RU2748492C1 - Dense nutrient medium for monitoring the number of live microbial cells of the vaccine strain of the plague microbe y.pestis ev - Google Patents
Dense nutrient medium for monitoring the number of live microbial cells of the vaccine strain of the plague microbe y.pestis ev Download PDFInfo
- Publication number
- RU2748492C1 RU2748492C1 RU2020124887A RU2020124887A RU2748492C1 RU 2748492 C1 RU2748492 C1 RU 2748492C1 RU 2020124887 A RU2020124887 A RU 2020124887A RU 2020124887 A RU2020124887 A RU 2020124887A RU 2748492 C1 RU2748492 C1 RU 2748492C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- microbial cells
- pestis
- nutrient medium
- vaccine strain
- sodium
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к микробиологии, а именно к приготовлению микробиологических питательных сред для контроля количества живых микробных клеток вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV.The invention relates to microbiology, namely the preparation of microbiological nutrient media for controlling the number of live microbial cells of the vaccine strain of the plague microbe Y. pestis EV.
Известна питательная среда для культивирования вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, включающая, г/л: гидролизат говяжьего мяса, содержащий аминного азота 0,12%; натрий хлористый 4,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 4,0; натрий сернисто кислый 0,04; кислоту соляную (1:1) 1,6; агар микробиологический 24,0; водопроводную воду до 1 литра. (Промышленный регламент на производство вакцины чумной живой, лиофилизата для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций ПР 01897080-09-16).Known nutrient medium for the cultivation of a vaccine strain of the plague microbe Y. pestis EV, including, g / l: beef hydrolyzate containing amine nitrogen 0.12%; sodium chloride 4.0; sodium phosphate 2-substituted 12-aqueous 4.0; sulphurous sodium 0.04; hydrochloric acid (1: 1) 1.6; microbiological agar 24.0; tap water up to 1 liter. (Industrial regulations for the production of live plague vaccine, lyophilisate for preparation of suspension for injection, skin scarification application and inhalation PR 01897080-09-16).
Недостатком данной среды является ее дороговизна.The disadvantage of this environment is its high cost.
Наиболее близкой предлагаемому изобретению является питательная среда для культивирования чумного микроба, содержащая, г/л: ферментативного гидролизата картофеля 310,0-410,0 мл, натрия хлористого 4,0-6,0, натрия фосфорнокислого 2-замещенного 3,0-5,0, натрия сернистокислого 0,3-0,5, агара микробиологического 10,0-14,0, дистиллированной воды до 1 литра. (Патент RU на изобретение №2380409 С1 Опубликовано: 27.01.2010 Бюл. №3).The closest to the proposed invention is a nutrient medium for the cultivation of the plague microbe, containing, g / l: enzymatic hydrolyzate of potatoes 310.0-410.0 ml, sodium chloride 4.0-6.0, sodium phosphate 2-substituted 3.0-5 , 0, sodium sulfite 0.3-0.5, microbiological agar 10.0-14.0, distilled water up to 1 liter. (Patent RU for invention No. 2380409 C1 Published: 27.01.2010 Bull. No. 3).
Недостатком данной среды является недостаточное количество живых микробных клеток вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV.The disadvantage of this environment is the insufficient number of live microbial cells of the vaccine strain of the plague microbe Y. pestis EV.
Целью изобретения является разработка питательной среды плотной для контроля количества живых микробных клеток вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, позволяющей получать высокий процент живых микробных клеток.The aim of the invention is to develop a dense nutrient medium for controlling the number of live microbial cells of the vaccine strain of the plague microbe Y. pestis EV, which allows obtaining a high percentage of live microbial cells.
Достигаемый технический результат заключается в том, что питательная среда в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат говяжьего мяса, а также включает: натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, агар микробиологический, дистиллированную воду и стимулирующие добавки - натрий сернистокислый, аммоний молибденовокислый 4-водный, кукурузный экстракт 20% раствор, при следующем соотношении ингредиентов:The achieved technical result is that the nutrient medium as a nutrient base contains an enzymatic hydrolyzate of beef meat, and also includes: sodium chloride, sodium phosphate 2-substituted 12-water, microbiological agar, distilled water and stimulating additives - sodium sulfate, ammonium molybdate 4-water, corn extract 20% solution, with the following ratio of ingredients:
Для приготовления питательной основы в качестве исходного сырья используют свежее говяжье мясо, содержащее, в среднем, от 12,7% до 21,71% азотистых веществ. Минеральные вещества мяса состоят из солей натрия, калия, кальция, фосфора и железа; общее их количество достигает 1%. Мясо содержит также витамины, микроэлементы. Целесообразно использование именно свежего говяжьего мяса, т.к. оно содержит больше экстрактивных веществ, чем свежемороженое (Ю.А. Козлов. Питательные среды в медицинской микробиологии. Медгиз. 1950. с. - 46).For the preparation of the nutrient base, fresh beef meat is used as a raw material, containing, on average, from 12.7% to 21.71% of nitrogenous substances. Meat minerals are composed of sodium, potassium, calcium, phosphorus and iron salts; their total number reaches 1%. Meat also contains vitamins and minerals. It is advisable to use just fresh beef meat, because it contains more extractive substances than fresh frozen (YA Kozlov. Nutrient media in medical microbiology. Medgiz. 1950. p. - 46).
Характеристика ферментативного гидролизата говяжьего мяса - рН 7,0; общий азот 1,1%; аминный азот 0,878%; процент расщепления белка 78,0%; пептон 1,2%; сухой остаток 10,0-1,5%; минеральные вещества, мг %: натрия хлорид 0,087; кальций 4,2; магний 5,21; фосфор общий 6,5; фосфор неорганический 57,1; редуцирующие вещества 367. Приготовление ферментативного гидролизата из говяжьего мяса производили (по ПР 01897080-09-16).Characteristics of the enzymatic hydrolyzate of beef meat - pH 7.0; total nitrogen 1.1%; amine nitrogen 0.878%; the percentage of protein breakdown 78.0%; peptone 1.2%; dry residue 10.0-1.5%; minerals, mg%: sodium chloride 0.087; calcium 4.2; magnesium 5.21; total phosphorus 6.5; inorganic phosphorus 57.1; reducing substances 367. Preparation of an enzymatic hydrolyzate from beef meat was carried out (according to PR 01897080-09-16).
При ферментативном гидролизе из белковых веществ говяжьего мяса образуются аминокислоты: лизин, метионин, триптофан, цистин, треонин, серии, фенилаланин, пролин, аланин, глицин, валин, лейцин, тирозин, гистидин.During enzymatic hydrolysis, amino acids are formed from the protein substances of beef: lysine, methionine, tryptophan, cystine, threonine, serine, phenylalanine, proline, alanine, glycine, valine, leucine, tyrosine, histidine.
Натрий хлористый «чда», ГОСТ 4233-77. Необходимость минимального количества солей в составе питательной среды обусловлена тем, что минеральные соединения являются катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке.Sodium chloride "analytical grade", GOST 4233-77. The need for a minimum amount of salts in the composition of the nutrient medium is due to the fact that mineral compounds are catalysts for various chemical processes occurring in the microbial cell.
Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный «чда», ГОСТ 4172-76. Важность включения в состав среды натрия фосфорнокислого 2-замещенного 12-водного обусловлена наличием у него буферных свойств в физиологически важном диапазоне рН при наименьшем токсическом влиянии на биологические объекты (М.С. Поляк; В.И. Сухаревич; М.Э. Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2008. - С. 37-38).Sodium phosphate 2-substituted 12-aqueous "analytical grade", GOST 4172-76. The importance of including sodium phosphate 2-substituted 12-aqueous sodium phosphate in the medium is due to its buffering properties in a physiologically important pH range with the least toxic effect on biological objects (M.S. Polyak; V.I.Sukharevich; M.E.Sukharevich. Nutrient media for medical and sanitary microbiology.SPb .: ELBI-SPb. - 2008. - P. 37-38).
Натрий сернистокислый ГОСТ - 195-77 «чда». Натрий сернистокислый является восстановителем окислительного потенциала питательной среды и стимулятором роста микроорганизмов - источником серы, необходимой для клеток микроорганизмов в количестве 1%. Для подавляющего числа микробов, в том числе патогенных, благоприятной для роста и размножения является нейтральная реакция среды (рН 7,0±0,5), корректировка осуществляется с использованием сернистых солей или кислот, в данном случае - натрием сернистокислым. Кроме того, при добавлении натрия сернистокислого среда становится прозрачнее.Sodium sulfate GOST - 195-77 "chda". Sodium sulfate is a reducing agent of the oxidative potential of the nutrient medium and a stimulator of the growth of microorganisms - a source of sulfur, which is necessary for the cells of microorganisms in an amount of 1%. For the overwhelming number of microbes, including pathogenic ones, a neutral reaction of the medium (pH 7.0 ± 0.5) is favorable for growth and reproduction, correction is carried out using sulfur salts or acids, in this case, sodium sulfite. In addition, with the addition of sodium sulfite, the medium becomes more transparent.
Кукурузный экстракт содержит до 45% азотистых веществ в сухом остатке; в среднем, 9,4% белка и до 25% углеводов. Кроме того, экстракт богат микроэлементами, в его составе, мг/кг: цинка 22; марганца 5; меди 5; кобальта 0,02; йода 0,30; макроэлементами, в %: фосфора 0,25; натрия 0,04; кальция 0,59; калия 0,36; магния 0,12; серы 0,11; хлора 0,04; аминокислотами, в %: аргинина 90,0; гистидина 72,0; лейцина 72,0; изолейцина 89,0; фенилаланина 59,0; треонина 95,0; валина 12,7; лизина 0,96; метионина 0,56; триптофана 0,22; метионина с цистином 0,27 и витаминами, мг/кг: каротина (витамина А) 8,0; B14,0; В2 1,0; В3 (пантотеновой кислоты) 6,5; В4 (холина) 400; В5 17; В6 2,9 (М.Ф. Нестерин, И.М. Скурихин. Химический состав пищевых продуктов. Москва. «Пищевая промышленность». 1979. 247 с).Corn extract contains up to 45% of nitrogenous substances in the dry residue; on average, 9.4% protein and up to 25% carbohydrates. In addition, the extract is rich in trace elements, in its composition, mg / kg: zinc 22; manganese 5; copper 5; cobalt 0.02; iodine 0.30; macronutrients, in%: phosphorus 0.25; sodium 0.04; calcium 0.59; potassium 0.36; magnesium 0.12; sulfur 0.11; chlorine 0.04; amino acids, in%: arginine 90.0; histidine 72.0; leucine 72.0; isoleucine 89.0; phenylalanine 59.0; threonine 95.0; valine 12.7; lysine 0.96; methionine 0.56; tryptophan 0.22; methionine with cystine 0.27 and vitamins, mg / kg: carotene (vitamin A) 8.0; B 1 4.0; B 2 1.0; B 3 (pantothenic acid) 6.5; B 4 (choline) 400; B 5 17; In 6 2.9 (MF Nesterin, IM Skurikhin. The chemical composition of food products. Moscow. "Food industry". 1979. 247 s).
Аммоний молибденовокислый 4-водный «чда», ГОСТ 3765-78. Соль аммония обеспечивает раскрытие пептидных связей белковых молекул и они становятся более доступными для различных микроорганизмов.Ammonium molybdenum acid 4-water "analytical grade", GOST 3765-78. The ammonium salt provides the opening of peptide bonds of protein molecules and they become more accessible to various microorganisms.
Агар микробиологический - ГОСТ 17206-96. Порошок светло - кремового цвета сероватого оттенка, запах без постороннего. Температура плавления студня с массовой долей сухого агара 0,85% не ниже 80°С, температура застудневания - 30-37°С, прочность студня - не менее 350±40 г.Microbiological agar - GOST 17206-96. Powder of light creamy grayish color, odor without foreign matter. The melting temperature of the jelly with a mass fraction of dry agar of 0.85% is not lower than 80 ° С, the gelation temperature is 30-37 ° С, the strength of the jelly is not less than 350 ± 40 g.
Дистиллированная вода-ГОСТ 6709-72, рН - 6,5. Вода составляет 80-90% от клеточной массы микроорганизмов и играет важнейшую роль в их физиологических функциях, а также входит в состав структурных элементов клетки, служит средой для биохимических реакций, источником кислорода в процессах метаболизма, непосредственно участвует в метаболических реакциях, например в реакциях гидролиза.Distilled water - GOST 6709-72, pH - 6.5. Water makes up 80-90% of the cell mass of microorganisms and plays an important role in their physiological functions, and is also part of the structural elements of the cell, serves as a medium for biochemical reactions, a source of oxygen in metabolic processes, directly participates in metabolic reactions, for example, in hydrolysis reactions ...
Приготовление ферментативного гидролизата из говяжьего мяса в реакторе.Preparation of an enzymatic hydrolyzate from beef meat in a reactor.
Мясо очищают от жира, сухожилий и пленок, режут на кусочки размером 2,5×2,5 см. Наливают в котел достаточного объема водопроводную воду, погружают обработанное мясо из расчета на 1 кг мяса 1,5 литра воды. Варят мясо 15-20 мин, затем вынимают, охлаждают и пропускают через мясорубку. Бульон, остывший до 50°С, подщелачивают Na2CO3 из расчета 3,0 г соды на 1 л взятой в реактор воды. Добавляют поджелудочную железу, дважды пропущенную через мясорубку, из расчета 80,0-100,0 г железы на 1 л воды в зависимости от ее активности. Активность должна быть не менее 5 тыс единиц по Фульд-Гроссу. Проверяют показатель рН, который должен быть 8,5±0,2. Добавляют хлороформ 2% к общему объему жидкости. Первые сутки гидролизат перемешивают механической мешалкой через каждые 15 мин по 5 мин. В дальнейшем переходят на режим, когда автоматическая мешалка включается через каждые 2 ч на 5 мин. Ежедневно определяют аминный азот в гидролизате. По достижению аминного азота 0,6%-0,9%, что бывает на 7-10 сутки, мешалку и подогрев отключают. Гидролизату дают отстояться 2 суток, затем отфильтровывают от осадка на пресс-фильтре, разливают в 10 литровые бутыли, добавляют хлороформ 2%, закрывают резиновыми пробками, этикетируют и хранят в холодовой комнате при температуре 6±2°С.The meat is cleaned of fat, tendons and films, cut into pieces measuring 2.5 × 2.5 cm.Pour tap water into the pot with sufficient volume, immerse the processed meat at the rate of 1.5 liters of water per 1 kg of meat. The meat is boiled for 15-20 minutes, then removed, cooled and passed through a meat grinder. The broth, cooled to 50 ° C, is alkalinized with Na 2 CO 3 at the rate of 3.0 g of soda per 1 liter of water taken into the reactor. Add the pancreas, twice passed through a meat grinder, at the rate of 80.0-100.0 g of the gland per 1 liter of water, depending on its activity. Activity should be at least 5 thousand units according to Fuld-Gross. Check the pH value, which should be 8.5 ± 0.2. Chloroform 2% is added to the total volume of the liquid. The first day the hydrolyzate is stirred with a mechanical stirrer every 15 minutes for 5 minutes. In the future, they switch to the mode when the automatic stirrer is turned on every 2 hours for 5 minutes. The amine nitrogen in the hydrolyzate is determined daily. When the amine nitrogen reaches 0.6% -0.9%, which happens on the 7-10th day, the stirrer and heating are turned off. The hydrolyzate is allowed to stand for 2 days, then filtered from the sediment on a press filter, poured into 10 liter bottles, chloroform 2% is added, closed with rubber stoppers, labeled and stored in a cold room at a temperature of 6 ± 2 ° C.
Приготовление 20% раствора кукурузного экстракта Мерно 2 л кукурузного экстракта сгущенного вливают в 10 л кастрюлю, затем добавляют до 10 л питьевой воды, устанавливают рН до 7,0±0,1. Коррекцию рН проводят соляной кислотой в разведении 1:1 или натрием гидроокиси 20% раствором. Кипятят в течение 10-15 минут, фильтрую через ткань Бельтинг, охлаждают, затем в фильтрат добавляют хлороформ 2,0±0,1%. Хранят в условиях холодовой камеры при температуре 5±2°C.Preparation of a 20% solution of corn extract Merno 2 l of condensed corn extract is poured into a 10 l pan, then add up to 10 l of drinking water, set the pH to 7.0 ± 0.1. The pH correction is carried out with hydrochloric acid in a dilution of 1: 1 or sodium hydroxide in a 20% solution. The mixture is boiled for 10-15 minutes, filtered through a Belting cloth, cooled, then chloroform 2.0 ± 0.1% is added to the filtrate. Store in a cold chamber at a temperature of 5 ± 2 ° C.
Приготовление питательной среды плотной для контроля количества живых микробных клеток вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EVPreparation of a dense nutrient medium to control the number of live microbial cells of the vaccine strain of the plague microbe Y. pestis EV
Для приготовления питательной среды плотной отмеряют - 85,0 мл ферментативного гидролизата говяжьего мяса, разбавляют его дистиллированной водой до содержания аминного азота 120 мг % и выливают в эмалированную кастрюлю, затем ссыпают взвешенные на механических весах натрий хлористый - 5,0 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12 водный - 4,0 г, агар микробиологический - 9,0 г, вливают дистиллированной воды воды до 1 л тщательно перемешивают до образования однородной массы. Подогревают до кипения, затем кипятят до полного расплавления агара в течение 2 мин. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Сбор фильтрата ведут в эмалированную кастрюлю, затем всыпают натрий сернистокислый - 0,3 г, вливают 20% раствор кукурузного экстракта - 20,0 мл, добавляют аммоний молибденовокислый - 4 водный - 30 мг. Готовая среда имеет светло-желтый цвет. После добавления соли аммония рН питательной среды повышается до 10,5-11,5, поэтому среду нейтрализуют раствором соляной кислоты (1:1) до значения рН 7,2±0,1, обеспечивающего успешный рост вакцинного штамма чумного микроба EV. Готовую питательную среду разливают в градуированные флаконы (матрацы) по 50,0 мл, затем стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин. После стерилизации охлаждают до 56°С, затем скашивают.To prepare a dense nutrient medium, 85.0 ml of enzymatic hydrolyzate of beef meat is measured, diluted with distilled water to an amine nitrogen content of 120 mg% and poured into an enamel pan, then sodium chloride weighed on a mechanical balance is poured - 5.0 g, sodium phosphate disubstituted 12 water - 4.0 g, microbiological agar - 9.0 g, distilled water is poured in water to 1 liter, thoroughly mixed until a homogeneous mass is formed. Heat to a boil, then boil until the agar is completely melted for 2 minutes. Filter through a cotton-gauze filter. Collecting the filtrate is carried out in an enamel pan, then add sodium sulfate - 0.3 g, pour in 20% corn extract solution - 20.0 ml, add ammonium molybdenum acid - 4 water - 30 mg. The finished medium is light yellow. After the addition of the ammonium salt, the pH of the nutrient medium rises to 10.5-11.5, therefore, the medium is neutralized with a solution of hydrochloric acid (1: 1) to a pH of 7.2 ± 0.1, which ensures the successful growth of the vaccine strain of the plague microbe EV. The prepared nutrient medium is poured into graduated flasks (mattresses) of 50.0 ml, then sterilized at 0.5 atm for 30 minutes. After sterilization, it is cooled to 56 ° C, then beveled.
В качестве примера испытывают культуру вакцинного штамма чумного микроба EV, выращенную на пластинках 2% агара Хоттингера, рН 7,2±0,1 при температуре (27±1)°С.Готовят взвесь I суточной культуры тест-штамма, соответствующую 10 ед по оптическому стандарту мутности (ОСО 42-28-85 П), эквивалентную 1,0×109 м.к./мл в стерильном 0,9% растворе натрия хлорида, затем разведением взвеси 1:1 получают содержание в 1 мл 500 млн м.к. Из данного разведения взвеси культуры высевают по 1,0 мл в 3 флакона (матраца), затем покачиванием распределяют взвесь по скошенной поверхности агара, оставляют на специально смонтированных подставках в скошенном состоянии, далее помещают в термостат. Выращивают в течение (48±2) ч при (27±1)°С.As an example, test the culture of the vaccine strain of the plague microbe EV grown on plates of 2% Hottinger agar, pH 7.2 ± 0.1 at a temperature of (27 ± 1) ° C. A suspension of I daily culture of the test strain, corresponding to 10 units of optical turbidity standard (OSO 42-28-85 P), equivalent to 1.0 × 10 9 m.c. / ml in sterile 0.9% sodium chloride solution, then diluting the suspension 1: 1, the content in 1 ml of 500 million m is obtained .to. From this dilution, the culture suspension is sown 1.0 ml in 3 vials (mattress), then the suspension is swayed over the beveled agar surface, left on specially mounted stands in a beveled state, then placed in a thermostat. Grow for (48 ± 2) h at (27 ± 1) ° C.
Результат учитывают через (48±2) ч. Производят смыв выращенной культуры 5 мл 0,9% раствора натрия хлористого из каждого флакона (матраца) путем отбора биомассы в градуированную пробирку объемом 25 мл стерильной бактериологической пипеткой объемом 5 мл и устанавливают концентрацию микробов в 1 мл суспензии по ОСО мутности. Для этого из каждой пробирки с собранной биомассой отбирают взвесь культуры в количестве 0,1 мл и разводят 0,9% раствором натрия хлорида в количестве 0,9 мл. Затем последовательно добавляют физиологический раствор до получения 1 млрд м.к./мл.The result is taken into account after (48 ± 2) hours. The cultured culture is washed off with 5 ml of 0.9% sodium chloride solution from each vial (mattress) by sampling the biomass into a 25 ml graduated tube with a sterile bacteriological pipette with a volume of 5 ml and the concentration of microbes is set to 1 ml of the suspension according to the RSD turbidity. For this, a suspension of culture in the amount of 0.1 ml is taken from each tube with the collected biomass and diluted with 0.9% sodium chloride solution in the amount of 0.9 ml. Then, physiological saline is added sequentially to obtain 1 billion MC / ml.
Методика подсчета количества живых микробных клетокMethod for counting the number of living microbial cells
Пробирки с 0,9% раствором натрия хлорида и пипетки, используемые при определении содержания живых микробных клеток в биомассе, должны быть охлаждены до температуры (4±2)°С.Tubes with 0.9% sodium chloride solution and pipettes used to determine the content of living microbial cells in biomass should be cooled to a temperature of (4 ± 2) ° C.
Из приготовленной микробной взвеси концентрацией 1 млрд м.к./мл пипетками делают последовательные десятикратные разведения по (0,5±0,01) мл взвеси в 0,9% растворе натрия хлористого (ряд из 8 пробирок с 4,5±0,05 мл 0,9% раствора натрия хлорида в пробирке), заканчивая 107 и 108 разведениями. Разведенную биомассу из двух последних пробирок (10-7 и 10-8) засевают пипеткой по (0,1±0,01) мл на 2 чашки Петри с питательным агаром (рН 7,2±0,1) и выдерживают при температуре (27±1)°С 2-3 суток. (Промышленный регламент ПР на производство Вакцины чумной живой, лиофилизата для приготовления суспензии для инъекционного накожного скарификационного нанесения и ингаляций ПР 01897080-09-16).From the prepared microbial suspension with a concentration of 1 billion m.c./ml, pipettes make successive tenfold dilutions of (0.5 ± 0.01) ml of suspension in 0.9% sodium chloride solution (a row of 8 tubes with 4.5 ± 0, 05 ml of 0.9% sodium chloride solution in a test tube), ending with 10 7 and 10 8 dilutions. The diluted biomass from the last two tubes (10 -7 and 10 -8 ) is inoculated with a pipette (0.1 ± 0.01) ml onto 2 Petri dishes with nutrient agar (pH 7.2 ± 0.1) and incubated at a temperature ( 27 ± 1) ° С for 2-3 days. (Industrial Regulations PR for the production of Plague live vaccine, lyophilisate for preparation of a suspension for injection skin scarification application and inhalation PR 01897080-09-16).
Процент выросших колоний вычисляют для пробы из каждого матраца, принимая за 100% число засеянных микробных клеток, исходя из вычисленной концентрации для биомассы, полученной с данного матраца, определенной методом сравнения с ОСО мутности 10 ME. За количество живых микробных клеток в процентах для серии контролируемой среды принимают среднюю арифметическую величину определений для трех образцов данного посева. Колебания результатов определения отдельных образцов не должны превышать 20% от средней арифметической величины.The percentage of grown colonies is calculated for a sample from each mattress, taking as 100% the number of seeded microbial cells, based on the calculated concentration for the biomass obtained from this mattress, determined by comparison with the RSD of turbidity of 10 IU. The arithmetic mean of determinations for three samples of a given culture is taken as the number of living microbial cells in percent for a batch of controlled environment. Fluctuations in the results of determining individual samples should not exceed 20% of the arithmetic mean.
Пример 1. Тест-штамм выращивали на пластинках питательной среды плотной в чашках Петри, содержащей: ферментативный гидролизат говяжьего мяса - 60,0 мл; натрий хлористый - 4,0 г; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12 - водный - 3,0 г; натрий сернистокислый - 0,2 г; кукурузный экстракт раствор 20% - 10 мл; аммоний молибденовокислый 4-водный - 20,0 мг, агар микробиологический - 7 г; дистиллированную воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество выросших колоний на пластинках питательной среды при посеве из разведения 10-7 составило 239; 211, диаметром 1,5-2 мм; при посеве из разведения 10-8 соответственно, 37; 31 в R-форме с выраженной кружевной зоной, сохраняющейся в течение 5 суток, что составляет 37,3% живых микробных клеток. Тогда как на контрольном питательном агаре при посеве из разведения 10-7 выросло 156; 129 колоний диаметром 1,3 мм, а при посеве изразведения 10-8 выросло, соответственно, 16; 15 в R-форме, диаметром 1,3 мм, что составляет 29,3% живых микробных клеток.Example 1. The test strain was grown on plates of dense nutrient medium in Petri dishes containing: enzymatic hydrolyzate of beef meat - 60.0 ml; sodium chloride - 4.0 g; sodium phosphate 2-substituted 12 - aqueous - 3.0 g; sodium sulfite - 0.2 g; corn extract solution 20% - 10 ml; ammonium molybdenum acid 4-water - 20.0 mg, microbiological agar - 7 g; distilled water up to 1 liter. With this ratio of ingredients, the number of grown colonies on the plates of the nutrient medium when inoculated from a dilution of 10 -7 was 239; 211, with a diameter of 1.5-2 mm; when sowing from a dilution of 10 -8, respectively, 37; 31 in the R-form with a pronounced lace zone that persists for 5 days, which is 37.3% of living microbial cells. Whereas on the control nutrient agar at sowing from a dilution of 10 -7 grew 156; 129 colonies with a diameter of 1.3 mm, and when inoculated, a dilution of 10 -8 grew, respectively, 16; 15 in R-form, 1.3 mm in diameter, which is 29.3% of living microbial cells.
Пример 2. Тест-штамм выращивали на пластинках питательной среды в чашках Петри, содержащей: ферментативный гидролизат говяжьего мяса -85,0 мл; натрий хлористый - 5,0 г; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12 - водный - 4,0 г; натрий сернистокислый - 0,3 г; кукурузный экстракт 20% раствор - 20 мл; аммоний молибденовокислый 4-водный - 30,0 мг, агар микробиологический - 9 г; дистиллированную воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество выросших колоний на пластинках питательной среды при посеве из разведения 10-7 составило 382; 331, диаметром 1,5-2 мм; при посеве из разведения 10-8 соответственно, 93; 77 колоний в R-форме, что составляет 47,4% живых микробных клеток. Тогда как на контрольном питательном агаре при посеве из разведения 10-7 выросло 156; 129 колоний диаметром 1,3 мм, а при посеве 10-8 м.к. выросло, соответственно, 16; 15 в R-форме, диаметром 1,3 мм, что составляет 29,3% живых микробных клеток.Example 2. The test strain was grown on plates of a nutrient medium in Petri dishes containing: enzymatic hydrolyzate of beef meat -85.0 ml; sodium chloride - 5.0 g; sodium phosphate 2-substituted 12 - aqueous - 4.0 g; sodium sulfite - 0.3 g; corn extract 20% solution - 20 ml; ammonium molybdenum acid 4-water - 30.0 mg, microbiological agar - 9 g; distilled water up to 1 liter. With this ratio of ingredients, the number of grown colonies on the plates of the nutrient medium when inoculated from a dilution of 10 -7 was 382; 331, with a diameter of 1.5-2 mm; when sowing from a dilution of 10 -8, respectively, 93; 77 colonies in R-form, which is 47.4% of living microbial cells. Whereas on the control nutrient agar at sowing from a dilution of 10 -7 grew 156; 129 colonies with a diameter of 1.3 mm, and when seeding 10 -8 m.c. increased, respectively, 16; 15 in R-form, 1.3 mm in diameter, which is 29.3% of living microbial cells.
Пример 3. Тест-штамм выращивали на пластинках питательной среды в чашках Петри, содержащей: ферментативный гидролизат говяжьего мяса -105,0 мл; натрий хлористый - 6,0 г; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный - 5,0 г; натрий сернистокислый - 0,4 г; кукурузный экстракт 20% раствор - 30 мл; аммоний молибденовокислый 4-водный - 40,0 мг, агар микробиологический - 11,0 г; дистиллированную юлу до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество выросших колоний на пластинках питательной среды при посеве из разведения 10-7 составило 211; 207 диаметром 1,5-2 мм; при посеве изразведения 10-8 соответственно, 24; 25 колоний в R-форме, что составляет 37,3% живых микробных клеток. Тогда как на контрольном питательном агаре при посеве из разведения 10-7 выросло 156; 129 колоний диаметром 1,3 мм, а при посеве из разведения 10-8 выросло, соответственно, 16; 15 в R-форме, диаметром 1,3 мм, что составляет 29,3% живых микробных клеток.Example 3. The test strain was grown on plates of a nutrient medium in Petri dishes containing: enzymatic hydrolyzate of beef meat -105.0 ml; sodium chloride - 6.0 g; sodium phosphate 2-substituted 12-aqueous - 5.0 g; sodium sulfite - 0.4 g; corn extract 20% solution - 30 ml; ammonium molybdenum acid 4-water - 40.0 mg, microbiological agar - 11.0 g; distilled whirligig up to 1 liter. With this ratio of ingredients, the number of grown colonies on the plates of the nutrient medium when inoculated from a dilution of 10 -7 was 211; 207 with a diameter of 1.5-2 mm; when sowing a dilution of 10 -8, respectively, 24; 25 colonies in R-form, which is 37.3% of living microbial cells. Whereas on the control nutrient agar at sowing from a dilution of 10 -7 grew 156; 129 colonies with a diameter of 1.3 mm, and when inoculated from a dilution of 10 -8 , respectively, 16 grew; 15 in R-form, 1.3 mm in diameter, which is 29.3% of living microbial cells.
Таким образом, заявленная питательная среда плотная для контроля количества живых микробных клеток вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV (пример 2), приготовленная на основе ферментативного гидролизата говяжьего мяса; с добавлением натрия сернистокислого, 20% раствора кукурузного экстракта и аммония молибденовокислого 4-водного может применяться для контроля количества живых микробных клеток вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, при этом обеспечивая высокий процент микробных клеток.Thus, the claimed nutrient medium is dense to control the number of live microbial cells of the vaccine strain of the plague microbe Y. pestis EV (example 2), prepared on the basis of an enzymatic hydrolyzate of beef meat; with the addition of sodium sulfite, a 20% solution of corn extract and ammonium molybdate 4-aqueous can be used to control the number of live microbial cells of the vaccine strain of the plague microbe Y. pestis EV, while providing a high percentage of microbial cells.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020124887A RU2748492C1 (en) | 2020-07-17 | 2020-07-17 | Dense nutrient medium for monitoring the number of live microbial cells of the vaccine strain of the plague microbe y.pestis ev |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020124887A RU2748492C1 (en) | 2020-07-17 | 2020-07-17 | Dense nutrient medium for monitoring the number of live microbial cells of the vaccine strain of the plague microbe y.pestis ev |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2748492C1 true RU2748492C1 (en) | 2021-05-26 |
Family
ID=76034009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020124887A RU2748492C1 (en) | 2020-07-17 | 2020-07-17 | Dense nutrient medium for monitoring the number of live microbial cells of the vaccine strain of the plague microbe y.pestis ev |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2748492C1 (en) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1304912A (en) * | 2000-12-31 | 2001-07-25 | 李承海 | Process for preparing microecological organic fertilizer |
| CN1163446C (en) * | 2000-09-26 | 2004-08-25 | 邓伟 | Microbial streptomycete fertilizer and production process |
| RU2433170C1 (en) * | 2010-06-21 | 2011-11-10 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Nutrient liquid medium for culturing plague microbe of vaccine strain eb |
| RU2626568C1 (en) * | 2016-06-14 | 2017-07-28 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Dense nutrient medium for cultivation and collection of biomass of plague microbe of ypestis ev vaccine strain |
| RU2681499C1 (en) * | 2017-12-04 | 2019-03-06 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" | Nutrient medium on basis of secondary product of beef hydrolyzate for cultivation of microorganisms |
| RU2702174C1 (en) * | 2018-10-24 | 2019-10-04 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" | Dense nutrient medium for cultivation and collection of biomass of vaccine strain of plague microbe yersinia pestis ev |
-
2020
- 2020-07-17 RU RU2020124887A patent/RU2748492C1/en active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1163446C (en) * | 2000-09-26 | 2004-08-25 | 邓伟 | Microbial streptomycete fertilizer and production process |
| CN1304912A (en) * | 2000-12-31 | 2001-07-25 | 李承海 | Process for preparing microecological organic fertilizer |
| RU2433170C1 (en) * | 2010-06-21 | 2011-11-10 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Nutrient liquid medium for culturing plague microbe of vaccine strain eb |
| RU2626568C1 (en) * | 2016-06-14 | 2017-07-28 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Dense nutrient medium for cultivation and collection of biomass of plague microbe of ypestis ev vaccine strain |
| RU2681499C1 (en) * | 2017-12-04 | 2019-03-06 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" | Nutrient medium on basis of secondary product of beef hydrolyzate for cultivation of microorganisms |
| RU2702174C1 (en) * | 2018-10-24 | 2019-10-04 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" | Dense nutrient medium for cultivation and collection of biomass of vaccine strain of plague microbe yersinia pestis ev |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Fabregas et al. | Marine microalgae as a potential source of single cell protein (SCP) | |
| RU2433170C1 (en) | Nutrient liquid medium for culturing plague microbe of vaccine strain eb | |
| RU2626568C1 (en) | Dense nutrient medium for cultivation and collection of biomass of plague microbe of ypestis ev vaccine strain | |
| RU2412240C1 (en) | Culture medium for growing legionella | |
| RU2748492C1 (en) | Dense nutrient medium for monitoring the number of live microbial cells of the vaccine strain of the plague microbe y.pestis ev | |
| RU2681285C1 (en) | Nutrient medium for cultivation of brucella neotomae species cultivation | |
| RU2702174C1 (en) | Dense nutrient medium for cultivation and collection of biomass of vaccine strain of plague microbe yersinia pestis ev | |
| RU2708029C1 (en) | Nutrient medium for cultivation of yersinia pestis ev | |
| RU2460774C1 (en) | Nutrient medium for legionella cultivation | |
| RU2681499C1 (en) | Nutrient medium on basis of secondary product of beef hydrolyzate for cultivation of microorganisms | |
| RU2728379C1 (en) | Nutrient medium dense for brucella cultivation | |
| RU2745504C1 (en) | Liquid nutritional medium for cultivation and discharge of biomass of vaccine strain of plague microbe (yersinia pestis ev) | |
| RU2688335C1 (en) | Dense nutrient medium for cultivation of brucellosis agent | |
| RU2380409C1 (en) | Nutrient medium for pestilential microbe cultivation | |
| RU2757428C1 (en) | Liquid nutrient medium for deep cultivation of vaccine strain of plague microbe y. pestis ev | |
| RU2748808C1 (en) | Dense universal nutrient medium for growing brucella biomass | |
| RU2648153C1 (en) | Solid nutrient medium cultivation of a plague microbe | |
| RU2792438C1 (en) | Selective nutrient medium with mannitol, bile and polymyxin to detect bacteria of the genera proteus, morganella, providencia, dry | |
| RU2785826C1 (en) | Liquid nutrient medium with increased storage properties for obtaining biomass yersinia pestis ev | |
| RU2728217C1 (en) | Liquid nutrient medium for cultivation of vibrio cholerae in matrasses and bottles | |
| RU2460768C1 (en) | Solid nutrient medium for legionella cultivation | |
| RU2681116C2 (en) | Dense nutrient medium for storage of plague microbe | |
| RU2415922C1 (en) | Nutrient medium for lactic acid bacilli cultivation | |
| RU2644248C2 (en) | Dense nutrient medium for cultivation and growing of tularemic microbe | |
| RU2825461C1 (en) | Method for industrial production of dry nutrient medium for isolation and cultivation of lactobacillus iners and other representatives of vaginal microbiota |