CN103354746A - 用于牛免疫接种的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供通过使用问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)免疫接种牛，特别是奶牛和小母牛，以抵御博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)的组合物、其用途以及方法。

Description

用于牛免疫接种的组合物和方法

发明背景

技术领域

本发明涉及通过使用问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)哈勒焦(hardjo)血清型(hardjoprajitno型)免疫接种牛(特别是奶牛和小母牛)以抵御博氏钩端螺旋体(Leptospira borgpetersenii)哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)的组合物、其用途和方法。

现有技术

钩端螺旋体病是世界上最流行的人畜共患疾病。它会影响大多数哺乳动物而且是世界各地牛繁殖失败的一个重要原因(参见Faine等，1999；Heathand Johnson，1994)。钩端螺旋体是革兰氏阴性的螺旋状细菌，分为至少12个致病种和4个腐生种，具有超过250种致病性血清变型。这种细菌可在环境中存活长达半年，尤其是在碱性土壤(pH7.2-8.0)和温暖湿润的环境中。这种细菌很少在干燥或极端寒冷的条件下生存(参见Faine等，1999；Heath andJohnson，1994)。

致病种以寄存宿主肾小管的慢性感染持续存在，有时会导致很少的疾病或不会致病。传染是通过直接接触受感染的尿液或通过接触被受感染的尿液污染的饲料或铺垫而传染。在牛中，该病常见的临床症状包括生殖功能衰竭、弱犊、流产、死胎、干尸化和无乳。尿液中细菌的释出的可能会在较长的时间内发生。肾脏病变可能是因感染钩端螺旋体血清型哈勒焦型、波莫纳型和流感伤寒型所致的钩端螺旋体血病(leptospiremia)的直接结果(参见Faine等，1999；Heath and Johnson，1994；Ellis，1994)。

牛是问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)(LHP)和博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)(LHB)的主要寄存宿主库。LHP主要在欧洲被发现，而全世界许多地方的牛的钩端螺旋体病的最常见的病因是LHB。LHB是迄今已从美国的牛分离的唯一的hardjo血清变型。(Bolin等，1989(a).)。

含有钩端螺旋体血清型哈勒焦型(hardjo)、犬型(canicola)、波莫纳型(pomona)、流感伤寒型(grippotyphosa)和出血黄疸型(icterohaemorrhagiae)的全细胞灭活的钩端螺旋体疫苗进行免疫接种，是控制牛钩端螺旋体病的主要手段。因为疫苗制造相关的成本与用于配制疫苗的组分的类型和数量直接相关，人们希望降低疫苗中组分的数量却不损失疫苗效价。本文描述了针对博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)提供保护而在疫苗中不包含哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)的疫苗，以及相关的方法及用途。

发明内容

本发明提供克服现有技术不足之处的免疫原性组合物、疫苗和相关的方法和用途。所述组合物、方法和用途通过免疫接种问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)防止博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染、减少其发病率、和/或减轻其严重程度。

本发明的免疫原性组合物和疫苗包含问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌或能够针对博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)诱发免疫应答的细菌。优选地，该问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)是灭活的一种或多种细菌。

本发明的免疫原性组合物和疫苗还可以进一步包含一种或多种选自传染性牛鼻气管炎(IBR)病毒(Bovine Rhinotracheitis(IBR)virus)、1型和2型牛病毒性腹泻(BVD)病毒(Bovine Virus Diarrhea(BVD)Types1and2)、3型副流感(PI3)病毒(Parainfluenza3(PI3)virus)和牛呼吸道合胞病毒(BRSV)(BovineRespiratory Syncytial Virus(BRSV))的经修饰的活病毒(MLV)。优选的免疫原性组合物和疫苗包含灭活的问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)、经修饰的传染性牛鼻气管炎(IBR)活病毒、经修饰的1型牛病毒性腹泻(BVD)活病毒和经修饰的2型牛病毒性腹泻(BVD)活病毒的组合，例如经批准的市售组合产品

3VL5，Boehringer Ingelheim Vetmedica，Inc.，St.Joseph。本发明的免疫原性组合物和疫苗可能还包含经修饰的牛呼吸道合胞活病毒(BRSV)，或灭活的胎儿弯曲杆菌(Campylobacter Fetus)、睡眠嗜血菌(Haemophilus somnus)和钩端螺旋体血清型犬型、流感伤寒型、哈勒焦型、出血黄疸型和波莫纳型的任一种的组合。

本发明的免疫原性组合物和疫苗在受试者中防止博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染、减少其发病率、和/或减轻其严重程度。优选地，受试者是牛，更优选地，牛是母牛或小母牛(heifer)，最优选地，牛是小母牛。

本发明的免疫原性组合物，其包含至少一种或多种问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌(如本文所定义)，可进一步包含生理上可接受的媒剂，如药学上或兽医学上可接受的载剂、佐剂或其组合。

本文提供的任何问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌或本文提供的包含一种或多种问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌的任何免疫原性组合物可以用作药物，优选作为疫苗或免疫原性组合物，最优选用于预防或治疗针对博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的受试者。

本领域技术人员将理解本文使用的组合物可与已知的可注射的、生理上可接受的无菌溶液混合。为了制备对于非经肠注射或滴注可随时使用的溶液，可使用水性等渗溶液，如生理盐水或血浆蛋白溶液。此外，本发明的免疫原性组合物和疫苗可以包含兽医学上可接受的载剂、稀释剂、等渗剂、稳定剂或佐剂。

本发明还提供用于在受试者中防止博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染、减少其发病率、和/或减轻其严重程度的方法以及本发明的组合物的用途，其包括向受试者施用免疫原性组合物或疫苗，其中所述的免疫原性组合物或疫苗包含问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)。

本发明的方法以及本发明的组合物的用途，其包括但不限于，用于在受试者中针对博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染诱发免疫应答的方法或用途，包括向受试者施用包含一种或多种本文所定义的问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌的免疫原性组合物的步骤。优选地，所引发的免疫应答抵御一种以上的博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)血清型或菌株。本发明的组合物可用于治疗或者预防博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染。优选地，这样的免疫应答降低由一种或多种博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)血清分型感染引起的或与其相关的一种或多种临床症状的发生率或严重程度。

本文中，需要施用本发明的组合物的合适的受试者包括需要预防或治疗病毒、微生物、寄生虫、原生动物、细菌或真菌的相关感染、疾病、或状况的动物和人类。通过使用本发明的组合物或方法刺激免疫应答的的动物包括家畜，例如猪、牛、家禽(例如鸡、鸭、鹅、或火鸡)、山羊、绵羊、和驯养动物，例如小鼠、兔、狗、猫和马。优选的动物包括牛，最优选奶牛和小母牛。

本发明还提供降低由博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染引起的或与其相关的一种或多种临床症状的发生率或严重程度的方法以及本发明的组合物的用途，其包括施用本发明的免疫原性组合物的步骤，所述组合物包含一种或多种如本文所述的问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌和优选地载剂分子，使得相对于未获得本文所述的免疫原性组合物的受试者而言，博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的临床症状的发生率或严重程度降低至少10%，优选至少20%，进一步更优选至少30%，进一步更优选至少50%，还更优选至少70%，和最优选100%。

根据进一步的方面，本发明还涉及预防博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的方法以及本发明的组合物的用途，其包括施用本发明的免疫原性组合物的步骤，所述组合物包含一种或多种本文所述的问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)。

本发明的另一个方面提供生产一种或多种问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌的方法，所述细菌诱导针对至少一种博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)血清型，和更优选两种或多种博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)血清型的免疫应答。该方法包括培养转化的表达载体，所述载剂编码并表达一种或多种本文所述的问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌。表达的细菌或被表达生物保留，或分泌到培养基中。表达在足以产生能够诱导博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)免疫应答的问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌的条件下进行。

制备本发明的组合物的方法还可以进一步包括混合一种或多种问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌和具有生理上可接受的媒剂，如药学上或兽医学上可接受的载剂、佐剂、或其组合的载剂分子。本领域技术人员将认识到，可通过递送路线、个人喜好和动物物种确定媒剂、佐剂或其组合的选择。

在另一个方面，本发明提供了一种诊断受试者中博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的方法，以及本发明的组合物的用途。方法和用途包括：提供一种或多种问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌；将一种或多种问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌与获得自受试者的样品接触；并且如果在样品中检测到能够结合一种或多种问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌的抗体，则确定受试者具有博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染。

本发明还提供一种试剂盒，其包含免疫原性组合物、包装免疫原性组合物的容器、一组印刷说明书、和能够给动物施用免疫原性组合物的分配器(dispenser)，所述免疫组合物包含一种或多种问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌，以及任选地一种载剂分子。任选地，所述一种或多种问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌和载剂分子可以包装在一起，或作为单独的组分包装。当单独提供时，提供混合或结合所述一种或多种问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌和载剂分子的装置，以及合适的印刷说明书。

本发明还提供用于免疫接种动物的试剂盒，其包含：一组印刷说明书；能够给动物施用本文所述的包含一种或多种问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌的免疫原性组合物的分配器；且其中至少一种问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌有效地免疫动物，使其抵御至少一种与博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染相关的疾病。优选地，所述一种或多种问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌选自本文提供的细菌。本发明的试剂盒可进一步包含兽医学上可接受的载剂、佐剂、或其组合。

本发明的试剂盒中的分配器能够将其内容物分散为液滴；当给动物皮下、鼻内、真皮内、或肌内注射施用时，包含在试剂盒中的包含本文所述的问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌的免疫原性组合物能够降低博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的至少一种临床症状的严重程度。优选地，与未处理的受感染动物相比，将临床症状的严重程度降低至少10%，进一步更优选至少20%，进一步更优选至少30%，进一步更优选至少50%，还更优选至少70%，并最优选100%。

同样公开了本发明的组合物用于治疗或预防博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)引起的感染的方法和用途。所述方法和用途包括向受试者施用有效量的一种或多种问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌，其中所述治疗或预防选自：减轻博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的症状，减少博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的临床症状的严重程度或发生率，降低博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的个体死亡率，及其组合。

本发明的组合物进一步包含兽医学上可接受的载剂、佐剂、或其组合。这样的组合物可以用作疫苗并包括减毒疫苗、灭活疫苗、或其组合。这类疫苗针对至少一种与博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染有关的疾病或临床症状引起保护性免疫应答。

本领域技术人员将理解，本文使用的组合物可与已知的可注射的、生理上可接受的无菌溶液混合。为了制备对于非经肠注射或滴注可随时使用的溶液，液体等渗溶液，如生理盐水或血浆蛋白溶液，均可使用。此外，本发明的免疫原性组合物和疫苗可以包含药学上或兽医学上可接受的载剂、稀释剂、等渗剂、稳定剂或佐剂。

本发明的方法和用途也可以包括将本发明的组合物与兽医学上可接受的载剂、佐剂、或其组合混合。本领域技术人员将认识到，可通过递送路线、个人喜好和动物物种确定载剂、佐剂或其组合的选择。

本发明还提供一种用于降低动物中博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染严重程度的方法或用途，其包括对动物施用包含一种或多种问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌的组合物。

同样公开了用于治疗或预防博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)引起的感染的方法，以及本发明的组合物的用途。所述方法包括对动物施用有效量的本发明的一种或多种问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌。

优选的施用途径包括皮下、鼻内、真皮内、和肌内注射。本领域技术人员将认识到，本发明的组合物也可以两种或多种剂量施用，以及通过其他施用途径施用。例如，这样的其它途径包括皮下、皮内、静脉内、血管内、动脉内、腹腔、鞘内、气管、心内、小叶内、髓内、肺内、或阴道内。根据所需的持续时间和治疗效果，本发明的组合物可以一次或数次施用，也可间歇地施用，例如持续数天、数周或数月施用并以不同的剂量施用。

本发明还提供用于接种动物的试剂盒，其包含：一组印刷说明书；能够给动物施用疫苗的分配器；和针对至少一种博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)相关疾病有效地免疫动物的至少一种灭活的问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)细菌。本发明的试剂盒可进一步包含兽医学上可接受的载剂、佐剂、或其组合。

本发明的试剂盒的分配器能够将其内容物分散为液滴；当给动物鼻内、口服、真皮内、或肌内注射施用时，包含在试剂盒中的分离物能够降低博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的至少一种临床症状的严重程度。在某些试剂盒中，分离物还能够降低博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的至少一种临床症状的严重程度。优选地，与未处理的受感染动物相比，将临床症状的严重程度降低至少10%。

本发明的其它目的、特征和优势将从下面的详细描述体现。然而，应该理解，虽然给出了本发明的优选实施例，但详细描述和具体实施例仅以说明的方式给出，因为从这样的详细描述出发，在本发明的精神和范围之内的各种改变和修饰对于本领域技术人员而言是显而易见。

发明详述

本发明提供了通过免疫接种问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)防止博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染、减少其发病率、和/或减轻其严重程度的免疫原性组合物、疫苗、相关方法和用途。

本发明证明了两种不同的组合疫苗的LHP组分抵御LHB攻击(challenge)的能力。攻击后培养结果表明疫苗治疗组(组1和2，实施例1)中接种的小母牛，作为攻击的结果均未被感染(见表2和6，实施例1)。这些结果与安慰剂对照接种的动物(100%的小母牛被感染(见表2、3和5，实施例1))形成了鲜明的对比。

与本文报道的结果相反，以往的研究报道指出，当用LHB攻击接种后的动物时，含有LHP的疫苗针对尿液释出或肾感染没有表现出良好的保护。用于制备疫苗的哈勒焦血清型的细微差别可能部分地导致这种疫苗提供的保护水平。这种差别可能包括原始分离物的差异，以及基于生长和传代方法引起的差异。

在本领域中能够理解，疫苗提供的保护水平不仅依赖于疫苗中包含的生物体的血清型/菌株的特性，而且还依赖于疫苗制剂中使用的佐剂，如果有的话。本文中，使用的疫苗包括佐剂。此外，用于生产菌株的生长和失活条件也可以影响疫苗所提供的功效。血清型差异加上佐剂制剂和产生疫苗的生物可以影响疫苗诱导保护性免疫应答的能力。任何或所有这些因素结合在一起可能会导致他人先前的失败和本发明的成功。

接种经修饰的活病毒/LHP菌素组合和灭活病毒/LHP菌素组合均防止尿液释出，并阻止LHB攻击后的肾脏感染和定居(clonization)。本研究的结果显示测试疫苗的哈勒焦型钩端螺旋体组分高度有效地抵抗肾感染以及由于LHB引起的定居和相关的尿液释出。

本发明的实践中，除非另有说明，采用本领域技能范围内的常规的分子生物学、微生物学、重组DNA技术、蛋白化学和免疫学技术。这些技术在文献中均有完整的解释。例如，参见Sambrook，Fritsch&Maniatis，MolecularCloning:A Laboratory Manual，Vols.I，II and III，Second Edition(1989)；DNACloning，Vols.I and II(D.N.Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait等，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Animal Cell Culture(R.K.Freshney ed.1986)；Immobilized Cells andEnzymes(IRL press，1986)；Perbal，B.，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan eds.，Academic Press，Inc.)；Protein purification methods–a practical approach(E.L.V.Harris和S.Angal，eds.，IRL Press at Oxford University Press)；和Handbook ofExperimental Immunology，Vols.I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell eds.，1986，Blackwell Scientific Publications)。

在详细描述本发明前，应当理解，本发明并不限定于特定的细菌培养物或工艺参数，这些当然会发生变化。也应当理解，本文使用的术语仅是用于描述本发明特定的实施例的目的，并不打算进行限制。必须指出的是，如在本说明书和所附的权利要求书中所用的，单数形式“一”、“一个”、“一种”包括复数对象，除非文中另有明确规定。因此，例如，“疫苗”的含义包括两种或多种抗原的混合物，“免疫原性组合物”的含义包括两种或两种以上免疫原性疫苗成分的混合物，等等。

A.定义

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均与提交申请时本发明所属领域中的技术人员的通常理解具有相同的含义。术语的含义和范围应清楚，然而，在有任何潜在歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外在的定义。此外，除非上下文另有规定，单数术语应包括复数而复数术语应包括单数。本文中，使用“或”是指“和/或”，除非另有说明。此外，使用的术语“包括”以及其他形式(如“含有”和“包含”)不是限制性的。本文提及的所有专利和出版物均引入本文作为参考。

“防止疾病”、“保护性免疫”，“功能性免疫”和类似的短语，是指通过施用本发明的一种或多种治疗性组合物或其组合所产生的对疾病或病症的应答，其导致比在已暴露于疾病或感染而未进行免疫的个体中所预期的更少的有害影响。即，在接种的个体中感染的有害影响的严重程度减轻了。在接种的个体中，感染可能会降低、减慢、或可能完全防止。本文中，当完全预防感染时将会具体声明。如果未声明完全预防，则该术语包括部分预防。

本文中，“临床症状发病率和/或严重程度的降低”或“临床症状的减少”是指(但不限于)与野生型感染相比在一组中感染者的数量减少，表现出感染的临床症状的个体的数目减少或消除，或在一个或多个个体中存在的任何临床症状的严重程度的减少。例如，它应该是指病原体载量、病原体释出的任何减少、病原体传播的减少，或疟疾的任何临床症状的减少。优选地，与不接受组合物进而被感染的受试者相比，在接受本发明的治疗组合物的一个或多个的受试者中这些临床症状减少至少10%。更优选在接受本发明的组合物的受试者中临床症状减少至少20%，优选至少30%，更优选至少40%，和进一步更优选至少50%。

在本文中，术语“增加的保护”是指(但不限于)与非接种对照组的受试者相比，接种组受试者中与感染性病原体(优选博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型))，引起的感染有关的一种或多种临床症状在统计学上显著的降低。术语“临床症状在统计学上显著的降低”是指(但不限于)在传染性病原体攻击后，在接种组受试者中至少一种临床症状的发生频率低于未接种对照组至少10%，优选20%，更优选30%，进一步更优选50%，和进一步更优选70%。

“持久的保护”是指“提高的效力”持续至少3周，但更优选至少3、4、5、6或7个月，还更优选8、9、10、11、或12个月，还更优选13、14、15、16、17、或18个月，最优选19个月或更长的时间。对于家畜而言最优选的是，持久的保护将继续到销售动物肉的平均年龄。在小母牛或奶牛的情况下最优选的是持久的保护应继续到动物不再生育并被销售的平均年龄。

“免疫原性组合物或免疫组合物”是指包含至少一种问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)或其免疫原性部分的组合物，其在宿主内针对该组合物引起细胞免疫应答或抗体介导的免疫应答。在本发明的一个优选实施方案中，免疫原性组合物诱导免疫应答并且，更优选地，赋予针对博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染引起一种或多种临床症状的保护性免疫。

“免疫应答”或“免疫学反应”是指(但不限于)响应于组合物或疫苗而产生的细胞免疫和/或抗体介导的免疫应答。通常，免疫应答或免疫学反应包括(但不限于)一种或多种以下效应：特异性针对包括在感兴趣的组合物或疫苗中的抗原，产生或激活抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞。优选地，宿主将增强治疗性或保护性免疫(记忆)反应，使得抵御新感染和/或降低疾病的临床严重程度。将通过症状数目、症状的严重程度的降低，或与病原感染相关的症状中的一种或多种的去除，病毒血症发作的延迟，病毒持续感染的减少，整体病毒载量的降低和/或病毒排出的减少证明这种保护作用。

本文中，“特异性免疫应答性”是指免疫应答性蛋白或多肽能够识别博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的抗原特性，但不与严历攻击对照的抗原特性发生反应。

如本文使用的，“药学或兽医学上可接受的载剂”包括任何以及所有的溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌及抗真菌剂、等渗剂、吸收延缓剂、及类似物。在一些优选的实施方案中，尤其是包括冷冻干燥的免疫原性组合物的那些实施方案中，用于本发明的稳定剂包括冻干或冷冻干燥的稳定剂。

在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含佐剂。本文使用的“佐剂”可包括氢氧化铝和磷酸铝、皂苷、例如Quil A、QS-21(Cambridge BiotechInc.，Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL)、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。乳液可以特别是基于轻质液体石蜡油(欧洲药典型)；异戊二烯油，如角鲨烷或角鲨烯；烯烃(特别是异丁烯或癸烯)低聚产生的油；包含直链烷基的酸或醇的酯，更特别是植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸/癸酸)酯、甘油三(辛酸/癸酸)酯或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。将油与乳化剂联合使用以形成乳液。乳化剂优选的是非离子型表面活性剂，特别是脱水山梨醇、二缩甘露醇(例如油酸脱水甘露醇酯)、乙二醇、聚甘油、丙二醇的酯和任选乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯，和聚氧丙烯-聚氧乙烯聚合物，特别是普朗尼克(Pluronic)产品，特别是L121。参见Hunter等，The Theory and Practical Application of Adjuvants(Ed.Stewart-Tull，D.E.S.)，JohnWiley和Sons，NY，pp51-94(1995)和Todd等，Vaccine15:564-570(1997)。典型的佐剂是“Vaccine Design，The Subunit and Adjuvant Approach”M.Powell和M.Newman编辑，Plenum Press，1995，第147页描述的SPT乳液和同一本书第183页描述的MF59乳液。

佐剂的其他实例是选自以下的化合物：丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，和马来酸酐与链烯基衍生物的共聚物。有利的佐剂化合物是交联的，特别是与糖醇或多元醇的聚烯醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物。这些化合物已知的术语为卡波姆(carbomer)(Phameuropa Vol.8，No.2，June1996)。本领域技术人员也可以参考美国专利第2,909,462号，其描述了这样的与多羟基化合物交联的丙烯酸聚合物，所述多羟基化合物具有至少3个羟基(优选不超过8个)，所述至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团取代的。优选的基团是那些含有2-4个碳原子，例如乙烯基、烯丙基和其它烯类不饱和基团。不饱和基团可以自身含有其它取代基，如甲基。商品名为卡波普(Carbopol；BF Goodrich，Ohio，USA)的产品是特别合适的。它们是与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联的。其中，可提及的有卡波普974P、934P和971P。最优选的是使用卡波普971P。在马来酸酐和链烯基衍生物的共聚物中，共聚物EMA(Monsanto)是马来酸酐和乙烯的共聚物。这些聚合物在水中的溶解产生酸性溶液，其需要中和，优选中和到生理pH条件，以得到合并有免疫原性、免疫学或疫苗组合物的佐剂溶液。

其他合适的佐剂包括(但不限于)RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron，Emeryville CA)、单磷脂酰脂质A、阿夫立定脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌的热不稳定的肠毒素(重组或非重组)、霍乱毒素、IMS1314或胞壁酰二肽、或者天然存在或重组的细胞因子或其类似物或内源性细胞因子释放的刺激物，等等。

据预计，每剂量可以添加佐剂的量为约100μg至约10mg，优选的量为每剂量约100μg至约10mg，更优选的量为每剂量约500μg至约5mg，进一步更优选的量为每剂量约750μg至约2.5mg，最优选的量为每剂量约1mg。另外，佐剂在最终产品体积中的浓度可为0.01-50%，优选在约2%-30%，更优选在约5%-25%，还更优选在约7%-22%，最优选在约10%-20%。

稀释剂可以包括水、生理盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。等渗剂包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖等。稳定剂包括白蛋白和乙二胺四乙酸的碱盐等。

“安全”是指接种后在接种疫苗的动物中没有不良后果，所述不良后果包括但不限于：细菌为基础的疫苗向毒力的潜在逆转，临床上显著的副作用，如持续性、全身性疾病，或疫苗接种部位不可接受的炎症。

如本文使用的术语“接种”或“疫苗接种”或它们的变体，是指(但不限于)包括施用本发明的免疫原性组合物的过程，当给动物施用所述组合物时，在动物中针对博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)直接或间接地引发或者能够引发免疫应答。

在本发明的内容中，“死亡”是指博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染导致的死亡，并包括感染是如此严重以致将动物安乐死以防止痛苦并人道地结束其生命的情况。

“减毒”是指减少病原体的毒力。在本发明中“减毒”与“无毒”是同义的。在本发明中，减毒的细菌是已经将其毒力降低使其不会引起钩端螺旋体病的临床症状，但能够在目标哺乳动物中诱导免疫应答的细菌，但也可指：与经非减毒的问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)感染并且不接受减毒细菌感染的“对照组”动物相比，减毒的问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)感染的动物中的临床症状的发病率和严重程度有所降低。在此内容中，与上文定义的对照组相比，术语“减少/减少的”是指减少至少10%，优选25%，进一步更优选50%，还更优选60%，进一步更优选70%，还更优选80%，进一步更优选90%和最优选100%。因此，减毒的、无毒力的问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)菌株适于掺入包含问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)经修饰的活细菌的免疫原性组合物中。

在本文中，“有效剂量”是指(但不限于)在施用抗原的动物中诱发或者能够诱发使临床症状减少的免疫应答的抗原的量。

如本文使用的术语“有效量”是指，在组合物的内容中，能够诱导免疫应答的免疫原性组合物的量，所述免疫应答在动物中降低感染的发生率、减轻感染的严重程度或降低疾病的发生率。特别是，有效量是指每剂量的菌落形成单位(CFU)。或者，在治疗的内容中，术语“有效量”是指这样的治疗量：足够减少或改善疾病或病症或其一种或多种症状的严重程度和持续时间，防止疾病或病症的进展，引起疾病或病症的消退，防止与疾病或病症相关的一种或多种症状的复发、发展、发病或进展，或增强或改善另一种治疗或治疗剂的预防或治疗。

如本文使用的术语“对博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)的免疫反应性”是指肽或片段针对博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)引发的免疫应答。

B.佐剂

为了进一步提高本文提供的免疫原性组合物的免疫原性，包含一种或多种问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)的组合物可以还包含一种或多种佐剂。

佐剂可通过先前描述的或本领域已知的任何技术进行纯化。优选的纯化技术是硅胶色谱法，特别是如W.Clark Still等，J.Organic Chemistry，43，2923-2925(1978)描述的“闪式”(快速)色谱技术。然而，其他色谱方法，包括HPLC，可用于佐剂纯化。结晶该也可用于纯化佐剂。在某些情况下，因为分析纯的产品是直接从合成得到，故无需纯化。

本发明的疫苗组合物是在适当的无菌条件下，根据产生佐剂组合物的已知技术，通过将佐剂与问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)物理混合制备。结合物上存在净负电荷以被静电吸引到长链烷基化合物佐剂的正电荷上，促进了问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)与佐剂的络合。

据预计，可以添加佐剂的量为每剂量约100μg至约10mg，优选的量为每剂量约100μg至约10mg，更优选的量为每剂量约500μg至约5mg，进一步更优选的量为每剂量约750μg至约2.5mg，最优选的量为每剂量约1mg。另外，佐剂在最终产品体积中的浓度可为0.01-75%的浓度，优选在约2%-30%的浓度，更优选在约5%-25%的浓度，还更优选在约7%-22%的浓度，最优选在约10%-20%的浓度。

C.生理上可接受的媒剂

可以使用那些用于其他药物多肽组合物的类似的技术配制本发明的疫苗组合物。因此，佐剂和问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)可以冻干形式储存并于施用前在生理上可接受的媒剂中重组以形成悬浮液。或者，佐剂和偶联物可存储在媒剂上。优选的媒剂是无菌溶液，特别是无菌缓冲溶液，如磷酸盐缓冲液。结合媒剂上的佐剂和偶联物，使得免疫原性组合物的免疫效果改进的任何方法都是适用的。

本发明的疫苗的单剂量的体积可以变化，但通常将在常规疫苗常用的范围内。以如上所述的偶联物和佐剂的浓度，单剂量的体积优选是在约0.1ml至约3ml之间，优选在约0.2ml至约1.5ml之间，更优选在约0.2ml至约0.5ml之间。

可以通过任何方便的、合适的方式施用本发明的疫苗组合物。

D.制剂

可以将包含问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)的免疫原性组合物用作针对博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)进行免疫的疫苗。在生理上可接受的媒剂中包含免疫原性组合物的疫苗在免疫动物，优选牛，优选奶牛，最优选小母牛，以治疗或预防博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的方法中是非常有用的。

通过用免疫原性组合物免疫而产生的针对本发明的免疫原性组合物的抗体，可以用于被动免疫治疗，并用于产生治疗或预防博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染的抗个体基团抗体。

施用组合物的受试者优选是动物，包括但不限于牛、马、羊、猪、家禽(例如鸡)、山羊、猫、狗、仓鼠、小鼠和大鼠，最优选动物是奶牛或小母牛。

本发明的制剂包含有效免疫量的一种或多种免疫原性组合物或其抗体和生理上可接受的媒剂。疫苗包含有效免疫量的一种或多种免疫原性组合物和生理上可接受的媒剂。制剂应适应于施用方式。

如果需要的话，免疫原性组合物也可以包含少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。免疫原性组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂、或粉末。口服制剂可包含标准的载剂，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

E.有效剂量

本文所述的化合物可以以治疗钩端螺旋体相关疾病的治疗有效剂量施用于受试者。剂量依赖于接受疫苗的宿主以及例如宿主的体型、体重和年龄等因素。

应用于制剂的本发明的免疫原性偶联物或抗体的精确剂量依赖于施用途径和受试者的性质(例如，物种、年龄、体型、疾病的阶段/水平)，并应根据标准的临床技术根据医生的判断和的每个受试者的情况决定。有效免疫量是在受试者中足够治疗或预防博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染性疾病的量。有效剂量也可从来自于动物模型测试系统的剂量-反应曲线推断，并可以在0.001mg/kg-100mg/kg之间变化。

化合物的毒性和疗效可通过在细胞培养或实验动物中标准的药学程序确定，例如LD₅₀(群体的50%致死的剂量)和ED₅₀(在群体的50%中治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，而且它可以表示为LD₅₀/ED₅₀之比。表现出大的治疗指数的化合物是首选的。虽然可以使用具有毒副作用的化合物，应该谨慎设计一种递送系统，所述系统使这样的化合物靶向到受影响的组织位点以减少对未感染细胞的潜在损害并且由此减少副作用。

从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可以用来制定用于动物，特别是牛的剂量范围。这样的化合物的剂量优选在包括很少或没有毒性的ED₅₀的循环浓度的范围内。剂量可以根据使用的剂型和施用途径在此范围内变化。对于本发明的方法中使用的任何化合物，可从细胞培养测定初步估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量以实现包括细胞培养中确定的IC₅₀(即，获得半-最大症状抑制的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围。这样的信息可以用于更准确地确定受试者的有效剂量。可以测量在血浆中的水平，例如通过高效液相色谱法。

可以使用本领域已知的任何免疫测定方法，通过监测测试受试者免疫接种组合物后的免疫应答测定组合物的免疫原性。可将体液(抗体)应答和/或细胞介导的免疫的产生作为免疫应答的指示。测试受试者包括动物，如猪、小鼠、仓鼠、狗、猫、兔、牛、马、羊、家禽(如鸡、鸭、鹅、火鸡）、和人类。

可以通过各种办法测试受试者的免疫应答，例如：如通过已知的技术，例如酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫印迹、免疫沉淀等，分析所得到的免疫血清对免疫原性结合物的反应性；或通过免疫的宿主由本领域已知的任何方法抵御病原体感染和/或使病原体感染引起的症状减轻，以此测定感染性疾病病原体的水平，例如细菌水平(例如通过来自受试者的样品的培养)，或通过本领域中已知的其它技术测定。传染性疾病病原体的水平也可通过测量免疫球蛋白所针对抗原的水平来确定。传染性疾病病原体水平的降低或感染性疾病症状的改善表明组合物是有效的。

可以在动物或人体内使用之前，在体外测试本发明的治疗剂所期望的治疗或预防活性。例如，可用于确定是否施用一种特定治疗剂的体外分析可以包括体外细胞培养分析，在此分析中，将适当细胞(细胞系或从具有特定的疾病或病症的受试者培养而来的细胞)暴露于治疗剂或者对其施用治疗剂，并观察治疗剂对细胞的影响。

另外地，可以通过使治疗剂接触细胞，所述细胞易于传染性疾病病原体感染但没有感染传染性疾病病原体(从受试者或从培养的细胞株培养该细胞)，将细胞暴露于传染病病原体，然后确定与治疗剂接触的细胞的感染率是否低于未与治疗剂接触的细胞的感染率。细胞感染传染性疾病病原体可以通过本领域已知的任何方法测定。

此外，可以通过在治疗之前、期间或之后的合适的时间间隔，测量动物模型或人类受试者中抗体所针对分子的水平来评估治疗。可以确定分子的量有无任何变化，并与受试者的治疗结果相关联。可以通过本领域已知的任何方法确定分子的水平。

使用本发明的方法和组合物用问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)接种动物后，可用本领域已知的任何结合分析评估产生的抗体与特定分子之间的结合。这些分析方法也可以用来筛选对特定抗原表现出较高的亲和力或特异性的抗体。

F.检测和诊断方法

使用本发明的问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)组合物产生的抗体或其结合部分，对于检测样品中钩端螺旋体的存在是有用的。该检测方法包括以下步骤：提供一种针对本发明的问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)产生的分离的抗体或其结合部分，将分离的抗体或其结合部分加入到怀疑含有一定量钩端螺旋体的样品中，并检测包含结合钩端螺旋体的分离的抗体或其结合部分的复合物的存在。

使用本发明的问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)组合物产生的抗体或其结合部分，对于检测样品中钩端螺旋体的存在也是有用的。该检测方法包括以下步骤：提供一种针对本发明的问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)产生的分离的抗体或其结合部分，将分离的抗体或其结合部分加入到怀疑含有一定量钩端螺旋体的样品中，并检测包含结合钩端螺旋体的分离的抗体或其结合部分的复合物的存在。

如本文所述的，与结合对的成员的特定分子结合的免疫球蛋白，特别是抗体(及其功能活性片段)可用于诊断和预测。在各种实施方式中，本发明提供了结合对的成员的测量，以及这样的测量在临床应用中的用途。本发明中的免疫球蛋白可用于例如检测生物样品中的抗原，其中检测受试者免疫球蛋白所结合分子的异常水平，和/或检测这样的分子的异常形式的存在。所谓“异常水平”是指相对于来自身体的一部分或不具有该疾病的受试者的类似的样品中存在的水平，或代表性的标准水平增加或减少。本发明的抗体也可以作为试剂包括在用于诊断或预后技术的试剂盒中。

在一个方面中，使用本发明的问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)组合物所产生的特异性地结合钩端螺旋体的抗体可用于诊断、预测或筛选钩端螺旋体感染。

在另一个方面中，本发明提供一种诊断或筛选钩端螺旋体感染或对其的免疫是否存在的方法，包括测定受试者中对于来自受试者样品的抗体的免疫特异性结合水平(该抗体在受试者中免疫特异性地结合钩端螺旋体肽)，其中相对于来自不具有感染性疾病病原体的受试者的类似样品中的免疫特异性结合的水平，若免疫特异性结合水平的增加，则表明存在猪链球菌(S.suis.)。

检测钩端螺旋体肽或其拮抗剂存在的合适的检测的实例包括但不限于ELISA、放射免疫分析、凝胶扩散沉淀反应试验、免疫扩散试验、凝集试验、荧光免疫分析、蛋白A免疫分析、或免疫电泳分析。

对特定分子的免疫分析通常包括在可检测的标记抗体的存在下培育样品，例如生物体液、组织提取物、新鲜收获的细胞或培养细胞的溶解物，并通过任何一种本领域熟知的技术检测结合的抗体。

给定的抗体的结合活性可根据公知的方法来确定。本领域技术人员将能够通过采用常规实验来确定每次测定的操作和最佳检测条件。

本发明的另一个方面涉及用于检测或测量LHB的诊断试剂盒。提供了诊断用的试剂盒，其在一个或多个容器中包含抗-问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)抗体，以及该抗体的任选一种标记的结合配偶体。或者，所述抗-问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)抗体可以是标记的(用可检测标记物标记，例如化学发光、酶、荧光或放射性部分)。因此，本发明提供了一种包含抗-问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)抗体和对照免疫球蛋白的诊断试剂盒。在一个特定实施方式中，容器的一种上述化合物可被可检测地标记。试剂盒可以任选地进一步在容器中包含预定量的问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型，其由该试剂盒的抗体识别)，用于作为标准或对照。

G.对受试者的施用

优选的施用途径包括但不限于血管内和肌内。本领域技术人员将认识到本发明的组合物也可以一种、两种或更多种剂量施用，以及通过其他的施用途径施用。例如，这样的其他途径包括口服、真皮内、鼻内、皮下、皮内、静脉内、动脉内、腹腔内、鞘内、气管内、心内、小叶内、髓内、肺内、和阴道内。根据所需的持续时间和治疗效果，本发明的组合物可以以一次或数次施用，也可间歇地，例如基于天数以数天、数周或数月并以不同的剂量施用。

包括下面的实施例以阐明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解的是实施方案中公开的技术是发明人发现的代表性技术以在本发明的实践中发挥良好作用，而因此可以被认为是构成其实践的优选模式。然而，在本公开内容的基础上，本领域技术人员应明白在所披露的具体实施方案中可以进行许多改变而在不脱离本发明的精神和范围的情况下，仍能获得相同或类似的结果。

实施例

材料与方法

动物：所有涉及牛的程序已经获得Rural Technologies Incorporated(RTI)动物关爱及使用委员会(Animal Care and Use Committee)的批准。疫苗接种前10天，55只6月龄荷斯坦(Holstein)小母牛到达干燥的饲养场中。所有的动物是健康的，无钩端螺旋体疫苗接种史，且在钩端螺旋体显微镜凝集试验(MAT)血清学检测中对6种钩端螺旋体血清型(波莫纳型、哈勒焦型、流感伤寒型、布拉迪斯拉发型(brataslava)、犬型和出血黄疸型)呈血清学阴性。此外，所有55只动物通过免疫组化(IHC)检测，耳缺口对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)呈阴性。最初采购55只动物以确保至少50只动物可进行接种和攻击部分的研究，以及2只动物用于攻击材料的传代。

动物居住和喂养：到达后，动物群养在带有150英尺(ft)混凝土双层围栏线的33,750平方英尺(sq ft)的干燥多用设施中。攻击前，将动物作为一组转移到约4,080平方英尺大小的窝棚(hoop barn)。窝棚设施提供100英尺的带头锁的隔间，以及两个自动饮水器。给所有动物喂食带干草的与年龄适当的口粮并提供自由采食的水。此外，在工作的日子利用饲料吸引小母牛进入头锁。

遮蔽(致盲)：进行攻击后临床评估的研究者和/或指定人不知道治疗组所分配的个体。检测血清、尿液和组织样本的实验室人员也不知道治疗组的分配。

动物登记、随机分组、和动物观察：初次接种前，治疗组动物的分配遵循完全随机的分布。使用

Excel中提供的分析工具库中的随机数字生成器将小母牛分配到治疗组。在第0天，将53只动物随机分配到三个治疗组(表1)。随机选取两只小母牛作为攻击传代动物。在研究结束时，利用之前所述的随机数字生成器将登记的小母牛随机分配到两个剖检日期之一。

B.治疗组

在研究中使用下列病毒/菌素联合疫苗(表1)：

表1.治疗组、动物数量和施用的疫苗剂量

治疗组1：施用的疫苗是由牛鼻气管炎病毒性腹泻-副流感3-呼吸道合胞病毒疫苗、经修饰的活病毒，胎儿弯曲杆菌-钩端螺旋体犬型-流感伤寒型-哈勒焦型-出血黄疸型-波莫纳型菌素(许可市售的组合产品，

5VL5，Boehringer Ingelheim Vetmedica，Inc.，St. Joseph，MO)组成的经修饰的活病毒组合物产品。

治疗组2：施用的疫苗是由牛鼻气管炎病毒性腹泻-副流感3-呼吸道合胞病毒疫苗、灭活的病毒，胎儿弯曲杆菌-睡眠嗜血菌-钩端螺旋体犬型-流感伤寒型-哈勒焦型-出血黄疸型-波莫纳型菌素(未经许可的实验组合产品，Boehringer Ingelheim Vetmedica，Inc.，St. Joseph，MO)组成的灭活的病毒组合产品。

治疗组3：安慰剂接种的对照组是施用由牛鼻气管炎病毒性腹泻-副流感3-呼吸道合胞病毒疫苗(许可市售的组合产品，

5 VL5，BoehringerIngelheim Vetmedica，Inc.，St.Joseph，MO)组成的经修饰的活病毒。

用于治疗组1和3的疫苗的产品是完全可得的市售产品。用于第2组的疫苗的产品是特定用于本研究中的实验系列产品。所有的疫苗是通过皮下(SC)途径施用。测试疫苗和安慰剂以二种剂量施用，如表1中所示的每次2或5mL，接种之间的时间间隔21天。所使用的测试疫苗配制成对于哈勒焦型钩端螺旋体组分生物的最小免疫剂量。以等于或高于正常释放剂量水平的量分批处理所有剩余的组分。

动物健康检查：在第0天，采集样品之前由兽医检查所有动物并认为是健康的。

接种：如本文概述的在接种后(PV)第0和21天对治疗组1、2和3的动物接种疫苗。未在任何动物中发现接种后的不良反应。

血样采集：在第0、21、35、43、105、112、119、126、133、140、147、154和160天经颈静脉穿刺从所有动物采集血液样本。日期和动物的识别(ID)号对管进行标记，并返回实验室进行处理。使样品在室温下凝结，以800×g离心15分钟，然后分装。

微量凝集试验(MAT)：如上所述处理血清样品，并等分提交到南达科他大学动物疾病研究和诊断实验室(South Dakota State University AnimalDisease Research and Diagnostic Laboratory,SDSU ADRDL)进行钩端螺旋体MAT测试以确定对钩端螺旋体犬型、流感伤寒型、哈勒焦型、出血黄疸型、布拉迪斯拉发型(bratislava)和波莫纳型的抗体反应。通过将已知的钩端螺旋体活培养物加入等量的稀释血清中并在反应时间结束时显微镜观察混合物的凝集，进行测试。终点滴度是表示至少50%测试孔中的钩端螺旋体凝集的最高血清稀释度。基于SDSU ADRDL MAT程序，认为>100的MAT终点滴度是阳性的。在哈勒焦型钩端螺旋体MAT中使用了LHP菌株。

尿液采集：在PV第0、105、112、119、126、133、140、147、154和160天从每只小母牛采集两个50mL锥形瓶的尿液。在排尿中段采集样本。给每只小母牛静脉注射(IV)500mg呋塞米(Furosemide，Vedco Inc.，St.Joseph，MO)后收集样本。收集后，每个管形瓶的外部进行消毒，用动物的ID号标记，并运送到RTI实验室进行钩端螺旋体培养。

尿液培养：尿液样本通过尿液培养用于检测尿液中的钩端螺旋体。简而言之，将每只小母牛的1mL尿液在运送培养基中连续按1:10稀释到10^-2稀释度。从每个稀释度的100μL和300μL样品体积接种到Ellis(80/40)培养基中并在29℃孵育长达两个月。显微镜观察培养物中钩端螺旋体生长的迹象。呈现阳性生长的培养样本通过暗视野显微镜确证为钩端螺旋体。观察2个月后没有显示出生长的培养物认为是阴性的。

肾培养：紧随安乐死，从每个小母牛去除两个肾脏。收集每份肾脏共约1cm²/1g组织的组织样本。如果标注了肾的可疑区域(以肾表面上凹陷的苍白区域为特征)，则组织样品从这些区域获得。如果没有见到可疑区域，则从每个肾脏随机取样。匀浆每个肾样品，在生长培养基中稀释肾匀浆并在29℃培养长达两个月。显微镜观察培养物中钩端螺旋体生长的迹象。呈现阳性生长的培养样本通过暗视野显微镜确证为钩端螺旋体。观察2个月后没有显示出生长的培养物认为是阴性的。

C.攻击阶段的产品

动物：在PV研究的第25天，将用于生产攻击接种物的两只未经治疗的小母牛(编号为29和48)移到相同设施的一个单独的建筑进行攻击。将动物与剩余的组保持相同的口粮，并允许自由接近干草。水随意供给。

攻击材料：用于攻击的LHB菌株203最初获得自国家动物疾病中心(National Animal Disease Center)，Ames，艾奥瓦州(Iowa)。该菌株之前已经描述过。参见Bolin等，1989(a)；Bolin等，1989(b)；和Bolin等，1991。

攻击准备：在PV研究的第25、26和27天攻击两只传代小母牛。在每一攻击日，用包含在1.0ml接种物中的约1.4×10⁷个新鲜生长的LHB培养物眼内攻击每只小母牛。将动物限制在一个斜槽中并用笼头保护头部。通过向下拉动下眼睑暴露结膜囊，从而眼内攻击动物。将体积0.5ml的攻击材料滴入每个囊，一只眼睛一次，并且在给予攻击材料后每个眼睑保持关闭60秒。

在第一次攻击后第0、15、23、28、36、42和51天，从两只传代小母牛获得血液和尿液样本以跟踪感染的进展。测试两只动物的尿液样本以确定生物体的存在。在攻击后第三周开始和继续直到尸检的尿液中，48号小母牛的培养物呈钩端螺旋体阳性。在攻击后第六和第七周，29号小母牛的尿液培养物呈钩端螺旋体阳性。

在第一次攻击后第51天，通过IV过量施用动物巴比妥类药物(Euthanasia6Grain，Vedco Inc.，St.Joseph，MO)人道安乐死29和48号动物。

从动物身上取出肾脏并转移到RTI实验室进行处理并分离钩端螺旋体。从48号小母牛的每个肾脏去除怀疑损伤的部位，将其称重并匀浆，然后加入到培养基中。在29号小母牛肾脏上没有发现可疑损伤，因此将随机的部分称重并匀浆，然后加入到培养基中。在生长培养基中稀释肾组织匀浆并培养。如本文所述的，在与尿培养相同的条件下培养肾培养物。

在剖检时从小母牛＃48获得肾脏样本是培养阳性，而从小母牛＃29获得的为阴性。将阳性肾培养物传代到新鲜生长培养基中以产生攻击接种物。每周检查一次攻击接种物以确定生物的生长和运动性。当运动性高并可提供足够进行全部研究的三次攻击的培养物(包含约10⁶生物每mL的1ml接种物)时，认为可以攻击接种。通过暗视野显微镜鉴定培养物作钩端螺旋体。

实施例1：在小母牛中接种和攻击的有效性

本研究目的在于评估市售五价联合疫苗的LHP组分抵抗LHB毒力攻击的有效性。有效性基于1)肾感染/定居的减少，2)攻击菌株尿释出的减少。治疗包括经修饰的活病毒(MLV)和菌素联合疫苗(许可市售的组合产品，3VL5，Boehringer Ingelheim Vetmedica，Inc.，St.Joseph)(治疗组1)，灭活病毒菌素联合疫苗(未许可的实验组合产品，Boehringer IngelheimVetmedica，Inc.，St.Joseph，MO)(治疗组2)，和使用不含钩端螺旋体菌素(leptobacterin)的经修饰的活病毒疫苗(许可市售的组合产品，

5，Boehringer Ingelheim Vetmedica，Inc.，St.Joseph，MO)接种的的安慰剂对照组(治疗组3)。

基于剖检时在尿液和肾组织中攻击后生物体复原(organism recovery)，通过比较接种和对照小母牛来确定有效性。为每个变量构建阻止分数(preventedfraction)和相应的95%置信区间。

A.操作

接种：如本文概述的在接种后(PV)第0和21天对治疗组1、2和3的动物接种疫苗。接种后未在任何动物中发现不良反应。

攻击：按照上文所述的两只动物攻击传代阶段之后，将LHB菌株203培养于RTI实验室并用于攻击。在PV第105、106、和107天，将新鲜材料用血细胞计数器计数并分装到3mL注射器中，各含有1mL的约10⁶个钩端螺旋体每mL的攻击材料。此外，将攻击后样品返回RTI实验室并在血细胞计数器上计数。如上所述，使用等分试样眼内攻击治疗组1、2和3中的小母牛。简单而言，限制动物并通过向下拉动下眼睑暴露结膜囊进行眼内攻击。将体积0.5ml的攻击材料投进每个囊，一只眼睛一次。施用攻击材料后将每个眼睑保持关闭60秒。

攻击后观察：从攻击当天直到剖检日，每天一次观察动物一般的临床症状。

血液和尿液样品采集：恰好在攻击之前和在攻击后(DPC)7-55天每周一次经颈静脉穿刺从所有动物采集血液样本。如上所述处理样品，并将等分试样提交到SDSU ADRDL进行钩端螺旋体MAT测试。DPC0-55天每周一次从每只动物采集两个50mL锥形瓶的尿液。如上所述收集样本。如上所述，通过培养将尿液样本用于检测尿中的钩端螺旋体。

动物处置和组织样品采集：在PV第161和162天(DPC56和57天)，将动物(n=53)运送到SDSU ADRDL进行剖检并且采集组织样品。在第161天将大约一半的小母牛随机分配进行剖检，并将另一半分配在第162天进行剖检。通过IV注射巴比妥类药物过量将动物人道安乐死。紧随安乐死从每个尸体将两个肾脏取出。从肾脏取出可疑损伤。如果没有观察到可疑损伤，从肾脏随机取样。将样品称重、匀浆，然后加入培养基中。如本文所述的，在与尿培养物相同的条件下培养肾培养物。

统计学分析：将53只动物随机分配到治疗组，在治疗组1和2中各有21只小母牛，在第3组(安慰剂对照组)中有11只动物。在PV第0天、PV第105天(DPC0天)、PV第112天(DPC7天)、PV第119天(DPC14天)、PV第126天(DPC21天)、PV第133天(DPC28天)、PV第140天(DPC35天)、PV第147天(DPC42天)、PV第154天(DPC49天)、PV第160天(DPC55天)评估尿液样品的生物体复原。剖检后评估肾组织样本的生物体复原。

阻止分数用来比较接种组和对照组间尿液释出和肾培养物的生物体复原。尿液释出的生物体复原定义为(1)在研究期间至少存在一个阳性尿液培养物或(0)在任何研究天没有阳性尿液培养物。肾组织样品的生物体复原定义为(1)阳性肾培养物或(0)阴性肾培养物。

估计的阻止分数(pf)按照风险比的补集计算，并且被定义为：pf=1-(y₂/n₂)/(y₁/n₁)/n₁)，其中y₂=在治疗组中受影响的数目(“存在”或=1)，n₂=治疗组中的总数，y₁=在对照组中受影响的数目(“存在”或=1)，和n₁=对照组中的总数。

基于标准化的统计学单侧检验和反相单侧检验，将

8.0用于计算风险比准确的95%置信区间。阻止分数的可信限是风险比的可信限的补集，或[1-U，1-L]。报道了由

8.0产生的相应的双侧值。阻止分数=0(Ho)的精确检验的p值与StatXact"提供的风险比=1的精确检验的p值是相同的。当阻止分数与0.0%有显著性差异(P<0.05)时，整个的95%置信区间大于0.0%。

使用p-水平为0.05构建所有的假设检验。在进行比较的组中，受影响的动物数量为零和接近零的值(数目“存在”或=1)可能会导致不稳定的置信限和p值。

B.结果

微量凝集测试结果：在PV第0、21、35和43天从第1、2和3组中所有登记的小母牛抽取血液样本进行MAT测试以确定对钩端螺旋体犬型、流感伤寒型、哈勒焦型、出血黄疸型和波莫纳型的抗体反应。在对两个接种组第二次接种后的第14和21天，在40%-75%的接种小母牛中对钩端螺旋体犬型、流感伤寒型、出血黄疸型和波莫纳型血清型检测接种MAT后瞬时的血清学反应(数据未显示)。仅在第二次接种后第14天，在不到24%的接种组中观察到对L.hardjo的瞬时阳性MAT血清学反应。攻击当天，所有未接种对照对所有血清型保持阴性。

在DPC第0、7、14、21、28、35、42、49和55天从第1、2和3组中所有登记的小母牛抽取攻击后血液样本进行MAT测试，以确定对钩端螺旋体犬型、流感伤寒型、哈勒焦型、出血黄疸型和波莫纳型的抗体反应。直到研究结束时，在所有动物中，对钩端螺旋体犬型、流感伤寒型、出血黄疸型和波莫纳型的攻击后MAT抗体反应仍为阴性。直到研究结束时，在所有第1和2组的接种小母牛中，对哈勒焦型钩端螺旋体的攻击后MAT结果保持阴性。然而，在第3组对照小母牛中，在DPC14天在11只动物的9只中、在DPC21天在所有11只动物中(100%)，攻击后MAT抗体反应是明显的。在未接种对照中MAT峰滴度范围为800(11只小母牛中的7只)到1600(11只小母牛中的4只)(数据未显示)。

尿液释出结果：从接种的小母牛(第1和2组)收集的所有尿液样本的所有攻击前和攻击后尿液培养物均呈钩端螺旋体生长阴性(表2)。这与安慰剂对照小母牛(第3组)形成对比，安慰剂组中至少两个攻击后样品(表3)100%具有尿液培养阳性(表2和3)。阳性培养物/小母牛范围为2-6(表3)。在DPC21天在第3组安慰剂对照小母牛中首次发现尿液释出，动物释出的最高数目在DPC35和49天(表3)。

表2.所有小母牛的攻击后尿液结果的汇总

组	阳性小母牛数	阴性小母牛数	阳性百分比
				1	0	21	0%
2	0	21	0%
				3	11	0	100%

表3.第3组(对照组)攻击后尿液培养和肾组织培养的结果

0=阴性；1=阳性

对各接种组的尿液释出所计算的阻止分数结果与安慰剂组相比为1.0000(100%)，而且相应的精确95%置信区间为[0.8389，1.0000]或[83.9%，100%](表4和5)。在两接种组中没有动物具有任何阳性尿液培养，和对照组中所有动物具有至少2个阳性尿液培养(表2和表3)。

表4.生物体复原存在的阻止分数和精确95%置信区间

表5.生物体复原存在的频率和比例(%)

肾培养结果：所有接种疫苗的小母牛(组1和组2)肾组织对钩端螺旋体分离株呈阴性(表6)，而对照组中11只小母牛中的10只具有阳性的肾组织钩端螺旋体培养(表3和表6)。

表6.第1、2、和3组的肾培养结果的汇总

组	阳性小母牛数	阴性小母牛数	阳性百分比
				1	0	21	0%
2	0	21	0%
				3	10	1	90.9%

对各接种组的肾组织培养样品所计算的阻止分数结果与对照组相比为1.0000(100%)，而且相应的精确95%置信区间为[0.8349，1.0000]或[83.5%，100%](表4和5)。在两接种组中小母牛没有任何阳性培养结果(表6)，且对照组中11只小母牛中的10只具有阳性肾培养结果(表3和表6)。

C.结论

血清学MAT结果显示了第二次接种后在接种的一部分动物中的全部血清型的瞬时血清学转换。在攻击时在所有组的所有动物中对所有血清型均为MAT阴性(数据未显示)。攻击三周后的，所有的安慰剂对照动物均对L.hardjo呈MAT阳性(作为对攻击的应答)并导致攻击生物的感染。在接种的动物中，动物的LHB攻击没有引起对L.hardjo的记忆性MAT血清学反应，然而安慰剂对照组的100%(11/11)在攻击后呈阳性MAT结果。利用从攻击后56天每周间隔收集的尿液样本的培养来复原攻击生物。安慰剂对照动物(第3组)的每只动物有至少两个尿液样本测试培养阳性，表明释出至少7天。安慰剂对照组中释出的持续时间范围为7天-35天。在第三组中，11只小母牛中的1只在2个取样日释出；11只中的4只在4天释出；11只中的4只在5个取样日释出；11只中的2只在6个取样日释出。在任何接种的动物的任何尿液样本中均没有生物体复原。基于培养结果，L.hardjo疫苗接种完全阻止了攻击生物的尿液释出。

还培养了剖检时取得的肾脏样本以确定攻击生物体复原。安慰剂对照组的11只动物中的10只(90.9%)的肾组织攻击生物体复原为阳性。在任何接种的小母牛(第1和2组)的任何肾脏样本中均没有生物体复原。基于培养结果，哈勒焦型钩端螺旋体疫苗接种完全阻止了攻击生物的肾脏感染/定居。

用经修饰的活病毒联合产品或灭活的病毒联合产品接种LHB的小母牛进行的攻击没有引起对哈勒焦型钩端螺旋体的记忆性MAT血清学反应，然而安慰剂对照组的100%(11/11)在攻击后呈阳性MAT结果。这些结果表明，安慰剂对照小母牛产生血清学MAT反应作为活性感染的结果。该结果与攻击后在接种的动物中没有MAT血清学反应形成鲜明的对比。在接种的动物中MAT血清学反应的缺失可能表明在这些接种的动物中并不会发生攻击生物体的复制，至少不足以引起记忆性血清学反应的程度。其他人也报道了在钩端螺旋体接种的动物中不存在攻击后记忆性血清学反应(Trueba等，1990；Bolin和Alt，2001)，并已经讨论过免疫原抗原表位上的IgG阻断作用或B淋巴细胞受体的负反馈作用，因而防止继发性抗体反应的可能性(Trueba等，1990)。从历史上看，主要基于在动物模型中利用对钩端螺旋体脂多糖的抗体的被动保护的研究，认为针对哈勒焦型钩端螺旋体的保护性免疫是抗体介导的(Jost等，1986;Masuzawa等，1990)。然而，涉及攻击时具有高滴度抗LPS抗体的动物的攻击的研究没有受到抵御L.hardjo攻击的保护(Bolin等，1989年(b)；Bolin等，1991)。利用提供针对LHB菌株203攻击保护的疫苗在牛中进行的研究已经表明，接种后诱导强效的Th1型免疫应答(其涉及CD4和λδT淋巴细胞)可能与疫苗诱导的针对攻击的保护相关(Naiman等，2001；Naiman等，2002)。也许在接种的动物中，Th1细胞介导的免疫应答提供的强大的保护记忆方面能够防止攻击生物体的复制。其结果可能是没有足够的抗原以导致诱发基于记忆性抗体的应答和被接种/攻击的动物的免疫系统识别。

这里报告的结果与报告一价钩端螺旋体疫苗对LHB菌株2038攻击提供保护的疫苗研究相似。在这些研究中所用的钩端螺旋体疫苗据报道从LHB菌株93U制备，而这里报道的研究的疫苗制备中利用的菌株是LHP。这些是两种血清学上相同但遗传上不同的哈勒焦血清型(Ellis等，1986;Djordjevic等，1993；Thiermann等，1986；Skilbeck和Davies，1989)。与这里报道的结果相反，以往的研究已经报道当用LHB攻击接种的动物时，包含LHP的疫苗对尿液释出或肾脏感染没有表现出良好的保护(Bolin等，1989(a)；Bolin等，1989(b)；Bolin等，1991;Bolin和Alt，2001)。在用于制备疫苗的哈勒焦血清型上的细微差别，可能部分地影响这种疫苗提供的保护水平。这种区别可能包括原始分离物的差异，以及由生长和传代方法引起的差异。疫苗提供的保护水平不仅依赖于疫苗中包含的生物体的血清型/菌株的特性，而且还依赖于疫苗制剂中使用的佐剂，如果有的话。本文中，使用的疫苗包含佐剂。用于生产菌株的生长和灭活条件也可能影响疫苗提供的功效。血清型差异、佐剂制剂和处理疫苗的生物体可以影响疫苗诱导保护性免疫应答的能力。

用经修饰的活病毒/LHP菌素组合和灭活的病毒/LHP菌素组合的接种，均在LHB攻击后导致尿液释出的保护和肾脏感染和定居的预防。本研究的结果表明测试疫苗的哈勒焦型钩端螺旋体组分对于抵御由于LHB攻击诱导的肾部感染和定居和相关的尿液释出是高度有效的。

可以制备和执行本文公开并要求保护的所有组合物和方法而在本公开内容基础上无需过多的实验。虽然在优选实施方案中已经描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，将变化应用到本文所述的组合物和方法和步骤或方法的步骤的顺序中是显而易见的。更具体地，化学和生理学相关的某些试剂可以取代本文所述的试剂而将获得相同或相似的结果，这将是显而易见的。本领域技术人员显而易见的所有这些相似的取代和修改被视为是在所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念之内。

参考文献

下列参考文献，在它们提供的示范性过程或补充本文前述内容的其他细节的范围内，特定地整合入本文作为参考。

1.Faine S,Adler B,Bolin CA,等人，Leptospira and leptospirosis,2^nd ed.Melborne,Australia,MediSci Press,1999.

2.Heath S and Johnson R.Leptospirosis.J Am Vet Med Assoc205:1518-1523,1994.

3.Ellis WA.Leptospirosis as a cause of reproductive failure.Vet Clin NAm Food Anim Pract10-463-478,1994.

4.Bolin,CA,Thiermann AB,等人，Effect of vaccination with a pentavalentleptospiral vaccine on Leptospira interrogans serovar hardjo typehardjo-bovis infection of pregnant cattle.Am J Vet Res50:161-165,1989(a).

5.Bolin CA,Zuerner RL,Trueba G.Effect of vaccination with a pentavalentleptospiral vaccine containing Leptospira interrogans serovar hardjo typehardjo-bovis on they hardjo-bovis infection of cattle.Am J Vet Res.50:2004-2008,1989(b).

6.Bolin CA,Cassells JA,Zuerner RL等人，Effect of vaccination with amonovalent Leptospira interrogans serovar hardjo type hardjo-bovisvaccine on type hardjo-bovis infection of cattle.Am J Vet Res.52:1639-1643,1991.

7.Trueba GA.,Bolin CA,Thoen CO.Evaluation of an enzyme immunoassayfor diagnosis of bovine leptospirosis caused by Leptospira interrogansserovar hardjo type hardjo-bovis.J Vet Diagn Invest2:323-329,1990.

8.Bolin,CA and Alt DP.Use of a monovalent leptopsiral vaccine to preventrenal colonization and urinary shedding in cattle exposed to Leptospriaborpetersenii serovar hardjo.Am J Vet Res62(7):995-1000,2001.

9.Jost BH,Adler B,Vihn T,Faine S.A monoclonal antibody reacting with adeterminant on leptospiral lipopolysaccharide protects guinea pigs againstleptospirosis.J Med Microbiol.22:269-275,1986.

10.Masuzawa T,Nakamura R,Hashiguchi Y等人，Immunological reactivityand passive protective activity of monoclonal antibodies against protectiveantigen(PAg)of Leptospira interrogans serovar lai.Zentbl BakteriolReihe A272:328-336,1990.

11.Naiman,BM,Alt D,Bolin CA等人，Protective killed Leptospiraborpetersenii vaccine induces potent Th1Immunity comprising responsesby CD4andλδT Lymphocytes.Infection and Immunity69(12):7550-7558,2001.

12.Naiman,BM,Blumerman S,Alt D,等人，Evaluation of Type1immuneresponse in naive and vaccinated animals following challenge withLeptospira borgpetersenii serovar hardjo:involvement of WC1+λδandCD4T cells.Infection and Immunity70(11):6147-6157,2002.

13.Ellis,WA,Thiermann AB,Marshall RB.Genotypes of Leptopria hardjoand their role in clinical disease.In Proceedings.14th World CongressDiseases of Cattle.966-970,1986.

14.Djordjevic S,Hornitzky M,Ross AD,等人，Restriction endonucleaseanalysis of Australian isolate of Leptospira interrogans serovar hardjo fromcattle with agalactia and abortion.Aust Vet J.70(3):98-100,1993.

15.Thiermann AB,Handaker AL,Foly JW,Kingscote BF.Reclassification ofNorth American leptospiral isolates belonging to serogroups Mini and Sejroeby restriction endonuclease analysis.Am J Vet Res.47:61-66,1986.

16.Skilbeck NW and Davies WD.Restriction endonuclease analysis ofAustralian isolates of Leptospira interrogans serovar hardjo.Aust Vet J.66:183-184.1989.

Claims (18)

1.一种免疫原性组合物，其包含能够针对博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)诱发免疫应答的问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)。

2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)是灭活的细菌。

3.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其进一步包含一种或多种选自传染性牛鼻气管炎(IBR)病毒、1型和2型牛病毒性腹泻(BVD)病毒、3型副流感(PI3)病毒和牛呼吸道合胞病毒(BRSV)的经修饰的活病毒(MLV)。

4.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述免疫应答在受试者中防止博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染、减少其发病率、和/或减轻其严重程度。

5.根据权利要求4所述的免疫原性组合物，其中所述受试者为牛。

6.根据权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述牛为奶牛或小母牛。

7.一种疫苗，其包含能够针对博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)诱发保护性免疫应答的问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)。

8.根据权利要求7所述的疫苗，其中所述问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)是灭活的细菌。

9.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，其进一步包含一种或多种选自传染性牛鼻气管炎(IBR)病毒、1型和2型牛病毒性腹泻(BVD)病毒、3型副流感(PI3)病毒和牛呼吸道合胞病毒(BRSV)的经修饰的活病毒(MLV)。

10.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，其中所述免疫应答在受试者中防止博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染、减少其发病率、和/或减轻其严重程度。

11.根据权利要求10所述的免疫原性组合物，其中所述受试者为牛。

12.根据权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述牛为奶牛或小母牛。

13.一种在受试者中防止博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染、减少其发病率、和/或减轻其严重程度的方法，其包括向受试者施用一种免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述问号钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjoprajitno型)是灭活的细菌。

15.根据权利要求13所述的方法，其进一步包含一种或多种选自传染性牛鼻气管炎(IBR)病毒、1型和2型牛病毒性腹泻(BVD)病毒、3型副流感(PI3)病毒和牛呼吸道合胞病毒(BRSV)的经修饰的活病毒(MLV)。

16.根据权利要求13所述的方法，其中所述免疫应答在受试者中防止博氏钩端螺旋体哈勒焦血清型(hardjo-bovis型)感染、减少其发病率、和/或减轻其严重程度。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述受试者为牛。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述牛为奶牛或小母牛。