JP6407888B2 - ペプチド - Google Patents
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Description
本発明者らは、T細胞に対して一定の抗原提示細胞により提示されうる、プロテオリピドタンパク質(PLP)から誘導可能な幾つかのペプチドを同定した。これらのペプチドは多発性硬化症のような脱髄疾患の予防および/または治療において有用でありうる。
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の全体または一部分を含むペプチドを提供する。
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の一部分を含みうる。
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PLP 207-234: GVLPWNAFPGKVCGSNLLSICKTAEFQM (配列番号3)
から選択されうる。
第1の態様において、本発明はペプチドに関する。
「ペプチド」なる語は、典型的には隣接アミノ酸のα-アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合により互いに連結された一連の残基、典型的にはL-アミノ酸を意味する通常の意味で用いられている。この用語は修飾ペプチドおよび合成ペプチド類似体を含む。
ミエリンは、通常はニューロンの軸索のみの周囲にミエリン鞘なる層を形成する誘電体(電気的絶縁体)である。それは神経系の適切な機能に必須である。ミエリンを構成するタンパク質のうちの幾つかは、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)およびプロテオリピドタンパク質(PLP)である。
配列番号16
1 glleccarc lvgapfaslv atglcffgva lfcgcgheal tgtekliety fsknyqdyey
60 linvihafqy viygtasfff lygalllaeg fyttgavrqi fgdyktticg kglsatvtgg
120 qkgrgsrgqh qahslervch clgkwlghpd kfvgityalt vvwllvfacs avpvyiyfnt
180 wttcqsiafp sktsasigsl cadarmygvl pwnafpgkvc gsnllsickt aefqmtfhlf
240 iaafvgaaat lvslltfmia atynfavlkl mgrgtkf
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PLP 179-206: TWTTCQSIAFPSKTSASIGSLCADARMY (配列番号2)。
適応免疫応答においては、Tリンパ球はタンパク質抗原の内部エピトープを認識することができる。抗原提示細胞(APC)はタンパク質抗原を取り込み、それらを短いペプチド断片へと分解する。ペプチドは細胞内で主要組織適合性複合体(MHC)クラスIまたはII分子に結合し、細胞表面に運ばれうる。該ペプチドは、MHC分子と共に細胞表面に提示されると、(T細胞受容体(TCR)を介して)T細胞により認識されることが可能であり、この場合、該ペプチドはT細胞エピトープである。
本発明のペプチドはインビトロでMHC分子に結合することができ、かつ抗原プロセシングを受けることなくT細胞に提示されることができる。
a)固定APC(CD28に対する抗体の存在下または非存在下)、
b)クラスIまたはII MHC分子を含有する脂質膜(CD28に対する抗体の存在下または非存在下)、
c)プレート結合形態の、精製された天然または組換えMHC(CD28に対する抗体の存在下または非存在下)。
本発明のペプチドはプロテオリピドタンパク質に対する寛容を誘発しうる。
(a)該ペプチドがインビボにおける標的エピトープである疾患に罹る感受性の低下;
(b)CD4+ T細胞におけるアネルギーの誘導(これはインビトロにおける抗原での後続チャレンジにより検出されうる);
(c)以下のものを含むCD4+ T細胞集団における変化:
(i)増殖の低減;
(ii)例えばIL-2、IFN-γおよびIL-4の、産生のダウンレギュレーション;
(iii)IL-10の産生の増加。
本発明のペプチドは疾患の治療および/または予防において使用されうる。該疾患は脱髄疾患、例えば副腎白質ジストロフィー、VWM型白質脳症(vanishing white matter disease)または多発性硬化症(MS)でありうる。
第2の態様において、本発明は、本発明の第1の態様の1以上のペプチドを含む医薬組成物に関する。
該ペプチドはアジュバントの非存在下で可溶性形態で投与されうる。
材料および方法
抗原
PLPは主に疎水性のタンパク質であるため、該配列の親水性部分を使用する必要があった。この目的のために、ハイドロパシシティ(hydropathicity)研究を行い、PLP分子の親水性ドメインから以下の8つのペプチドを合成した。
HEAL-26にまたがる15マー重複ペプチドの一群を、標準的なF-moc化学法を用いて合成した。各ペプチドは、以下に示すとおり、1アミノ酸ずつずらされていた。
TWTT-28にまたがる15マー重複ペプチドの一群を、標準的なF-moc化学法を用いて合成した。各ペプチドは1アミノ酸ずつずらされていた。DR2マウスからのTWTT-28特異的ハイブリドーマを使用して、ペプチドを分析した。
GVLP-28にまたがる15マー重複ペプチドの一群を、標準的なF-moc化学法を用いて合成した。各ペプチドは1アミノ酸ずつずらされていた。DR2マウスからのTWTT-28特異的ハイブリドーマを使用して、ペプチドを分析した。
寛容を誘発する該アピトープの能力を評価するために、本発明者らは、まず、エクスビボで免疫応答を抑制するこれらのアピトープの能力を測定した。この目的のために、HLA-DRB1*1501マウスを漸増用量の個々のアピトープで前処理し、ついで対応する長いペプチドでプライミングした。プライミングの10日後、脾細胞(SPL)およびリンパ節細胞(LNC)を、3日間にわたって、対応する長いペプチドと共に培養し、該ペプチドで刺激して、3H-チミジン取り込みによりそれらの増殖を、そして多重サイトカインプロファイリング系によりサイトカイン産生を評価した(図5)。
マウス
HLA-DRB1*1501マウス(DR2マウス)をLars Fugger(LS Madsenら, A humanized model for multiple sclerosis using HLA-DR2 and a human T-cell receptor. Nature genet 1999. 23, 343-347)から入手し、Ab0マウスと戻し交雑させた。生じたDR2マウスはHLA-DRB1*1501分子を発現するが、マウスMHC分子を発現しない。
長いペプチドおよび15マーペプチドがGL Biochem Ltd(Shangai, China)により合成され、ジメチルスルホキシド(DMSO, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MA)中で-80℃で貯蔵された。
NetMHCII 2.2サーバー
NetMHCII 2.2サーバーは、人工ニューロンネットワークを使用して、HLA-DRB1*1501へのペプチドの結合を予測する。予測値はnM IC50値で示される。強力な及び弱い結合性ペプチドが出力において示される。高いアフィニティの結合性ペプチドは50nM未満のIC50値を有し、弱い結合性ペプチドは500nM未満のIC50値を有する。その結果は、以下のとおりに計算された予測スコアとして示される: 1-log50000(aff)。ウェブサイトアドレス: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII。
各ペプチドに関して、4つの方法(ARB、コンビナトリアルライブラリー、SMM alignおよびSturniolo)のそれぞれのパーセンタイル順位を、SWISSPROTデータベースから選択された500万個のランダム15マーのスコアに対して該ペプチドのスコアを比較することにより得た。小さな数字のパーセンタイル順位は高いアフィニティを示す。ついで4つの方法の中央値パーセンタイル順位を用いて、コンセンサス法に関する順位を得た。ウェブサイトアドレス: http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_II_binding.html。
プライミングおよびEAE(実験的自己免疫脳脊髄炎)
HLA-DRB1*1501トランスジェニックマウスに、4mg/ml 結核菌(Mycobacterium tuberculosis)(MTb, BD Difco, Oxford, UK)を含む完全フロイントアジュバント(CFA; BD Difco, Oxford, UK)と共に、PBS(Lonza, Verviers, Belgium)中の100μgの長いペプチドまたはPBSのみを含有する100μlを尾基底部に皮下注射した。EAE研究のために、プライミングと同時に、およびその2日後、200ngの百日咳毒素を該マウスに注射した。ついで毎日、該マウスを追跡観察し、秤量し、疾患に関してスコアリングした。
第10日に、流入領域リンパ節および脾臓を摘出し、脾細胞およびリンパ節細胞を単離し、96ウェル平底プレートにおいてX-vivo 15培地(グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したもの; Lonza, Verviers, Belgium)内で培養した。200μl/ウェル中の0.5×106 細胞/ウェルを増殖アッセイのために種々の濃度のペプチドと共に培養した。
培養内で3日後、60μlの上清を(細胞を乱すことなく)集め、凍結した。20μCi/mlの前希釈(ストック5mCi; PerkinElmer,Waltham, MA)のトリチウム化チミジン25μl/ウェルを0.5μCi/ウェルの最終濃度まで該細胞に加えた。該細胞を37℃でインキュベートした。18時間後、プレートを凍結した。ついで、解凍されたプレートを集め、β-カウンター(Wallac 1450 MicroBeta TriLux Liquid Scintillation Counter)で読取った。ついで上清をマウスTh1/Th2 10plex FlowCytomix Multiplex(Bender)で分析した。
プライミングおよびT細胞系の樹立:
第0日に、5匹のHLA-DRB1*1501トランスジェニックマウスの尾基底部に、4mg/ml 結核菌(Mycobacterium tuberculosis)を含有するCFA中の100μgの長いペプチドを注射した。PBSでプライミングされた対照群をプライミングに関する対照として使用した。第10日に、流入領域リンパ節および脾臓を摘出し、脾細胞およびリンパ節細胞を単離した。脾細胞およびリンパ節細胞を混合し、陰性精製キット(非接触(untouched)CD4 T細胞; Miltneyi, Bergisch Gladbach, Germany)を使用してCD4 T細胞を精製した。ついでCD4 T細胞を、HLA-DRB1*1501マウスからのAPC(抗原提示細胞)としての照射済脾細胞(3000 rad)を1:1の比で約5×106細胞/mlで用いて、10μg/mlの長いペプチドにより、6ウェルプレート内で再刺激した。該刺激は、ウシ胎児血清(FCS)に特異的な細胞を活性化することを避けるためにX-vivo 15培地内で行った。第4日に、20 U/mlの組換えヒトIL-2(R&D, Mineapolis, MN)を該細胞に加えた。第7日に、全ての細胞を集め、死細胞をフィコール密度勾配分離(Histopaque 1083, Sigma-Aldrich, St Louis, MA)により除去した。ついで細胞をDR2マウスからの照射済脾細胞(2:1のAPC:CD4 T細胞の比)で再刺激した。再度、長いペプチドを該培養物に10μg/mlで加えた。今回はRPMI-5% FCS(Biosera, Ringmer, UK; ヘペス(hepes)、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン : Lonzaおよびβ-メルカプトエタノール : ギブコ(gibco)を補充したもの)を使用した。第7日に、細胞を集め、フィコール処理し、融合させた。
1×107個のBW5147細胞(Health Protection Agency Culture Collections, Salisbury, UK)および1×106個のCD4 T細胞系を混合し、硬いペレットのため遠心機上の最高破壊設定を用いて50ml チューブ内で37℃の無血清培地中で洗浄した。上清を注ぎ出し、過剰分をピペットで除去した。細胞を水浴内に5分間放置して、残存培地を滴下させ、ついでピペットで除去した。細胞ペレットを穏やかかつ完全に再懸濁させた。ついで1mlの37℃のPEG(ポリエチレングリコール, 40〜50%溶液, Sigma-Aldrich, St Louis, MA)を45秒かけて加え、該細胞をフード内の小型水浴内に維持した。該細胞を37℃で45秒間インキュベートした。1mlの37℃の無血清培地を、チューブを回旋させながら30秒かけて加え、ついで2mlを同様にして加え、ついで3、4、10および30mlも前記のとおりに加えた。該チューブを非常にゆっくりと反転させ、37℃で5分間インキュベートした。ついで細胞をブレーキ(brake)無しで1300rpmで室温(RT)で5分間遠心分離した。上清をピペットで注意深く除去した(約1mlをペレット上に残した)。50mlのRT無血清培地を、細胞ペレットを除去することなく加えた。該細胞を前記のとおりに遠心沈降させ、完全培地で洗浄を繰返した。ついで細胞を50mlのRT完全培地 10%-FCS中に再懸濁させ、4つの96ウェル平底プレート(100μl/ウェル)内にプレーティングした。ついで38mlの完全RPMI-10% FCSを該チューブに加え、前工程を2回繰返して、37℃でインキュベートされた3系列の希釈(合計12プレート)で完了した。48時間後、100μlの2×HAT(ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MA)培地を各ウェルに加えた。第6日までにハイブリドーマが出現し始めた。クローンを、それらが安定になるまでHAT 1×培地内で維持し、ついでHT(ヒポキサンチン-チミジン, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MA)培地内に2〜3週間に隔離(wean)し、ついで完全RPMI内に隔離した。クローンは不安定になる可能性があるため、それを通常は凍結した(90% FCS + 10% DMSO)。
100μlのハイブリドーマ細胞を5×104個のMGAR細胞(HLA-DRB1*1501を発現するヒト細胞系, Health Protection Agency Culture Collections, Salisbury, UK)と共に平底96ウェルプレートのウェル内で培養した。10μg/mlの長いペプチドを含有する50μlの完全RPMI-10% FCSまたは同体積のDMSO(該ペプチドの希釈剤)を該ウェルに加えた。48時間後、120μlの上清を取り出し、マウスIL-2 ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)を行った。IL-2を産生するクローンは、使用した抗原を認識する。残存上清を-20℃で凍結した。
96ウェルプレート(Immunosorb 96 well, Nunc, Roskilde , Denmark)を50μl/ウェルの精製ラット抗マウスIL-2捕捉Ab(BD Biosciences, Oxford, UK)でコートし、炭酸バッファー(3.56gのNa2CO3 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MA)、8.4gのNaHCO3 (Fisher Scientific, Loughborough, UK)、1Lのエルガスタット(elgastat)水; pH 9.5)中で1:250希釈し、4℃で一晩インキュベートした。PBS-Tween(1Lの10×PBS、9Lの蒸留水、0.5 mlのTween (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MA))中の2回の洗浄の後、200μl/ウェルのPBS-10% FCSを加え、室温で1時間インキュベートした。PBS-Tween中の3回の洗浄の後、50μlの上清またはIL-2標準(BD Biosciences, Oxford, UK)希釈物(PBS-10% FCS中)を該ウェルに加え、室温で2時間インキュベートした。PBS-Tween(Sigma-Aldrich, Saint Louis, MA)中の4回の洗浄の後、10% FCS/PBS中に1:1000希釈された50μl/ウェルのビオチンラット抗マウスIL2(BD Biosciences, Oxford, UK)を加え、室温で1時間インキュベートした。4回の洗浄の後、PBS中に1:1000希釈された50μl/ウェルのエクストラビジン(extravidin)ペルオキシダーゼ(Sigma-Aldrich, Saint Louis, MA)を加え、室温で30分間インキュベートした。4回の洗浄の後、50μl/ウェルの基質溶液*を加え、明らかな色変化が見られるまで室温でインキュベートした。50μl/ウェルの2M H2SO4 (BDH, Poole, UK)を使用して反応を停止させ、プレートをELISAリーダー(SpectraMax Pro, Molecular Device, Sunnyvale, CA)で450nm(550nm ref)で読取った。*基質溶液: 10mlのリン酸-クエン酸バッファー0.1M (5.14 ml 0.2M Na2HPO4 (BDH, Poole, UK)、4.86 mlの0.1M シトラート (Sigma)、10 mlのエルガスタット(elgastat)水)、0.1 mlのTMB (DMSO中、10mg/mlの解凍された3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MA)、6μlの過酸化水素 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MA)。
ついで該特異的クローンを15マーペプチド(POP-1〜POP-12)に対するそれらの応答に関して、固定または非固定MGAR細胞を使用して試験した。この目的のために、個々のクローンからの1×105個の細胞を5×104個の固定または新鮮MGAR細胞と共に96ウェル平底プレート内で培養した。MGAR細胞固定のために、20×106個のMGAR細胞を6mlのパラホルムアルデヒド(PFA, BDH, Poole, UK)0.5% (pH 7)と共に室温で5分間インキュベートし、ついで6mlのグリシン(Fisher Scientific, Loughborough, UK)を0.4Mにて加えて反応を停止させた。ついで該細胞を洗浄し、RPMI-10% FCS中に再懸濁させた。RPMI-10% FCS中に希釈された10μg/mlの各15マーペプチドを個々のウェルに加えた。ペプチドの代わりにDMSOを含有するウェルを陰性対照として各クローンに使用し、長いペプチドを含有するウェルを陽性対照として使用した。培養内で48時間の後、120μlの上清を集め、ELISAにより分析してIL-2産生を評価した。
HLA-DRB1*1501トランスジェニックマウスを漸増用量(0.1、1、10および3× 100μg)のアピトープまたは100μlのPBSで第-15日、第-13日、第-11日、第-8日、第-6日、第-4日に前処理した。第0日に、該マウスを、4mg/mlの結核菌(Mycobacterium tuberculosis)を含有するCFA中の100μgの長いペプチドで尾基底部にプライミング(初回免疫)した。10日後、鼡径リンパ節および脾臓を摘出した。ついでLNCおよび脾細胞による増殖およびサイトカイン産生を前記のとおりに分析する。
Claims (5)
- 以下のPLPペプチド:
PLP 39-53: LTGTEKLIETYFSKN (配列番号7)、
PLP 42-56: TEKLIETYFSKNYQD (配列番号8)、
PLP 43-57: EKLIETYFSKNYQDY (配列番号9)、
PLP 180-194: WTTCQSIAFPSKTSA (配列番号10)、
PLP 181-195: TTCQSIAFPSKTSAS (配列番号11)、
PLP 182-196: TCQSIAFPSKTSASI (配列番号12)、
PLP 183-197: CQSIAFPSKTSASIG (配列番号13)、および
PLP 184-198: QSIAFPSKTSASIGS (配列番号14)、
から選択される、インビトロでMHC分子に結合することができ、かつ抗原プロセシングを受けることなくT細胞に提示されることができるペプチド。 - 請求項1記載の1以上のペプチドを含む、脱髄疾患の治療および/または予防のための医薬組成物。
- 該疾患が多発性硬化症である、請求項2記載の医薬組成物。
- 脱髄疾患の予防および/または治療における使用のための医薬の製造における、請求項1記載のペプチドの使用。
- 該疾患が多発性硬化症である、請求項4記載の使用。
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