CN105102477B

CN105102477B - 肽

Info

Publication number: CN105102477B
Application number: CN201480009124.4A
Authority: CN
Inventors: D.赖思; H.斯特里特; L.奥多尼兹
Original assignee: Apitope Technology Bristol Ltd
Current assignee: Baimingxinkang Biotechnology Zhejiang Co ltd
Priority date: 2013-01-15
Filing date: 2014-01-13
Publication date: 2019-03-19
Anticipated expiration: 2034-01-13
Also published as: DK2945965T3; WO2014111841A2; RU2667428C2; IL239870B; EP2945965B1; US20150352197A1; MX2015009086A; US20240148843A1; KR102129763B1; CN105102477A; EP2945965A2; EP2945965B8; HK1211595A1; US20190275126A1; PL2945965T3; RU2015134357A; MX369413B; JP6407888B2; IL239870A0; CA3154542A1

Abstract

本申请提供了一种能够与MHC分子体外结合并被呈递至T细胞而无需抗原加工的肽(即apitope)，所述肽包含以下蛋白脂质蛋白(PLP)肽的全部或一部分：PLP 36‑61:HEALTGTEKLIETYFSKNYQDYEYLI(SEQ ID NO.1)PLP 179‑206:TWTTCQSIAFPSKTSASIGSLCADARMY(SEQ ID NO.2)PLP 207‑234:GVLPWNAFPGKVCGSNLLSICKTAEFQM(SEQ ID NO.3)。本申请还提供了该肽在药物组合物中的用途以及使用该肽治疗和/或预防疾病的方法。

Description

肽

技术领域

本发明涉及来自蛋白脂质蛋白(PLP)的肽。具体地，本发明涉及包含衍生自PLP的一个亲水区段的肽，其能够与MHC分子体外结合并被呈递给T细胞而无须抗原加工。本申请还涉及该肽在治疗和/或预防疾病中的用途。

背景技术

多发性硬化(MS)是影响中枢神经系统的慢性退行性疾病，特征在于神经轴突的脱髓鞘。MS会造成众多生理和精神症状，并且通常发展为生理缺陷和认知功能障碍。疾病通常在年轻人(20至40岁)中发病，在女性中更常见，并且在世界范围内影响超过一百万人。

MS的病程各不相同，并且会潜伏或随时间稳步发展。已根据进展模式描述了MS的几种亚型。患有MS的人会患有几乎任何神经症状或迹象，包括知觉变化，如丧失敏感度或发麻、刺痛或麻痹(感觉迟钝和感觉异常)、肌肉虚弱、阵挛、肌肉痉挛或移动困难；协调和平衡困难(共济失调)；语言问题(构音障碍)或吞咽问题(吞咽困难)、视觉问题(眼球震颤、视神经炎(包括光幻视)或复视)、疲劳、急性或慢性疼痛以及膀胱和肠困难。

目前MS被认为是免疫介导性病症，其中人体自身的免疫系统攻击并损伤了髓鞘质。

没有已知的针对MS的治愈方法。已证明，几种现有疗法在疾病侵袭(复发)后的功能恢复中、在预防或降低新的疾病侵袭(复发)的程度或频率中、或者在预防或降低残疾程度中是有效的。然而，很多现有MS疗法有副作用或耐受不良。因而需要对能有效治疗MS并有效缓解或减少MS的症状的MS替代疗法。

发明内容

本发明人已确定了一系列衍生自蛋白脂质蛋白(PLP)的肽，所述肽可以通过固定的抗原呈递细胞呈递给T细胞。这些肽可有效预防和/或治疗脱髓鞘疾病，如多发性硬化。

因此，在第一方面，本发明提供了能够与MHC分子体外结合并被呈递给T细胞而无需抗原加工的肽，且所述肽包含以下蛋白脂质蛋白(PLP)区段的全部或一部分：

PLP 36-61:HEALTGTEKLIETYFSKNYQDYEYLI(SEQ ID No.1)

PLP 179-206:TWTTCQSIAFPSKTSASIGSLCADARMY(SEQ ID No.2)

PLP 207-234:GVLPWNAFPGKVCGSNLLSICKTAEFQM(SEQ ID No.3)。

所述肽可包含以下区段中的一部分：

PLP 39-57:LTGTEKLIETYFSKNYQDY(SEQ ID NO.4)

PLP 180-198:WTTCQSIAFPSKTSASIGS(SEQ ID NO.5)

PLP 208-222:VLPWNAFPGKVCGSN(SEQ ID NO.6)

所述肽可选自以下PLP肽：

PLP 39-53:LTGTEKLIETYFSKN(SEQ ID NO.7)

PLP 42-56:TEKLIETYFSKNYQD(SEQ ID NO.8)

PLP 43-57:EKLIETYFSKNYQDY(SEQ ID NO.9)

PLP 180-194:WTTCQSIAFPSKTSA(SEQ ID NO.10)

PLP 181-195:TTCQSIAFPSKTSAS(SEQ ID NO.11)

PLP 182-196:TCQSIAFPSKTSASI(SEQ ID NO.12)

PLP183-197:CQSIAFPSKTSASIG(SEQ ID NO.13)

PLP 184-198:QSIAFPSKTSASIGS(SEQ ID NO.14)

PLP 208-222:VLPWNAFPGKVCGSN(SEQ ID NO.15)

PLP 36-61:HEALTGTEKLIETYFSKNYQDYEYLI(SEQ ID NO.1)

PLP 179-206:TWTTCQSIAFPSKTSASIGSLCADARMY(SEQ ID NO.2)和

PLP 207-234:GVLPWNAFPGKVCGSNLLSICKTAEFQM(SEQ ID NO.3)

在第二方面，本发明提供了根据本发明的第一方面的肽，其用于治疗和/或预防脱髓鞘疾病。

在第三方面，本发明提供了包含一种或多种根据本发明的第一方面的肽的药物组合物。

在第四方面，本发明提供了治疗和/或预防有此需要的受试者中的脱髓鞘疾病的方法，所述方法包含向所述受试者给药根据本发明的第一方面所述的肽的步骤。

在第五方面，本发明涉及根据本发明的第一方面的肽在制造用于预防和/或治疗脱髓鞘疾病的药物中的用途。

与本发明的第二、第四和第五方面有关，所述疾病可为多发性硬化。

附图说明

图1–图1：三种PLP肽区段在体外和体内产生应答，以及所述应答与DR结合预测相关。A，大体上代表计算机模拟的PLP肽与HLA-DRB1*1501的结合预测(IEDB和NetMHCII法)，以及这些肽在这些小鼠中诱导增殖应答的能力。B和C代表这些长肽中的4种诱导EAE的能力(2组独立实验)。

图2–确定HEAL-26中的apitope。

图3–确定TWTT-28中的apitope。

图4–确定GVLP-28中的apitope。

图5–诱导耐受性(tolerisation)方案。

图6–来自用HEAL-26或POP-4预处理的小鼠的LNC的增殖和细胞因子生成。A，代表来自用HEAL-26或POP-4apitope预处理小鼠的LNC的胸腺嘧啶核苷掺入的均值+/-标准误差(SEM)。

图7–来自用HEAL-26或POP-4预处理的小鼠的SPL的增殖和细胞因子生成。A，代表来自用HEAL-26或POP-4apitope预处理小鼠的SPL的胸腺嘧啶核苷掺入的均值+/-SEM。

图8–来自用TWTT-28预处理的小鼠的LNC的增殖和细胞因子生成。A，代表来自用TWTT-28apitope预处理小鼠的LNC的胸腺嘧啶核苷掺入的均值+/-SEM。

图9–来自用TWTT-28预处理的小鼠的SPL的增殖和细胞因子生成。A，代表来自用TWTT-28apitope预处理小鼠的SPL的胸腺嘧啶核苷掺入的均值+/-SEM。

图10–来自用POP-15预处理的小鼠的LNC的增殖和细胞因子生成。A，代表来自用POP-15apitope预处理小鼠的LNC的胸腺嘧啶核苷掺入的均值+/-SEM。

图11–来自用POP-15预处理的小鼠的SPL的增殖和细胞因子生成。A，代表来自用POP-15apitope预处理小鼠的SPL的胸腺嘧啶核苷掺入的均值+/-SEM。

图12–来自用POP-22预处理的小鼠的LNC的增殖和细胞因子生成。A，代表来自用POP-22apitope预处理小鼠的LNC的胸腺嘧啶核苷掺入的均值+/-SEM。

图13–来自用POP-22预处理的小鼠的SPL的增殖。A，代表来自用POP-22apitope预处理小鼠的SPL的胸腺嘧啶核苷掺入的均值+/-SEM。

图14–来自用POP-22或GVLP-28预处理的小鼠的LNC的增殖和细胞因子生成。A，代表来自用POP-22(左图)或GVLP-28(右图)apitope预处理小鼠的LNC的胸腺嘧啶核苷掺入的均值+/-SEM。

图15–用POP-22或GVLP-28预处理的小鼠的SPL的增殖和细胞因子生成。A，代表来自用POP-22或GVLP-28apitope预处理小鼠的SPL的胸腺嘧啶核苷掺入的均值+/-SEM。

对于图6至15的每张图，B，表示胸腺嘧啶核苷掺入的刺激指数。C，表示在培养物上清液中分泌的细胞因子的量。在B和C中，每剂量的每个点表示单只小鼠，而带横杠的表示中值。P是用Mann-Whitney检验计算的。仅显示了低p值。小于0.05的p值被认为是显著的。

具体实施方式

在第一方面，本发明涉及肽。

肽

术语“肽”根据其标准含义是用来指一系列残基(通常为L-氨基酸)，通常通过α-氨基和相邻氨基酸的羧基之间的肽键彼此相连。该术语包括修饰的肽和合成的肽类似物。

本发明的肽的长度为能够与主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类分子体外结合并被呈递给T细胞而无需抗原加工。换句话说，该肽能够直接与MHC分子的肽结合槽结合而无需在一个端点或两个端点进行任何修剪。

与MHC I类分子结合的肽通常为7至13个氨基酸、更通常地为8至10个氨基酸的长度。该肽的结合通过以下方式在其两个端点得到稳定，所述方式为肽的主链原子与所有MHCI类分子的肽结合槽内的非可变位点之间的接触。在所述槽的两个端点处都具有非可变位点，其与肽的氨基和羧基末端结合。肽长度的变化通过肽主链的卷曲来调节，通常在允许所需柔性的脯氨酸或甘氨酸残基处发生。

与MHC II类分子结合的肽通常为8至20个氨基酸之间的长度，更通常地为10至17个氨基酸之间的长度，并且可以更长。这些肽以沿着两端开放的MHC II肽结合槽(与MHC I类肽结合槽不同)伸展的构象存在。主要通过主链原子与排列形成肽结合槽的保守残基接触而使肽维持在合适的位置。

本发明的肽可以通过化学方法制备(Peptide Chemistry,A practicalTextbook.Mikos Bodansky,Springer-Verlag,Berlin.)。例如，可以通过固相技术合成肽(Roberge JY等人(1995)Science 269:202-204)，从树脂上切除，并通过制备性高效液相色谱纯化(如Creighton(1983)Proteins Structures And Molecular Principles,WHFreeman and Co,New York NY)。例如，根据制造商提供的说明书使用ABI 431A肽合成仪(Perkin Elmer)可实现自动合成。

或者，可通过重组方式、或通过从更长的多肽上切除来制备所述肽。例如，可以通过从髓鞘蛋白脂质蛋白上切除来获得所述肽。肽的组成可通过氨基酸分析或测序来确定(如Edman降解法)。

髓鞘蛋白脂质蛋白(PLP)

髓鞘质是非传导性(电绝缘)材料，其形成层即髓鞘，该层通常仅环绕神经元的轴突。其对于神经系统发挥正常功能十分重要。组成髓鞘质的一些蛋白为髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)和蛋白脂质蛋白(PLP)。

髓鞘蛋白脂质蛋白(PLP)，即中枢神经系统(CNS)髓鞘质中最丰富的蛋白，是疏水性完整膜蛋白。

人类PLP序列如SEQ ID No.16中所示。

SEQ ID No.16

1glleccarc lvgapfaslv atglcffgva lfcgcgheal tgtekliety fsknyqdyey

60linvihafqy viygtasfff lygalllaeg fyttgavrqi fgdyktticg kglsatvtgg

120qkgrgsrgqh qahslervch clgkwlghpd kfvgityalt vvwllvfacs avpvyiyfnt

180wttcqsiafp sktsasigsl cadarmygvl pwnafpgkvc gsnllsickt aefqmtfhlf

240iaafvgaaat lvslltfmia atynfavlkl mgrgtkf

本发明的肽可衍生自PLP序列的亲水区段。所述肽可衍生自经抗原呈递细胞对抗原天然加工而产生的抗原片段。

PLP的亲水区段为：

PLP 36-61:TGTEKLIETYFSKNYQDYEYLI(SEQ ID No.17)

PLP 88-119:TTGAVRQIFGDYKTTICGKGLSATVTGG(SEQ ID No.18)

PLP 104-135:CGKGLSATVTGGQKGRGSRGQHQAHSLE(SEQ ID No.19)

PLP 119-150:RGSRGQHQAHSLERVCHCLGKWLGHPDK(SEQ ID No.20)

PLP 179-206:CQSIAFPSKTSASIGSLCADARMY(SEQ ID No.21)

PLP 192-219:GSLCADARMYGVLPWNAFPGKVC(SEQ ID No.22)

PLP 207-234:WNAFPGKVCGSNLLSICKTAEFQM(SEQ ID No.23)

PLP 260-276:FAVLKLMGRGTKF(SEQ ID No.24)

所述肽可包含以下全部蛋白脂质蛋白(PLP)区段或其中的一部分：

PLP 36-61:HEALTGTEKLIETYFSKNYQDYEYLI(SEQ ID NO.1)

PLP 179-206:TWTTCQSIAFPSKTSASIGSLCADARMY(SEQ ID NO.2)

PLP 207-234:GVLPWNAFPGKVCGSNLLSICKTAEFQM(SEQ ID NO.3)。

所述肽可包含来自这些区段中的一个的最小表位。

所述肽可包含以下区段中的一部分：

PLP 39-57:LTGTEKLIETYFSKNYQDY(SEQ ID NO.4)

PLP 180-198:WTTCQSIAFPSKTSASIGS(SEQ ID NO.5)

PLP 208-222:VLPWNAFPGKVCGSN(SEQ ID NO.6)

所述肽可选自以下PLP肽：

PLP 39-53:LTGTEKLIETYFSKN(SEQ ID NO.7)

PLP 42-56:TEKLIETYFSKNYQD(SEQ ID NO.8)

PLP 43-57:EKLIETYFSKNYQDY(SEQ ID NO.9)

PLP 180-194:WTTCQSIAFPSKTSA(SEQ ID NO.10)

PLP 181-195:TTCQSIAFPSKTSAS(SEQ ID NO.11)

PLP 182-196:TCQSIAFPSKTSASI(SEQ ID NO.12)

PLP183-197:CQSIAFPSKTSASIG(SEQ ID NO.13)

PLP 184-198:QSIAFPSKTSASIGS(SEQ ID NO.14)

PLP 208-222:VLPWNAFPGKVCGSN(SEQ ID NO.15)

PLP 36-61:HEALTGTEKLIETYFSKNYQDYEYLI(SEQ ID NO.1)

PLP 179-206:TWTTCQSIAFPSKTSASIGSLCADARMY(SEQ ID NO.2)和

PLP 207-234:GVLPWNAFPGKVCGSNLLSICKTAEFQM(SEQ ID NO.3)。

所述肽可包含来自这些肽中的一种的最小表位。

具体地，所述肽可包含以下中的一种、由以下中的一种组成或包含以下中的一种的最小表位：

PLP 39-53:LTGTEKLIETYFSKN(SEQ ID NO.7)

PLP 181-195:TTCQSIAFPSKTSAS(SEQ ID NO.11)

PLP 179-206:TWTTCQSIAFPSKTSASIGSLCADARMY(SEQ ID NO.2)

Apitope

在适应性免疫应答中，T淋巴细胞能够识别蛋白质抗原的内在表位。抗原呈递细胞(APC)吸收蛋白抗原并将它们降解成短的肽片段。肽可与细胞内的主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类分子结合并被转运至细胞表面。当与MHC分子一起被呈递至细胞表面时，该肽可被T细胞识别(通过T细胞受体(TCR))，在这种情况下该肽为T细胞表位。

T细胞表位在对任何抗原(无论是自身的或外来的)的适应性免疫应答中扮演了重要的角色。已通过使用实验模型证实了T细胞表位在超敏性疾病(包括过敏、自身免疫性疾病和移植排斥)中扮演的重要角色。通过注射与佐剂组合的合成肽(基于T细胞表位的结构)可以诱导炎症性或过敏性疾病。

相比之下，已显示可以通过给药可溶形式的肽表位来诱导对特定肽表位的免疫耐受。在实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE-一种多发性硬化(MS)的模型)(Metzler和Wraith(1993)Int.Immunol.5:1159-1165；Liu和Wraith(1995)Int.Immunol.7:1255-1263；Anderton和Wraith(1998)Eur.J.Immunol.28:1251-1261)；以及关节炎、糖尿病和葡萄膜视网膜炎的实验模型(如以上Anderton和Wraith(1998)中所述)中，给药可溶性的肽抗原被证实是一种抑制疾病的有效方法。这也被证实是一种治疗EAE中疾病进展的方法(如上所述的Anderton和Wraith(1998))。

耐受原性肽在治疗或预防疾病中的用途已吸引了相当多的注意力。其一个原因是已显示某些耐受原性表位可下调针对相同组织内的不同抗原的T细胞应答。这种被称为“旁观者抑制”的现象是指使用特定的耐受原性肽(如上所述的Anderton和Wraith(1998))可以诱导针对给定抗原内的多于一个表位(优选所有表位)和针对给定疾病的多于一个抗原的耐受性。这避免了需确定特定疾病中的全部病原性抗原的需要。

肽也是一种有利的治疗选择，这是由于肽相对较低的成本以及可生产出具有改变的免疫性状的肽类似物的事实。因而可以对肽进行修饰以改变其与MHC或TCR的相互作用。

这种方法的一个可能的问题是，已经显示并不是所有作为T细胞表位的肽都能够诱导耐受性。髓鞘碱性蛋白(MBP)肽89-101是一种免疫接种后的免疫显性抗原，同时在引发T细胞反应和诱导EAE方面也具有非常有效的免疫原性。然而，已显示，当以溶液形式给药时，该肽在诱导耐受性方面是无效的(如上所述的Anderton和Wraith(1998))。

对于所观察到的在T细胞表位诱导耐受性能力方面的等级提出了一系列解释(如以上Anderton和Wraith(1998)中所述)。具体地，已提出在肽对MHC的亲和力和致耐受性间存在相关性(如上述的Liu和Wraith(1995))，但这与一些观察结果不相符。例如，非致耐受性的MBP[89-101]以相对较高的亲和力与I-A^S结合。因而无法直接预测哪些肽将诱导耐受性。

本发明人已证明，如果肽表位具有无需抗原加工就被未成熟的APC呈递的合适大小，则其可诱导免疫耐受(国际专利申请PCT/GB01/03702)。因此，可以通过这样的事实，即一些表位在其能被MHC分子呈递前需要进一步的加工，来解释一些T细胞表位是致耐受性而另一些无法诱导耐受性的观察结果。虽然当与佐剂结合注射时其有能力诱导疾病，但当以可溶性形式给药时这些需要进一步加工的表位无法诱导耐受性。

不需要进一步加工的表位能够诱导耐受性，并被发明人称为“apitope”(不依赖于抗原加工的表位(Antigen Processing Independent epiTOPES))。

不依赖于抗原加工的呈递系统(APIPS)

本申请的肽能够与MHC分子在体外结合并被呈递给T细胞而无需抗原加工。

可以使用“无加工”系统测试肽是否能够无需抗原加工就与MHC分子结合。该系统应能够通过MHC分子将抗原呈递给T细胞，但无法加工抗原。因而可以使用不依赖于抗原加工的呈递系统(APIPS)测试肽在体外结合至MHC分子并无需抗原加工就被呈递给T细胞的能力。

APIPS的实例包括：

a)固定的APC(含有或不含CD28抗体)；

b)含有MHC I类或II类分子的脂质膜(含有或不含CD28抗体)；和

c)纯化的天然或重组的板结合(plate-bound)形式的MHC(含有或不含CD28抗体)。

已知使用固定的APC来探究T细胞应答，例如在研究中通过测量对经截短的肽的应答来探究多肽内的最小表位(Fairchild等人(1996)Int.Immunol.8:1035-1043)。可使用例如甲醛(通常为多聚甲醛)或戊二醛来固定APC。

脂质膜(可为平面膜或脂质体)可通过使用人工脂质来制备，或可为来自APC的质膜/微粒体碎片。

在使用中，可将APIPS施用于组织培养皿的孔中。然后加入肽抗原，并通过添加挑选的T细胞系或克隆来检测肽与APIPS的MHC部分的结合。可通过本领域已知的任何方法，例如通过掺入³H胸腺嘧啶核苷或细胞因子分泌，来测量T细胞系或克隆的活化。

如果肽能够通过APIPS被呈递给T细胞，那么它就能够无需抗原加工就与MHC分子结合，且这就是apitope。

耐受性

本发明的肽能够诱导针对蛋白脂质蛋白的耐受性。

如本文所用，术语“致耐受性”是指能够诱导耐受性。

耐受性是对抗原不应答。对自身抗原的耐受性是免疫系统的一个重要特征，当失去该耐受性时，可导致自身免疫性疾病。适应性免疫系统必须保持对大量的各种传染源的应答能力的同时避免其自身组织中含有的自身抗原的免疫攻击。这在很大程度上受不成熟的T淋巴细胞对胸腺中凋亡细胞死亡的灵敏度来调控(中枢性耐受)。然而，不是所有的自身抗原都能在胸腺中检测到，因此自身反应性的胸腺细胞的死亡并不完全。因而，也存在这样的机制，外周组织中成熟的自身反应性T淋巴细胞藉此机制获得耐受性(外周耐受)。Anderton等人在1999年给出了对中枢和外周耐受性机制的综述(Immunological Reviews169:123-137)。

可通过在至少一部分CD4+T细胞中诱导无反应性来产生或表征耐受性。为了活化T细胞，肽必须与能够向T细胞传递两种信号的“专业”APC缔合。第一信号(信号1)通过APC细胞表面上的MHC-肽复合体来递送，并通过TCR被T细胞接收。第二信号(信号2)通过APC表面上的共同刺激性分子(如CD80和CD86)来递送，并被T细胞表面上的CD28接收。人们认为，当T细胞在缺乏信号2的情况下接收信号1时，其并未被活化，并且事实上变得无反应性。无反应性的T细胞对随后的抗原刺激也无反应，并且能够抑制其它免疫应答。无反应性的T细胞被认为牵涉在介导T细胞耐受性中。

在能够与MHC分子一起被呈递之前需要加工的肽不诱导耐受性，因为它们必须被成熟的抗原呈递细胞处理。成熟的抗原呈递细胞(如巨噬细胞、B细胞和树突细胞)能够进行抗原加工，但也能够向T细胞递送信号1和2，导致T细胞活化。另一方面，apitope能够在未成熟的APC上与II类MHC结合。因而其无需共同刺激就被呈递给T细胞，导致T细胞无反应性和耐受性。

当然，apitope也能与成熟APC细胞表面处的MHC分子结合。然而，免疫系统含有比成熟的APC更丰富的不成熟APC(有人提出少于10％的树突细胞被活化，Summers等人(2001)Am.J.Pathol.159:285-295)。因此，apitope的默认状态为无反应性/耐受性，而非活化。

已显示当耐受性被诱导时，抗原特异性的CD4+T细胞的增殖能力降低。同时，由这些细胞产生的IL-2、IFN-γ和IL-4的生成被下调，但IL-10的生成增加。已显示，对处于肽诱导的耐受性状态中的小鼠中的IL-10进行中和完全恢复了对疾病的敏感性。有人已提出，一定数量的调控细胞持续保持在产生IL-10同时介导免疫调节的耐受状态(Burkhart等人(1999)Int.Immunol.11:1625-1634)。

因此可通过各种技术来监测耐受性的诱导，其包括：

(a)降低对感染其中所述肽为体内目标表位的疾病的敏感性；

(b)在CD4+T细胞中诱导无反应性(可通过随后的体外抗原刺激来检测)；

(c)改变CD4+T细胞群，包括：

(i)降低增殖；

(ii)下调例如IL-2、IFN-γ和IL-4的生成；和

(iii)增加IL-10的生成。

目标疾病

本发明的肽可用于治疗和/或预防疾病。

所述疾病可为脱髓鞘疾病，如肾上腺脑白质营养不良、白质消融病或多发性硬化(MS)。

本发明的肽在治疗和/或预防多发性硬化(MS)中十分有效。多发性硬化(MS)是一种慢性炎症性疾病，特征在于在整个CNS白质中传播并在各位点和各个时期发生的多脱髓鞘病变(McFarlin和McFarland,1982New England J.Medicine307:1183-1188和1246-1251)。MS被认为是由自身反应性T细胞介导的。

药物组合物

在第二方面，本发明涉及包含一种或多种本发明第一方面的肽的药物组合物。

本发明人预测，尽管存在“旁观者抑制”，但可能有必要靶向多个不同的T细胞克隆以有效诱导耐受性。因此可向个体给药多种肽以预防或治疗疾病。

药物组合物可例如包含1至20种apitope，例如1至15种、2至8种或4至6种apitope。

当存在两种或更多种apitope时，药物组合物可为试剂盒形式，其中一些或每种apitope均单独提供以用于同时给药、单独给药或顺序给药。

或者(或另外)，如果药物组合物(或其任何部分)以多剂量形式给药，则每一剂量可单独包装。

药物组合物可包含治疗或预防有效量的特定或每种apitope，同时任选地包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

同样，在本发明的药物组合物中，特定或每种apitope可与任何合适的一种或多种粘合剂、一种或多种润滑剂、一种或多种悬浮剂、一种或多种包衣剂或一种或多种助溶剂混合。

给药

所述肽可在无佐剂的情况下以可溶性形式给药。

所述肽可通过鼻内途径、粘膜途径、皮下途径或皮内途径给药。

研究显示，当以可溶性形式经腹膜内(i.p.)、静脉内(i.v.)或鼻内(i.n.)或口服给药时，所述肽可诱导T细胞耐受性(如上所述的Anderton和Wraith(1998)；如上所述的Liu和Wraith(1995)；Metzler和Wraith(1999)Immunology 97:257-263)。

小鼠中的研究表明，诱导耐受性所需的肽的给药持续时间取决于受体中T细胞的前体频率(precursor frequency)(如上所述的Burkhart等人(1999))。在多个实验研究中已证明，需要重复给药肽来诱导耐受性(如上所述的Burkhart等人(1999))。因此，肽的确切剂量和给药次数将取决于个体；然而，在优选的实施方式中进行多次给药。

如果同时给药多种肽，其可以为适合单次给药或多次给药的“鸡尾酒”形式。或者，可优选进行多次给药，但改变各次之间肽的相对浓度。

在优选的实施方式中，可沿用“剂量梯度增加”方案，其中以递增的浓度向患者多次给药。该方法已被用于例如磷脂酶A2肽在针对蜂毒变态反应的免疫治疗的应用中(Müller等人(1998)J.Allergy Clin Immunol.101:747-754和Akdis等人(1998)J.Clin.Invest.102:98-106)。

实施例

以下实施例用于举例说明本发明，但不能被解释为对本发明的限制。本发明特别涉及这些实施例中所描述的具体实施方式。

实施例1–探究蛋白脂质蛋白(PLP)序列的亲水片段

材料和方法

抗原

由于PLP是大部分疏水性的蛋白，有必要使用该序列的亲水部分。为此，进行亲水性研究，并合成以下八种来自PLP分子的亲水结构域的肽：

36-61(26个):TGTEKLIETYFSKNYQDYEYLI-NH2

88-119(32个):TTGAVRQIFGDYKTTICGKGLSATVTGG-NH2

104-135(32个):CGKGLSATVTGGQKGRGSRGQHQAHSLE-NH2

119-150(32个):RGSRGQHQAHSLERVCHCLGKWLGHPDK-NH2

179-206(28个):CQSIAFPSKTSASIGSLCADARMY-NH2

192-219(28个):GSLCADARMYGVLPWNAFPGKVC-NH2

207-234(28个):WNAFPGKVCGSNLLSICKTAEFQM-NH2

260-276(17个):FAVLKLMGRGTKF–NH2

对每种肽进行计算机模拟研究以预测DR2(HLA-DRB1*1501)结合能力，并进行体外(增殖测定)和体内(EAE诱导)研究以探究应答。结果示于图1中。

经证明，三种肽在体外和体内研究中都产生应答，并且这与DR2结合预测相关。这些肽为HEAL-26、TWTT-28和GVLP-28(使用以上序列中以粗体表示的前四个氨基酸来识别肽)。

实施例2–确定HEAL-26中的apitope

使用标准F-moc化学合成跨越HEAL-26的一组15-个的重叠肽。每种肽中有一个氨基酸被替换，如下所示：

HEAL-26肽	序列
		POP-1	HEALTGTEKLIETYF
POP-2	EALTGTEKLIETYFS
		POP-3	ALTGTEKLIETYFSK
POP-4	LTGTEKLIETYFSKN
		POP-5	TGTEKLIETYFSKNY
POP-6	GTEKLIETYFSKNYQ
		POP-7	TEKLIETYFSKNYQD
POP-8	EKLIETYFSKNYQDY
		POP-9	KLIETYFSKNYQDYE
POP-10	LIETYFSKNYQDYEY
		POP-11	IETYFSKNYQDYEYL
POP-12	ETYFSKNYQDYEYLI

使用来自DR2小鼠的HEAL-26特异性杂交瘤来分析所述肽。在这些肽中，POP-4、POP-7和POP-8被确定为apitope。

实施例3–确定TWTT-28中的apitope

使用标准F-moc化学合成跨越TWTT-28的一组15-个的重叠肽。每种肽中有一个氨基酸被替换。使用来自DR2小鼠的TWTT-28特异性杂交瘤来分析肽。

具有以下序列的POP-14至POP-18被确定为apitope：

TWTT-28肽	序列
		POP-14	WTTCQSIAFPSKTSA
POP-15	TTCQSIAFPSKTSAS
		POP-16	TCQSIAFPSKTSASI
POP-17	CQSIAFPSKTSASIG
		POP-18	QSIAFPSKTSASIGS

实施例4–鉴定GVLP-28中的apitope

使用标准F-moc化学合成跨越GVLP-28的一组15-个的重叠肽。每种肽中有一个氨基酸被替换。使用来自DR2小鼠的TWTT-28特异性杂交瘤来分析肽。

具有以下序列的肽POP-22被确定为apitope：VLPWNAFPGKVCGSN。

实施例5–离体耐受性测定

为了评估apitope诱导耐受性的能力，发明人首先确定这些apitope离体抑制免疫应答的能力。为此，用按比例增加剂量的各apitope预处理HLA-DRB1*1501小鼠，然后用相应的长肽引发(prime)。引发后10天，培养脾细胞(SPL)和淋巴结细胞(LNC)，并用相应的长肽刺激3天，以通过³H-胸腺嘧啶核苷掺入评估其增殖，并通过多重细胞因子分析系统评估细胞因子的生成(图5)。

诱导耐受性研究显示，POP-4预处理在淋巴结(图6)和脾(图7)中诱导了对T细胞增殖的抑制和对Th1/Th17细胞因子生成的抑制(IFN-γ、TNF-α和IL-17显著减少)。HEAL-26(图6和7)在SPL和LNC中都减少了增殖并减少了IL-17的生成。但是当用HEAL-26预处理小鼠时也观察到IL-5的增加，显示由Th1/Th17细胞因子向Th2细胞因子转移。

POP-15和TWTT-28很好地抑制了SPL和LNC的增殖以及细胞因子生成。对于POP-15，在脾细胞的增殖方面没有区别，但在细胞因子的生成方面有少许不同。事实上，用POP-15处理的小鼠产生更少的IFN-γ(统计学上显著的)、更少的GM-CSF和更少的IL-17。此外，当用POP-15处理小鼠时，在LNC内存在对增殖和细胞因子(IFN-γ、GM-CSF和IL-17)的显著抑制。

对于POP-22，结果不太明显，这是因为PBS小鼠非常低的应答。然而，可观察到用POP-22和GVLP-28预处理的效果。事实上，刺激指数显示使用POP-22(图12和14)和GVLP-28(图14)时LNC增殖减少。当用POP-22或GVLP-28预处理小鼠时也观察到了对这些细胞产生IL-17的显著抑制。

材料和方法

小鼠

从Lars Fugger获得HLA-DRB1*1501小鼠(DR2小鼠)(LS Madsen等人，A humanizedmodel for multiple sclerosis using HLA-DR2and a human T-cell receptor.Naturegenet 1999.23,343-347)并使其回交至Ab⁰小鼠中。所得DR2小鼠表达HLA-DRB1*1501分子，而非小鼠MHC分子。

肽

由GL Biochem Ltd(Shanghai,China)合成长肽和15-个的肽，并将其在-80℃下储存于二甲基亚砜中(DMSO,Sigma-Aldrich,Saint Louis,MA)。

探究肽与HLA-DRB1*1501的结合

NetMHCII 2.2服务器

NetMHCII 2.2服务器使用人工神经元网络预测肽与HLA-DRB1*1501的结合。预测值以nM IC50值给出。在输出结果中标明强结合肽和弱结合肽。高亲和性结合肽具有低于50nM的IC50值，而弱结合肽具有低于500nM的IC50值。结果以预测评分呈现，该评分如下计算：1-log50000(aff)。网址：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII。

免疫表位数据库(IEDB)：共识法

对每种肽，通过将该肽的评分与选自SWISSPROT数据库中五百万种随机的15个的评分相比，针对四种方法(ARB、组合文库、SMM_排列和Sturniolo)中的每一种都产生百分等级。较小数值的百分等级标明较高的亲和性。然后使用四种方法中的中值百分等级产生共识法的等级。网址：http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_II_ binding.html。

确定长肽的免疫原性

引发和EAE(实验性自身免疫性脑脊髓炎)

向HLA-DRB1*1501转基因小鼠在尾根部皮下注射100μl含有100μg长肽的PBS(Lonza,Verviers,Belgium)或仅注射100μl的PBS，还注射具有4mg/ml结核分枝杆菌(MTb,BD Difco,Oxford,UK)的完全弗氏佐剂(CFA；BD Difco,Oxford,UK)。对于EAE研究，在启动的同时和2天后向小鼠注射200ng的百日咳毒素。随后每天对小鼠进行追踪、称重和给疾病评分。

细胞培养

在第10天，移除引流淋巴结和脾，分离脾细胞和淋巴结细胞并将其在96孔平底板中在X-vivo 15培养基(补充谷氨酰胺、青霉素和链霉素；Lonza,Verviers,Belgium)中培养。以200μl/孔中0.5x10⁶个细胞/孔进行培养，具有不同浓度的肽，从而进行增殖测定。

增殖测定和细胞因子分析

培养3天后，收获60μl的上清液(不扰动细胞)并冷冻。向细胞中以20μl/孔加入氘标记胸腺嘧啶核苷的20μCi/ml预稀释液(原液5mCi；PerkinElmer,Waltham,MA)直至最终浓度为0.5μCi/孔。在37℃下培育细胞。18小时后将板冷冻。然后收获解冻的板并用β计数器读数(Wallac 1450MicroBeta TriLux Liquid Scintillation Counter)。然后用小鼠Th1/Th210plex FlowCytomix多细胞因子检测试剂盒(Bender)分析上清液。

产生T细胞克隆

启动和建立T细胞系

在第0天，向五只HLA-DRB1*1501转基因小鼠在尾根部注射在具有4mg/ml的结核分枝杆菌的CFA中的100μg长肽。将PBS启动的对照组作为启动对照。在第10天，移除引流淋巴结和脾，并分离脾细胞和淋巴结细胞。混合脾细胞和淋巴结细胞并使用负性纯化试剂盒(未碰触过的CD4T细胞；Miltneyi,Bergisch Gladbach,Germany)纯化CD4T细胞。然后在6孔板中用约5x10⁶个细胞/ml以1:1的比例用辐射过的脾细胞(3000rad)作为HLA-DRB1*1501小鼠的APC(抗原呈递细胞)和10μg/ml的长肽再刺激CD4T细胞。在X-vivo 15培养基中进行刺激，以避免活化对胎牛血清(FCS)具有特异性的细胞。在第4天，向细胞中加入20U/ml的重组人类IL-2(R&D,Mineapolis,MN)。在第7天，收获所有细胞，并通过Ficoll密度梯度分离(Histopaque 1083,Sigma-Aldrich,St Louis,MA)除去死细胞。然后以APC:CD4T细胞＝2:1的比例用辐射过的来自DR2小鼠的脾细胞再刺激细胞。再一次以10μg/ml将长肽加入培养物中。这次使用RPMI-5％FCS(Biosera,Ringmer,UK；补充有HEPES、青霉素、链霉素、谷氨酰胺：Lonza；和β-巯基乙醇：GIBCO)。在第7天，收获细胞，加入聚蔗糖(ficooled)并融合。

融合：

将1x10⁷BW5147细胞(Health Protection Agency Culture Collections,Salisbury,UK)和1x10⁶CD4T细胞系混合在一起，并在50ml管中在37℃的无血清培养基中在离心机上使用最高制动设定以获得密实沉淀物。倒掉上清液，并用吸液管移除多余的上清液。将细胞置于水浴中5分钟以使残留的培养基滴下，然后用吸液管移除。轻轻地但彻底地使细胞沉淀再悬浮。然后历时45秒加入1ml的37℃的PEG(聚乙二醇，40％-50％的溶液，Sigma-Aldrich,St Louis,MA)，在通风橱中将细胞保持在微型水浴中。在37℃下培育细胞45秒。在转动试管的同时历时30秒加入1ml的37℃的无血清培养基，然后以相同方式加入2ml，然后如上所述也再加入3ml、4ml、10ml和30ml。缓慢倒转试管，并在37℃下培育5分钟。然后在室温(RT)下以1300rpm对细胞离心5分钟，其间没有暂停。用吸液管小心移除上清液(高于沉淀物留下约1ml)。保持细胞沉淀不动，加入50ml的RT无血清培养基。将细胞如上所述离心并用完全培养基重复清洗。然后将细胞再悬浮在50ml的10％-FCS的RT完全培养基中，并分配到四个96孔平底板中(100μl/孔)。然后向试管中加入38ml的完全RPMI-10％FCS，并重复两次上述步骤以获得在37℃培育的3种连续的稀释液(共12个板)。48小时后，向每个孔中加入100μl的2x HAT(次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷，Sigma-Aldrich,SaintLouis,MA)培养基。至第6天，开始出现杂交瘤。将克隆保持在HAT 1X培养基中直至其稳定，然后转入HT(次黄嘌呤-胸腺嘧啶核苷，Sigma-Aldrich,Saint Louis,MA)培养基中保持2至3周，然后转入完全RPMI。将克隆定期冷冻，因为它们会变得不稳定(90％FCS+10％DMSO)。

评估克隆的抗原特异性

在平底96孔板的孔中将100μl的杂交瘤细胞与5x10⁴的MGAR细胞(表达HLA-DRB1*1501的人类细胞系，Health Protection Agency Culture Collections,Salisbury,UK)一起培养。向孔中加入含有10μg/ml长肽的50μl完全RPMI-10％FCS或相同体积的DMSO(肽的稀释剂)。48小时后，移除120μl的上清液，并进行小鼠IL-2ELISA(酶联免疫吸附测定)。产生IL-2的克隆识别所用的抗原。将残留上清液在-20℃下冷冻。

IL-2 ELISA

用50μl/孔经纯化的大鼠的抗小鼠IL-2捕获Ab(BD Biosciences,Oxford,UK)包被96孔板(Immunosorb 96孔,Nunc,Roskilde,Denmark)，在碳酸盐缓冲液(3.56g Na₂CO₃(Sigma-Aldrich,Saint Louis,MA)、8.4g NaHCO₃(Fisher Scientific,Loughborough,UK)、1L Elgastat水；pH 9.5)中以1:250稀释并在4℃下温育过夜。在用PBS-Tween(1L 10xPBS,9L蒸馏水,0.5ml Tween(Sigma-Aldrich,Saint Louis,MA))清洗2次后，加入200μl/孔的PBS-10％FCS并在RT下温育1小时。在用PBS-Tween清洗3次后，向孔中加入50μl的上清液或IL-2标准品(BD Biosciences,Oxford,UK)稀释液(在PBS-10％FCS中)并在RT下温育2小时。在用PBS-Tween(Sigma-Aldrich,Saint Louis,MA)清洗4次后，加入50μl/孔的在10％FCS/PBS中稀释为1:1000的生物素大鼠抗小鼠IL2(BD Biosciences,Oxford,UK)并在RT下温育1小时。在清洗4次后，加入50μl/孔在PBS中稀释为1:1000的ExtrAvidin过氧化物酶(Sigma-Aldrich,Saint Louis,MA)并在RT下温育30分钟。清洗4次后，加入50μl/孔的底物溶液*并在RT下温育直至观察到明显的颜色变化。使用50μl/孔的2M H₂SO₄(BDH,Poole,UK)使反应终止，并用酶标仪((SpectraMax Pro,Molecular Device,Sunnyvale,CA)在450nm(550nmref)下对板进行读数。*底物溶液：10ml磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液浓度为0.1M(5.14ml浓度为0.2M Na₂HPO₄(BDH,Poole,UK),4.86ml浓度为0.1M的柠檬酸盐(Sigma),10mlElgastat水)，0.1ml的TMB(解冻的于DMSO中的10mg/ml的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，Sigma-Aldrich,Saint Louis,MA)，6μl的过氧化氢(Sigma-Aldrich,Saint Louis,MA)。

不依赖于抗原加工的呈递系统

然后用固定或未固定的MGAR细胞测试特异性克隆对15-个肽(POP-1至POP-12)的应答。为此，在96孔平底板中，将来自各克隆的1x10⁵个细胞与5x10⁴个固定的或新鲜的MGAR细胞一起培养。为了固定MGAR细胞，在RT下用6ml的0.5％多聚甲醛(PFA,BDH,Poole,UK)(pH7)温育20x10⁶的MGAR细胞5分钟，然后加入6ml浓度为0.4M的甘氨酸(Fisher Scientific,Loughborough,UK)使反应终止。然后清洗细胞并将其在RPMI-10％FCS中再悬浮。向各孔中加入10μg/ml的在RPMI-10％FCS中稀释的各15-个肽。对于每种克隆，将含有DMSO而非肽的孔作为阴性对照，并将含有长肽的孔作为阳性对照。培养48小时后，收获120μl的上清液，并用ELISA分析以评估IL-2生成。

用apitope处理来诱导耐受性

在第-15天、第-13天、第-11天、第-8天、第-6天、第-4天用按比例增加剂量(0.1、1、10和3次100μg)的apitope或100μl的PBS预处理HLA-DRB1*1501转基因小鼠。在第0天，用在具有4mg/ml的结核分枝杆菌的CFA中的100μg长肽在尾根部对小鼠进行启动。10天后，收获腹股沟淋巴结和脾。然后如上所述分析LNC和脾细胞的增殖和细胞因子生成。

对本发明所述方法和系统的各种改进和改变，对于本领域技术人员来说是显而易见的，其并未背离本发明的范围和主旨。虽然结合特定优选的实施方式来描述了本发明，但应理解所要求保护的发明不应当过分局限于所述具体实施方式。事实上，本发明意图涵盖那些为了实现本发明而对所记载的模型进行的各种改进，这些改进对于化学或分子生物学或相关领域的技术人员来说是显而易见的。将以上说明书中提到的所有公开出版物引入本文作为参考。

Claims

1.肽，所述肽能够与MHC分子体外结合并被呈递至T细胞而无需抗原加工，其选自以下PLP肽：

PLP 39-53:LTGTEKLIETYFSKN(SEQ ID NO.7)

PLP 42-56:TEKLIETYFSKNYQD(SEQ ID NO.8)

PLP 43-57:EKLIETYFSKNYQDY(SEQ ID NO.9)

PLP 180-194:WTTCQSIAFPSKTSA(SEQ ID NO.10)

PLP 181-195:TTCQSIAFPSKTSAS(SEQ ID NO.11)

PLP 182-196:TCQSIAFPSKTSASI(SEQ ID NO.12)

PLP183-197:CQSIAFPSKTSASIG(SEQ ID NO.13)

PLP 184-198:QSIAFPSKTSASIGS(SEQ ID NO.14)

PLP 208-222:VLPWNAFPGKVCGSN(SEQ ID NO.15)

PLP 36-61:HEALTGTEKLIETYFSKNYQDYEYLI(SEQ ID NO.1)

PLP 179-206:TWTTCQSIAFPSKTSASIGSLCADARMY(SEQ ID NO.2)和

PLP 207-234:GVLPWNAFPGKVCGSNLLSICKTAEFQM(SEQ ID NO.3)。

2.药物组合物，包含一种或多种根据权利要求1所述的肽。

3.根据权利要求1所述的肽在制造用于预防和/或治疗脱髓鞘疾病的药物中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述疾病为多发性硬化。