gctccaaaag agccgcctcc 2280
catgatgtaa acaaaaacat tcgtagaatg cgtctggaag tttgaagcac attgaaaaaa 2340
tcctcttgct actgct 2356
<210> 2
<211> 2261
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA from influenza D virus
<400> 2
acgtcaatga tatcattgac atacccatac actggggcac ctcctatgtc acatggaaca 60
tcgaccaaat actcaatgga gactgtgtca agaacttact cctacagtag aactaaaaaa 120
gaggtacctt cgggaatatt cccaataaag agaaggaaat tctgtaacac aatagaagac 180
aaagaaaacc tggaaaaacc gaatggaaat gttgatataa atttcatgtt atcgctggca 240
gaaatgctgg aagaaaagat gggaaaaggg ttcttcaaat tctgtgccaa tgaagctgaa 300
gctgaaattt tgaagatgca cttcagcaag ctcactgaag gaaggcaaac ttatgactgg 360
acaagtgaaa gaaatatgcc agcagccacc gctcttcagc taacagtaga cgctatacaa 420
gaaacacagg gaacattcaa aggaactacc atggttgaat attgcaacaa gatattagaa 480
atgatggatt ggccagaagt gaaattcaaa aaggtcagaa tgattgttca gaggcattgg 540
gacccgaaaa ccaaaaaaga aataaaaatg aagtctccaa cattgatgat aacaaagatt 600
ggaagagaag aattcataaa gaggatatgc acgataaaca ccatggccaa agacggagaa 660
agaggaaaat acaaaagaag agctatagcc acccccggga tgggaatcag gccattctca 720
aaaattgtgg aaactttagc acaaaagatt tgtgagagac tagcagagag cggtttgcct 780
gttgggggaa atgagaagaa agccaaacta aaaactacgg tctcttcaac aaactcaaaa 840
ctacaagaag ggcagttcat ggtaaacata acaggggaca acagcaagtg gaatgaatgt 900
cagcaaccag aagcttatct tgcaatgttg gcatacatta ctaaagacag cagcaactta 960
atgaaagatc tctgctcagt agctccaaca ttgttctgca ataagtacgt gaaaatggga 1020
caaggtttcc gagcaaaaaa caaaagaaaa accaaagaaa tagtgatacc cgcaaaaagg 1080
atgaaagaaa ggaaagaatt gatgaacgcg gaatggaggg acctgtttga aacaatagaa 1140
ccttacatgg atggagagtg ctgcttcttg gggggaggaa tgctgatggg aatgtttaac 1200
atgttgtcaa ctgtttttgg agtcatgaca ttaaattaca gggaggaagc attggccaga 1260
aggaactgtt actggactgg gctacaaagt tcagatgatt ttgtgctctt ttgcatctct 1320
aaaacttggc cagagatgga gatgactatt ctaaaattca tcgctgtttg caagttgatg 1380
ggaataaaca tgtctttgga aaaatcctac gggtgcttgc ctgaactttt tgagttcaca 1440
agcatgttct tttccgggga ttttgtctca aacatagcct tggagttacc tgctttcaca 1500
acagctggaa tgaatgaagg aaccgacttc acagctgcga tgtctgtcat aagaacaaac 1560
atgatcaata atggactttc tcctgggact gctttaatgg ccctgcgaat ttgtctgcag 1620
gaatttagag caacatacag agtacaccct tatgactctg gagtgaagaa tcatcgaatg 1680
aaaatcataa ggaaattcat tgaaactatt gaaaacaaag atggattgct gatatcagat 1740
ggcgggaaat taatgaacaa tatctcaagt ttgcacatcc ctgaagaaat attgaaagag 1800
gatttgatgg atccctccta caggaacaga gttttcaatc ctaggaaccc ctttacacag 1860
tttgagaaga cagttgacat ctttaaggca agtgggccta taagagtaga ggagaacgaa 1920
gcagttgtat caacgcattc ctttaaaaca aggagcaata ggacattgct aaacacagac 1980
atgagggcaa tggctctcga agagaaaaga taccaagttg tttgcaacat gtaccgatcg 2040
gtcttcgaaa gtgcagacgt taacacccca ataggatcaa tgtcgatggg agaggcaatt 2100
gaagccaaaa tccttgaccg ggccagaacc cagtttgaaa atggaatcat agggggagaa 2160
gaatattctg aaatcaaaag actaatcgag gacgccaagc gtcaacgact gtctgtttaa 2220
gctttgcgtt gtttaataac agaaaaatcc tcttgctact g 2261
<210> 3
<211> 2194
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA from influenza D virus
<400> 3
agcagatatc aggagattta gaaatgtcta gtgtaatcag agaaatcgca aagcgattct 60
tggaacaagc aacgataaac atcgctgaag aagtggtcag agaatatgga gaccatgaaa 120
gaacaatgat atctgttgga gttcatttcc aagcttgctg ccttataagt gatgaatata 180
cccttgagga tgagacaacc ccaagatacg ttcttttgga gggattgaga agacaagagg 240
ctataagcaa gcagaataac atttgctcca ctttgggatt ggaacccttg agaaatctag 300
cagatatttt tgatcgaaaa acaagaagat tccttgaaat aggaattaca aagagagaat 360
ccgatgagta ttaccaggaa aagttcaaca aaataggaaa tgacatggac atacatgttt 420
tcacatatga aggcaaatat ttcagcaaca atcccaatgg gttggaagac atccaaaaga 480
caagaatttt tacattccta tcttttgtgt cagacgaatt gagaaaagag aacatgttca 540
cagaaatgta tgttacagaa gaaggggcac ctgagcttga aatgtacaag tcaaagcttt 600
tcattgcaat gagagacgag agcgtgcctt tgccttacat aaactatgag caccttagga 660
caagatgtga aacattcaaa agaaatcagg ctgaatgcga agcaaaggta gcggatgtgg 720
cttcacggct aaaaatcaaa ctggaacatc tagaagaaaa caaactgcgg ccgctagaga 780
taccgaagga gaaagaggct ccctatacgc acaaatttat gatgaaagat gcttggttct 840
ttgcaaaacc tcatgattcg gagagagcac aaccgcaaca gatattgtat gatttctttg 900
aagcagcaaa catggggttc atgacgacat ccccaaaacc gatattcgga aagcaaggac 960
tgatgtatca ctccctctgg gggcagataa aaagggcaat aaaggacaag agaaatgagt 1020
tggagccttc agaacagagg gacttccttt gtggaattgg aagagcctcc aagaaaatac 1080
aggaggacaa atggcaagaa tccagagagg aagagtttaa acaagaagag actaaagggg 1140
cagctaagag ggggttccca acatggttta atgaagaatg gctttgggca atgagggact 1200
caggggatgg ggacaacaaa ataggggatt ggatacccat ggcagaaatg cctccctgca 1260
agaatgaaat ggaagattat gcaaaaaaga tgtgtgaaga attagaatcc aaaatacagg 1320
gaacaaattg tgctagggaa atgtccaagt tgatacatac aattgggagc ttacatacag 1380
aatgtaggaa ctttcccgga aaggtcaaga tagtgcctat atactgcaga gggacactga 1440
gaggggaatc aactgactgt ttgtttggaa tagcaataaa agggaaatcc catttaaaca 1500
aagatgatgg aatgtatact gttgtaactt ttgagttttc cactgaagaa ccaaatccaa 1560
gcaaacatga aaaatatacg gtcttcgaag ctggaacagt gcctgtggaa gccgtggtgt 1620
taactcccaa aagggaaaga gttctcaaag agaagaaatt gtttctttat tgcagaacta 1680
ctggaatgag caagttaaag aacgattggt tttctaaatg caggagatgt cttataccaa 1740
caatggagac tgtagagcag atagtgctga aagaatgcgc tctgaaagaa gaaaacagag 1800
tttcagagat gttggagaat aagagagctt ggattgccca tgagaacgga gagaatctta 1860
caagattggt atcaacaaag ctcaaagact tgtgtagaat gctaattgtg acacaatttt 1920
attactgtat atataacgac aatcagttgg aaggattctg taacgagcaa aagaaattcc 1980
ttatgtttct tcaagcagat aaggactcaa aatctgcatt tacttttaat cagaaagggt 2040
tatatgaaaa aattgaagag tgtattgtca gcaatccatt atgtattttc ctagctgata 2100
ggctgaacaa attatttctt gtagccaagt ccaatggagc taagtacttt gaatgaccaa 2160
aggccttgta atgttaaaaa tctccttgct actg 2194
<210> 4
<211> 2049
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA from influenza D virus
<400> 4
gcagatagca ggagattttc aaagatgttt ttgcttctag caacaattac agcaataact 60
gcttgccaag cagaaagaga actgatatgt atagtgcaaa gagtgaatga aagcttctct 120
cttcactctg gatttggagg aaatgtttac agcatgaaga ctgagccaat gactggattc 180
acaaatgtga ccaaaggtgc tagtgtcatc aaccaaaaag actgggttgg attcggagat 240
tcaaggacag acttgactaa tgctcagttt ccagcgtctt cagatgtccc attggcagtg 300
gcaaagaagt ttaggtcatt gtcaggggct tcgttaatgt tgtcagcttt tggacctcct 360
ggcaaggttg attaccttta tcaaggatgc gggaaagaaa aagtatttta tgaaggggta 420
aactggtccc ctgaggcagg aattgattgc tttgggtcaa actggactca gacaaaaaag 480
gacttctatt cgaggatata tgaagctgct agaggcagca cgtgcatgac ccttgtaaat 540
tctctagaca ccaagatatc atcaaaaaca gccacagctg gaaccacatc ttcttgttct 600
tcaagctgga tgaaaagccc gttgtggtat gcagaatctt ctgttaatcc tggagctaga 660
cctcaagctt gtgggactga gcaatcagca acttttactt tgccgacaag tttcggaatt 720
tacaaatgca acaagcatgt agtgcaactt tgttactttg tgtatgaaaa caaaacagca 780
tttaacactc ttggctgtgg agattattac caaaattact atgacgggaa tggaaacctg 840
gtagggggag tggataacag agtggcagca tacagaggaa tagcaggctc tagagttaaa 900
attgaatgtc cttcaaaaat cttgaaccct gggacttaca gcattagatc aacaccaaaa 960
ttccttctgg taccaaaaag gtcatattgc ttcgacactg atggagggta ccctatacaa 1020
gtggttcaat ctgagtggtc agcttcacga agatcagata atgccactga agaagcatgc 1080
ctacaaacag aaggatgtat tttcatcaaa aagacaaccc cttatgtagg agaagcagat 1140
gacaaccatg gggacattga gatgaggcaa ctcttgagtg ggcttggcaa caacgacaca 1200
gtgtgtgttt cccaaagtgg atacacaaaa ggagagaccc cttttgtaaa ggattatttg 1260
agtcctccca agtatggcag atgtcagttg aaaactgaca gtggaagaat cccaactcta 1320
ccttctgggt tgataatacc gcaagcaggg actgattctt taatgagaac tttgacacca 1380
gcaacaagga tcttcggaat agatgactta gtcttcgggc ttttattcat agggtttgtc 1440
gcaggaggag ttgcaggagg ttacttctgg ggaagatcaa gtggaggggg tggtggtgcc 1500
tcggtgagca gtacgcaggc tggatttgac aaaatcggaa aagatataca gcagcttcgg 1560
aatgacacaa atgcagcaat tgaaggcttc aacgggagaa ttgcccatga tgagcaagcc 1620
attaagaatt tggcaaaaga aatcgaagat gcaagggcag aagctttggt aggggaactt 1680
ggtataataa gatccctcat agttgccaac ataagcatga acctaaaaga atctttatat 1740
gaactcgcaa accaaataac aaagagagga ggaggaattg cacaagaagc aggcccaggg 1800
tgttggtatg ttgactccga aaactgtgat gcaagctgca aggagtacat tttcaacttc 1860
aatggcagtg ccactgtccc cacattgagg ccagttgaca ccaatgttgt aataacatcg 1920
gatccttatt acttgggctc gaccatagct ctctgtcttt tgggtctgat ggcgattgct 1980
gcttttgttg gtgtgagttg gatctgttgc aagaaataga atcttagaaa aaatctcctt 2040
gctactgct 2049
<210> 5
<211> 1776
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA from influenza D virus
<400> 5
agcagatagc aggagattat taagcaatat ggactcaaca aaagcccaaa cgcctgaaga 60
gcaaagagca aagaatgcca aaaccatcct tgagaacata cagatatatg aaaggatgtg 120
tgatctcttt ggggtgtcag aagatgacaa actgataatt gagaacagta tttcaattga 180
gagaatgata agagttgtaa cagataagaa atatcaagac aagaaactaa agaatgctgg 240
aagtgatctt gaaaagattg caaatgcagg gaaagttttc tgccgattgg tggagtcaac 300
agctgggaaa tgtagtgcaa gattgggaat ggcactgaaa cccaacgttg aggcagtcct 360
gaccgatgta ctcgggaatg agctggatag ggctgctgtg cttgggaaaa ggatggggtt 420
tacagcaatg ttcaaatcaa acctggaaga ggttttgtac caaagaggaa agaatcagct 480
taaaaagagg aatgctgcag aaactttcac tctttcacaa ggtgcttcgc tagaggcaag 540
atttaggccc ataatggaaa aacacctagg tgttgggact gttgtggcgt caataaagaa 600
tatcctggca agcaaaaaga acgggaacta caggaacaag atggtgagga aacctggagg 660
aaacagagaa agctggtcac cattggagag agaaatatcc tttctgaaca agaagttgtt 720
tcctggacca atgaggcagc tctgcaagaa attcgaatac ttgaacgacc aagagaagca 780
actggcctta aacctcatgc tggatgcaag tctcatcctg aagccacaag tgactcataa 840
aatgataatg ccttggtcaa tgtggctggc tgtgaagaaa tatgcagaaa tgaacaaggg 900
atcacccagt cttgaagacc tcgcagccta ttctggagta agagccttta tggccttcaa 960
tacagcttgc tacatgagta aattcaccat tgggaaggga attgtgggag atgcagagat 1020
catggaaaat ggaaacgaca agatgcaaac tcttgcaatg gcttgttttg gactggcgta 1080
tgaagacacc gggattgttg cagcaatgat ctcccaaccc atgaagaaaa gatatcagtt 1140
gagggtgggg aacttcaacc ctccagaaga aggaacaata aaaggaacaa gcgccggcta 1200
tttccacaag tgggctgaat ttggaaatag gctgcctttc aacagttttg gaactggtga 1260
atccaaacag ataagcaact caggagtgtt tgcagtgcag aggcccagca ctactaacat 1320
tcaaagactg gcagagctaa tggctaggaa tactggagaa accagcgaca actttactca 1380
gttggttcag aaaataagag aacaagtggg gacctttgct gatcaaaaag caaatcttcg 1440
agagttcacc ggaggatata tttatgatat tactgacgta acgaagagca accccaagat 1500
acctcagttg ggtggggact ctttcttctt tgagttcacc ggaagcgacg ttccaagaac 1560
tggagccaaa agaagagtgg gaggagctga tgatgtgacc cctggaactt cccagcccaa 1620
gaaaagagga aggcaaggtg ccggagcaga atcaagtatg gacattgaaa cagttggtga 1680
agattaactc ttctttggat ggttctgttg cagtccccag tgggtgttaa aggtgttggt 1740
ttgtcttatt taacaaaaaa tctccttgct actgct 1776
<210> 6
<211> 1219
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA from influenza D virus
<400> 6
agcataagca gaggatattt ttgacgcaat ggcacaagaa caactacttg ctgaacttga 60
gggatacctc agaggaatta acccaatgac caggcaaaca attttgagat ctgcaagagg 120
tggaatggat agcgctaggg atgcagcaag agcagcgaag aagggagaaa tgcaactaac 180
aagtggagag agtatagtgg tgcacatatg cctgagggcc atgtaccctg gaataaagcc 240
atggtcagaa gccaaaaaag atcttgataa agctacagaa ggactgagtg gaaaagacag 300
caaaagcata agaaaggctt tgaggaaggc gggagacctg acagggataa aggagatgat 360
gatgatgtat gaaatgaggg aggacaaaaa agcagaaatg gtggagcaaa tctacgacga 420
tccagaggat tttacagaag atgtaaggct tgggaccgtt gctgcctggc ttcaatgcaa 480
aaacaaaagg agcgagaaat atcatcacaa aatgtcaatg tctggaagca ctgcacttgc 540
cttgggagat gcccaaaaag ctggaatggc catagaaaat atggccagtg ttgtaccaat 600
gaaaaaagag gcccaggcac tgcacaaaga cgcagaagtc ttaattgaac tggcaagaat 660
agcatatggg tcaagagcaa tggaaggaca cctgcaaaat gcaatggacg gaattggaag 720
caaagtcagt ggaatggcta atcttgctct aaaaaggtca gttcttactt tgttaatgtt 780
ggtaatttgt gggatatcca cctgtgtaaa tgctgaaact gtggaagaat tttgtagaaa 840
gaaactaaat cagacggaag aaaaggttta tgtccattgt ttcaatgagg atgatagtcg 900
ggcaatgact ctagctgctt tgatacttgg atgctttagt atgctttaca ttttaataaa 960
ggcaatactg atgcttttgt tgacaatcat aaatggaaga ccaaatggaa gttgggatga 1020
cttgaaacat gttgtaaaat gtttttcaga gactggaagt gagaacttcg ccagggatat 1080
aatggtcctg gagtccaggc gagatgggga ggagacaagc tccctggagg agggactggg 1140
ccctccattg agtggattca atgaaaatgg tgtattcatg gaaacattat aatcgcgaaa 1200
aaatcctctt gctactgct 1219
<210> 7
<211> 869
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA from influenza D virus
<400> 7
gcagatatca ggggtgtaca atttcaatat gtctgaaaat aagtcagtga acacaacaaa 60
tatcagagca gcaatctccg aattggcatt gggcgcagcc agctggatgg attcctctgg 120
attaatgact ttcgagaaaa tgagaaagtc tgctgagaat tcactgagag tcgaacaggt 180
ttatgaaccg agaacttggg aagatgcagt ggccgaaggt agagaaattc taggattcac 240
tactattgct gccttaagaa aaccagagga gactcatgct gttgaattgg gaaagaacat 300
tatctatccc ttaggaggaa atcctttcta tctgagccca tgtaccattg acactctgta 360
tgagccaaag ctcataagac aaggagaagt cttgggagta aaatatcgga actgcaattg 420
ctttgtaaaa actgctgaac tattagtgac cgacatggga gaaatcattg tgctcttttg 480
cagaaacact gagaaaccag cttactgcct taagaatttc cgtagaggag atgacccaga 540
gaagtcagta cgaaagatac tcagaatttg gagaagtgga cttgttgttg ccgttgatgc 600
ggaatctaga gatgagatca gacgatacaa atctggatgt gaaacagatc ccttctggag 660
aagagaaggc gcaactactg gagaggttca ggagttgctt ggtgtcattg ataaggttga 720
aatccaagct gggagtagcg atggtgaact ctttgactaa ccaggatatg agggccgctt 780
tggatgaaat caagtcagtt tcgagaacaa tttcaatgtt aaaagaatgt attcgttctt 840
tagtatgaaa aaaccccttg ctatctgct 869
<210> 8
<211> 2337
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA from influenza D virus
<400> 8
tatcgctcgc aaaagagtat gcaaatctca caaaggataa gaaatcatgc aaattgctgt 60
cgcaagggac cgtgtcaagc tacaccactt ttaagaaatg gacaacatcg agaaaagaga 120
aaaacccatc ccttcgaatg agatgggcaa tgggaagcaa gttcccaatc atggcaaaca 180
gagaaatttt ggaagaagct gggataccag aacaatggga agggatagac ctttggtcaa 240
aaaaggatga tgtttcaaag ttggggatgg tgttagcgtc tccagcagcc ataacttact 300
ggaatttttg tggacctgga gtggacaatt cttctgtaat aagggatgtt tacaaagcaa 360
aatttatgaa aaaagagaga tggagagaga ctctgtgggg accaatgaac tttgaactgg 420
tgggtaaaca aagaagaatg gttgaaactc aaccagtgga aataaaacta aaccaaaaag 480
aaataaaaga actgacgatg tgggttcttt ttgaggatga agcaaacctt gcaagtaaat 540
tcatacagga aaatttctca cttgtcctgt cattaagaga actttacaag ggaaaggcag 600
taaataaaga tgttgcagct tttatgattg cacaccaatt ttctcccgag aagaggttct 660
tacccacttt tggccccatt agaccagaaa ggatggagct gctccactgt ttagggggtg 720
acttctggaa gatagaggca gtaactgcag ggagcttgaa tgaagaacaa aagaagagag 780
atgttagagc agttgccaga aaaatttgcc ttagagcaag tgtggactta tttactccag 840
cagagaagat aagggactat atatcaagtg tgacaatgag atttggaaca gtagaaagaa 900
cgttcgaaga cgtaataaga aacagtgatg atatatctgc ggaagtgacc ctatgcaaag 960
cggcacttgg atgcgaattg ggcaaaagca tgagctttgg gaatctaaat ctgaggaaag 1020
tcagtggaga agcagaaaca atagaaaaaa cagtatattg gggattaaag cccataaaat 1080
acaaatgctg gagaggagag gaaacatttt attgcgaact gaggaaagta acttgtatgt 1140
ttagaaggtc tgaaggccta gattgggcta acattggacc tggttcacct gaagaaagaa 1200
gagagctctt ggcaatggtg atgatattct gcagagatgg gagatttttt gaatctgcac 1260
cagttaatat tgatgaatca ttctttagaa caagactgaa taaagaaata ccttatcaat 1320
atgtgctgct aaaatgggta aggcaatcga gagacaactt ggatgccttg ttgagtacaa 1380
gaggactgat acctgctcat attggacaat ttggaaaagg aatgggaata gatggaagta 1440
gctcatcttc tatggtttac aagggagtca tgttgtcgaa gacaccgata gacatagtgg 1500
agagcaaaga gaagcacagg ttgtttttaa atgacaatat agaagcgata acagagagag 1560
gagcaatggt tgcatccata atggacctat cagaggataa tagagaaaca tttaacgatg 1620
tgacttttaa ccatgtcgac ctagctgttc tcaaagatga aaaaactgca ataataaaga 1680
tctatcgatc actggtggaa agaataaaca ctgatgatga tggcctacct gctttgataa 1740
tgggtaaaag atatttagag ttgtatcaat tagatgaagt gagagacgcg gtcgggctaa 1800
taccaaaacg gatgctgggg gcgtattcct accaggcaag acagctcata caatcgcaga 1860
tcaaaaatga cagttatagc cttcctgaaa taataaagtt gctgcccttc tgttacagcc 1920
ctccaaagaa aatgttattt gatgggactt tccatttcaa aaatcaaatg tatgttaggc 1980
ctgggataaa cacaaacctt ttcagtttta gtaagaccga caaaagcaag atatatgtga 2040
acggaagcgc agtgaaaata aagcttgtgc tcggagacga tgaaatggac accagtcttg 2100
cctttgttga aggatttcaa gtttgtgaat atgatccaag agcacctttg ataccaagaa 2160
gagatttgag actgattggg ttcggaaaga aagttagagt ttttgttggt cagggacagg 2220
agaaaaccct ggtgaggacg agctccaaaa gagccgcctc ccatgatgta agcaaaaaca 2280
ttcgtagaat gcgtctggaa gtttgaagca cattgaaaaa atcctcttgc tactgct 2337
<210> 9
<211> 2307
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA from influenza D virus
<400> 9
caatggaaat aaacccatat ctactcatgc taaacaatga tataacgtca atgatatcat 60
tgacataccc atatactggg gcacctccta tgtcacatgg aacatcgacc aaatactcaa 120
tggagactgt gtcaagaact tactcctaca gtagaactaa aaaagaggta ccttcgggaa 180
tattcccaat agagagaagg aaattctgta acacaataga agacaaagaa aacctggaaa 240
aaccgaatgg aaatgttgat ataaatttca tgttatcgct ggcagaaatg ctggaagaaa 300
agatggggaa agggtttttc aaattctgtg ccaatgaagc tgaagctgaa attttgaaga 360
tgcacttcag caagctcact gaaggaaggc aaacttatga ctggacaagt gaaagaaata 420
tgccagcagc caccgctctt cagctaacag tagacgctat acaagaaaca cagggaacat 480
tcaaaggaac taccatggtt gaatattgca acaagatatt agaaatgatg gattggccgg 540
aagtgaaatt caaaaaggtc agaatgattg ttcagaggca ttgggacccg aaaaccaaaa 600
aagaaataaa aatgaagtct ccaacattga tgataacaaa gattggaaga gaagaattca 660
taaagagaat atgcacgata aataccatgg ccaaagacgg agaaagagga aaatacaaaa 720
gaagagctat agccaccccc gggatgggaa tcaggccatt ctcaaaaatt gtggaaactt 780
tagcacaaaa gatttgtgag agactagcag agagcggttt gcctgttggg ggaaatgaga 840
agaaagccaa actaaaaact acggtctctt caacaaactc aaaactacaa gaagggcagt 900
tcatggtaaa cataacaggg gacaacagca agtggaatga atgtcagcaa ccagaagctt 960
atcttgcaat gttggcatac attactaaag acagcagcaa cttaatgaaa gatctctgct 1020
cagtagcacc aacattgttc tgcaataagt atgtaaaaat gggacaaggt ttccgagcaa 1080
aaaacaaaag aaaaaccaaa gaaatagtga tacccgcaaa aaagatgaaa gaaaggaaag 1140
aattgatgaa cgcggaatgg agggacctat ttgaaacaat agaaccttac atggatggag 1200
agtgctgctt cttgggggga ggaatgctga tgggaatgtt taacatgttg tcaactgttt 1260
ttggagtcat gacattaaat tacagggagg aagcattggc caaaaggaac tgttactgga 1320
ctgggctaca aagttcagat gattttgtgc tcttttgcat ctctaggact tggccagaga 1380
tggagatgac tattctaaaa ttcatcgctg tttgcaagtt gatgggaata aacatgtctt 1440
tggaaaaatc ctacgggtgc ttgcctgaac tttttgagtt cacaagcatg ttcttttccg 1500
gggattttgt ctcaaacata gcattggagt tacctgcttt cacaacagct ggaatgaatg 1560
aaggaaccga cttcacagct gcgatgtctg tcataagaac aaacatgatt aataatggac 1620
tttctcctgg gactgcttta atggccctgc gaatttgtct gcaggaattt agagcaacat 1680
acagagtaca cccttatgat tctggagtga agaatcatcg aatgaaaatc ataaggaaat 1740
tcattgaaac tattgaaaac aaagatggat tgctgatatc agatggcggg aaattaatga 1800
acaatatctc aagtttgcac atccctgaag aaatattgaa agaggatttg atggatccct 1860
cctacaggaa cagagttttc aatcctagga acccctttac acagtttgag aagacagttg 1920
acatctttaa ggcaagtgga cctataaggg tagaggagaa cgaggcagtt gtatcaacgc 1980
attcctttag aacaaggagc aataggacat tgctaaatac agacatgagg gcaatggctc 2040
tcgaagagaa aagataccaa gttgtttgca acatgtaccg atcggtcttc gaaagtgcag 2100
acgttaacac cccaatagga tcaatgtcga tgggagaggc aattgaagcc aaaatccttg 2160
accgggccag aacccagttt gaaaatggaa tcataggggg agaagaatat tctgaaatca 2220
aaagactaat cgaggacgcc aagcgtcaac gactgtctgt ttaagctttg cgttgtttaa 2280
taacagaaaa atcctcttgc tactgct 2307
<210> 10
<211> 2196
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA from influenza D virus
<400> 10
agcagatagc aggagattta gaaatgtcta gtgtaatcag agaaatcgca aagcgattct 60
tggaacaagc aacgataaac atcgctgaag aagtggtcag agaatatgga gaccatgaaa 120
gaacaatgat atctgttgga gttcatttcc aagcttgctg ccttataagt gatgaatata 180
cccttgagga tgagacaacc ccaagatacg ttcttttgga gggattgaaa agacaagagg 240
ctataagcaa gcagaataac atttgctcca ctttgggatt ggagcccttg agaaatctag 300
cagatatttt tgatcgaaaa acaaaaagat tccttgaggt aggaattaca aggagagaat 360
ccgatgagta ttaccaggaa aagttcaaca aaataggaaa tgacatggac atacatgttt 420
tcacatatga aggcaaatac ttcagcaaca atcccaatgg gttggaagac atccaaaaga 480
caagaatttt tacattccta tcttttgtgt cagacgaatt gagaaaagag aacatgttca 540
cagaaatgta tgttacagaa gaaggggcac ctgagcttga aatgtacaag tcaaagcttt 600
tcattgcgat gagagacgag agcgtgcctt tgccttacat aaactatgag caccttagaa 660
caagatgtga aacattcaaa agaaatcagg ctgaatgcga agcaaaggta gcggatgtgg 720
cttcacggct aaaaatcaaa ctggaacatc tagaagaaaa taaactgcgg ccgctagaga 780
taccgaagga gaaagaggct ccctatacac acaaattttt gatgaaagat gcttggttct 840
ttgcaaaacc tcatgattcg gagagagcac aaccgcaaca gatattgtat gatttctttg 900
aagcagcaaa catggggttc atgacgacat ccccaaaacc gatattcgga aagcaaggac 960
tgatgtatca ctccctctgg gggcagacaa aaagagcaat aaaggacaag agaaatgagt 1020
tggagccttc agaacagaga gacttccttt gtggaattgg aagagcctcc aagaaaatac 1080
aggaggacaa atggcaagaa tccagagagg aagagtttaa acaagaagag actaaagggg 1140
cagctaagag ggggttccca acatggttta atgaagaatg gctttgggca atgagggatt 1200
caggggatgg ggacaataaa ataggggatt ggatacccat ggcagaaatg cctccttgca 1260
agaatgagat ggaagattat gcaaaaaaga tgtgtgaaga attagaatcc aaaatacagg 1320
gaacaaattg tgctagggaa atgtccaagt tgatacatac aattgggagc ttacatacag 1380
aatgtaggaa ctttcccgga aaggtcaaga tagtgcctat atactgcaga gggacactga 1440
gaggggaatc aactgactgt ttgtttggaa tagcaataaa agggaaatcc catttaaaca 1500
aagatgatgg aatgtatact gttgtaactt ttgagttttc cactgaagaa ccaaatccaa 1560
gcaaacatga aaaatatacg gtcttcgaag ctggaacagt gcctgtggaa gccgtggtgt 1620
taactcccaa aagggaaaga gttctcaaag agaagaaatt gttcctttat tgcagaacta 1680
ctggaatgag caagttaaag aacgattggt tttctaaatg caggagatgt cttataccaa 1740
caatggagac tgtagagcag atagtgctga aagaatgcgc tctgaaagaa gaaaacagag 1800
tttcagagat gttggagaat aagagagctt ggattgccca tgagaacgga gagaatctta 1860
caagattggt atcaacaaag ctcaaagact tgtgtagaat gctaattgtg acacaatttt 1920
attactgtat atataatgac aatcaattgg aaggattctg taacgagcaa aagaaattcc 1980
ttatgtttct tcaagcagat aaggactcaa aatctgcatt tacttttaat cagaaagggt 2040
tatatgaaaa aattgaagag tgtattgtca gcaatccatt atgtattttc ctagctgata 2100
ggctaaacaa attatttctt gtagccaagt ccaatggagc taagtacttt gaatgaccaa 2160
aggccttgta atgttaaaaa tctccttgct actgct 2196
<210> 11
<211> 2045
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA from influenza D virus
<400> 11
gcagatagca ggagattttc aaagatgttt ttgcttctag caacaattac agcaataact 60
gcttgccaag cagaaagaga actgatatgc atagtgcaaa gagtgaatga aagcttctct 120
cttcactctg gatttggagg aaatgtttac agcatgaaga ctgagccaat gactggattc 180
acaaacgtga ccaaaggtgc tagtgtcatc aaccaaaaag actggattgg attcggagat 240
tcaagaacag acttgaataa tgatcagttt ccagcgtctt cagatgttcc attggcagtg 300
gcgaagaagt ttcggtcatt gtcaggggct tcgctgatgt tgtcagcttt tgggcctcct 360
ggcaaggttg actacctcta tcaaggatgt gggaaagaga aagtatttta tgaaggggta 420
aactggtccc ctgaggcagg aattgattgc tttggatcaa actggactca gacaaagaag 480
gacttctatt cgaagatata tgaagctgct agaagcagca catgcatgac tcttgtaaat 540
tctcttgaca ccaagatatc atcaacaaca gctacggctg gaaccgcatc ttcttgttct 600
tcaagttgga tgaaaagccc gttgtggtat gcagaatctt ctgttaatcc tggagctaaa 660
cctcaagttt gtgggactga gcaatcggca acttttactt tgccgacaag cttcggaatt 720
tacaaatgca acaagcatgt agtgcagctt tgttactttg tatacgaaaa caaaacaaca 780
tttaacactt ttggctgtgg agattattac caaaattact atgatgggaa tggaaacctg 840
atagggggaa tggataacag agtggcagca tacagaggaa tagcaaacgc tggagttaaa 900
attgaatgtc cttccaaaat cttgaaccct gggacttaca gcattagatc aacaccaaga 960
ttcctcctag taccaaaaag gtcatactgc ttcgacactg atggagggta ccctatacaa 1020
gtagttcaat ctgagtggtc agcttcacga agatcagata atgccacaga agaagcatgc 1080
ctacaaacag aaggatgtat tttcatcaaa aagacaaccc cttatgtagg agaagcagat 1140
gacaaccatg gagacattga gatgaggcaa ctcttgagtg ggcttggcaa caatgacaca 1200
gtgtgcgttt cccaaagtgg atacacaaaa ggagagaccc cttttgtaaa ggattatttg 1260
agtcctccca agtatggcag atgtcagttg aaaactgaca gtggaagaat cccaactcta 1320
ccttctgggt tgataatacc gcaagcaggg actgactctt taatgacaac tttgacgcca 1380
gcaacaagga tcttcggaat agatgactta atcttcgggc ttttattcgt ggggtttgtc 1440
gcaggagggg tcgcaggagg ttacttctgg ggaagatcaa atggaagggg tggtggtgcc 1500
tcggtgagca gtacgcaggc tggatttgac aaaatcggaa aagatataca gcagcttcgg 1560
aatgacacaa atgcagcaat tgaaggcttc aacgggagaa ttgcccatga tgagcaagcc 1620
attaagaatt tggcaaaaga aatcgaagat gcaagggcag aggctttggt aggggaactt 1680
ggtataataa gatccctcat agttgccaac ataagcatga atctaaaaga atctttatat 1740
gaactagcaa accaaataac aaaaagagga ggaggaattg cacaagaagc aggcccaggg 1800
tgttggtatg ttgactccga aaactgtgat gcaagctgca aagagtacat tttcaacttc 1860
aatggaagtg ccactgtccc cacattgagg ccagttgaca ccaaggttgt aataacatcg 1920
gatccttatt acttgggttc gaccatagct ctctgtcttt tggggctggt ggcgattgct 1980
gcttctgttg gtgtgatttg gatctgttgc aagaaataga atcttagaaa aaatctcctt 2040
gctac 2045
<210> 12
<211> 1774
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA from influenza D virus
<400> 12
agcagatagc aggagattat taagcaatat ggactcaaca aaagcccaaa cgcctgaaga 60
gcagagagca aagaatgcca aaaccatcct tgagaacata cagatatatg aaaggatgtg 120
tgatctcttt ggggtgtcag aagatgacaa actgataatt gagaacagta tttcaattga 180
gagaatgata agagttgtaa cagataagaa ataccaagac aaaaaactaa agaatgccgg 240
aagtgatcct gaaaagattg caaatgcagg gaaagttttc tgtcgattgg tggagtcaac 300
agctgggaaa tgtagtgcaa gattgggaat ggcactgaaa cccaacgttg aggcagtcct 360
gaccgatgta ctcgggaatg aactggatag ggctgctgtg cttgggaaaa gaatggggtt 420
ttcagcaatg ttcaaatcaa acctggaaga ggttttgtac caaagaggaa agaatcagct 480
taaaaagagg aatgctgcag aaactttcac tctttcacaa ggtgcttcgc tagaggcaag 540
atttaggccc ataatggaaa aacacctagg tgttgggact gttgtggcgt caataaagaa 600
tatcctggca agcaaaaaga acgggaacta caggaacaag atggtgagga aacctggagg 660
aaacagagag agctggtcac cattggagag agagatatcc tttctgaaca agaagctgtt 720
tcctggacca atgaggcagc tctgcaagaa attcgaatac ttgaacgacc aagagaagca 780
actggcctta aaccttatgc tggatgcaag tctcatccta aaaccgcaag tgactcacaa 840
aatgataatg ccttggtcaa tgtggctggc tgtgaagaag tatgcagaaa tgaacaaggg 900
atcacccagt cttgaagacc tcgcagccta ttctggagta agagccttta tggccttcaa 960
tacagcttgc tacatgagta aattcaccat tgggaaggga attgtgggag atgcagagat 1020
catggaaaat ggaaacgaca agatgcaaac tcttgcaatg gcttgttttg gactggcgta 1080
tgaagacacc gggattgttg ctgcaatgat ctcccaaccc atgaagaaaa gatatcagtt 1140
gagagtgggg aacttcaatc ctccagaaga aggaacaata aaaggaacaa gcgccggcta 1200
tttccacaag tgggctgaat ttggaaatag gctgcctttc aacagttttg gaactggtga 1260
atccaaacag ataagcaact caggagtgtt tgcagtgcag aggcccagca ctactaacat 1320
tcaaagactg gcagagctaa tggctaggaa taccggagaa accagcgaca actttactca 1380
gttggttcag aaaataagag aacaagtggg ggcctttgct gatcaaaaag caaatcttcg 1440
agagttcacc ggaggatata tttatgacat tactgacgta acgaagagca accccaagat 1500
acctcagttg ggtggggact ctttcttctt tgaattcacc ggaagcgacg ttccaagaac 1560
tggagccaaa agaagagtgg gaggagctga tgatgtgacc cctggaactt cccagcccaa 1620
gaaaagagga aggcaaggtg ccggagcaga atcaagtatg gacattgaaa cagttggtga 1680
agattaactc atctttggat ggttctgttg cagtccccag tgggtgttaa aggtgttggt 1740
ttgtcttatt taacaaaaaa tctccttgct actg 1774
<210> 13
<211> 1218
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA from influenza D virus
<400> 13
gcagaagcag aggatatttt tgacgcaatg gcacaagaac aactacttgc tgaacttgag 60
ggatacctca gaggagttaa cccaatgacc aggcaaacga ttatgaagtc tgcaagaggt 120
gggatggata gtgctaagga ggcagcaaaa gcagcgaaga agggagaaat gcaactaaca 180
agtggagaga gcatagtggt gcacatatgc ctgagagcca tgtaccctgg aataaagcca 240
tggtcagaag ccaaaaaaga tcttgataaa gctacagaag gactgagtgg aaaagacagc 300
aaaaatataa gaaaagctct gaggaaggca ggagacctga cagggataaa ggagatgatg 360
atgatgtatg aaatgaggga ggacaaaaaa gcagaaatgg tagagcaaat ctacgatgac 420
ccagaggatt ttacagaaga tgtaaggctt gggaccgttg ctgcctggct tcaatgcaaa 480
aacaaaagga gcgagaaata tcatcacaag atgtcaatgt ctggaagcac tgcacttgcc 540
ttgggagatg cccaaaaggc cggaatggcc atagaaaata tggctagtgt tgtgccaatg 600
aaaaaagagg cccaggcact gcacaaagac gcagaagttt tgattgaact ggcaagaata 660
gcatatgggt caagagcaat ggaagggcac ctgcaaaatg caatggacgg aattggaagc 720
aaagtcagtg gaatggctaa tcttgcccta aaaaggtcag ttcttacttt gttaatgttg 780
gtaatttgtg ggatccccac ttgtgtaaat gctgaaactg tggaagaatt ttgtagaaag 840
aaactaaatc agacggaaga aaaggtttat gtccattgtt tcaatgagga tgatggtcgg 900
gcaatgactt tagctgcttt gatacttgga tgctttagta tgctttacat tttaataaag 960
gcaatactga tgcttttgtt gacaatcata aatggaagac caaatggaaa ttgggatgac 1020
ttgaaacatg ttgtaaaatg tttttcagag actggaagtg agaacttcgc cagggatata 1080
atggtcctgg aatccaggcg agatggggag gagacaagct ccccagagga gggactaggc 1140
cctccattga gtggattcaa tgaaaatggt gtattcatgg aaacattata atcgcgaaaa 1200
aatcctcttg ctactgct 1218
<210> 14
<211> 869
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA from influenza D virus
<400> 14
gcagatagca ggggtgtaca atttcaatat gtctgaaaat aagtcagtga acacaacaaa 60
tatcagagca gcaatctccg aattggcatt gggcgcagcc agctggatgg attcctctgg 120
gttaatgact ttcgagaaaa tgagaaagtc tgctgagaat tcactgagag tcgaacaggt 180
ttatgaaccg agaacttggg aagatgcagt ggctgaaggt agagaaattc taggattcac 240
tactattgct gccttaagaa aaccagagga gactcatgct gttgaattgg ggaagaacat 300
tatctatccc ttaggaggaa accctttcta tctaagccca tgtaccattg acactctgta 360
tgagccaaag ctcataagac aaggagaagt ctttggagta aaatatcgga actgcaattg 420
ctttgtaaaa actgctgaac tattagtgac cgacatggga gaaatcattg tgctcttttg 480
cagaaacact gagaaaccag cttactgcct taagaatttc cgtagaggag atgacccaga 540
gaagtcagta cgaaagatac tcagaatttg gagaagtgga cttgttgttg ccgttgatgc 600
ggaatctaga gatgaaatca gacgatacaa atctggatgt gaaacagatc ccttctggag 660
aagagaaggc gcaactactg gagaggttca ggagttgctt ggtgtcatta ataaggttga 720
aatccaagct gggagtagcg atggtgaact ctttgactaa ccaggatatg agggccgctt 780
tggatgaaat caagtcagtt tcgagaacaa tttcaatgtt aaaagaatgt attcgttctt 840
tagtatgaaa aaaccccttg atatctgct 869
<210> 15
<211> 2364
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA from influenza D virus
<400> 15
agcagaagca gaggatgtca ctactattaa cgctcgcaaa agagtatgca aatctcacaa 60
aggataagaa atcatgcaaa ttgctgtcgc aagggaccgt gtcaagctac accactttta 120
agaaatggac aacatcgaga aaagagaaaa acccatccct tcgaatgaga tgggcaatgg 180
gatctaagtt tccgataatg gctaatagag aaatactcga agaggcaggg atacccgaac 240
aatgggaagg tatagatcta tggagtaaaa aagacgatgt gtctaagtta gggatggtgt 300
tagcgtcacc tgcagcaata acgtattgga atttttgtgg tccaggagtg gataactcta 360
gcgtaattag ggatgtgtat aaagcgaaat ttatgaaaaa agagagatgg agagagacac 420
tatggggtcc tatgaatttc gaactcgtag ggaaacaacg gagagtagta gaaacgcaac 480
ccgttgagat aaaactgaat caaaaagaga taaaggaatt gactatgtgg gtgctattcg 540
aagacgaagc gaatctggct agtaaattta tacaggaaaa ctttagctta gtgttgtcac 600
ttagggaatt gtataagggg aaggcagtga ataaagacgt agcagcattt atgatagcac 660
accaatttag tcccgaaaaa agattcttac ctacattcgg acctattaga cccgaaagaa 720
tggaattgtt gcattgctta gggggggatt tttggaaaat cgaagcggtt accgcaggat 780
cacttaacga ggagcagaaa aaaagagacg ttagggcagt cgctagaaag atatgcctta 840
gagctagcgt tgatctgttt acacctgccg aaaaaattag ggattacata tctagcgtta 900
ctatgagatt cggaacagtc gaaagaacat tcgaagacgt aattaggaat agcgatgata 960
taagcgcaga agtgacacta tgtaaagcag cattaggttg cgaattgggg aagtctatgt 1020
cattcggaaa tcttaacctt agaaaggtta gcggagaagc cgaaactatc gaaaaaacag 1080
tgtattgggg acttaagcct ataaaatata aatgttggag aggcgaagag acattctatt 1140
gcgaacttag aaaagtgaca tgcatgttta gacgatccga agggttagat tgggctaaca 1200
tagggccagg atcacccgaa gagagaaggg aattgctcgc aatggttatg atattttgta 1260
gagacggaag atttttcgaa agcgcaccag tgaatataga cgaatcattt tttagaacta 1320
gacttaacaa agagatacca taccaatacg tactgcttaa atgggttagg caatctaggg 1380
ataacttaga cgcactattg tcaactaggg gactgatacc cgcacatata gggcaattcg 1440
gaaagggaat ggggatagac ggatctagta gtagttctat ggtgtataag ggagtgatgc 1500
tatctaagac acctatcgat atagtcgaat cgaaagagaa acatagattg ttccttaacg 1560
ataacataga ggcaataacc gaaagaggcg caatggttgc gtcaattatg gatcttagcg 1620
aagataatag ggaaactttt aacgatgtga cattcaatca cgttgatcta gccgtactga 1680
aagacgaaaa aactgcgata attaagatat atagatcact agtcgaaaga ataaatactg 1740
acgatgacgg actgccagca ctgataatgg gaaagagata tctcgaattg tatcaattgg 1800
acgaagtgaa agacgccgtg ggactgatac ctaaaagaat gttaggcgca tactcatatc 1860
aggctagaca attgatacaa tcgcaaatta aaaacgatag ttatagtctg ccagagataa 1920
taaaactgtt accattttgt tatagtccac ctaaaaaaat gctattcgac ggaacttttc 1980
actttaaaaa ccaaatgtac gttagaccag ggataaatac taatctgttt agcttttcga 2040
aaaccgataa gtctaagata tacgttaacg gatccgcagt taagataaag ttagtgttag 2100
gcgatgacga aatggatact agtctcgcat tcgttgaggg atttcaggtc tgcgaatacg 2160
atcctagagc accactgata ccaagaagag atttgagact gattgggttc ggaaagaaag 2220
ttagagtttt tgttggtcag ggacaggaga aaaccctggt gaggacgagc tccaaaagag 2280
ccgcctccca tgatgtaagc aaaaacattc gtagaatgcg tctggaagtt tgaagcacat 2340
tgaaaaaatc ctcttgctac tgct 2364
<210> 16
<211> 2330
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA from influenza D virus
<400> 16
agcagaagca gaggatttta taacaatgga aataaaccca tatctactca tgttaaacaa 60
tgatataacg tcaatgatat cattgacata cccatacact ggggcacctc ctatgtcaca 120
tggaacatcg accaaatact caatggagac tgtgtcaaga acttactcct acagtagaac 180
taaaaaagag gtaccttcgg gaatattccc aataaagaga aggaaattct gtaacacaat 240
agaagacaaa gaaaacctgg aaaaaccgaa tggaaatgtt gatataaatt tcatgttatc 300
gttagccgaa atgttagagg aaaaaatggg aaagggtttc tttaaatttt gcgctaacga 360
agccgaagcc gaaatactga aaatgcactt tagcaagttg accgaaggta gacagacata 420
cgattggact agtgaacgaa atatgccagc cgcaaccgca ttgcaattga cagtcgacgc 480
tatacaggaa acacagggga cattcaaagg gactactatg gtcgaatact gtaataagat 540
actcgaaatg atggattggc ctgaagtgaa attcaaaaaa gttagaatga tagtgcaacg 600
acattgggat cctaagacta aaaaagagat taaaatgaaa agtcctacat tgatgattac 660
gaaaatcgga agagaggaat tcataaaaag gatatgcaca atcaatacta tggctaaaga 720
cggagagaga gggaagtaca aaagaagggc aatcgctaca cctggaatgg ggattaggcc 780
attctctaag atagtcgaaa cattagcgca aaagatatgc gaaaggttag ccgaatccgg 840
attgcccgta gggggaaacg aaaaaaaggc taagcttaag actaccgtta gtagtactaa 900
ctctaagttg caggaagggc aatttatggt taacataaca ggcgataact caaaatggaa 960
cgaatgccag caaccggaag catacttagc tatgttggca tacataacga aagactcatc 1020
taaccttatg aaagacctat gtagcgttgc gccaacattg ttttgcaata aatacgttaa 1080
gatgggacag gggtttaggg ctaaaaacaa acgaaaaact aaagagatag tgatacccgc 1140
taagagaatg aaagagagaa aagagttgat gaacgctgaa tggagagacc tattcgaaac 1200
aatcgaacca tacatggacg gagagtgttg tttcttagga ggggggatgt tgatgggaat 1260
gttcaatatg ctatcaaccg tattcggagt tatgacactt aactataggg aagaggcact 1320
agctagacga aattgttatt ggacagggtt gcaatctagc gacgatttcg tactgttttg 1380
catatctaag acatggcctg aaatggaaat gacaatactg aaattcatag ccgtatgcaa 1440
attgatgggg attaacatgt cactcgaaaa atcatacgga tgcttacccg aattgttcga 1500
attcacttca atgtttttta gcggagattt cgtttcgaat atcgcactcg aattgcctgc 1560
attcactacc gcaggaatga acgagggaac cgatttcaca gccgcaatgt ccgttattag 1620
gactaacatg attaataacg gactgtcacc aggaaccgca ttgatggcac ttaggatatg 1680
cttgcaggaa tttagggcta catacagagt gcatccatac gatagcggag tgaaaaacca 1740
tagaatgaaa attattagga aatttatcga aacaatcgaa aacaaagacg gactattgat 1800
tagcgacgga gggaaattga tgaataacat atctagtcta cacatacccg aagagatact 1860
gaaagaggat ctgatggacc catcatatag gaatagggtt tttaacccta gaaacccatt 1920
tacgcaattc gaaaagacag tcgacatatt caaagctagc ggacctatta gggtcgaaga 1980
gaacgaagcc gttgtgtcaa cacactcatt caaaactagg tctaatagga cactactgaa 2040
taccgatatg agagctatgg cactcgaaga gaaaagatac caagtcgtat gcaatatgta 2100
tagatccgta ttcgaatccg cagacgttaa cacacctatc ggatcaatgt cgatgggaga 2160
ggcaattgaa gccaaaatcc ttgaccgggc cagaacccag tttgaaaatg gaatcatagg 2220
gggagaagaa tattctgaaa tcaaaagact aatcgaggac gccaagcgtc aacgactgtc 2280
tgtttaagct ttgcgttgtt taataacaga aaaatcctct tgctactgct 2330
<210> 17
<211> 2195
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA from influenza D virus
<400> 17
agcagaagca ggagatttag aaatgtctag tgtaatcaga gaaatcgcaa agcgattctt 60
ggaacaagca acgataaaca tcgctgaaga agtggtcaga gaatatggag accatgaaag 120
aacaatgata tctgttggag ttcatttcca agcttgctgc cttataagtg atgaatatac 180
cttggaggac gaaactacac ctagatacgt actgttggag ggattgagac ggcaagaggc 240
aatatccaaa cagaataaca tttgttcaac attggggttg gaacccctta gaaacctagc 300
cgatatattc gatagaaaga ctaggagatt cttagagata gggattacga aaagggaatc 360
cgacgaatat tatcaagaga aattcaataa gatagggaac gatatggaca tacatgtgtt 420
tacatacgaa gggaaatatt tttccaataa ccctaacgga ttggaagaca tacaaaaaac 480
taggattttt acattcctat cattcgtttc cgacgaattg agaaaagaga atatgtttac 540
ggaaatgtac gttaccgaag agggagcacc cgaactcgaa atgtataagt ctaagttgtt 600
catagctatg agagacgaat ccgttccctt accctatatt aattacgaac atcttagaac 660
tagatgcgaa acattcaaac ggaatcaggc agaatgcgaa gctaaagtgg cagacgtagc 720
tagcagactg aaaattaagc ttgagcatct cgaagagaat aagcttagac ccttagagat 780
accgaaagag aaagaggcac catatacaca taagtttatg atgaaagacg catggttttt 840
cgctaaacca cacgattccg aaagagcgca accgcaacag atactatacg attttttcga 900
agcagctaat atggggttta tgacaacatc ccctaagcct atattcggaa aacagggatt 960
gatgtatcat agcctatggg ggcaaattaa gagagcaatt aaggataaga gaaacgaact 1020
cgaacctagc gaacagagag actttctttg cggaataggg agagctagca aaaagataca 1080
agaggataaa tggcaagagt ctagggaaga ggaattcaaa caggaagaga ctaagggagc 1140
agctaaaagg gggtttccga catggtttaa cgaagaatgg ttatgggcta tgagggatag 1200
cggagacgga gacaataaga taggcgattg gatacctatg gccgaaatgc caccatgtaa 1260
aaacgaaatg gaggattacg ctaaaaaaat gtgcgaagag ttagagtcta agatacaggg 1320
aactaattgc gctagggaaa tgtcaaaact gatacataca atagggtcat tgcatacaga 1380
gtgtagaaac tttcccggaa aggttaagat agtgccaatt tattgtagag ggacacttag 1440
gggggaatca actgattgcc tattcggaat cgcaattaag ggaaaatccc atcttaacaa 1500
agacgacgga atgtatacag ttgtgacatt cgaattctca actgaggaac ctaatccctc 1560
aaaacacgaa aagtatacgg tattcgaagc aggaacagtg ccagtcgaag ccgtagtgtt 1620
gacacctaag agagagagag tgcttaaaga gaaaaaattg tttttgtatt gtagaacaac 1680
agggatgtca aaactgaaaa acgattggtt ttcgaaatgt agacgatgtc tgataccgac 1740
aatggagaca gtcgaacaga tagtgcttaa ggaatgcgca cttaaggaag agaatagggt 1800
tagcgaaatg cttgagaata agagagcatg gatcgcacac gaaaacggag agaatctgac 1860
tagattggtg tcaactaagc ttaaagacct atgtagaatg ttgatagtga cacaattcta 1920
ttattgtata tataacgata accaattgga ggggttttgt aacgaacaga aaaaattcct 1980
tatgtttttg caggcagata aggattccaa atccgcattt acttttaatc agaaagggtt 2040
atatgaaaaa attgaagagt gtattgtcag caatccatta tgtattttcc tagctgatag 2100
gctgaacaaa ttatttcttg tagccaagtc caatggagct aagtactttg aatgaccaaa 2160
ggccttgtaa tgttaaaaat ctccttgcta ctgct 2195
<210> 18
<211> 2049
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA from influenza D virus
<400> 18
agcagaagca ggagattttc aaagatgttt ttgcttctag caacaattac agcaataact 60
gcttgccaag cagaaagaga actgatatgt atagtgcaaa gagtgaatga aagcttctct 120
cttcactctg ggttcggtgg taacgtatac tctatgaaaa ccgaacctat gacagggttt 180
actaacgtta ctaagggggc tagtgtaatt aaccaaaagg attgggtcgg gttcggagac 240
tctaggaccg atcttactaa cgcacaattt cccgcatcat ctgacgtacc attagcagtc 300
gcaaaaaaat ttagatcgct atctggagca tcacttatgc ttagcgcatt cggcccacca 360
ggaaaggttg actatttgta tcagggatgt ggaaaggaaa aagtgtttta cgaaggagtt 420
aattggtcac ctgaagccgg catcgattgt ttcggatcta attggacaca aactaaaaaa 480
gacttttact ctagaatata cgaagccgct aggggatcga catgcatgac attggttaac 540
tcacttgaca ctaagattag ttcgaaaacc gctacagccg gaactactag ttcatgttca 600
tctagttgga tgaaatcacc attgtggtat gctgaatcta gcgttaaccc aggagctagg 660
ccgcaagcat gcggcactga gcaatccgct acatttacat tgcctacatc attcggaata 720
tataagtgta ataagcatgt agtgcaattg tgttatttcg tatacgaaaa caaaaccgca 780
ttcaatacgt taggttgcgg agactattat cagaattatt acgacggaaa cggaaacctc 840
gtggggggaa tggacaatag agtcgcagca tataggggga tagccggatc aggagttaaa 900
atcgaatgcc ctagcaagat acttaatccc ggcacatact caattaggtc tacacctaaa 960
tttctgttag tgcctaagag gtcatattgt ttcgatacag acggagggta tccgatacag 1020
gtagtgcaat ccgaatggtc agctagtaga agatccgata acgcaaccga agaggcatgc 1080
ttgcagactg agggatgtat ttttattaaa aaaactacac catacgtagg agaagcagac 1140
gataatcatg gcgatatcga aatgagacaa ttgttgtcag ggttagggaa taacgatacc 1200
gtatgcgttt cgcaatctgg gtatactaaa ggcgaaacac cattcgttaa ggattatctg 1260
tcaccaccta aatacggtag atgtcaattg aaaaccgata gcggcagaat acctacattg 1320
cctagcggat tgattatacc gcaagccgga actgactcac ttatgcggac attgacacct 1380
gcaactcgaa tattcggaat agacgattta gtgttcggac tattgttcat agggttcgtt 1440
gcaggaggcg tcgcaggggg gtatttttgg ggtagatcta gcggaggggg agggggagct 1500
agcgttagta gtacacaagc cggattcgat aagataggga aggatataca gcaacttagg 1560
aacgatacta acgcagcaat cgaagggttt aacggtagaa tcgcacatga cgaacaggca 1620
attaagaatc tcgctaaaga gatagaggac gctagagccg aagcactcgt aggcgaattg 1680
gggataatta gatcattgat cgttgcgaat atatctatga atcttaaaga gtcactatac 1740
gaactagcta accaaattac gaaaagagga gggggaatcg cacaagaggc aggacctgga 1800
tgttggtatg ttgatagcga aaattgcgac gctagttgta aagagtatat ttttaacttt 1860
aacggatccg caacagtgcc tacacttagg ccagtcgata ctaacgtagt gattactagt 1920
gatccttatt acttgggctc gaccatagct ctctgtcttt tgggtctgat ggcgattgct 1980
gcttttgttg gtgtgagttg gatctgttgc aagaaataga atcttagaaa aaatctcctt 2040
gctactgct 2049
<210> 19
<211> 1775
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA from influenza D virus
<400> 19
agcagaagca ggagattatt aagcaatatg gactcaacaa aagcccaaac gcctgaagaa 60
caaagagcaa agaatgccaa aaccatcctt gagaacatac agatatatga aaggatgtgt 120
gatctctttg gagttagtga agacgataaa ttgataatag aaaactcaat tagtatcgaa 180
agaatgatta gggtggtgac cgataaaaag tatcaggata agaaactgaa aaacgcaggt 240
tccgatctgg aaaaaatcgc taacgcaggg aaggtgtttt gtagactggt ggagtcaact 300
gccggaaagt gtagcgctag actgggaatg gcacttaagc ctaacgttga ggcagtgttg 360
actgacgtac tgggtaacga actcgatagg gccgcagtgt tgggaaagag aatgggtttt 420
accgctatgt tcaaatctaa tctcgaagag gttctgtatc agagagggaa gaaccaactg 480
aaaaagagaa acgctgcaga gacattcaca ctgtcacagg gtgctagtct tgaggctagg 540
tttagaccaa ttatggagaa acacctaggg gttggaaccg tagtcgctag tattaagaat 600
atactcgcta gcaagaaaaa cggtaactat aggaataaga tggttaggaa acccggaggg 660
aatagggagt catggtcacc ccttgagaga gagattagct ttctgaataa aaaactgttt 720
cccggaccta tgcgacaatt gtgcaaaaaa ttcgaatacc ttaacgatca ggaaaagcaa 780
ttggcattga accttatgct tgacgctagt ctgatactga aaccacaagt gacacataag 840
atgattatgc catggtcaat gtggttagcc gttaagaaat acgctgagat gaataaggga 900
tcaccctcac tcgaagacct agccgcatat tccggcgtga gagcgtttat ggcattcaat 960
accgcatgct atatgtcaaa gtttactatc ggaaagggga tcgtgggaga cgcagagatt 1020
atggaaaacg gaaacgataa gatgcagaca ctagctatgg catgcttcgg actggcatac 1080
gaagataccg gaatagtggc agcaatgata tcccaaccta tgaaaaaacg ttatcaattg 1140
agagttggaa actttaaccc acccgaagag ggaactatta agggaactag cgcagggtat 1200
tttcacaaat gggccgaatt cggaaataga ctgccattca atagtttcgg aactggagaa 1260
tcgaaacaga ttagcaatag cggagtgttc gcagtgcaac gacctagtac tactaacata 1320
cagagactag ccgaattgat ggctaggaat accggagaga ctagcgataa ctttacgcaa 1380
ttggtgcaaa agattaggga acaggttgga acattcgcag accaaaaggc taaccttagg 1440
gaattcacag gggggtatat atacgatata actgacgtta ctaagtctaa ccctaagata 1500
ccccaactcg ggggggattc attctttttc gaatttaccg gatccgacgt acctagaacc 1560
ggagcgaaaa gaagggttgg gggggcagac gacgttactc ccggaactag ccaacctaaa 1620
aaaaggggga gacagggagc cggagcagaa tcaagtatgg acattgaaac agttggtgaa 1680
gattaactct tctttggatg gttctgttgc agtccccagt gggtgttaaa ggtgttggtt 1740
tgtcttattt aacaaaaaat ctccttgcta ctgct 1775
<---

Claims (16)

1. Иммуногенная композиция против инфекции дыхательных путей, вызываемой вирусом гриппа D, и инфекции Mannheimia haemolytica, содержащая антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica.
2. Иммуногенная композиция по п. 1, отличающаяся тем, что антиген Mannheimia haemolytica выбран из группы из инактивированной бактерии, экстракта белков наружной мембраны и рекомбинантного лейкотоксина и любой их комбинации.
3. Иммуногенная композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота представляет собой инактивированный вирус.
4. Иммуногенная композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота представляет собой модифицированный живой вирус.
5. Иммуногенная композиция по п. 4, отличающаяся тем, что антиген модифицированного живого вируса гриппа D крупного рогатого скота представляет собой модифицированный живой вирус, модифицированный путем деоптимизации кодонов.
6. Иммуногенная композиция по п. 4, отличающаяся тем, что антиген модифицированного живого вируса гриппа D крупного рогатого скота содержит по меньшей мере один кодон-деоптимизированный геномный сегмент, имеющий последовательность кДНК, выбранную из группы SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 и SEQ ID NO:19.
7. Вакцина против респираторного заболевания крупного рогатого скота, вызываемого вирусом гриппа D и Mannheimia haemolytica, содержащая антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica и фармацевтически приемлемый наполнитель, стабилизатор, солюбилизатор или разбавитель и необязательно адъювант.
8. Вакцина по п. 7, дополнительно содержащая по меньшей мере один антиген из дополнительного патогена крупного рогатого скота.
9. Вакцина по п. 8, отличающаяся тем, что дополнительный патоген крупного рогатого скота выбран из группы из вируса вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота (BRSV), герпесвируса крупного рогатого скота (BHV), вируса парагриппа 3 (PI3), Pasteurella multocida, видов Leptospira и Histophilus somni, а также любой их комбинации.
10. Способ лечения респираторного заболевания крупного рогатого скота, вызываемого вирусом гриппа D и Mannheimia haemolytica, включающий введение крупному рогатому скоту иммуногенной композиции по пп. 1-6 или вакцины по пп. 7-9.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что введение осуществляют перорально, интраназально, интратрахеально или путем инъекции.
12. Применение комбинации антигена вируса гриппа D крупного рогатого скота и антигена Mannheimia haemolytica при лечении респираторного заболевания крупного рогатого скота, вызываемого вирусом гриппа D и Mannheimia haemolytica.
13. Применение антигена вируса гриппа D крупного рогатого скота и антигена Mannheimia haemolytica при производстве лекарственного средства от респираторного заболевания крупного рогатого скота, вызываемого вирусом гриппа D и Mannheimia haemolytica.
14. Композиция, содержащая антиген вируса гриппа D крупного рогатого скота и антиген Mannheimia haemolytica, для применения при лечении, снижении степени или предотвращении респираторного заболевания крупного рогатого скота, вызываемого вирусом гриппа D и Mannheimia haemolytica, у крупного рогатого скота.
15. Применение иммуногенной композиции по пп. 1-6 или вакцины по пп. 7-9 при лечении респираторного заболевания крупного рогатого скота, вызываемого вирусом гриппа D и Mannheimia haemolytica.
16. Применение иммуногенной композиции по пп. 1-6 или вакцины по пп. 7-9 при производстве лекарственного средства от респираторного заболевания крупного рогатого скота, вызываемого вирусом гриппа D и Mannheimia haemolytica.
RU2019132984A 2017-05-05 2018-04-27 Вакцина против респираторного заболевания крупного рогатого скота RU2762938C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762502004P 2017-05-05 2017-05-05
US62/502,004 2017-05-05
PCT/US2018/029759 WO2018204178A1 (en) 2017-05-05 2018-04-27 Bovine respiratory disease vaccine

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2019132984A RU2019132984A (ru) 2021-06-07
RU2019132984A3 RU2019132984A3 (ru) 2021-06-07
RU2762938C2 true RU2762938C2 (ru) 2021-12-24

Family

ID=62165675

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019132984A RU2762938C2 (ru) 2017-05-05 2018-04-27 Вакцина против респираторного заболевания крупного рогатого скота

Country Status (12)

Country Link
US (1) US11439701B2 (ru)
EP (1) EP3618858A1 (ru)
JP (2) JP7341120B2 (ru)
CN (1) CN110545839A (ru)
AR (1) AR111770A1 (ru)
AU (1) AU2018262481B2 (ru)
BR (1) BR112019020635A2 (ru)
CA (1) CA3060122A1 (ru)
MX (1) MX2019013154A (ru)
NZ (1) NZ757651A (ru)
RU (1) RU2762938C2 (ru)
WO (1) WO2018204178A1 (ru)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020102366A1 (en) * 2018-11-14 2020-05-22 The Regents Of The University Of California Methods of determining the risk of bovine respiratory disease in pre-weaned dairy calves
CN113552191B (zh) * 2021-07-28 2023-11-21 江苏师范大学 基于多层dna放大回路检测甲基化dna的比例型电化学传感器的构建方法
CN116785420B (zh) * 2023-08-21 2023-11-14 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 一种牛病毒性腹泻病毒的mRNA疫苗及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2403061C1 (ru) * 2009-06-29 2010-11-10 Автономная некоммерческая организация "Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных" (АНО "НИИ ДПБ") Вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной болезни, вирусной диареи и пастереллеза крупного рогатого скота

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2587084C (en) 2004-10-08 2019-07-16 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Modulation of replicative fitness by using less frequently used synonym ous codons
EP4368202A2 (en) 2007-03-30 2024-05-15 The Research Foundation for The State University of New York Attenuated viruses useful for vaccines
TWI396547B (zh) * 2009-09-02 2013-05-21 Univ Nat Pingtung Sci & Tech 溶血性曼哈米亞桿菌疫苗
US9278999B2 (en) 2012-01-27 2016-03-08 Newport Laboratories Influenza C virus and vaccine
MX2015000789A (es) 2012-07-19 2015-05-07 Zoetis Llc Composiciones de virus de la gripe bovina.
US10316294B2 (en) 2013-03-15 2019-06-11 The Research Foundation For The State University Of New York Attenuated influenza viruses and vaccines
US20180326040A1 (en) 2015-11-16 2018-11-15 Kansas State University Research Foundation Influenza virus vaccine and vaccine platform

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2403061C1 (ru) * 2009-06-29 2010-11-10 Автономная некоммерческая организация "Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных" (АНО "НИИ ДПБ") Вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной болезни, вирусной диареи и пастереллеза крупного рогатого скота

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAUSE B.M., et al. " An inactivated influenza D virus vaccine partially protects cattle from respiratory disease caused by homologous challenge", Veterinary Microbiology. 2017; 199:47-53; DOI: 10.1016/j.vetmic.2016.12.024; abstract, стр.49,52,53. *
HAUSE B.M., et al. " An inactivated influenza D virus vaccine partially protects cattle from respiratory disease caused by homologous challenge", Veterinary Microbiology. 2017; 199:47-53; DOI: 10.1016/j.vetmic.2016.12.024; abstract, стр.49,52,53. TUCCI P., et al. " Identification of Leukotoxin and other vaccine candidate proteins in a Mannheimia haemolytica commercial antigen", Heliyon. 2016; e00158$ DOI: 10.1016/j.heliyon.2016.e00158; abstract. Глобальная инициатива по безопасности вакцин https://www.who.int/vaccine_safety/initiative/en/. *
LUCAS FERGUSON, et al, Pathogenesis of influenza D virus in cattle, Journal of virology, june 2016, volume 90, N12, p. 5636-5642. *
SAHLU AYALEW, et al, Mannheimia haemolytica chimeric protein vaccine composed of the major surface-exposed epitope of outer membrane lipoprotein PlpE and the neutralizing epitope of leukotoxin, Vaccine 26 (2008), 4955-4961. *
SAHLU AYALEW, et al, Mannheimia haemolytica chimeric protein vaccine composed of the major surface-exposed epitope of outer membrane lipoprotein PlpE and the neutralizing epitope of leukotoxin, Vaccine 26 (2008), 4955-4961. LUCAS FERGUSON, et al, Pathogenesis of influenza D virus in cattle, Journal of virology, june 2016, volume 90, N12, p. 5636-5642. *
TUCCI P., et al. " Identification of Leukotoxin and other vaccine candidate proteins in a Mannheimia haemolytica commercial antigen", Heliyon. 2016; e00158$ DOI: 10.1016/j.heliyon.2016.e00158; abstract. Глобальная инициатива по безопасности вакцин https://www.who.int/vaccine_safety/initiative/en/. *

Also Published As

Publication number Publication date
US20210338799A1 (en) 2021-11-04
JP2020516691A (ja) 2020-06-11
CN110545839A (zh) 2019-12-06
BR112019020635A2 (pt) 2020-04-22
AR111770A1 (es) 2019-08-21
RU2019132984A (ru) 2021-06-07
EP3618858A1 (en) 2020-03-11
CA3060122A1 (en) 2018-11-08
AU2018262481A1 (en) 2019-10-17
NZ757651A (en) 2022-07-01
WO2018204178A1 (en) 2018-11-08
MX2019013154A (es) 2020-02-05
JP7341120B2 (ja) 2023-09-08
RU2019132984A3 (ru) 2021-06-07
US11439701B2 (en) 2022-09-13
JP2022070898A (ja) 2022-05-13
AU2018262481B2 (en) 2021-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4667507B2 (ja) イヌインフルエンザを治療するワクチンおよび方法
US10905756B2 (en) Bivalent swine influenza virus vaccine
RU2762938C2 (ru) Вакцина против респираторного заболевания крупного рогатого скота
IL226253A (en) Canine / Miami / 05/05 influenza virus capable of infecting canine animals and methods used
JP5087604B2 (ja) 家禽類の疾病の原因である新規バクテリアおよびそれに由来するワクチン
CN107375922B (zh) 一种水溶性复合免疫佐剂及猪圆环病毒病疫苗
KR20130109220A (ko) 1b형 소 바이러스성 설사 바이러스 백신 조성물 및 방법
US9296991B2 (en) Infectious bronchitis vaccines derived from IB-QX-like vaccine strains
CN115322972B (zh) 一株h9亚型禽流感病毒分离株及其应用
EA032284B1 (ru) Вакцинация респираторным коронавирусом собак для защиты от инфекций в. bronchiseptica
CN114573708B (zh) 副鸡禽杆菌ha融合蛋白及其三聚体、制备的疫苗组合物、制备方法和应用
RU2553222C2 (ru) Композиции для лечения и предупреждения комплекса респираторных заболеваний собак
WO2021105167A1 (en) Triple vaccine against avibacterium paragallinarum and avian encephalomyelitis virus and fowl pox virus
AU2016203333A1 (en) Infectious bronchitis vaccines derived from IB-QX-like strains
CN110713987A (zh) 一种重组基因vii型新城疫病毒毒株及其疫苗组合物、制备方法及应用
KR20200061508A (ko) 약독화된 조류메타뉴모바이러스 주 및 이를 포함하는 백신 조성물
WO2023196374A1 (en) Live mycoplasma gallisepticum vaccines
KR20120082796A (ko) 고양이에게 감염성을 갖는 인플루엔자 바이러스 및 그의 용도
Bakri et al. MONITORING OF MYCOPLASMA GALLISEPTICUM LIVE VACCINE-K STRAIN
AU2013260726A1 (en) Infectious bronchitis vaccines derived from IB-QX-like strains
CN103354746A (zh) 用于牛免疫接种的组合物和方法