RU2660075C1 - Способ хранения клеточных культур в суспензии - Google Patents
Способ хранения клеточных культур в суспензии Download PDFInfo
- Publication number
- RU2660075C1 RU2660075C1 RU2017128728A RU2017128728A RU2660075C1 RU 2660075 C1 RU2660075 C1 RU 2660075C1 RU 2017128728 A RU2017128728 A RU 2017128728A RU 2017128728 A RU2017128728 A RU 2017128728A RU 2660075 C1 RU2660075 C1 RU 2660075C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- container
- volume
- gas
- suspension
- culture
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 239000000725 suspension Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 238000003860 storage Methods 0.000 title abstract description 7
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims abstract description 56
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims abstract description 56
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 claims abstract description 41
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000001307 helium Substances 0.000 claims description 30
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 claims description 30
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 229910052754 neon Inorganic materials 0.000 claims description 15
- GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N neon atom Chemical compound [Ne] GKAOGPIIYCISHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 claims description 12
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229910018503 SF6 Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 claims description 9
- SFZCNBIFKDRMGX-UHFFFAOYSA-N sulfur hexafluoride Chemical compound FS(F)(F)(F)(F)F SFZCNBIFKDRMGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 229910052743 krypton Inorganic materials 0.000 claims description 6
- DNNSSWSSYDEUBZ-UHFFFAOYSA-N krypton atom Chemical compound [Kr] DNNSSWSSYDEUBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960000909 sulfur hexafluoride Drugs 0.000 claims description 6
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 abstract 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 56
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 29
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 11
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 11
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 8
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 5
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 3
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 3
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 239000008150 cryoprotective solution Substances 0.000 description 2
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 238000000079 presaturation Methods 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000566515 Nedra Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- UBAZGMLMVVQSCD-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide;molecular oxygen Chemical compound O=O.O=C=O UBAZGMLMVVQSCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано при хранении клеточных культур. Для криоконсервации используют контейнер с регулируемым объемом и возможностью его герметизации, при этом осуществляют вывод атмосферного газа из внутреннего объема контейнера и последующий ввод объема суспензионной клеточной культуры. Затем в объем контейнера вводят инертный газ при одновременном увеличении объема контейнера до величины, обеспечивающей выбранное соотношение между объемом культуры и объемом инертного газа, размещенных в контейнере. Регулировку объема контейнера осуществляют штоком, снабженным поршнем. Культуру с газом перемешивают в выбранном объеме контейнера при температуре от +4 до +25°С в течение от 10 мин до 2 часов. Далее клеточную суспензию, насыщенную газом, перемещают в более компактный контейнер, с возможностью его герметизации или суспензию оставляют в контейнере с регулируемым объемом. Затем идентифицируют контейнер и помещают его в морозильную камеру с температурой от -80°С до -130°С. Способ криосохранения суспензионной клеточной культуры обеспечивает качество и жизнеспособность клеточных культур при одновременном снижении затрат на криоконсервацию клеток. 15 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 ил.
Description
Область техники
Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано при криоконсервации клеточных суспензий человека, используемых в качестве лечебных препаратов.
Уровень техники
Длительное хранение жизнеспособного биологического материала является необходимым элементом многих технологий в области биологии, медицины, сельского хозяйства. Наиболее длительные сроки хранения биообъектов обеспечивают технологии криоконсервации - способ глубокого замораживания биологических объектов с сохранением их жизнеспособности. Для дальнейшего совершенствования методов криоконсервации необходимо устранить повреждающие факторы, воздействующие на биологические структуры во время замораживания-оттаивания. Одно из направлений используемое в технических решениях связано с использованием инертных газов для повышения выживаемости клеток при криоконсервации.
Известен способ криоконсервации, который включает насыщение клеток в пластикатном контейнере «Компопласт 300», помещенном в металлический криобароконтейнер, инертным газом ксеноном под давлением 0,6 атм в течение 20 мин в условиях комнатной температуры +21±2°C с последующим удалением избытка газа и извлечением из металлического контейнера, замораживанием биообъекта до -28°С в этиловом спирте и перемещением в электроморозильник на -80°С. Размораживание биообъекта осуществляется в водяной ванне 39±1,5°С в течение 1,5 мин [1].
Известен способ консервации биоматериала, включающий размещение биоматериала в стерильной емкости, удаление воздуха из емкости и ее последующую герметизацию, обработку биоматериала в закрытой среде в емкости со смотровым окном ксеноном и последующее охлаждение биоматериала при постоянном визуальном мониторинге состояния биоматериала. Обработку биоматериала производят ксеноном 90-99,999% степенью чистоты до величины давления в 7-9 атм., а последующее охлаждение биоматериала ведут до температуры не более +5°С, но не менее -10°С.[2].
Одно из технических решений описано в патенте РФ №2433173 [3]. В качестве криопротектора при криоконсервации смеси клеток с культуральной средой используют химически чистый газ ксенон - Хе состава 99.999%, а криоконсервацию проводят путем продувки газом Хе до насыщения смеси клеточной культуры (суспензии клеток) в среде DMEM (Sigma), помещенных в открытых пластиковых криопробирках, причем продувку Хе проводят при атмосферном давлении на ледяной бане при 0°С в течении 10-20 мин, после чего криопробирки объемом 2 мл со смесью ММСК насыщенной ксеноном закрывают и помещают в криоконтейнер, который погружают в морозильник типа Sanyo для контролируемого замораживания до -70-85°С со скоростью охлаждения 1°С в минуту и до образования монолита смеси культуральной среды с криопротектором Хе и далее для длительного хранения в хранилище с жидким азотом для последующего использования. Недостатком данного технического решения является возможность снижения воспроизводимости результатов криоконсервации за счет неконтролируемого процесса продувки ксеноном суспензии клеток из-за малой площади открытой поверхности суспензии, поскольку суспензия размещена в криопробирках объемом 2 мл.
В патенте США № US 7129035 [4] раскрыто техническое решение, в котором криоконсервируют фрагменты ткани органов млекопитающих используя барботирование инертными газами раствора, в котором размещены образцы ткани для криоконсервации. Барботирование раствора инертными газами, в том числе азотом, аргоном или гелием осуществляют для удаления растворенного кислорода из раствора. К недостатку данного способа криоконсервации относится то, что микропузырьки газа при барботировании могут повреждать клетки, предназначенные криоконсервации.
Технической задачей изобретения является разработка надежного способа криоконсервации клеточных суспензий, повышающего качество и жизнеспособность клеточных культур при одновременном снижении затрат на криоконсервацию клеток.
Технический результат состоит в увеличении жизнеспособности клеток за счет мягкого перемешивания суспензии с использованием шейкера в контейнере, обеспечивающем выбранное соотношение между объемом культуры и объемом инертного газа размещенных в контейнере.
Сущность изобретения
Поставленная задача решается тем, что в новом способе криосохранения суспензионной клеточной культуры в среде инертного газа после помещения клеточной культуры в подходящую для криоконсервации культуральную среду с добавлением классических криопротекторов или без них, осуществляют ввод суспензионной клеточной культуры в контейнер с регулируемым объемом. На первом этапе осуществляют вывод атмосферного газа из внутреннего объема контейнера затем вводят суспензию клеточной структуры, затем в объем контейнера вводят легкий инертный газ при одновременном увеличении объема контейнера до величины, обеспечивающей выбранное соотношение между объемом культуры и объемом легкого инертного газа, размещенных в контейнере. При этом регулировку объема контейнера осуществляют штоком снабженным поршнем. Далее выдерживают культуру с газом в выбранном объеме контейнера при температуре от +4 до +25°С в течение от 10 мин до 2 часов при мягком перемешивании на шейкере, идентифицируют и помещают контейнер в морозильную камеру с температурой от 80°С до -130°С.
В другом варианте после выдерживания суспензии клеток в атмосфере легкого инертного газа суспензию перемещают в более компактную тару, не содержащую излишнего объема газа: криопробирки, паетты, пакеты, контейнеры.
Следующий аспект изобретения состоит в том, что соотношение объемов суспензионной культуры и объема инертного газа составляет от 0,01 до 0,1
Другой аспект изобретения состоит в том, что инертный газ, выбирают из группы, состоящей из: гелия, аргона и элегаза (гексафторид серы), криптона, ксенона.
Другой аспект изобретения состоит в том, что контейнер выполнен в форме шприца, с объемом от 1 до 5 мл, который выполнен из термостойкой пластмассы и содержит линии градуировки объема.
Перечень чертежей
Фиг. 1. Жизнеспособность клеток HeLa после криоконсервации в присутствии различных газов без применения классических криопротекторов. Где: А) Количество живых клеток сразу после размораживания, протестированное окрашиванием трипановым синим; Б) Развитие культуры клеток после криоконсервации, оцененное по плотности клеточной культуры через сутки культивирования.
Фиг. 2. Данные приведенные на фиг. 2А и фиг. 2Б показывают жизнеспособность клеток HeLa после криоконсервации в присутствии 10% глицерина и газов гелия, неона и атмосферного воздуха (К). Где: А) Количество живых клеток сразу после размораживания, протестированное окрашиванием трипановым синим; Б) Развитие культуры клеток после криоконсервации, оцененное по плотности клеточной культуры через сутки культивирования.
Фиг. 3. Данные приведенные на фиг. 3А и фиг. 3Б показывают жизнеспособность фибробластов NCTCL929 после криоконсервации в присутствии 3% глицерина и насыщением культуры газами гелием, неоном или под воздействием атмосферного воздуха (К). Где: А) Количество живых клеток сразу после размораживания, протестированное окрашиванием трипановым синим; Б) Пролиферативная активность замороженно-оттаянных клеток, оцененная по плотности клеток через сутки культивирования.
Описание изобретения
В процессе изучения влияние насыщения клеточной суспензии инертными газами (гелий, аргон, криптон, ксенон и гексофторид серы) на выживаемость клеток при криоконсервации было обнаружено, что значительное влияние на результат имеет природа газа и способ насыщения газом клеточной суспензии.
Насыщение клеточной суспензии тяжелыми инертными газами (аргоном, криптоном, ксеноном), в том числе часто используемым в биологии аргоном имеет менее выраженный благоприятный эффект или, в отдельных случаях, даже негативное влияние на выживаемость клеток в процессе криоконсервации. Обнаружено, что наиболее благоприятный эффект наблюдается при насыщении суспензии легкими инертными газами: гелием, неоном. Гелий и неон - это легкие газы, имеющие низкую растворимость в воде и водных растворах. Эти газы обладают еще одним интересным свойством - способностью растворяться во льду [5, 6]. При этом коэффициент растворимости во льду даже выше, чем растворимость в воде при той же температуре. То есть если все прочие газы при кристаллизации воды «выдавливаются» в окружающий незамерзший раствор и далее, в процессе вымораживания воды, образуют микропузыри газа, нарушающие структуру замерзающего раствора, то гелий и неон встраиваются в лед без нарушения его структуры. Это способствует тому, что растворы, насыщенные гелием или неоном, при замерзании будут обладать более однородной структурой и содержать меньше механических дефектов.
При этом существенное значение имеет способ насыщения суспензии газом. Насыщение газом методом барботажа (или «промывка» газом) оказывает повреждающее действие на клетки и снижает выживаемость клеточных суспензий в процессе криоконсервации. Мы связываем это с двумя факторами - повреждение клеток газовыми пузырьками в процессе промывки неконтролируемость остаточных концентраций атмосферных газов после окончания процедуры промывки легкими инертными газами. При выдерживании клеточной суспензии в атмосфере легкого инертного газа фиксированного объема происходит насыщение суспензии инертным газом без повреждений клеток и при этом в суспензии остается достаточная остаточная концентрация кислорода и углекислого газа, обеспечивающая оптимальные условия для выживания клеток в процессе криоконсервации. При этом оптимальные концентрации кислорода и углекислого газа обеспечиваются без использования газовых смесей и соответствующего специализированного оборудования.
С другой стороны, помещение клеток в криопротектирующий раствор, заранее насыщенный газом, также имеет более низкую результативность по сравнению с предлагаемой технологией насыщения легкими инертными газами клеточной суспензии (см. пример 4). Очевидно, преднасыщение криопротектирующего раствора инертным газом не обеспечивает оптимального соотношения концентраций инертного газа и физиологических газов (кислорода, углекислого газа).
Согласно изобретению, увеличить воспроизводимость криоконсервации при одновременном расширении возможности применения размороженных клеток после криоконсервации возможно при использовании контейнеров с регулируемым объемом, например, контейнеров, содержащих шток и поршень с помощью которых можно точно установить объем используемого газа при прочих равных условиях.
Из уровня техники известно использование шприцев в качестве контейнеров при криоконсервировании клеточных суспензий. В международной заявке на изобретение № WO 2016019108 приведено описание устройства для применения в качестве крио-шприца и крио контейнера для хранения клеток в жидком азоте и возможности осуществления клеточной терапии. Компоненты устройства выполнены из материала, выдерживающего низкие температуры, например, пластика. Однако это устройство не предназначено для сохранения в нем кроме клеточной суспензии дополнительных газов [7].
В международной заявке на изобретение № WO 2015194872 в качестве контейнера для клеточной терапии и хранения клеточной суспензии при низких температурах используют шприц, но в технологии криосохранения отсутствует смена газовой фазы внутри контейнера при подготовке к криоконсервации. Кроме этого токсичные криопротекторы, в составе суспензии для криоконсервации, заменены на смесь, в состав которой дополнительно входят сахара [8].
Было найдено, что выполнить условия воспроизведения технологии возможно при использовании контейнеров в виде одноразовых шприцев, которые состоят из прозрачного цилиндра, штока-поршня, уплотняющего кольца-манжеты. Например, на основе трехкомпонентного одноразового шприца с линиями градуировки объема. Благодаря наличию резиновой манжеты на поршне, а также за счет покрытия поршня и внутренней полости цилиндра шприца силиконовой смазкой, скольжение поршня шприцев осуществляется без рывков и обеспечивает плавность и точность установки внутреннего объема шприца. Данные качества шприца имеют особенно большое значение при точном дозировании клеточной суспензии и величины объема инертного газа. Кроме этого после разморозки шприца клеточная суспензия готова к введению в млекопитающее при клеточной терапии, так как шприц комплектуется стерильной иглой с колпачком, через которую вводят клеточную суспензию и выбранный газ.
Обычно шприц упаковывается после изготовления с надетой иглой, тем самым исключается попадание волокон упаковочной бумаги на детали шприца и иглу. Герметичное соединение иглы и шприца исключает потери инертного газа при подготовке клеточной среды к замораживанию. При изготовлении каждый шприц одноразового использования упакован в индивидуальную стерильную полиэтиленовую упаковку. Все детали шприцов изготовлены из полипропилена медицинского назначения, тем самым обеспечивается приспособленность данных шприцов для работы с различными клеточными средами, а также проходит дополнительную стерилизацию [7]. Объем контейнера составляет от 1 до 20 мл, предпочтительно 2 мл. Соотношение объемов суспензионной культуры и объема инертного газа составляет от 0,01 до 0,25. Предпочтительно соотношение объемов суспензионной культуры и объема инертного газа составляет 0,15. Для насыщения клеточной культуры газом используют давление газа от 1 до 5 атмосфер. Для насыщения культуры клеток используют инертные газы, входящие в группу, состоящую из гелия, неона, аргона, элегаза (гексафторид серы). Предпочтительно использовать легкие инертные газы неон и гелий.
Клеточную культуру с газом в выбранном объеме контейнера выдерживают при температуре от +4 до +25°С в течение от 10 мин до 2 часов при мягком перемешивании на шейкере. Затем клеточную суспензию, насыщенную газом, перемещают в более компактный контейнер, с возможностью его герметизации или суспензию оставляют в контейнере с регулируемым объемом. На заключительном этапе идентифицируют контейнер, размещая на нем на внешней поверхности этикетку с кодом, выбранным из группы, состоящей: из штрих-кода, бар-кода, двухмерного кода и помещают контейнер в морозильную камеру с температурой от -80°С до -130°С.
Результаты эксперимента по криоконсервации культуры клеток насыщенной инертными газами приведены в примерах, которые включают, но не ограничивают типов клеточных суспензий и типов инертных газов, используемых при криоконсервации.
Данный способ криоконсервации несмотря на простоту и последующую доступность в практике применения для медицины содержит оригинальность технического решения и неизвестен из доступных литературных источников, что свидетельствует о соответствии заявляемого изобретения критерию "новизна" и "изобретательский уровень".
Примеры.
Пример 1. Получение культуры клеток для криоконсервации.
Клети HeLa культивировали в стандартных условиях в среде у DMEM (High glucose) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Дезинтеграцию монослоя для получения суспензии клеток осуществляли раствором 0,05% трипсина/EDTA (Gibco), проводили подсчет концентрации клеток в полученной суспензии с помощью камеры Горяева. Затем клетки осаждали и ресуспендировали DMEM (High glucose) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) из расчета конечной концентрациии 1 млн. клеток в мл. раствора.
Пример 2. Криоконсервация клеток линии HeLa без применения классических криопротекторов с предварительным насыщением культуры клеток инертными газами.
Для насыщения газами и последующей криоконсервации использовали стандартные одноразовые шприцы объемом 2 мл. В шприц набирали 0,5 мл суспензии клеток, изгоняли излишки воздуха, подсоединяли к источнику газа, объем газа около 2,5 мл и закрывали кончик шприца герметичным наконечником. Суспензию клеток насыщали 2 часа при комнатной температуре (20°С) при мягком покачивании на шейкере Laboratory shaker type 358S (Poland). После насыщения газом шприцы в горизонтальном положении помещали в морозильную камеру с температурой -130°С. В таких условиях охлаждение суспензии от 20°С до -100°С происходит со скоростью около 2°/мин. Применение шприцов при криоконсервации в газовой атмосфере позволяет за счет свободного хода поршня избежать образовани пониженного давления при температурном сжатии газов и вакуума при сжижении ксенона и гексафторида серы, используемых в эксперимпенте. Размораживание проводили в водяной бане 37°С в течение 2 мин. (скорость размораживания ≈60°/мин). В качестве контроля замораживали аналогичную суспензию клеток без воздействия специальной газовой среды.
Жизнеспособность клеточной культуры после криоконсервации оценивали по окрашиванию трипановым синим непосредственно после размораживания, а также по профилеративной активности клеток в течение 16 часов после размораживания. Подсчет клеток, окрашенных трипановым синим осуществляли на автоматическом счетчике клеток Countess II FL. (США). Для контроля способности клеток к развитию и пролиферации помещали 0,45 мл суспензии клеток в ячейку 6-луночного планшета, добавляли 2 мл среды ДМЕМ с 10% FBS и антибиотиками и помещали в инкубатор при температуре 37°С и атмосфере с 5% СО2 на 5 часов. Через 5 часов проводили замену среды. Через 16 часов инкубирования оценивали визуально состояние клеточной культуры по морфологии клеток и подсчитывали количество клеток с помощью счетчика клеток Genetic Clone Select (США).
Результаты эксперимента по криоконсервации суспензии клеток HeLa, насыщенной инертными газами, входящими в группу, состоящую из гелия, аргона, элегаза (гексафторид серы), криптона, ксенона приведены на фиг. 1. Данные приведенные на фиг. 1А и фиг 1Б показывают жизнеспособность клеток HeLa после криоконсервации в присутствии различных газов без применения классических криопротекторов. На фиг. 1А приведены данные по количеству живых клеток сразу после размораживания, протестированное окрашиванием трипановым синим. На фиг. 1Б) показаны данные по развитию культуры клеток после криоконсервации суспензии клеток насыщенной разными типами газов, оцененное по плотности клеточной культуры через сутки культивирования.
Как видно из диаграмм, гелий значительно повышал выживаемость клеток в процессе криоконсервации. Ксенон и криптон практически не оказали положительного эффекта на выживаемость клеток. Аргон и гексафторид серы оказывали положительное влияние на выживаемость клеток, но положительный эффект этих газов уступает воздействию гелия.
Пример 2. Криоконсервация клеток линии HeLa с 10% глицерином под воздействием гелия.
Культивирование проводили способом аналогичным примеру 1 за исключением среды криоконсервирования. После дезинтеграции монослоя и центрифугирования клетки ресуспендировали в среде у DMEM (High glucose) с добавлением 10% FBS и 10% глицерина. Криоконсервацию клеток проводили способом аналогичным примеру 2. Результаты эксперимента представленые на фиг. 2 показывают жизнеспособность клеток HeLa после криоконсервации в присутствии 10% глицерина и газов гелия, неона и атмосферного воздуха (К). На фиг. 2А представлено количество живых клеток сразу после размораживания, протестированное окрашиванием трипановым синим. На фиг. 2Б показаны результаты развития культур клеток после криоконсервации, оцененное по плотности клеточной культуры через 16 часов культивирования.
Как видно из диаграмм, представленных на фиг. 2 насыщение суспензии клеток гелием или неоном незначительно сказывалась на целостности мембран заморожено/оттаянных клеток (окрашивание трипановым синим, фиг. 2А), но существенно улучшала их способность к пролиферации и росту (фиг. 2Б).
Пример 3. Криоконсервация фибробластов NCTCL929 с 3% глицерином под воздействием гелия, неона и атмосферного воздуха,,
В эксперименте использовали фибробластов NCTCL929. Культивирование и криоконсервацию клеток проводили аналогично описанному в примере 1, за исключением среды криоконсервирования. После дезинтеграции монослоя и центрифугирования клетки ресуспендировали в среде у DMEM (High glucose) с добавлением 10% FBS и 3% глицерина. Дальнейшие процедуры проводили как описано в примерах 1 и 2.
Результаты эксперимента, представленые на фиг. 3, показывают жизнеспособность фибробластов NCTCL929 после криоконсервации в присутствии 3% глицерина и насыщением газами гелием, неоном и под воздействием атмосферного воздуха (К). Где: А) Количество живых клеток сразу после размораживания, протестированное окрашиванием трипановым синим; Б) Развитие культуры клеток после криоконсервации, оцененное по плотности клеточной культуры через сутки культивирования.
Как видно из диаграмм, представленных на фиг. 3 насыщение суспензии клеток гелием или неоном незначительно сказывалась на целостности мембран заморожено-оттаянных клеток (окрашивание трипановым синим, фиг. 3А), но существенно улучшала их способность к пролиферации и росту (фиг. 3Б).
Пример 4. Сравнение предлагаемого метода насыщения гелием суспензии клеток HeLa и метода предобработки гелием криозащитной среды перед суспендированием клеток.
Культуру клеток HeLa культивировали и подготавливали к замораживанию аналогично приведенному в примере 1. Затем ресуспендировали клетки либо в 2 мл стандартной среды ДМЕМ с 10% FBS, либо в среды ДМЕМ с 10% FBS, предобработанной гелием. Предобработка заключалась в вакуумировании среды в течение 1 часа с последующим промыванием среды гелием в течение 30 мин. Использовали три варианта: 1) Ресуспендирование клеток в стандартной среде, затем выдержка суспензии в течение 1 часа в атмосфере гелия при 20°С согласно схеме, приведенной в примере 1; 2) Ресуспендирование клеток в криозащитной среде, предобработанной гелием, кратковременная выдержка в течение 3х минут без контакта с атмосферным воздухом, затем замораживание; 3) Ресуспендирование клеток в криозащитной среде, предобработанной гелием, выдерживание суспензии клеток в течение 1 часа в атмосфере гелия при 20°С по схеме, аналогичной приведенной в примере 1, затем замораживание. Замораживание и размораживание осуществляли аналогично описанному выше в примерах. Результаты эксперимента представлены в табл. 1.
Промышленная применимость
Заявляемое изобретение может быть выполнено из известных материалов с помощью известных средств, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения критерию патентоспособности «промышленная применимость». Применение технологии обеспечивает более эффективную сохранность клеточных суспензий. Предложенный способ криоконсервирования прост в реализации, обладает воспроизводимостью и найдет широкое применение при криоконсервации клеток и в медицинской практике.
Источники информации
1. Полежаева Т.В. и др. СПОСОБ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ С КСЕНОНОМ. Патент РФ №2543534 (10.03.2015).
2. Пономарев А.И. СПОСОБ КОНСЕРВАЦИИ БИОМАТЕРИАЛА. Патент РФ №2 577 996 (20.03.2016).
3. Макеев О.Г. СПОСОБ КРИОКОНСЕРВАЦИИ МУЛЬТИПАТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК. Патент РФ №2433173 (10.11.2011).
4. GOLDSTEIN S., HAMBY J. Radical retardant cryopreservation solutions. Патент США № US 7129035 (2006-10-31).
5. Намиот А.Ю. Растворимость газов в воде. М. «Недра» 1991, 167 с.
6. Косяков В.И., Шестаков В.А. Моделирование фазовых равновесий в системах вода-гелий и вода-неон. Журн. физ. химии. 2002. Т. 76. №5, с. 815-819.
7. GARZA L.A. et al. CRYOSYRINGE DESIGNED FOR STERILE LIQUID NITROGEN FREEZING, QUICK THAWING AND INJECTION OF CELLULAR SLURRIES. Международная заявка № WO 2016019108 (2016-02-04).
8. Jeon S., Kim Y.H. Cell Therapy Preparation Inducing the Release of Cellular Substances for Tissue Regeneration Международная заявка № WO 2015194872 (2015-12-30).
9. ШПРИЦЫ 3-х компонентные, http://chetp.ru/articles/meditsinsikie-raskhodnye-materialy/Odnorazovye-shpritsy.
Claims (16)
1. Способ криосохранения суспензионной клеточной культуры, размещенной в контейнере, в среде инертного газа, отличающийся тем, что используют контейнер с регулируемым объемом и возможностью его герметизации, при этом осуществляют вывод атмосферного газа из внутреннего объема контейнера и последующий ввод объема суспензионной клеточной культуры, затем в объем контейнера вводят инертный газ при одновременном увеличении объема контейнера до величины, обеспечивающей выбранное соотношение между объемом культуры и объемом инертного газа, размещенными в контейнере, при этом регулировку объема контейнера осуществляют штоком, снабженным поршнем, далее перемешивают культуру с газом в выбранном объеме контейнера при температуре от +4 до +25°С в течение от 10 мин до 2 часов, при этом суспензию, насыщенную газом, перемещают в более компактный контейнер, с возможностью его герметизации или суспензию оставляют в контейнере с регулируемым объемом, затем контейнер помещают в морозильную камеру с температурой от -80°С до -130°С.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что инертный газ выбирают из группы, состоящей из: гелия, неона, аргона, элегаза (гексафторид серы), криптона, ксенона.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в клеточную культуру вводят легкие инертные газы, входящие в группу, состоящую из неона, гелия.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что соотношение объемов суспензионной культуры и объема инертного газа составляет от 0,01 до 0,1.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что соотношение объемов суспензионной культуры и объема инертного газа составляет 0,05.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перемешивание объемов культуры с газом в объеме контейнера осуществляют шейкером.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что давление инертного газа составляет до 5 атмосфер.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что давление инертного газа равно атмосферному давлению.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что контейнер выполнен на основе шприца.
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что контейнер выполнен на основе трехкомпонентного одноразового шприца с линиями градуировки объема.
11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что шприц снабжен штоком, поршнем, уплотняющим кольцом, иглой с колпачком.
12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что объем контейнера составляет от 1 до 5 мл.
13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что емкость контейнера составляет 2 мл.
14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культуру с газом перемешивают в объеме контейнера при температуре от +4°С до +25°С.
15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что температура морозильной камеры составляет -80°С.
16. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выход контейнера, через который осуществляют ввод или вывод клеточной культуры или газа, закрывают колпачком или краном.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017128728A RU2660075C1 (ru) | 2017-08-11 | 2017-08-11 | Способ хранения клеточных культур в суспензии |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017128728A RU2660075C1 (ru) | 2017-08-11 | 2017-08-11 | Способ хранения клеточных культур в суспензии |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2660075C1 true RU2660075C1 (ru) | 2018-07-05 |
Family
ID=62815627
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017128728A RU2660075C1 (ru) | 2017-08-11 | 2017-08-11 | Способ хранения клеточных культур в суспензии |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2660075C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2809133C1 (ru) * | 2022-12-15 | 2023-12-07 | Александр Юрьевич Верховский | Применение инертного газа для увеличения пролиферации фибробластов и выработки коллагена при облучении уф |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2433173C1 (ru) * | 2010-06-01 | 2011-11-10 | Олег Германович Макеев | Способ криоконсервации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток |
| RU2543534C2 (ru) * | 2013-02-26 | 2015-03-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук | Способ криоконсервирования лейкоцитов с ксеноном |
| WO2015194872A1 (ko) * | 2014-06-18 | 2015-12-23 | 전세화 | 조직재생물질 방출 유도형 세포치료제 조성물 및 그의 제조방법 |
| WO2016019108A1 (en) * | 2014-07-31 | 2016-02-04 | The Johns Hopkins University | Cryosyringe designed for sterile liquid nitrogen freezing, quick thawing and injection of cellular slurries |
| RU2577996C2 (ru) * | 2014-07-04 | 2016-03-20 | Общество с ограниченной ответственностью "ИнПрес" | Способ консервации биоматериала |
-
2017
- 2017-08-11 RU RU2017128728A patent/RU2660075C1/ru active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2433173C1 (ru) * | 2010-06-01 | 2011-11-10 | Олег Германович Макеев | Способ криоконсервации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток |
| RU2543534C2 (ru) * | 2013-02-26 | 2015-03-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук | Способ криоконсервирования лейкоцитов с ксеноном |
| WO2015194872A1 (ko) * | 2014-06-18 | 2015-12-23 | 전세화 | 조직재생물질 방출 유도형 세포치료제 조성물 및 그의 제조방법 |
| RU2577996C2 (ru) * | 2014-07-04 | 2016-03-20 | Общество с ограниченной ответственностью "ИнПрес" | Способ консервации биоматериала |
| WO2016019108A1 (en) * | 2014-07-31 | 2016-02-04 | The Johns Hopkins University | Cryosyringe designed for sterile liquid nitrogen freezing, quick thawing and injection of cellular slurries |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2809133C1 (ru) * | 2022-12-15 | 2023-12-07 | Александр Юрьевич Верховский | Применение инертного газа для увеличения пролиферации фибробластов и выработки коллагена при облучении уф |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8481253B2 (en) | Cryopreservation of adipose tissue for the isolation of mesenchymal stem cells | |
| CN108617638B (zh) | 组织和/或细胞冻存保护液及其制备与应用 | |
| US9944900B2 (en) | Pulsatile perfusion extraction method for non-embryonic pluripotent stem cells | |
| US4473552A (en) | Anaerobic method for preserving whole blood, tissue and components containing living mammalian cells | |
| CN106465710B (zh) | 脂肪组织冻存液及脂肪组织冻存方法 | |
| EP2038402B1 (en) | Systems and methods for cryopreservation of cells | |
| AU2009228141A1 (en) | Mehtod, system, and apparatus for hypothermic collection, storage, transport and banking of birth tissue | |
| KR20120117209A (ko) | 줄기세포 동결보존액 및 이를 이용하는 줄기세포 동결보존방법 | |
| EP3252143B1 (en) | Method for producing a platelet-lysate-containing gel | |
| CN107872954A (zh) | 在低温下保存细胞、组织或器官的方法 | |
| RU2433173C1 (ru) | Способ криоконсервации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток | |
| RU2577996C2 (ru) | Способ консервации биоматериала | |
| RU2660075C1 (ru) | Способ хранения клеточных культур в суспензии | |
| RU2704489C1 (ru) | Способ получения бесклеточного матрикса дермы для последующей реконструкции обширных дефектов мягких тканей | |
| KR102101684B1 (ko) | 적혈구 보존 방법 | |
| JP2015002721A (ja) | 培養細胞格納容器及びそれを用いた細胞の輸送及び／又は保管方法 | |
| JP5100078B2 (ja) | 組織由来細胞の凍結保存方法 | |
| WO2017187941A1 (ja) | 凍結細胞集塊及び凍結細胞集塊の製造方法 | |
| US20220408718A1 (en) | Aqueous solution for cell preservation | |
| JP2016059290A (ja) | 動物細胞のガラス化凍結保存方法 | |
| Ugraitskaya et al. | The Effect of Helium on Cryopreservation of HeLa and L929 Cells | |
| RU2731287C1 (ru) | Пробирка для криоконсервации ткани яичников | |
| JP7309194B2 (ja) | 幹細胞運搬方法 | |
| JP2009219503A (ja) | 組織由来細胞の凍結保存方法 | |
| RU2655222C2 (ru) | Способ подготовки жировой ткани к криоконсервированию |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner |