RU2667428C2 - Пептид - Google Patents
Пептид Download PDFInfo
- Publication number
- RU2667428C2 RU2667428C2 RU2015134357A RU2015134357A RU2667428C2 RU 2667428 C2 RU2667428 C2 RU 2667428C2 RU 2015134357 A RU2015134357 A RU 2015134357A RU 2015134357 A RU2015134357 A RU 2015134357A RU 2667428 C2 RU2667428 C2 RU 2667428C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- plp
- peptide
- seq
- peptides
- cells
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 157
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 66
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 49
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims abstract description 28
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 claims abstract description 14
- 208000016192 Demyelinating disease Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 22
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 9
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 13
- 102000016202 Proteolipids Human genes 0.000 abstract description 8
- 108010010974 Proteolipids Proteins 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 abstract description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 27
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 27
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 25
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 24
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 23
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 23
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 22
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 20
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 19
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 19
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 18
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 15
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 13
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102100040485 HLA class II histocompatibility antigen, DRB1 beta chain Human genes 0.000 description 11
- 108010039343 HLA-DRB1 Chains Proteins 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 9
- 208000012997 experimental autoimmune encephalomyelitis Diseases 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 5
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 5
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 5
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 4
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 4
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 3
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 3
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 3
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 3
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 101001043827 Mus musculus Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 3
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000055324 Myelin Proteolipid Human genes 0.000 description 3
- 101710094913 Myelin proteolipid protein Proteins 0.000 description 3
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 3
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 206010012305 Demyelination Diseases 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000004044 Hypesthesia Diseases 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 102000002233 Myelin-Oligodendrocyte Glycoprotein Human genes 0.000 description 2
- 108010000123 Myelin-Oligodendrocyte Glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 101150025129 POP1 gene Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 208000034783 hypoesthesia Diseases 0.000 description 2
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000024949 interleukin-17 production Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 208000035824 paresthesia Diseases 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000035807 sensation Effects 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HYCKBFLTZGORKA-HNPMAXIBSA-N 3,7-dihydropurin-6-one;1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2.O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 HYCKBFLTZGORKA-HNPMAXIBSA-N 0.000 description 1
- 201000011452 Adrenoleukodystrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000000094 Chronic Pain Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000019505 Deglutition disease Diseases 0.000 description 1
- 208000003164 Diplopia Diseases 0.000 description 1
- 206010013887 Dysarthria Diseases 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108010051539 HLA-DR2 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000982010 Homo sapiens Myelin proteolipid protein Proteins 0.000 description 1
- 101001030197 Homo sapiens Myelin transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001135738 Homo sapiens Parathyroid hormone-related protein Proteins 0.000 description 1
- 101000619805 Homo sapiens Peroxiredoxin-5, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 102100037611 Lysophospholipase Human genes 0.000 description 1
- 102000009030 Member 1 Subfamily D ATP Binding Cassette Transporter Human genes 0.000 description 1
- 108010049137 Member 1 Subfamily D ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 1
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 description 1
- 206010028347 Muscle twitching Diseases 0.000 description 1
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 1
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 1
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 1
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000003435 Optic Neuritis Diseases 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 1
- 206010034962 Photopsia Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 206010040030 Sensory loss Diseases 0.000 description 1
- 230000017274 T cell anergy Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 210000000173 T-lymphoid precursor cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 208000005298 acute pain Diseases 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- 230000006470 autoimmune attack Effects 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003659 bee venom Substances 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 208000029444 double vision Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 102000050902 human MYT1 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000018879 impaired coordination Diseases 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 210000003007 myelin sheath Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000862 numbness Toxicity 0.000 description 1
- 206010029864 nystagmus Diseases 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910000065 phosphene Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000034280 venom allergy Diseases 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/577—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 tolerising response
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к эпитопным пептидам, и может быть использовано в медицине для терапии демиелинизирующего заболевания, такого как рассеянный склероз. Получены пептидные фрагменты из протеолипидного белка (PLP): PLP 39-53: LTGTEKLIETYFSKN; PLP 42-56: TEKLIETYFSKNYQD; PLP 43-57: EKLIETYFSKNYQDY; PLP 180-194: WTTCQSIAFPSKTSA; PLP 181-195: TTCQSIAFPSKTSAS; PLP 182-196: TCQSIAFPSKTSASI; PLP 183-197: CQSIAFPSKTSASIG; PLP 184-198: QSIAFPSKTSASIGS; PLP 208-222: VLPWNAFPGKVCGSN; PLP 36-61: HEALTGTEKLIETYFSKNYQDYEYLI; PLP 179-206: TWTTCQSIAFPSKTSASIGSLCADARMY и PLP 207-234: GVLPWNAFPGKVCGSNLLSICKTAEFQM. Изобретение обеспечивает получение пептидного эпитопа PLP, способного связываться с молекулой MHC in vitro и быть представленным T-клетке без процессинга антигена. 5 н. и 3 з.п. ф-лы, 15 ил., 5 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к пептидам из протеолипидного белка (PLP). В частности, изобретение относится к пептидам из одной из гидрофильных областей PLP, которые способны связываться с молекулой MHC и быть представленными T-клетке in vitro без процессинга антигена. Изобретение также относится к применению таких пептидов в лечении и/или профилактике заболевания.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Рассеянный склероз (РС) это хроническое дегенеративное заболевание, поражающее центральную нервную систему, которое характеризуется демиелинизацией аксонов. РС может вызывать многочисленные физические и психические симптомы и часто прогрессирует до состояния физической и когнитивной инвалидности. Заболевание, как правило, возникает у молодых людей (20-40 лет), чаще встречается у женщин и поражает более 1 миллиона человек по всему миру.
Заболевание РС протекает по-разному и может быть латентным или неуклонно прогрессировать с течением времени. Описано несколько подтипов РС в зависимости от характера прогрессирования. У больного РС может развиваться практически любой неврологический симптом или признак, в том числе изменения ощущений, такие как потеря чувствительности или покалывание, ощущение колющей боли или онемение (гипестезия и парестезия), мышечная слабость, подергивание мышц, мышечные спазмы или затруднения при движении; нарушение координации и равновесия (атаксия); проблемы с речью (дизартрия) или глотанием (дисфагия), проблемы со зрением (нистагм, неврит зрительного нерва, включая фосфены или двоение в глазах), утомляемость, острая или хроническая боль, а также проблемы с мочевым пузырем и кишечником.
В настоящее время РС считают иммуноопосредованным заболеванием, при котором собственная иммунная система организма атакует и повреждает миелин.
Для РС не существует известного лечения. Несколько современных методов лечения оказались полезными для восстановления функции после приступа (рецидива), предотвращения или снижения степени тяжести или частоты новых приступов (рецидивов), либо предотвращения или снижения степени инвалидности. Однако многие современные методы лечения РС связаны с неблагоприятными эффектами или плохо переносятся. Таким образом, существует потребность в альтернативных методах лечения РС, эффективных для лечения РС и для облегчения или уменьшения симптомов РС.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения идентифицировали ряд пептидов, полученных из протеолипидного белка (PLP), которые могут быть представлены фиксированными антигенпредставляющими клетками T-клеткам. Эти пептиды могут быть полезны для профилактики и/или лечения демиелинизирующих заболеваний, таких как рассеянный склероз.
Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к пептиду, способному связываться с молекулой MHC in vitro и быть представленным T-клетке без процессинга антигена, который содержит все или часть следующих областей протеолипидного белка (PLP):
PLP 36-61: HEALTGTEKLIETYFSKNYQDYEYLI (SEQ ID NO. 1);
PLP 179-206: TWTTCQSIAFPSKTSASIGSLCADARMY (SEQ ID NO. 2);
PLP 207-234: GVLPWNAFPGKVCGSNLLSICKTAEFQM (SEQ ID NO. 3).
Пептид может содержать часть следующих областей:
PLP 39-57: LTGTEKLIETYFSKNYQDY (SEQ ID NO. 4);
PLP 180-198: WTTCQSIAFPSKTSASIGS (SEQ ID NO. 5);
PLP 208-222: VLPWNAFPGKVCGSN (SEQ ID NO. 6).
Пептид можно выбирать из следующих пептидов PLP:
PLP 39-53: LTGTEKLIETYFSKN (SEQ ID NO. 7);
PLP 42-56: TEKLIETYFSKNYQD (SEQ ID NO. 8);
PLP 43-57: EKLIETYFSKNYQDY (SEQ ID NO. 9);
PLP 180-194: WTTCQSIAFPSKTSA (SEQ ID NO. 10);
PLP 181-195: TTCQSIAFPSKTSAS (SEQ ID NO. 11);
PLP 182-196: TCQSIAFPSKTSASI (SEQ ID NO. 12);
PLP 183-197: CQSIAFPSKTSASIG (SEQ ID NO. 13);
PLP 184-198: QSIAFPSKTSASIGS (SEQ ID NO. 14);
PLP 208-222: VLPWNAFPGKVCGSN (SEQ ID NO. 15);
PLP 36-61: HEALTGTEKLIETYFSKNYQDYEYLI (SEQ ID NO. 1);
PLP 179-206: TWTTCQSIAFPSKTSASIGSLCADARMY (SEQ ID NO. 2) и
PLP 207-234: GVLPWNAFPGKVCGSNLLSICKTAEFQM (SEQ ID NO. 3).
Во втором аспекте изобретение относится к пептиду по первому аспекту изобретения, предназначенному для использования в лечении и/или профилактике демиелинизирующего заболевания.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей один или более пептидов по первому аспекту изобретения.
В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики демиелинизирующего заболевания у субъекта, который нуждается в этом, включающему этап введения пептида по первому аспекту изобретения субъекту.
В пятом аспекте настоящее изобретение относится к применению пептида по первому аспекту изобретения в производстве лекарственного средства, предназначенного для использования в профилактике и/или лечении демиелинизирующего заболевания.
В случае второго, четвертого и пятого аспектов изобретения заболевание может представлять собой рассеянный склероз.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фигура 1. Три пептидные области PLP демонстрируют ответ in vitro и in vivo, и ответ коррелирует с прогнозируемым связыванием DR2. A представляет в общих чертах прогноз связывания пептидов PLP с HLA-DRB1*1501 in silico (методы IEDB и NetMHCII) и способность этих пептидов индуцировать пролиферативный ответ у таких мышей. B и C, представлена способность 4 из этих длинных пептидов индуцировать ЭАЭ (2 отдельных эксперимента).
Фигура 2. Идентификация эпитопов в HEAL-26.
Фигура 3. Идентификация эпитопов в TWTT-28.
Фигура 4. Идентификация эпитопов в GVLP-28.
Фигура 5. Протокол толеризации.
Фигура 6. Пролиферация и продуцирование цитокинов в LNC от мышей, предварительно получавших HEAL-26 или POP-4. A, представлены средние значения +/- среднеквадратическая ошибка среднего (SEM) для включения тимидина в LNC от мышей, предварительно получавших эпитоп HEAL-26 или POP-4.
Фигура 7. Пролиферация и продуцирование цитокинов в спленоцитах (SPL) от мышей, предварительно получавших HEAL-26 или POP-4. A представляет средние значения +/- SEM для включения тимидина в SPL от мышей, предварительно получавших эпитоп HEAL-26 или POP-4.
Фигура 8. Пролиферация и продуцирование цитокинов в LNC от мышей, предварительно получавших TWTT-28. A представляет средние значения +/- SEM для включения тимидина в LNC от мышей, предварительно получавших эпитоп TWTT-28.
Фигура 9. Пролиферация и продуцирование цитокинов в SPL от мышей, предварительно получавших TWTT-28. A представляет средние значения +/- SEM для включения тимидина в SPL от мышей, предварительно получавших эпитоп TWTT-28.
Фигура 10. Пролиферация и продуцирование цитокинов в LNC от мышей, предварительно получавших POP-15. A представляет средние значения +/- SEM для включения тимидина в LNC от мышей, предварительно получавших эпитоп POP-15.
Фигура 11. Пролиферация и продуцирование цитокинов в SPL от мышей, предварительно получавших POP-15. A представляет средние значения +/- SEM для включения тимидина в SPL от мышей, предварительно получавших эпитоп POP-15.
Фигура 12. Пролиферация и продуцирование цитокинов в LNC от мышей, предварительно получавших POP-22. A представляет средние значения +/- SEM для включения тимидина в LNC от мышей, предварительно получавших эпитоп POP-22.
Фигура 13. Пролиферация SPL от мышей, предварительно получавших POP-22. A представляет средние значения +/- SEM для включения тимидина в SPL от мышей, предварительно получавших эпитоп POP-22.
Фигура 14. Пролиферация и продуцирование цитокинов в LNC от мышей, предварительно получавших POP-22 или GVLP-28. A представляет средние значения +/- SEM для включения тимидина в LNC от мышей, предварительно получавших эпитоп POP-22 (левая панель) или GVLP-28 (правая панель).
Фигура 15. Пролиферация и продуцирование цитокинов в SPL от мышей, предварительно получавших POP-22 и GVLP-28. A представляет средние значения +/- SEM для включения тимидина в SPL от мышей, предварительно получавших эпитоп POP-22 или GVLP-28.
На каждой из фигур 6-15, B, представлен индекс стимуляции для включения тимидина. C представляет количество цитокинов, секретированных в культуральный супернатант. На B и C каждая точка на дозу соответствует отдельной мыши, и столбик представляет среднее значение, p рассчитывали с использованием критерия Манна-Уитни. Показаны только низкие значения p. Величину p <0,05 считали значимой.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
В первом аспекте настоящее изобретение относится к пептиду.
Пептиды
Термин «пептид» используют в обычном смысле для обозначения последовательности остатков, как правило, L-аминокислот, связанных друг с другом, как правило, пептидными связями между α-амино и карбоксильными группами расположенных рядом аминокислот. Термин включает модифицированные пептиды и синтетические пептидные аналоги.
Пептид по настоящему изобретению имеет такую длину, что он способен связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или II in vitro и быть представленным T-клетке без процессинга антигена. Иными словами, пептиды способны связываться непосредственно с пептидсвязывающей бороздкой молекулы MHC без необходимости какого-либо укорочения с одного или обоих концов.
Пептиды, которые связываются с молекулами MHC класса I, как правило, имеют длину 7-13, чаще 8-10 аминокислот. Связывание пептида стабилизируется на обоих его концах за счет контактов между атомами в основной цепи пептида и инвариантными сайтами в пептидсвязывающей бороздке всех молекул MHC класса I. На обоих концах бороздки существуют инвариантные сайты, которые связывают амино- и карбоксильные концы пептида. Вариации длины пептидов приходятся на сгибы пептидного каркаса, часто на остатки пролина или глицина, что придает необходимую гибкость.
Пептиды, которые связываются с молекулами MHC класса II, имеют длину, как правило, 8-20 аминокислот, чаще длину 10-17 аминокислот и могут быть намного длиннее. Эти пептиды располагаются в вытянутой конформации вдоль пептидсвязывающей бороздки MHC II, которая (в отличие от пептидсвязывающей бороздки MHC класса I) открыта на обоих концах. Пептид удерживается на месте в основном за счет контактов атомов основной цепи с консервативными остатками, которые выстилают пептидсвязывающую бороздку.
Пептид по настоящему изобретению можно получать химическими методами (Peptide Chemistry, A practical Textbook. Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlin). Например, пептиды можно синтезировать твердофазным методом (Roberge J.Y. et al. (1995) Science 269: 202-204), отщеплять от смолы и очищать препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией (например, Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY). Автоматический синтез можно осуществлять, например, с использованием пептидного синтезатора ABI 431A (Perkin Elmer) в соответствии с инструкциями производителя.
Альтернативно, пептид можно получать рекомбинантными методами или путем отщепления от более длинного полипептида. Например, пептид можно получать путем отщепления от протеолипидного белка миелина. Состав пептида можно подтверждать аминокислотным анализом или секвенированием (например, методом деградации по Эдману).
Протеолипидный белок миелина (PLP)
Миелин представляет собой диэлектрический (изолирующий электрические импульсы) материал, который образует слой, миелиновую оболочку, как правило, только вокруг аксона нейрона. Это важно для правильного функционирования нервной системы. Некоторые из белков, составляющих миелин, представляют собой основной белок миелина (MBP), миелиновый олигодендроцитарный гликопротеин (MOG) и протеолипидный белок (PLP).
Протеолипидный белок миелина (PLP), наиболее распространенный белок центральной нервной системы (ЦНС), представляет собой гидрофобный интегрированный мембранный белок.
Последовательность PLP человека представлена в SEQ ID No. 16.
SEQ ID No. 16
1 glleccarc lvgapfaslv atglcffgva lfcgcgheal tgtekliety fsknyqdyey
60 linvihafqy viygtasfff lygalllaeg fyttgavrqi fgdyktticg kglsatvtgg
120 qkgrgsrgqh qahslervch clgkwlghpd kfvgityalt vvwllvfacs avpvyiyfnt
180 wttcqsiafp sktsasigsl cadarmygvl pwnafpgkvc gsnllsickt aefqmtfhlf
240 iaafvgaaat lvslltfmia atynfavlkl mgrgtkf
Пептид по изобретению получают из гидрофильной области последовательности PLP. Пептид можно получать из фрагмента антигена, возникающего в результате естественного процессинга антигена антигенпредставляющей клеткой.
Гидрофильные области PLP являются следующими:
PLP 36-61: HEALTGTEKLIETYFSKNYQDYEYLI (SEQ ID No. 17);
PLP 88-119: EGFYTTGAVRQIFGDYKTTICGKGLSATVTGG (SEQ ID No. 18);
PLP 104-135: KTTICGKGLSATVTGGQKGRGSRGQHQAHSLE (SEQ ID No. 19);
PLP 119-150: GQKGRGSRGQHQAHSLERVCHCLGKWLGHPDK (SEQ ID No. 20);
PLP 179-206: TWTTCQSIAFPSKTSASIGSLCADARMY (SEQ ID No. 21);
PLP 192-219: TSASIGSLCADARMYGVLPWNAFPGKVC (SEQ ID No. 22);
PLP 207-234: GVLPWNAFPGKVCGSNLLSICKTAEFQM (SEQ ID No. 23);
PLP 260-276: ATYNFAVLKLMGRGTKF (SEQ ID No. 24).
Пептид может содержать все или часть из следующих областей протеолипидного белка (PLP):
PLP 36-61: HEALTGTEKLIETYFSKNYQDYEYLI (SEQ ID NO. 1);
PLP 179-206: TWTTCQSIAFPSKTSASIGSLCADARMY (SEQ ID NO. 2);
PLP 207-234: GVLPWNAFPGKVCGSNLLSICKTAEFQM (SEQ ID NO. 3).
Пептид может содержать минимальный эпитоп из одной из этих областей.
Пептид может содержать часть из следующих областей:
PLP 39-57: LTGTEKLIETYFSKNYQDY (SEQ ID NO. 4);
PLP 180-198: WTTCQSIAFPSKTSASIGS (SEQ ID NO. 5);
PLP 208-222: VLPWNAFPGKVCGSN (SEQ ID NO. 6).
Пептид можно выбирать из следующих пептидов PLP:
PLP 39-53: LTGTEKLIETYFSKN (SEQ ID NO. 7);
PLP 42-56: TEKLIETYFSKNYQD (SEQ ID NO. 8);
PLP 43-57: EKLIETYFSKNYQDY (SEQ ID NO. 9);
PLP 180-194: WTTCQSIAFPSKTSA (SEQ ID NO. 10);
PLP 181-195: TTCQSIAFPSKTSAS (SEQ ID NO. 11);
PLP 182-196: TCQSIAFPSKTSASI (SEQ ID NO. 12);
PLP 183-197: CQSIAFPSKTSASIG (SEQ ID NO. 13);
PLP 184-198: QSIAFPSKTSASIGS (SEQ ID NO. 14);
PLP 208-222: VLPWNAFPGKVCGSN (SEQ ID NO. 15);
PLP 36-61: HEALTGTEKLIETYFSKNYQDYEYLI (SEQ ID NO. 1);
PLP 179-206: TWTTCQSIAFPSKTSASIGSLCADARMY (SEQ ID NO. 2) и
PLP 207-234: GVLPWNAFPGKVCGSNLLSICKTAEFQM (SEQ ID NO. 3).
Пептид может содержать минимальный эпитоп из одного из этих пептидов.
В частности, пептид может содержать, состоять из или содержать минимальный эпитоп из одного из следующих пептидов:
PLP 39-53: LTGTEKLIETYFSKN (SEQ ID NO. 7);
PLP 181-195: TTCQSIAFPSKTSAS (SEQ ID NO. 11);
PLP 179-206: TWTTCQSIAFPSKTSASIGSLCADARMY (SEQ ID NO. 2).
Эпитопы
При адаптивном иммунном ответе T-лимфоциты способны узнавать внутренние эпитопы белкового антигена. Антигенпредставляющие клетки (АПК) поглощают белковые антигены и расщепляют их на короткие пептидные фрагменты. Пептид может связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или II внутри клетки и переноситься на поверхность клетки. Будучи представленным на поверхности клетки в сочетании с молекулой MHC, пептид может узнаваться T-клеткой (с помощью T-клеточного рецептора (TCR)), в этом случае пептид представляет собой T-клеточный эпитоп.
T-клеточные эпитопы играют центральную роль в адаптивном иммунном ответе на любой антиген, как собственный, так и чужеродный. Центральная роль T-клеточных эпитопов в заболеваниях гиперчувствительности (включающих аллергию, аутоиммунные заболевания и отторжение трансплантата) была продемонстрирована на экспериментальных моделях. Можно индуцировать воспалительные или аллергические заболевания путем инъекции синтетических пептидов (на основе структуры T-клеточных эпитопов) в сочетании с адъювантом.
Напротив, показано, что можно индуцировать иммунологическую толерантность в отношении конкретных пептидных эпитопов путем введения пептидных эпитопов в растворимой форме. Показано, что введение растворимых пептидных антигенов является эффективным способом ингибирования заболевания при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (ЭАЭ - модель для рассеянного склероза (РС) (Metzler and Wraith (1993) Int. Immunol. 5: 1159-1165; Liu and Wraith (1995) Int. Immunol. 7: 1255-1263; Anderton and Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28: 1251-1261) и в экспериментальных моделях артрита, диабета и увеоретинита (обзор в Anderton and Wraith (1998), выше). Также была продемонстрирована эффективность этого метода для лечения текущего заболевания при ЭАЭ (Anderton and Wraith (1998), выше).
Использование толерогенных пептидов для лечения или профилактики заболевания привлекло значительное внимание. Одной из причин этого является то, что было показано, что некоторые толерогенные эпитопы способны подавлять ответы T-клеток на другие антигены в той же ткани. Это явление, известное как «подавление иммунного ответа неродственным антигеном», означает, что должна быть возможность индуцировать толерантность к более чем одному эпитопу (предпочтительно, ко всем эпитопам) в конкретном антигене и к более чем одному антигену для конкретного заболевания с использованием конкретного толерогенного пептида (Anderton and Wraith (1998), выше). Это избавило бы от необходимости определения всех патогенных антигенов при конкретном заболевании.
Пептиды также являются подходящим вариантом для терапии вследствие их относительно низкой стоимости и того факта, что можно получать пептидные аналоги с измененными иммунологическими свойствами. Пептиды, таким образом, можно модифицировать для изменения их взаимодействий либо с MHC, либо с TCR.
Одна из возможных проблем этого подхода заключается в том, что было показано, что не все пептиды, которые действуют в качестве T-клеточных эпитопов, способны вызывать толерантность. Пептид 89-101 основного белка миелина (MBP) является иммунодоминантным антигеном после иммунизации и также является очень эффективным иммуногеном как с точки зрения примирования для реакционной способности T-клеток, так и индукции ЭАЭ. Однако показано, что данный пептид неэффективен для индукции толерантности при введении в растворе (Anderton and Wraith (1998), выше).
Был предложен целый ряд объяснений для наблюдаемой иерархии в способности T-клеточных эпитопов индуцировать толерантность (обзор в Anderton and Wraith (1998), выше). В частности, было высказано предположение, что существует корреляция между аффинностью пептида в отношении MHC и толерогенностью (Liu and Wraith (1998), выше), но это не согласуется с некоторыми из наблюдений. Например, MBP [89-101], который не является толерогенным, связывается с I-AS с относительно высокой аффинностью. Таким образом, не просто предсказать, какие пептиды будут индуцировать толерантность.
Авторы настоящего изобретения показали, что если пептидный эпитоп имеет соответствующий размер, чтобы быть представленным незрелой АПК без процессинга антигена, он может индуцировать иммунологическую толерантность (международная патентная заявка номер PCT/GB01/03702). То наблюдение, что некоторые T-клеточные эпитопы являются толерогенными, а другие неспособны индуцировать толерантность, таким образом, может быть объяснено тем фактом, что некоторые эпитопы нуждаются в процессинге антигена прежде, чем они смогут быть представлены молекулой MHC. Эти эпитопы, которым необходим дополнительный процессинг, не индуцируют толерантность при введении в растворимой форме, несмотря на их способность индуцировать заболевание при введении в сочетании с адъювантом.
Эпитопы, которые не нуждаются в дополнительном процессинге, способны индуцировать толерантность, и они были названы авторами изобретения «эпитопами» (независящими от процессинга антигена эпитопами).
Независящие от процессинга антигена системы представления (APIPS)
Пептиды по настоящему изобретению способны связываться с молекулой MHC in vitro и быть представленными T-клетке без процессинга антигена.
Можно тестировать способность пептида связываться с молекулой MHC без процессинга антигена, используя «беспроцессинговую» систему. Такая система должна быть способна представлять антиген с помощью молекул MHC T-клеткам, но не способна процессировать антиген. Таким образом, пептиды можно тестировать на их способность связываться с молекулой MHC in vitro и быть представленными T-клетке без процессинга антигена с использованием независящей от процессинга антигена системы представления (APIPS).
Примеры APIPS включают:
a) фиксированные АПК (с антителами к CD28 или без них);
b) липидные мембраны, содержащие молекулы MHC класса I или II (с антителами к CD28 или без них); и
c) очищенные природные или рекомбинантные молекулы MHC, связанные с планшетом (с антителами к CD28 или без них).
Известно, что фиксированные АПК используют для изучения T-клеточных ответов, например, в исследованиях с целью определения минимального эпитопа в полипептиде путем измерения ответа на укороченные пептиды (Fairchild et al. (1996) Int. Immunol. 8: 1035-1043). АПК можно фиксировать при помощи, например, формальдегида (как правило, параформальдегида) или глутаральдегида.
Липидные мембраны (которые могут быть плоскими мембранами или липосомами) могут быть получены с использованием искусственных липидов или могут представлять собой плазматические мембранные/микросомальные фракции из АПК.
На практике, APIPS можно наносить в лунки планшета для культивирования тканей. Затем добавляют пептидные антигены и связывание пептида с MHC частью APIPS определяют, добавляя выбранные T-клеточные линии или клоны. Активацию T-клеточной линии или клона можно измерять любыми методами, известными в данной области, например, по включению 3H-тимидина или секреции цитокинов.
Если пептид может быть представлен T-клетке при помощи APIPS, тогда он способен связываться с молекулой MHC без процессинга антигена и является эпитопом.
Толерантность
Пептиды по настоящему изобретению способны индуцировать толерантность к протеолипидному белку.
Используемый в настоящем документе термин «толерогенный» означает способный индуцировать толерантность.
Толерантность это неспособность реагировать на антиген. Толерантность к собственным антигенам является важной особенностью иммунной системы, если она теряется, может развиться аутоиммунное заболевание. Адаптивная иммунная система должна поддерживать способность реагировать на огромное разнообразие инфекционных агентов, при этом избегая аутоиммунной атаки на собственные антигены, содержащиеся в собственных тканях организма. В значительной степени это контролируется за счет подверженности незрелых T-лимфоцитов клеточному апоптозу в тимусе (центральная толерантность). Однако не все собственные антигены обнаруживаются в тимусе, так что гибели аутореактивных тимоцитов недостаточно. Вследствие этого, существуют дополнительные механизмы, за счет которых толерантность могут приобретать зрелые аутореактивные T-лимфоциты в периферических тканях (периферическая толерантность). Обзор механизмов центральной и периферической толерантности приведен в Anderton et al. (1999) (Immunological Reviews 169: 123-137).
Толерантность может возникать вследствие, или характеризоваться индукцией, анергии по меньшей мере в части CD4+ T-клеток. Для активации T-клетки пептид должен связываться с «профессиональной» АПК, способной доставлять два сигнала к T-клеткам. Первый сигнал (сигнал 1) доставляется MHC-пептидным комплексом на клеточную поверхность АПК и воспринимается T-клеткой через рецептор TCR. Второй сигнал (сигнал 2) доставляется на поверхность АПК костимулирующими молекулами, такими как CD80 и CD86, и воспринимается CD28 на поверхности T-клетки. Считается, что когда T-клетка получает сигнал 1 в отсутствие сигнала 2, она не активируется и, фактически, становится анергической. Анергические T-клетки невосприимчивы к последующему воздействию антигена и могут быть способны подавлять другие иммунные ответы. Считается, что анергические T-клетки вовлечены в опосредование T-клеточной толерантности.
Пептиды, которым необходим процессинг прежде, чем они смогут быть представлены в сочетании с молекулами MHC, не индуцируют толерантность, поскольку они должны подвергаться процессингу зрелыми антигенпредставляющими клетками. Зрелые антигенпредставляющие клетки (такие как макрофаги, B-клетки и дендритные клетки) способны к процессингу антигена, но также и к доставке обоих сигналов 1 и 2 к T-клетке, что приводит к активации T-клетки. Эпитопы, с другой стороны, способны связывать MHC класса II на незрелых АПК. Таким образом, они будут представлены T-клеткам без костимулирования, что приводит к анергии T-клеток и толерантности.
Безусловно, эпитопы также способны связываться с молекулами MHC на клеточной поверхности зрелых АПК. Однако в иммунной системе имеется намного больше незрелых, чем зрелых АПК (было высказано предположение, что менее 10% дендритных клеток являются активированными, Summers et al. (2001) Am. J. Pathol. 159: 285-295). Таким образом, по умолчанию, основное действие эпитопа будет заключаться в индукции анергии/толерантности, а не активации.
Показано, что при индукции толерантности способность антигенспецифических CD4+ T-клеток к пролиферации снижена. Кроме того, продуцирование IL-2, IFN-γ и IL-4 этими клетками снижено, однако продуцирование IL-10 повышено. Показано, что нейтрализация IL-10 у мышей в состоянии индуцированной пептидом толерантности полностью восстанавливает восприимчивость к заболеванию. Было высказано предположение, что популяция регуляторных клеток сохраняется в толерантном состоянии, при котором продуцируется IL-10 и опосредуется иммунная регуляция (Burkhart et al. (1999) Int. Immunol. 11: 1625-1634).
Таким образом, индукцию толерантности можно отслеживать различными способами, включая:
(a) уменьшение восприимчивости к заболеванию, для которого пептид является эпитопом-мишенью in vivo;
(b) индукцию анергии в CD4+ T-клетках (которая может быть обнаружена при последующей стимуляции антигеном in vitro);
(c) изменения в популяции CD4+ T-клеток, включая
(i) снижение пролиферации;
(ii) уменьшение продуцирования, например, IL-2, IFN-γ и IL-4; и
(iii) увеличение продуцирования IL-10.
Целевые заболевания
Пептид по изобретению можно использовать в лечении и/или профилактике заболевания.
Заболевание может представлять собой демиелинизирующие заболевания, такие как адренолейкодистрофия, болезнь исчезновения белого вещества или рассеянный склероз (РС).
Пептиды по настоящему изобретению особенно полезны в лечении и/или профилактике рассеянного склероза (РС). Рассеянный склероз (РС) представляет собой хроническое воспалительное заболевание, характеризующееся наличием множественных очагов демиелинизации, диссеминированных по всему белому веществу ЦНС и возникающих в различных участках в разное время (McFarlin and McFarland, 1982 New England J. Medicine 307: 1183-1188 и 1246-1251). Считается, что РС опосредуется аутореактивными Т-клетками.
Фармацевтическая композиция
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей один или более пептидов по первому аспекту изобретения.
Авторы настоящего изобретения прогнозируют, что, несмотря на «подавление иммунного ответа неродственным антигеном», может быть необходимым воздействие на ряд различных T-клеточных клонов, чтобы эффективно индуцировать толерантность. Таким образом, индивидууму можно вводить несколько пептидов для лечения или профилактики заболевания.
Фармацевтическая композиция может, например, содержать от 1 до 20 эпитопов, например, 1-15, 2-8 или 4-6 эпитопов.
В случае двух или более эпитопов фармацевтическая композиция может быть в виде набора, в котором некоторые или все эпитопы предоставлены отдельно для одновременного, раздельного или последовательного введения.
Альтернативно (или дополнительно), если фармацевтическую композицию (или любую ее часть) предстоит вводить в нескольких дозах, каждая доза может быть упакована отдельно.
Фармацевтическая композиция может содержать терапевтически или профилактически эффективное количество каждого эпитопа и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.
Кроме того, в фармацевтической композиции по настоящему изобретению каждый эпитоп можно смешивать с любым подходящим связующим веществом(ами), смазывающим веществом(ами), суспендирующим веществом(ами), покрывающим средством(ами) или солюбилизирующим средством(ами).
Введение
Пептид можно вводить в растворимой форме без адъюванта.
Пептид можно вводить интраназальным, трансмукозальным, подкожным или внутрикожным путями введения.
Исследования показали, что пептид при введении в растворимой форме внутрибрюшинно (в/б), внутривенно (в/в), интраназально (и/н) или перорально может индуцировать толерантность T-клеток (Anderton and Wraith (1998), выше; Liu and Wraith (1995), выше; Metzler and Wraith (1999) Immunology 97: 257-263).
Исследования на мышах показали, что продолжительность введения пептида, необходимая для индукции толерантности, зависит от частоты предшественников T-клеток у реципиента (Burkhart et al. (1999), выше). Во многих экспериментальных исследованиях было показано, что для индукции толерантности необходимы повторные дозы пептида (Burkhart et al. (1999), выше). Таким образом, точная доза и число доз пептида будет зависеть от индивидуума, однако в предпочтительном варианте осуществления вводят несколько доз.
Если несколько пептидов вводят одновременно, они могут находиться в виде «коктейля», подходящего для введения в одной или нескольких дозах. Альтернативно, может быть предпочтительным введение нескольких доз, но с варьирующими от дозы к дозе относительными концентрациями пептидов.
В предпочтительном варианте осуществления можно следовать протоколу «эскалации дозы», согласно которому несколько доз вводят пациенту в возрастающих концентрациях. Такой подход был использован, например, для пептидов фосфолипазы A2 в иммунотерапии против аллергии на пчелиный яд (Müller et al. (1998) J. Allergy Clin Immunol. 101: 747-754 и Akdis et al. (1998) J. Clin. Invest. 102: 98-106).
ПРИМЕРЫ
Следующие далее примеры служат для иллюстрации настоящего изобретения, но их не следует рассматривать в качестве его ограничения. Изобретение, в частности, относится к конкретным вариантам осуществления, описанным в этих примерах.
Пример 1 - Изучение гидрофильных участков последовательности протеолипидного белка (PLP)
Материалы и методы
Антигены
Поскольку PLP является в значительной степени гидрофобным белком, нужно было использовать гидрофильные участки последовательности. Для этого проводили гидропатические исследования и синтезировали восемь пептидов из гидрофильных доменов молекулы PLP, а именно:
36-61 (26-членный): HEALTGTEKLIETYFSKNYQDYEYLI-NH2;
88-119 (32-членный): EGFYTTGAVRQIFGDYKTTICGKGLSATVTGG-NH2;
104-135 (32-членный): KTTICGKGLSATVTGGQKGRGSRGQHQAHSLE-NH2;
119-150 (32-членный): GQKGRGSRGQHQAHSLERVCHCLGKWLGHPDK-NH2;
179-206 (28-членный): TWTTCQSIAFPSKTSASIGSLCADARMY-NH2;
192-219 (28-членный): TSASIGSLCADARMYGVLPWNAFPGKVC-NH2;
207-234 (28-членный): GVLPWNAFPGKVCGSNLLSICKTAEFQM-NH2;
260-276 (17-членный): ATYNFAVLKLMGRGTKF-NH2.
Для каждого пептида проводили исследования in silico для прогнозирования способности к связыванию DR2 (HLA-DRB1*1501) и проводили исследования in vitro (анализ пролиферации) и in vivo (индукция ЭАЭ) для изучения иммунного ответа. Результаты представлены на фигуре 1.
Показано, что три пептида демонстрировали реакцию в исследованиях как in vitro, так и in vivo, и это коррелировало с прогнозом связывания DR2. Этими пептидами были HEAL-26, TWTT-28 и GVLP-28 (для идентификации пептида использованы первые четыре аминокислоты, выделенные жирным шрифтом в последовательностях, приведенных выше).
Пример 2 - Идентификация эпитопов в HEAL-26
Синтезировали панель 15-членных перекрывающихся пептидов, охватывающих HEAL-26, с использованием стандартной Fmoc-технологии. Каждый пептид имел сдвиг на 1 аминокислоту, как показано ниже:
Пептид HEAL-26 | Последовательность |
POP-1 | HEALTGTEKLIETYF |
POP-2 | EALTGTEKLIETYFS |
POP-3 | ALTGTEKLIETYFSK |
POP-4 | LTGTEKLIETYFSKN |
POP-5 | TGTEKLIETYFSKNY |
POP-6 | GTEKLIETYFSKNYQ |
POP-7 | TEKLIETYFSKNYQD |
POP-8 | EKLIETYFSKNYQDY |
POP-9 | KLIETYFSKNYQDYE |
POP-10 | LIETYFSKNYQDYEY |
POP-11 | IETYFSKNYQDYEYL |
POP-12 | ETYFSKNYQDYEYLI |
Пептиды анализировали с использованием HEAL-26-специфичных гибридом, полученных от мышей DR2.
Из этих пептидов, POP-4, POP-7 и POP-8 были идентифицированы как эпитопы.
Пример 3 - Идентификация эпитопов в TWTT-28
Синтезировали панель 15-членных перекрывающихся пептидов, охватывающих TWTT-28, с использованием стандартной Fmoc-технологии. Каждый пептид имел сдвиг на 1 аминокислоту. Пептиды анализировали с использованием TWTT-28-специфичных гибридом, полученных от мышей DR2.
Как эпитопы были идентифицированы пептиды от POP-14 до POP-18, имеющие следующие последовательности:
Пептиды TWTT-28 | Последовательность |
POP-14 | WTTCQSIAFPSKTSA |
POP-15 | TTCQSIAFPSKTSAS |
POP-16 | TCQSIAFPSKTSASI |
POP-17 | CQSIAFPSKTSASIG |
POP-18 | QSIAFPSKTSASIGS |
Пример 4 - Идентификация эпитопов в GVLP-28
Синтезировали панель 15-членных перекрывающихся пептидов, охватывающих GVLP-28, с использованием стандартной Fmoc-технологии. Каждый пептид имел сдвиг на 1 аминокислоту. Пептиды анализировали с использованием GVLP-28-специфичных гибридом, полученных от мышей DR2.
Как эпитоп был идентифицирован пептид POP-22, имеющий следующую последовательность: VLPWNAFPGKVCGSN.
ПРИМЕР 5 - Ex vivo анализ толерантности
Для оценки способности эпитопов индуцировать толерантность авторы изобретения сначала определяли способность этих эпитопов ингибировать иммунный ответ ex vivo. Для этой цели мыши HLA-DRB1*1501 предварительно получали отдельный эпитоп в режиме эскалации дозы, а затем были примированы соответствующим длинным пептидом. Через 10 дней после примирования спленоциты (SPL) и клетки лимфатических узлов (LNC) переводили в культуру и стимулировали соответствующим длинным пептидом в течение 3 дней для оценки их пролиферации по включению 3H-тимидина и оценки продуцирования цитокинов с помощью мультиплексных систем профилирования цитокинов (фигура 5).
Изучение толеризации показало, что предварительное введение POP-4 приводило к ингибированию пролиферации T-клеток и подавлению продуцирования цитокинов Th1/Thl7 (значительному снижению уровней IFN-γ, TNF-α и IL-17) в лимфатических узлах (фигура 6) и селезенке (фигура 7). HEAL-26 (фигура 6 и 7) приводил к снижению пролиферации и уменьшению продуцирования IL-17 как в SPL, так и в LNC. Однако также наблюдалось увеличение уровня IL-5, что свидетельствовало о переключении продуцирования с Th1/Thl7 цитокинов на Th2 цитокины, когда мыши предварительно получали HEAL-26.
POP-15 и TWTT-28 очень хорошо ингибировали пролиферацию и продуцирование цитокинов в SPL и LNC. В случае POP-15 отсутствовала разница в пролиферации для спленоцитов, однако имели место небольшие различия в продуцировании цитокинов. Действительно, мыши, предварительно получавшие POP-15, продуцировали меньше IFN-γ (статически достоверно), меньше GM-CSF и меньше IL-17. Кроме того, имело место значительное ингибирование пролиферации и продуцирования цитокинов (IFN-γ, GM-CSF и IL-17) в LNC, когда мыши предварительно получали POP-15.
В случае POP-22 результаты были менее очевидными из-за очень слабого ответа PBS мышей. Однако можно было наблюдать эффект предварительного воздействия POP-22 и GVLP-28. Действительно, индекс стимуляции показывает снижение пролиферации LNC при использовании POP-22 (фигура 12 и 14) и GVLP-28 (фигура 14). Также наблюдали значительное ингибирование продуцирования IL-17 этими клетками, когда мыши предварительно получали POP-22 или GVLP-28.
Материалы и методы
Мыши
Мышей HLA-DRB1*1501 (мышей DR2) получали от Lars Fugger (L.S. Madsen et al. A humanized model for multiple sclerosis using HLA-DR2 and a human T-cell receptor. Nature genet 1999, 23, 343-347) и проводили обратное скрещивание с мышами Ab0. Полученные мыши DR2 экспрессировали молекулу HLA-DRB1*1501, но не молекулу MHC мыши.
Пептиды
Длинные пептиды и 15-членные пептиды синтезировали при помощи GL Biochem Ltd (Shangai, China) и хранили в диметилсульфоксиде (ДМСО, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MA) при -80°C.
Изучение пептидов, связывающихся с HLA-DRB1*1501
Сервер NetMHCII 2.2
Сервер NetMHCII 2.2 позволяет прогнозировать связывание пептидов с HLA-DRB1*1501 с использованием искусственных нейронных сетей. Прогнозируемые значения выражаются в величинах нМ IC50. В выходных данных указаны сильно и слабо связывающиеся пептиды. Связывающиеся с высокой аффинностью пептиды имеют величину IC50 ниже 50 нМ, а слабо связывающиеся пептиды имеют величины IC50 ниже 500 нМ. Результат представлен в виде прогностических баллов, рассчитанных следующим образом: 1-log50000(афф). Адрес веб-сайта:
http://wvvw.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII.
База данных иммунных эпитопов (IEDB): консенсусный метод
Для каждого пептида создавали процентильный ранг для каждого из четырех методов (ARB, комбинаторная библиотека, SMM_align и Sturniolo) путем сравнения баллов пептида с баллами пяти миллионов случайных 15-членных пептидов, выбранных из базы данных SWISSPROT. Малочисленный процентильный ранг свидетельствовал о высокой аффинности. Усредненный процентильный ранг для четырех методов затем использовали для создания ранга для консенсусного метода. Адрес веб-сайта:
http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_II_binding.html.
Определение иммуногенности длинных пептидов
Примирование и ЭАЭ (экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит)
Трансгенные мыши HLA-DRB1*1501 получали инъекцию 100 мкл смеси, содержащей 100 мкг длинного пептида в PBS (Lonza, Verviers, Belgium) или только PBS с полным адъювантом Фрейнда (CFA; BD Difco, Oxford, UK), содержащим 4 мг/мл Mycobacterium tuberculosis (MTb, BD Difco, Oxford, UK), подкожно в основание хвоста. Для изучения ЭАЭ мыши получали инъекцию 200 нг коклюшного токсина одновременно с примированием и через 2 дня. Затем мышей ежедневно осматривали, взвешивали и определяли степень тяжести заболевания в баллах.
Культура клеток
В день 10 дренирующие лимфатические узлы и селезенку удаляли и спленоциты и клетки лимфатических узлов выделяли и культивировали в среде X-vivo 15 (с добавлением глютамина, пенициллина и стрептомицина; Lonza, Verviers, Belgium) в 96-луночных плоскодонных планшетах. Для анализа пролиферации 0,5×106 клеток/лунку в объеме 200 мкл/лунку культивировали с пептидом в различных концентрациях.
Тест на пролиферацию и анализ цитокинов
Через 3 дня культивирования отбирали 60 мкл супернатанта (не затрагивая клетки) и замораживали. 25 мкл/лунку меченого тритием тимидина, предварительно разведенного до 20 мкКи/мл (сток 5 мКи; PerkinElmer, Waltham, MA), добавляли к клеткам до конечной концентрации 0,5 мкКи/лунку. Клетки инкубировали при температуре 37°C. Через 18 часов планшеты замораживали. Затем оттаявший материал собирали из планшетов и просчитывали на β-счетчике (жидкостной сцинтилляционный счетчик Wallac 1450 MicroBeta TriLux). Затем супернатант анализировали с помощью системы Th1/Th2 10plex FlowCytomix Multiplex (Bender) для мышей.
Получение клонов T-клеток
Примирование и создание линии T-клеток:
В день 0 пять трансгенных мышей HLA-DRB1*1501 получали инъекцию 100 мкг длинного пептида в CFA с 4 мг/мл Mycobacterium tuberculosis в основание хвоста. Примированную PBS контрольную группу использовали в качестве контроля для примирования. В день 10 дренирующие лимфатические узлы и селезенки удаляли и выделяли спленоциты и клетки лимфатических узлов. Спленоциты и клетки лимфатических узлов смешивали и CD4 T-клетки очищали с использованием набора для очистки по отрицательному принципу (нетронутые CD4 T-клетки; Miltneyi, Bergisch Gladbach, Germany). Затем CD4 T-клетки повторно стимулировали с облученными спленоцитами (3000 рад) в качестве APC (антигенпредставляющих клеток) от мышей HLA-DRB1*1501 в соотношении 1:1 при концентрации примерно 5×106 клеток/мл и с длинным пептидом в концентрации 10 мкг/мл в 6-луночном планшете. Стимуляцию проводили в среде X-vivo 15, чтобы избежать активации клеток, специфичных для эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). В день 4 к клеткам добавляли рекомбинантный человеческий IL-2 в концентрации 20 Ед/мл (R&D, Mineapolis, MN). В день 7 все клетки собирали и от мертвых клеток освобождались путем разделения в градиенте плотности фиколла (Histopaque 1083, Sigma-Aldrich, St Louis, MA). Затем клетки повторно стимулировали с облученными спленоцитами от мышей DR2 в соотношении APC:CD4 T-клетки, равном 2:1. Вновь в культуру добавляли длинный пептид в концентрации 10 мкг/мл. На этот раз использовали RPMI-5% ЭТС (Biosera, Ringmer, UK; с добавлением HEPES, пенициллина, стрептомицина, глютамина: Lonza; и β-меркаптоэтанола: Gibco). В день 7 клетки собирали, разделяли в фиколле и проводили слияние.
Слияние:
1×107 клеток BW5147 (коллекция клеточных культур Агентства защиты здоровья (Health Protection Agency), Salisbury, UK) и 1×106 линейных CD4 T-клеток смешивали вместе и промывали в бессывороточной среде при температуре 37°C в 50-мл пробирке с использованием максимальных параметров торможения на центрифуге для получения плотного осадка. Супернатант сливали и оставшийся супернатант удаляли пипеткой. Клетки оставляли на водяной бане на 5 минут, чтобы оставшиеся капли среды могли стечь, после чего капли удаляли пипеткой. Клеточный осадок осторожно, но тщательно ресуспендировали. Затем добавляли 1 мл ПЭГ (полиэтиленгликоль, 40-50% раствор, Sigma-Aldrich, St Louis, MA) с температурой 37°C в течение 45 секунд, держа клетки в мини-водяной бане в вытяжном шкафу. Клетки инкубировали при температуре 37°C в течение 45 секунд. 1 мл бессывороточной среды с температурой 37°C добавляли в течение 30 секунд, при этом поворачивая пробирку, затем таким же образом добавляли 2 мл и после этого также добавляли 3, 4, 10 и 30 мл, как указано выше. Пробирку очень медленно переворачивали и инкубировали при температуре 37°C в течение 5 минут. Затем клетки центрифугировали в течение 5 минут со скоростью 1300 об/мин при комнатной температуре (RT) без использования тормоза. Супернатант осторожно удаляли с помощью пипетки (примерно 1 мл оставляли над осадком). Добавляли 50 мл бессывороточной среды с температурой RT, не разрыхляя осадок клеток. Клетки вновь осаждали центрифугированием, как указано, и промывание повторяли, используя полную среду. Затем клетки ресуспендировали в 50 мл полной среды 10%-ЭТС с температурой RT и высаживали в четыре 96-луночных плоскодонных планшета (100 мкл/лунку). Вслед за этим в пробирку добавляли 38 мл полной среды RPMI-10% ЭТС и предыдущий этап повторяли дважды, заканчивая 3 серийными разбавлениями (всего 12 планшетов) и инкубировали при температуре 37°C. Через 48 часов 100 мкл 2x среды HAT (гипоксантин-аминоптерин-тимидин, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MA) добавляли в каждую лунку. К 6 дню начинали появляться гибридомы. Клоны поддерживали в 1X среде HAT до достижения ими стабильности, затем переводили их в среду HT (гипоксантин-тимидин Sigma-Aldrich, Saint Louis, MA) на 2-3 недели, а затем в полную среду RPMI. Клоны регулярно замораживали, поскольку они могли стать нестабильными (90% ЭТС + 10% ДМСО).
Оценка антигенной специфичности клонов
100 мкл клеток гибридом культивировали с 5×104 клеток MGAR (линия человеческих клеток, экспрессирующих HLA-DRB1*1501, коллекция клеточных культур Агентства защиты здоровья, Salisbury, UK) в лунках плоскодонного 96-луночного планшета. В лунки добавляли 50 мкл полной среды RPMI-10% ЭТС, содержащей длинный пептид в концентрации 10 мкг/мл, или такой же объем ДМСО (разбавитель пептида). Через 48 ч 120 мкл супернатанта удаляли и проводили анализ ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) на IL-2 мыши. Клоны, продуцирующие IL-2, узнавали используемый антиген. Оставшиеся супернатанты замораживали при -20°C.
IL-2 ELISA
96-луночные планшеты (Immunosorb 96 well, Nunc, Roskilde, Denmark) покрывали по 50 мкл/лунку очищенными антителами крысы против IL-2 мыши в качестве захватывающих Ат (BD Biosciences, Oxford, UK), разведенными 1:250 в карбонатном буфере (3,56 г Na2CO3 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MA), 8,4 г NaHCO3 (Fisher Scientific, Loughborough, UK), 1 л воды Elgastat; pH 9,5) и инкубировали в течение ночи при температуре 4°C. После 2 промываний в PBS-Tween (1 л 10x PBS, 9 л дистиллированной воды, 0,5 мл Tween (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MA)) добавляли 200 мкл/лунку PBS-10% ЭТС и инкубировали при RT в течение 1 часа. После 3 промываний в PBS-Tween, 50 мкл супернатанта или серийно разведенного стандарта IL-2 (BD Biosciences, Oxford, UK) (в PBS-10% ЭТС) добавляли в лунки и инкубировали 2 часа при RT. После 4 промываний в PBS-Tween (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MA) добавляли 50 мкл/лунку биотинилированных антител крысы против IL-2 мыши (BD Biosciences, Oxford, UK), разведенных 1:1000 в 10% ЭТС/PBS, и инкубировали в течение 1 часа при RT. После 4 промываний добавляли 50 мкл/лунку конъюгата экстравидин-пероксидаза (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MA), разведенного 1:1000 в PBS, и инкубировали 30 минут при RT. После 4 промываний добавляли 50 мкл/лунку раствора субстрата* и инкубировали при RT до отчетливого изменения цвета раствора. Реакцию останавливали, добавляя 50 мкл/лунку 2M H2SO4 (BDH, Poole, UK) и планшеты просчитывали при 450 нм (550 нм реф.) на ELISA-ридере (SpectraMax Pro, Molecular Device, Sunnyvale, CA). *Раствор субстрата: 10 мл фосфат-цитратного буфера 0,1 M (5,14 мл 0,2 M Na2HPO4 (BDH, Poole, UK), 4,86 мл 0,1 M цитрата (Sigma), 10 мл воды Elgastat), 0,1 мл TMB (размороженный 3,3',5,5'-тетраметилбензидин в концентрации 10 мг/мл в ДМСО, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MA), 6 мкл пероксида водорода (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MA).
Независящая от процессинга антигена система представления
Специфические клоны впоследствии тестировали в отношении их ответов на 15-членные пептиды (POP-1 до POP-12) с фиксированными или нефиксированными клетками MGAR. С этой целью, 1×105 клеток из отдельных клонов культивировали с 5×104 фиксированных или свежих клеток MGAR в 96-луночном плоскодонном планшете. Для фиксирования клеток MGAR 20×106 клеток MGAR инкубировали в течение 5 минут с 6 мл 0,5% параформальдегида (PFA, BDH, Poole, UK) (pH 7) при RT и затем добавляли 6 мл глицина (Wisher Scientific, Loughborough, UK) в концентрации 0,4 M для остановки реакции. Затем клетки промывали и ресуспендировали в RPMI-10% ЭТС. В отдельные лунки добавляли каждый из 15-членных пептидов в концентрации 10 мкг/мл, разведенный в RPMI-10% ЭТС. Лунку, содержащую ДМСО вместо пептида, использовали для каждого клона в качестве отрицательного контроля и лунку, содержащую длинный пептид, использовали в качестве положительного контроля. Через 48 часов культивирования собирали 120 мкл супернатанта и анализировали методом ELISA для оценки продуцирования IL-2.
Индукция толерантности путем введения эпитопа
Трансгенным мышам HLA-DRB*1501 предварительно вводили эпитоп в режиме эскалации дозы (0,1, 1, 10 и 3 раза 100 мкг) или 100 мкл PBS в день -15, -13, -11, -8, -6, -4. В день 0 проводили примирование мышей путем введения 100 мкг длинного пептида в CFA с 4 мг/мл Mycobacterium tuberculosis инъекцией в основание хвоста. Через 10 дней собирали паховые лимфатические узлы и селезенки. Пролиферацию и продуцирование цитокинов LNC и спленоцитами анализировали, как описано выше.
Для специалистов в данной области будут очевидны различные модификации и вариации описанных способов и системы по изобретению без отклонения от объема и сущности изобретения. Хотя изобретение описано применительно к конкретным вариантам осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не должно быть ограничено такими конкретными вариантами осуществления. Действительно, различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые очевидны для специалистов в области химии или молекулярной биологии, или родственных областях, должны входить в объем настоящего изобретения. Все публикации, упомянутые в приведенном выше описании, включены в настоящий документ посредством ссылки.
Claims (20)
1. Пептид, способный связываться с молекулой MHC класса I или II in vitro и быть представленным T-клетке без процессинга антигена и который выбран из следующих пептидов PLP:
PLP 39-53: LTGTEKLIETYFSKN (SEQ ID NO. 7);
PLP 42-56: TEKLIETYFSKNYQD (SEQ ID NO. 8);
PLP 43-57: EKLIETYFSKNYQDY (SEQ ID NO. 9);
PLP 180-194: WTTCQSIAFPSKTSA (SEQ ID NO. 10);
PLP 181-195: TTCQSIAFPSKTSAS (SEQ ID NO. 11);
PLP 182-196: TCQSIAFPSKTSASI (SEQ ID NO. 12);
PLP 183-197: CQSIAFPSKTSASIG (SEQ ID NO. 13);
PLP 184-198: QSIAFPSKTSASIGS (SEQ ID NO. 14);
PLP 208-222: VLPWNAFPGKVCGSN (SEQ ID NO. 15);
PLP 36-61: HEALTGTEKLIETYFSKNYQDYEYLI (SEQ ID NO. 1);
PLP 179-206: TWTTCQSIAFPSKTSASIGSLCADARMY (SEQ ID NO. 2) и
PLP 207-234: GVLPWNAFPGKVCGSNLLSICKTAEFQM (SEQ ID NO. 3).
2. Применение пептида по п.1 в лечении или профилактике демиелинизирующего заболевания у субъекта.
3. Применение пептида по п.2, где заболевание представляет собой рассеянный склероз.
4. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество одного или более пептидов по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент, для применения в лечении или профилактике демиелинизирующего заболевания.
5. Способ лечения или профилактики демиелинизирующего заболевания у субъекта, который нуждается в этом, включающий этап введения пептида по п.1 субъекту.
6. Способ по п.5, где заболевание представляет собой рассеянный склероз.
7. Применение пептида по п.1 в производстве лекарственного средства, предназначенного для профилактики или лечения демиелинизирующего заболевания.
8. Применение по п.7, где заболевание представляет собой рассеянный склероз.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB1300683.8 | 2013-01-15 | ||
GBGB1300683.8A GB201300683D0 (en) | 2013-01-15 | 2013-01-15 | Peptide |
PCT/IB2014/058234 WO2014111841A2 (en) | 2013-01-15 | 2014-01-13 | Peptide |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2015134357A RU2015134357A (ru) | 2017-02-22 |
RU2667428C2 true RU2667428C2 (ru) | 2018-09-19 |
Family
ID=47757994
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015134357A RU2667428C2 (ru) | 2013-01-15 | 2014-01-13 | Пептид |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US20150352197A1 (ru) |
EP (1) | EP2945965B8 (ru) |
JP (2) | JP6407888B2 (ru) |
KR (1) | KR102129763B1 (ru) |
CN (1) | CN105102477B (ru) |
AU (1) | AU2014206593B2 (ru) |
CA (2) | CA3154542A1 (ru) |
DK (1) | DK2945965T3 (ru) |
ES (1) | ES2694660T3 (ru) |
GB (1) | GB201300683D0 (ru) |
HK (1) | HK1211595A1 (ru) |
HU (1) | HUE040547T2 (ru) |
IL (1) | IL239870B (ru) |
MX (1) | MX369413B (ru) |
PL (1) | PL2945965T3 (ru) |
PT (1) | PT2945965T (ru) |
RU (1) | RU2667428C2 (ru) |
SG (1) | SG11201505530XA (ru) |
TR (1) | TR201815667T4 (ru) |
WO (1) | WO2014111841A2 (ru) |
ZA (1) | ZA201504986B (ru) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7419229B2 (ja) * | 2017-08-14 | 2024-01-22 | 百明信康生物技術(浙江)有限公司 | 方法 |
US20230172894A1 (en) | 2020-05-06 | 2023-06-08 | Imcyse Sa | Combination treatment for fumarate-related diseases |
BR112023024546A2 (pt) | 2021-06-01 | 2024-02-15 | Imcyse Sa | Métodos de tratamento usando peptídeos imunogênicos |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996032957A1 (en) * | 1995-04-20 | 1996-10-24 | Brigham & Women's Hospital | Modulation of cytokine patterns of human autoreactive t-cell clones |
US6037135A (en) * | 1992-08-07 | 2000-03-14 | Epimmune Inc. | Methods for making HLA binding peptides and their uses |
WO2003033645A2 (en) * | 2001-10-17 | 2003-04-24 | Yeda Research And Development Co. Ltd | Synthetic peptides and dna sequences for treatment of multiple sclerosis |
WO2003040165A2 (en) * | 2000-10-19 | 2003-05-15 | Epimmune Inc. | Hla class i and ii binding peptides and their uses |
US20070055049A1 (en) * | 1992-08-07 | 2007-03-08 | Grey Howard M | HLA binding motifs and peptides and their uses |
RU2387453C2 (ru) * | 2004-06-25 | 2010-04-27 | АйДи БАЙОМЕДИКАЛ КОРПОРЕЙШН ОФ КВЕБЕК | Композиции и способы лечения неврологических нарушений |
WO2012041867A2 (en) * | 2010-09-27 | 2012-04-05 | China Agricultural University | Combined antigen and dna vaccine for preventing and treating autoimmune diseases |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1997035879A1 (en) * | 1996-03-28 | 1997-10-02 | Immulogic Pharmaceutical Corporation | Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptides and uses thereof |
US8188218B2 (en) * | 2006-10-27 | 2012-05-29 | University Of Kansas | Bi-functional peptides for multiple sclerosis treatment and diagnosis |
-
2013
- 2013-01-15 GB GBGB1300683.8A patent/GB201300683D0/en not_active Ceased
-
2014
- 2014-01-13 SG SG11201505530XA patent/SG11201505530XA/en unknown
- 2014-01-13 WO PCT/IB2014/058234 patent/WO2014111841A2/en active Application Filing
- 2014-01-13 CA CA3154542A patent/CA3154542A1/en active Pending
- 2014-01-13 TR TR2018/15667T patent/TR201815667T4/tr unknown
- 2014-01-13 AU AU2014206593A patent/AU2014206593B2/en active Active
- 2014-01-13 EP EP14703176.9A patent/EP2945965B8/en active Active
- 2014-01-13 JP JP2015552189A patent/JP6407888B2/ja active Active
- 2014-01-13 US US14/760,492 patent/US20150352197A1/en not_active Abandoned
- 2014-01-13 CN CN201480009124.4A patent/CN105102477B/zh active Active
- 2014-01-13 ES ES14703176.9T patent/ES2694660T3/es active Active
- 2014-01-13 KR KR1020157020498A patent/KR102129763B1/ko active IP Right Grant
- 2014-01-13 MX MX2015009086A patent/MX369413B/es active IP Right Grant
- 2014-01-13 PT PT14703176T patent/PT2945965T/pt unknown
- 2014-01-13 HU HUE14703176A patent/HUE040547T2/hu unknown
- 2014-01-13 CA CA2897894A patent/CA2897894C/en active Active
- 2014-01-13 RU RU2015134357A patent/RU2667428C2/ru active
- 2014-01-13 DK DK14703176.9T patent/DK2945965T3/en active
- 2014-01-13 PL PL14703176T patent/PL2945965T3/pl unknown
-
2015
- 2015-07-09 IL IL239870A patent/IL239870B/en active IP Right Grant
- 2015-07-10 ZA ZA2015/04986A patent/ZA201504986B/en unknown
- 2015-12-11 HK HK15112228.2A patent/HK1211595A1/xx unknown
-
2018
- 2018-07-27 JP JP2018141119A patent/JP2018193390A/ja not_active Withdrawn
-
2019
- 2019-03-26 US US16/365,365 patent/US20190275126A1/en not_active Abandoned
-
2021
- 2021-03-01 US US17/188,318 patent/US20220016226A1/en not_active Abandoned
-
2023
- 2023-08-11 US US18/448,678 patent/US20240148843A1/en active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6037135A (en) * | 1992-08-07 | 2000-03-14 | Epimmune Inc. | Methods for making HLA binding peptides and their uses |
US20070055049A1 (en) * | 1992-08-07 | 2007-03-08 | Grey Howard M | HLA binding motifs and peptides and their uses |
WO1996032957A1 (en) * | 1995-04-20 | 1996-10-24 | Brigham & Women's Hospital | Modulation of cytokine patterns of human autoreactive t-cell clones |
WO2003040165A2 (en) * | 2000-10-19 | 2003-05-15 | Epimmune Inc. | Hla class i and ii binding peptides and their uses |
WO2003033645A2 (en) * | 2001-10-17 | 2003-04-24 | Yeda Research And Development Co. Ltd | Synthetic peptides and dna sequences for treatment of multiple sclerosis |
RU2387453C2 (ru) * | 2004-06-25 | 2010-04-27 | АйДи БАЙОМЕДИКАЛ КОРПОРЕЙШН ОФ КВЕБЕК | Композиции и способы лечения неврологических нарушений |
WO2012041867A2 (en) * | 2010-09-27 | 2012-04-05 | China Agricultural University | Combined antigen and dna vaccine for preventing and treating autoimmune diseases |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220016226A1 (en) | Peptide | |
JP2019104754A (ja) | アネキシン−1(リポコルチン1)をモジュレートすることによる自己免疫疾患の処置方法 | |
US10377800B2 (en) | Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) peptide | |
JP6476181B2 (ja) | ペプチド | |
Hudemann et al. | Human Desmocollin 3‒Specific IgG Antibodies Are Pathogenic in a Humanized HLA Class II Transgenic Mouse Model of Pemphigus | |
KR20040108650A (ko) | 미엘린 염기성 단백질 기원의 면역허용원 펩타이드 | |
Didona et al. | Humoral epitope spreading in autoimmune bullous diseases: An update | |
Potomkina et al. | Lishchuk-Yakymovych K., Chopyak V. | |
JP2011116719A (ja) | Hla−dr4エピトープの同定と、関節炎治療への応用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HZ9A | Changing address for correspondence with an applicant |