RU2626568C1 - Dense nutrient medium for cultivation and collection of biomass of plague microbe of ypestis ev vaccine strain - Google Patents
Dense nutrient medium for cultivation and collection of biomass of plague microbe of ypestis ev vaccine strain Download PDFInfo
- Publication number
- RU2626568C1 RU2626568C1 RU2016123661A RU2016123661A RU2626568C1 RU 2626568 C1 RU2626568 C1 RU 2626568C1 RU 2016123661 A RU2016123661 A RU 2016123661A RU 2016123661 A RU2016123661 A RU 2016123661A RU 2626568 C1 RU2626568 C1 RU 2626568C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- biomass
- vaccine strain
- cultivation
- nutrient medium
- plague
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к микробиологии, именно к приготовлению микробиологических питательных сред для культивирования чумного микроба и выращивания биомассы Y.pestis EV и может быть использована в получении достаточного количества биомассы с определенным процентом живых микробных клеток.The invention relates to microbiology, namely to the preparation of microbiological culture media for cultivating a plague microbe and growing biomass of Y. pestis EV and can be used to obtain a sufficient amount of biomass with a certain percentage of living microbial cells.
Питательная среда для культивирования вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV включающая, г/л: гидролизат говяжьего мяса, содержащего аминный азот 0,12%; натрий хлористый 4,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 4,0; натрий сернистокислый 0,04; кислота соляная (1:1) 1,6; агар микробиологический 24,0; питьевая вода до 1 литра (Промышленный регламент на производство, вакцины чумной живой, лиофилизата для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций. ПР 01897080-09-09. Регистрационный №2134-09. 2009 г. 253 с.).Nutrient medium for cultivation of the vaccine strain of the plague microbe Y. pestis EV including, g / l: hydrolyzed beef meat containing amine nitrogen 0.12%; sodium chloride 4.0; sodium phosphate 2-substituted 12-aqueous 4.0; sodium sulfide 0.04; hydrochloric acid (1: 1) 1.6; microbiological agar 24.0; drinking water up to 1 liter (Industrial regulations for production, plague live vaccines, lyophilisate for the preparation of suspension for injection, cutaneous scarification application and inhalation. PR 01897080-09-09. Registration No. 2134-09. 2009, 253 p.).
Недостатком данной среды является ее дороговизна.The disadvantage of this environment is its high cost.
Наиболее близкой к предлагаемому изобретению относится питательная среда, состоящая из смеси двух гидролизатов в отношении 1:2 для культивирования вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV включающая, г/л: гидролизат кукурузного экстракта, содержащего аминный азот 0,45%; гидролизат казеиновый, содержащий аминный азот 0,45%, - 85; натрий хлористый 3,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 2,0; натрий сернистокислый 0,4; молибденовый аммоний 0,5; агар микробиологический 30,0; pH 7,0±0,2 питьевая вода до 1 литра. Смесь тщательно перемешивают и выливают в загрузочный люк установки для сушки белковых гидролизатов. Высушивание ведут при температуре (80±2)°C, под вакуумом не менее 0,6 атм (НПО» Аллерген» г. Ставрополь). Высушенный агар измельчают керамическими шарами в сушильной камере в течение 2,5-3 ч, периодически (каждые 15-20 мин), меняя ее положение (от горизонтального до предельного наклона влево и право) для перемешивания. (Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук., Саратов 1994 г. Гюлушанян К.С.)Closest to the proposed invention relates to a nutrient medium consisting of a mixture of two hydrolysates in a ratio of 1: 2 for the cultivation of a vaccine strain of the plague microbe Y. pestis EV including, g / l: hydrolyzed corn extract containing 0.45% amine nitrogen; casein hydrolyzate containing amine nitrogen of 0.45%, - 85; sodium chloride 3.0; sodium phosphate 2-substituted 12-aqueous 2.0; sodium sulfide 0.4; molybdenum ammonium 0.5; microbiological agar 30.0; pH 7.0 ± 0.2 drinking water up to 1 liter. The mixture is thoroughly mixed and poured into the loading door of the installation for drying protein hydrolysates. Drying is carried out at a temperature of (80 ± 2) ° C, under a vacuum of at least 0.6 atm (NPO Allergen, Stavropol). Dried agar is crushed with ceramic balls in a drying chamber for 2.5-3 hours, periodically (every 15-20 minutes), changing its position (from horizontal to extreme left and right) for stirring. (The dissertation for the degree of candidate of biological sciences., Saratov 1994, Gyulushanyan KS)
Недостатком данной среды является ее сложность и громоздкость.The disadvantage of this environment is its complexity and bulkiness.
Целью изобретения является получение качественной питательной среды плотной для культивирования и выращивания биомассы вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV на белковой основе из растительного сырья - ферментативного гидролизата кукурузного экстракта (сгущенный), которая обеспечивает достаточное количество биомассы с определенным процентом живых микробных клеток, а также значительный экономический эффект.The aim of the invention is to obtain a high-quality nutrient medium dense for cultivation and cultivation of biomass of the vaccine strain of the plague microbe Y. pestis EV on a protein basis from plant material - enzymatic hydrolyzate of corn extract (condensed), which provides a sufficient amount of biomass with a certain percentage of living microbial cells, as well as significant economic effect.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что питательная среда плотная в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат кукурузного экстракта (сгущенный), натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, агар микробиологический, питьевую воду, с добавлением в среду стимулирующей добавки - соли Мора при следующем соотношении ингредиентов, г/л:The essence of the invention lies in the fact that the nutrient medium is dense as a nutrient base, contains an enzymatic hydrolyzate of corn extract (condensed), sodium chloride, sodium phosphate 2-substituted 12-water, microbiological agar, drinking water, with the addition of a stimulating additive - salt Pestilence in the following ratio of ingredients, g / l:
В качестве исходного сырья используют кукурузный экстракт-(сгущенный), содержащий в среднем 9,4% белка. Благодаря высокому содержанию в сухом остатке азотистых веществ (до 45%) и углеводов (до 25%), экстракт является хорошей питательной средой при производстве пенициллина и других антибиотиков и витаминов. Кроме того, он богат микроэлементами, мг/кг: цинк 22; марганец 5; медь 5; кобальт 0,02; йод 0,30, макроэлементами, %: фосфор 0,25; натрий 0,04; кальций 0,59; калий 0,36; магний 0,12; сера 0,11; хлор 0,04; аминокислотами, в %: аргинина 90,0; гистидин 72,0; лейцин 72,0; изолейцин 89,0; фенилаланин 59,0; треонин 95,0; валин 12,7; лизин 0,96; метионин 0,56; триптофан 0,22; метионин + цистин 0,27, и витаминами, мг/кг: каротин (витамин A) 8,0; B1 4,0; B2 1,0; B3 (пантотеновая кислота) 6,5; B4 (холин) 400; B5 17; B6 2,9. Как известно (И.В. Петрухин, 1989), кукурузные белки характеризуются повышенным содержанием треонина, гистидина, лейцина, валина, поставляющих макроэргические связи, кукурузные белки содержат также большое количество таких незаменимых аминокислот, как изолейцин, лейцин, аргинин, фенилаланин. (М.Ф. Нестерин, И.М. Скурихин. Химический состав пищевых продуктов. Москва. «Пищевая промышленность». 1979. 247 с.). Имеются также сведения о способности лейцина, как аминокислоты с разветвленной белковой цепью, инициировать синтез белка (Е.А. Газов, X.С. Морган, / США / 1989).As a feedstock, corn extract- (condensed) containing an average of 9.4% protein is used. Due to the high solids content of nitrogenous substances (up to 45%) and carbohydrates (up to 25%), the extract is a good nutrient medium in the production of penicillin and other antibiotics and vitamins. In addition, it is rich in trace elements, mg / kg: zinc 22; manganese 5; copper 5; cobalt 0.02; iodine 0.30, macrocells,%: phosphorus 0.25; sodium 0.04; calcium 0.59; potassium 0.36; magnesium 0.12; sulfur 0.11; chlorine 0.04; amino acids, in%: arginine 90.0; histidine 72.0; leucine 72.0; isoleucine 89.0; phenylalanine 59.0; threonine 95.0; valine 12.7; lysine 0.96; methionine 0.56; tryptophan 0.22; methionine + cystine 0.27, and vitamins, mg / kg: carotene (vitamin A) 8.0; B 1 4.0; B 2 1.0; B 3 (pantothenic acid) 6.5; B 4 (choline) 400; B 5 17; B 6 2.9. As is known (I.V. Petrukhin, 1989), corn proteins are characterized by an increased content of threonine, histidine, leucine, valine, which supply macroergic bonds, corn proteins also contain a large amount of such essential amino acids as isoleucine, leucine, arginine, phenylalanine. (M.F. Nesterin, I.M. Skurikhin. Chemical composition of food products. Moscow. "Food Industry". 1979. 247 p.). There is also information about the ability of leucine, as branched chain amino acids, to initiate protein synthesis (E. A. Gazov, X. S. Morgan, / USA / 1989).
Натрий хлористый, хч, ГОСТ 4233-77 партия 24, срок годности 12.2015. Бактерии нуждаются в минимальном количестве солей. Будучи растворены в питательной среде и находясь в состоянии электролитического распада, ионизируемые минеральные соединения являются одновременно катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке.Sodium chloride, hch, GOST 4233-77 batch 24, shelf life 12.2015. Bacteria need a minimal amount of salt. Being dissolved in a nutrient medium and being in a state of electrolytic decay, ionized mineral compounds are simultaneously catalysts of various chemical processes occurring in a microbial cell.
Включение в состав среды натрия фосфорнокислого 2 замещенного 12-водного обосновано широким использованием фосфатов при приготовлении питательных сред, т.к. это единственные неорганические соединения, обладающие буферным действием в физиологически важном диапазоне pH, они малотоксичны (Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов-М., 1989). (М.С. Поляк; В.И. Сухаревич; М.Э. Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2008. - С. 37-38).The inclusion in the medium of sodium phosphate 2 substituted 12-water is justified by the widespread use of phosphates in the preparation of culture media, because these are the only inorganic compounds that have a buffering effect in a physiologically important pH range, they are low toxic (Guidelines for the manufacture and use of culture media and solutions for microbiological purposes, the cultivation of cells and viruses, M. 1989). (M.S. Polyak; V.I. Sukharevich; M.E. Sukharevich. Nutrient media for medical and sanitary microbiology. St. Petersburg: ELBI-St. Petersburg. - 2008. - P. 37-38).
Соль Мора ГОСТ 4208-72. Двойная сернокислая соль закиси железа и аммония. Не горюча, не ядовита. Партия 14, дата изготовления октябрь 2014 г. Срок годности 3 года. Поставщиком соли Мора является ООО «НПФ Невский химик» Санкт-Петербург (Нева реактив).Salt of Mora GOST 4208-72. Double sulfate salt of iron oxide and ammonium. Not combustible, not toxic. Lot 14, production date October 2014. Shelf life 3 years. Mora salt is supplied by NPF Nevsky Chemist LLC St. Petersburg (Neva Reagent).
Агар микробиологический - агар бактериологический (европейский тип). Производитель: «Pronadisa» Испания. Партия LF 15130184. Срок годности до 10.2017 г. Дата изготовления: октябрь 2013 г.Microbiological agar - bacteriological agar (European type). Producer: "Pronadisa" Spain. Lot LF 15130184. Shelf life until 10.2017. Production date: October 2013.
Питьевая вода-ГОСТ Р 51232-98 отвечает всем гигиеническим требованиям.Drinking water-GOST R 51232-98 meets all hygiene requirements.
Приготовление ферментативного гидролизата из кукурузного экстракта (сгущенного).Preparation of enzymatic hydrolyzate from corn extract (condensed).
Способ приготовления питательной основы для выращивания чумного микроба вакцинного штамма Y. pestis EV заключается в следующем: кукурузный экстракт (сгущенный) в количестве 4,0 кг помещают в варочный котел, затем добавляют 24 л питьевой воды кипятят в течение 5 минут, устанавливают pH до 8,2 40% раствором натрия гидроокиси в количестве 52 мл, затем настой сливают в 10 л баллоны, охлаждают до 46°C. В остуженный настой добавляют поджелудочную железу крупного рогатого скота (КРС) из расчета 30,0 на 1 л, устанавливают pH до 8,2-8,5, добавляют 1,5% хлороформа. Гидролиз ведут в термокамере при температуре 46°C в течение 10 сут. В первые 24 ч смесь перемешивают через каждые 15 мин, в последующем смесь перемешивают через каждые 2 ч. Ежедневно измеряют уровень аминного азота. На 10 сутки аминный азот составил 1120 мг %, а сухой остаток соответственно 25,5%. С прекращением нарастания аминного азота, что бывает на 7-10 сутки, прекращают перемешивать и подогревать. Дают отстояться в течение 2 суток, затем жидкость отфильтровывают от осадка на пресс-фильтре, разливают по бутылям с добавлением 1% хлороформа, пробкуют стерильными резиновыми пробками и хранят при температуре 4-6°C.A method of preparing a nutrient base for growing the plague microbe of the vaccine strain Y. pestis EV is as follows: corn extract (condensed) in an amount of 4.0 kg is placed in a digester, then 24 l of drinking water is added, boiled for 5 minutes, the pH is adjusted to 8 , 2 40% sodium hydroxide solution in an amount of 52 ml, then the infusion is poured into 10 l containers, cooled to 46 ° C. In the cooled infusion, add the pancreas of cattle (cattle) at a rate of 30.0 per 1 liter, set the pH to 8.2-8.5, add 1.5% chloroform. Hydrolysis is carried out in a heat chamber at a temperature of 46 ° C for 10 days. For the first 24 hours, the mixture is stirred every 15 minutes, then the mixture is stirred every 2 hours. The level of amine nitrogen is measured daily. On day 10, amine nitrogen amounted to 1120 mg%, and the dry residue, respectively, 25.5%. With the cessation of the growth of amine nitrogen, which happens on the 7-10th day, stop mixing and heating. Allowed to stand for 2 days, then the liquid is filtered off from the precipitate on a press filter, bottled with 1% chloroform, poured with sterile rubber stoppers and stored at 4-6 ° C.
Приготовление питательной среды плотнойPreparation of a dense culture medium
Питательную среду на основе ферментативного гидролизата кукурузного экстракта (сгущенный) для культивирования чумного микроба и выращивания вакцинного штамма Y. pestis EV готовят следующим способом: ферментативный гидролизат, разбавленный питьевой водой до показания аминного азота 0,12% 48 мл, натрий хлористый 5,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водного 4,0; агар микробиологический 17,0; питьевая вода до 1 литра. Среду кипятят до полого растворения, затем устанавливают pH 7,2±0,1 с помощью 20% раствора натрия гидроокиси, добавляют стимулирующую добавку: соль Мора в концентрации соответственно 0,1 г/л, разливают в градуированные флаконы (матрацы) по 50,0 мл, затем стерилизуют при 0,5 атм. в течение 30 мин. После стерилизации, охлаждают до 56°C, затем скашивают.A nutrient medium based on an enzymatic hydrolyzate of corn extract (condensed) for cultivating a plague microbe and growing a vaccine strain of Y. pestis EV is prepared in the following way: an enzymatic hydrolyzate diluted with drinking water to an amine nitrogen reading of 0.12% 48 ml, sodium chloride 5.0; sodium phosphate 2-substituted 12-aqueous 4.0; microbiological agar 17.0; drinking water up to 1 liter. The medium is boiled until it is completely dissolved, then the pH is adjusted to 7.2 ± 0.1 with a 20% sodium hydroxide solution, a stimulant is added: Mohr's salt at a concentration of 0.1 g / l, respectively, poured into graduated bottles (mattresses) of 50, 0 ml, then sterilized at 0.5 atm. within 30 minutes After sterilization, cool to 56 ° C, then mow.
Перед приготовлением производственной культуры проводят анимализацию вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV путем пассажа через организм морской свинки. Все стерильные бактериологические пипетки перед работой хранят в условиях холодильника при (4±1)°C. Ампулу с сухой культурой штамма EV вскрывают с соблюдением правил асептики, разводят ее содержимое 0,9% раствором натрия хлорида и засевают микробной взвесью ряд пробирок со скошенным агаром Хоттингера pH 7,1±0,1 (исходная культура или культура I генерации). Одновременно контролируют ее культурально-морфологические и ферментативные свойства, высевают по 2 пробирки со средами Гисса с сахарозой, лактозой, рамнозой и глицерином, к которым добавляют индикатор Андреде, и высевают на 3 чашки Петри с агаром Хоттингера pH 7,3±0,1. Также культуру высевают на 3 чашки Петри с агаром Хоттингера pH 7,1±0,1, которые в дальнейшем используют последовательного рассева с целью получения изолированных колоний. Все чашки Петри с посевами помещают на (48±2) ч для выращивания в термостат при температуре (27±1)°C. В том случае, если культура без диссоциации, т.е. морфология колоний типична для чумного микроба и вакцинный штамм стойко удерживает свой биохимический тип, исходную культуру I генерации пересевают в бактериологические пробирки (культура II генерации). Посевы инкубируют (24±1) ч при (27±1)°C. Через сутки пробирки с культурой II генерации используют для культивирования вакцинного штамма чумного микроба на скошенные поверхности во флаконы (матрацы). В качестве примера испытывают культуру вакцинного штамма чумного микроба ЕВ выращенную на пластинках 2% агара Хоттингера, pH 7,2±0,1 при температуре (27±1)°C. Затем готовят взвесь I суточной культуры тест-штамма, соответствующую 10 ед. по оптическому стандартного образца мутности (ОСО 42-28-85 П), эквивалентную 1,0×109 м.к./мл в стерильном 0,9% растворе натрия хлорида, затем разведением взвеси 1×1 из 1,0×109 доводят содержания в 1 мл 500 млн. м.к. из данного разведения взвеси культуры высевают по 1,0 мл в 3 флакона (матраца), затем покачиванием распределяют взвесь по скошенной поверхности агара, оставляют на специально смонтированных подставках в скошенном состоянии, помещают в термостат. Выращивают в течение (48±2) ч при (27±1)°C.Before preparing the production culture, the vaccine strain of the plague microbe Y. pestis EV is animated by passage through the body of the guinea pig. Before sterilization, all sterile bacteriological pipettes are stored in a refrigerator at (4 ± 1) ° C. An ampoule with a dry culture of strain EV is opened according to aseptic rules, its contents are diluted with 0.9% sodium chloride solution and a number of test tubes with Hottinger beveled agar pH 7.1 ± 0.1 are seeded with microbial suspension (initial culture or culture of the 1st generation). At the same time, its cultural-morphological and enzymatic properties are monitored, 2 test tubes with Giss medium with sucrose, lactose, rhamnose and glycerin are added, to which Andrede indicator is added, and plated on 3 Petri dishes with Hottinger agar pH 7.3 ± 0.1. The culture is also seeded on 3 Petri dishes with Hottinger agar pH 7.1 ± 0.1, which are subsequently used for sequential sieving in order to obtain isolated colonies. All Petri dishes with crops are placed for (48 ± 2) h for growing in a thermostat at a temperature of (27 ± 1) ° C. In that case, if the culture without dissociation, i.e. colony morphology is typical of a plague microbe and the vaccine strain stays firmly on its biochemical type, the initial culture of the 1st generation is transferred to bacteriological tubes (culture of the 2nd generation). Crops incubated (24 ± 1) h at (27 ± 1) ° C. After a day, test tubes with a culture of the second generation are used to cultivate the plague microbe vaccine strain on beveled surfaces in bottles (mattresses). As an example, test the culture of the vaccine strain of the plague microbe EB grown on plates of 2% Hottinger agar, pH 7.2 ± 0.1 at a temperature of (27 ± 1) ° C. Then prepare a suspension of the I daily culture of the test strain, corresponding to 10 units. according to the optical standard sample turbidity (OCO 42-28-85 P), equivalent to 1.0 × 10 9 MK / ml in a sterile 0.9% sodium chloride solution, then diluting a suspension of 1 × 1 from 1.0 × 10 9 adjust the content in 1 ml of 500 million m.k. from this dilution, culture suspensions are sown in 1.0 ml in 3 vials (mattress), then the suspension is distributed by swaying on the beveled surface of the agar, left on specially mounted supports in a beveled state, and placed in a thermostat. Grown for (48 ± 2) h at (27 ± 1) ° C.
Учет результатов проводят через (48±2) ч. После чего производят смыв выращенной культуры 5 мл 0,9% раствором натрия хлористого из каждого флакона (матраца) путем отсасывания биомассы в градуированную пробирку объемом 25 мл стерильной бактериологической пипеткой объемом 5 мл и устанавливают концентрацию микробов в 1 мл суспензии по ОСО мутности.The results are taken into account after (48 ± 2) h. After that, the grown culture is washed off with 5 ml of 0.9% sodium chloride solution from each bottle (mattress) by aspirating biomass into a graduated 25 ml test tube with a 5 ml sterile bacteriological pipette and the concentration is established microbes in 1 ml of suspension for CCA turbidity.
Методика подсчета количества микробных клетокThe method of counting the number of microbial cells
Питательные среды из ферментативного гидролизата кукурузного экстракта (сгущенный) для определения количества живых микробных клеток должны обеспечивать, без добавления стимуляторов, рост микробов вакцинного штамма Y. pestis EV на всех чашках Петри с агаром, засеянных 10 м.к. по ОСО мутности 42-28-85П 10МЕ. В качестве стимулятора роста, к питательным средам перед розливом их в чашки Петри, добавляют 1 мл/л гемолизированной крови или 0,25 г/л свежеприготовленного прокипяченного натрия сернистокислого. Пробирки с 0,9% раствором натрия хлорида и пипетки, используемые при определении содержания живых микробов в биомассе, должны быть охлаждены до температуры (4±2)°C. Из каждой пробирки с жидкой питательной средой содержимое в количестве 0,1 мл разводят 0,9% раствором натрия хлорида в количестве 0,9 мл (основное разведение 10-1). Добавляют последовательно физиологический раствор до получения 1 млрд м.к./мл. Затем пипеткой делают последовательные десятикратные разведения полученной взвеси в 0,9% растворе натрия хлористого, начиная с 10-1 по (0,5±0,01) мл взвеси с 4,5±0,05 мл 0,9% раствора натрия хлорида, заканчивая (10-7) и (10-8). Разведенную биомассу из двух последних пробирок (10-7) и (10-8) засевают пипеткой по (0,1±0,01) мл на 2 чашки Петри с питательным агаром (pH 7,2±0,1) и выдерживают при температуре (27±1)°C 2-3 суток. (Промышленный регламент ПР на производство Вакцины чумной живой, лиофилизата для приготовления суспензии для инъекционного накожного скарификационного нанесения и ингаляций ПР 01897080-09-09) от 11.12.2009 г.Nutrient media from the enzymatic hydrolyzate of corn extract (condensed) for determining the number of live microbial cells must ensure, without the addition of stimulants, the growth of the microbes of the vaccine strain Y. pestis EV on all Petri dishes with agar seeded with 10 mk by CCA turbidity 42-28-85P 10ME. As a growth promoter, 1 ml / l of hemolyzed blood or 0.25 g / l of freshly prepared boiled sodium sulfite is added to the nutrient media before filling them into Petri dishes. Test tubes with 0.9% sodium chloride solution and pipettes used to determine the content of live microbes in biomass should be cooled to a temperature of (4 ± 2) ° C. From each tube with a liquid nutrient medium, the contents in an amount of 0.1 ml are diluted with 0.9% sodium chloride solution in an amount of 0.9 ml (basic dilution 10 -1 ). Saline is added sequentially to obtain 1 billion MK / ml. Then, a ten-fold dilution of the obtained suspension in a 0.9% sodium chloride solution is made with a pipette, starting from 10 -1 to (0.5 ± 0.01) ml of suspension with 4.5 ± 0.05 ml of a 0.9% sodium chloride solution ending with (10 -7 ) and (10 -8 ). The diluted biomass from the last two tubes (10 -7 ) and (10 -8 ) is inoculated with a (0.1 ± 0.01) ml pipette into 2 Petri dishes with nutrient agar (pH 7.2 ± 0.1) and kept at temperature (27 ± 1) ° C for 2-3 days. (Industrial regulation PR for the production of the Plague live vaccine, lyophilisate for the preparation of a suspension for injectable cutaneous application of scarification and inhalation PR 01897080-09-09) dated 11.12.2009.
Пример 1. Тест-штамм выращивали на скошенной поверхности питательной среды, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат кукурузного экстракта (сгущенный) 40,0; натрий хлористый 4,0; натрий фосфорнокислый 2- замещенный 12-водный 3,0; соль Мора 0,08; агар микробиологический 15,0; питьевую воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов сбор биомассы Y. pestis EV составляет 13 мл взвеси, в 1 мл, которой получено 59 млрд. м.к., процент живых м.к. через (48±1) ч соответственно 51, после сушки получено 20% живых микробных клеток.Example 1. The test strain was grown on a sloping surface of a nutrient medium containing, g / l: enzymatic hydrolyzate of corn extract (condensed) 40.0; sodium chloride 4.0; sodium phosphate 2- substituted 12-aqueous 3.0; Mohr's salt 0.08; microbiological agar 15.0; drinking water up to 1 liter. With this ratio of ingredients, the collection of biomass of Y. pestis EV is 13 ml of suspension, in 1 ml, which received 59 billion m.k., the percentage of live m.k. after (48 ± 1) h, respectively 51; after drying, 20% of live microbial cells were obtained.
Пример 2. Тест-штамм выращивали на скошенной поверхности питательной среды, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат кукурузного экстракта (сгущенный) 48,0; натрий хлористый 5,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 4,0; соль Мора 0,1; агар микробиологический 17,0; питьевую воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов сбор биомассы Y. pestis EV составил 15 мл взвеси, в 1 мл, которой получено 100 млрд. м.к., процент живых м.к. через (48±1) ч соответственно 86,6, после сушки получено 43,8% живых микробных клеток.Example 2. The test strain was grown on a sloping surface of a nutrient medium containing, g / l: enzymatic hydrolyzate of corn extract (condensed) 48.0; sodium chloride 5.0; sodium phosphate 2-substituted 12-aqueous 4.0; Mora salt 0.1; microbiological agar 17.0; drinking water up to 1 liter. With this ratio of ingredients, the collection of Y. pestis EV biomass amounted to 15 ml of suspension, in 1 ml, which received 100 billion m.k. after (48 ± 1) h, 86.6 respectively, after drying, 43.8% of live microbial cells were obtained.
Пример 3. Тест-штамм выращивали на скошенной поверхности питательной среды, содержащей, г/л; ферментативный гидролизат кукурузного экстракта (сгущенный) 56,0; натрий хлористый 6,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 5,0; соль Мора 0,12; агар микробиологический 19,0; питьевую воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов сбор биомассы Y. pestis EV составил 14 мл взвеси, в 0.1 мл, которой получено 65 млрд. м.к., процент живых микробных клеток через (48±1) ч соответственно 65, после сушки получено 23% живых микробных клеток.Example 3. The test strain was grown on a beveled surface of a nutrient medium containing, g / l; enzymatic hydrolyzate of corn extract (condensed) 56.0; sodium chloride 6.0; sodium phosphate 2-substituted 12-aqueous 5.0; Mohr's salt 0.12; microbiological agar 19.0; drinking water up to 1 liter. With this ratio of ingredients, the collection of Y. pestis EV biomass amounted to 14 ml of suspension, in 0.1 ml, which received 65 billion cu.m., the percentage of live microbial cells after 65 (48 ± 1) h, respectively 65, after drying, 23% of live microbial cells.
Таким образом, заявленная питательная среда плотная для культивирования чумного микроба и выращивания биомассы вакцинного штамма Y. pestis EV (пример 2), приготовленная на основе ферментативного гидролизата кукурузного экстракта (сгущенный), может применяться для культивирования и выращивания биомассы вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, которая обеспечивает достаточное количество биомассы с определенным процентом живых микробных клеток и значительный экономический эффект при замене мясных питательных основ на кукурузные. Рентабельность среды составляет 31%.Thus, the claimed nutrient medium is dense for cultivating the plague microbe and growing the biomass of the vaccine strain Y. pestis EV (Example 2), prepared on the basis of the enzymatic hydrolyzate of the corn extract (condensed), can be used for cultivating and growing the biomass of the vaccine strain of the plague microbe Y. pestis EV, which provides a sufficient amount of biomass with a certain percentage of living microbial cells and a significant economic effect when replacing meat nutritional bases with corn. The profitability of the environment is 31%.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016123661A RU2626568C1 (en) | 2016-06-14 | 2016-06-14 | Dense nutrient medium for cultivation and collection of biomass of plague microbe of ypestis ev vaccine strain |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016123661A RU2626568C1 (en) | 2016-06-14 | 2016-06-14 | Dense nutrient medium for cultivation and collection of biomass of plague microbe of ypestis ev vaccine strain |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2626568C1 true RU2626568C1 (en) | 2017-07-28 |
Family
ID=59632272
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016123661A RU2626568C1 (en) | 2016-06-14 | 2016-06-14 | Dense nutrient medium for cultivation and collection of biomass of plague microbe of ypestis ev vaccine strain |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2626568C1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2702174C1 (en) * | 2018-10-24 | 2019-10-04 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" | Dense nutrient medium for cultivation and collection of biomass of vaccine strain of plague microbe yersinia pestis ev |
| RU2708029C1 (en) * | 2018-12-07 | 2019-12-03 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" | Nutrient medium for cultivation of yersinia pestis ev |
| RU2748492C1 (en) * | 2020-07-17 | 2021-05-26 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Dense nutrient medium for monitoring the number of live microbial cells of the vaccine strain of the plague microbe y.pestis ev |
| RU2800371C1 (en) * | 2022-08-15 | 2023-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации | Method of obtaining protein hydrolyzate from corn extract (concessed) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2245362C2 (en) * | 2002-12-15 | 2005-01-27 | Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт | Nutrient medium for culturing plague microorganism vaccine strain |
| RU2394905C1 (en) * | 2009-01-26 | 2010-07-20 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Nutrient medium for cultivation of plague microbe |
| RU2433170C1 (en) * | 2010-06-21 | 2011-11-10 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Nutrient liquid medium for culturing plague microbe of vaccine strain eb |
-
2016
- 2016-06-14 RU RU2016123661A patent/RU2626568C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2245362C2 (en) * | 2002-12-15 | 2005-01-27 | Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт | Nutrient medium for culturing plague microorganism vaccine strain |
| RU2394905C1 (en) * | 2009-01-26 | 2010-07-20 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Nutrient medium for cultivation of plague microbe |
| RU2433170C1 (en) * | 2010-06-21 | 2011-11-10 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Nutrient liquid medium for culturing plague microbe of vaccine strain eb |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ГЮЛУШАНЯН К.С. Использование питательной среды на основе кукурузного экстракта в производстве чумной вакцины ЕВ. Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Саратов, 1994, с.9-22. * |
| СТАРЦЕВА О.Л. Совершенствование биотехнологии производства питательных сред для культивирования чумного микроба на основе сырья животного и растительного происхождения. Дисс. на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Ставрополь, 2005, с. 28-38. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2702174C1 (en) * | 2018-10-24 | 2019-10-04 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" | Dense nutrient medium for cultivation and collection of biomass of vaccine strain of plague microbe yersinia pestis ev |
| RU2708029C1 (en) * | 2018-12-07 | 2019-12-03 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" | Nutrient medium for cultivation of yersinia pestis ev |
| RU2748492C1 (en) * | 2020-07-17 | 2021-05-26 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Dense nutrient medium for monitoring the number of live microbial cells of the vaccine strain of the plague microbe y.pestis ev |
| RU2800371C1 (en) * | 2022-08-15 | 2023-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации | Method of obtaining protein hydrolyzate from corn extract (concessed) |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2626568C1 (en) | Dense nutrient medium for cultivation and collection of biomass of plague microbe of ypestis ev vaccine strain | |
| RU2433170C1 (en) | Nutrient liquid medium for culturing plague microbe of vaccine strain eb | |
| RU2580028C1 (en) | Heavy nutrient medium for the cultivation of brucella | |
| RU2412240C1 (en) | Culture medium for growing legionella | |
| RU2681285C1 (en) | Nutrient medium for cultivation of brucella neotomae species cultivation | |
| RU2702174C1 (en) | Dense nutrient medium for cultivation and collection of biomass of vaccine strain of plague microbe yersinia pestis ev | |
| RU2435842C1 (en) | Transport nutrient medium (liquid) for cultivation of brucellous microbe | |
| RU2681499C1 (en) | Nutrient medium on basis of secondary product of beef hydrolyzate for cultivation of microorganisms | |
| RU2728379C1 (en) | Nutrient medium dense for brucella cultivation | |
| RU2460774C1 (en) | Nutrient medium for legionella cultivation | |
| RU2708029C1 (en) | Nutrient medium for cultivation of yersinia pestis ev | |
| RU2681116C2 (en) | Dense nutrient medium for storage of plague microbe | |
| RU2648153C1 (en) | Solid nutrient medium cultivation of a plague microbe | |
| RU2518282C1 (en) | Nutrient medium for submerged cultivation of tularemia microbe | |
| RU2394905C1 (en) | Nutrient medium for cultivation of plague microbe | |
| RU2748492C1 (en) | Dense nutrient medium for monitoring the number of live microbial cells of the vaccine strain of the plague microbe y.pestis ev | |
| RU2725733C1 (en) | Transport liquid nutrient medium for maintaining the viability of the brucellous microbe | |
| RU2785826C1 (en) | Liquid nutrient medium with increased storage properties for obtaining biomass yersinia pestis ev | |
| RU2415922C1 (en) | Nutrient medium for lactic acid bacilli cultivation | |
| RU2525637C2 (en) | Nutrient medium for cultivation of listeriosis causative agent | |
| RU2728217C1 (en) | Liquid nutrient medium for cultivation of vibrio cholerae in matrasses and bottles | |
| RU2410424C1 (en) | Culture medium for growing microorganism | |
| RU2745504C1 (en) | Liquid nutritional medium for cultivation and discharge of biomass of vaccine strain of plague microbe (yersinia pestis ev) | |
| RU2301256C1 (en) | Liquid nutrient medium for culturing cholera vibrio | |
| RU2444567C1 (en) | NUTRITIVE MEDIUM FOR DETERMINATION OF Listeria GENUS BACTERIA LECITHINASE ACTIVITY |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180615 |