RU2649401C2 - Соль пептидной вакцины, способ ее получения и фармацевтический препарат, содержащий эту соль - Google Patents
Соль пептидной вакцины, способ ее получения и фармацевтический препарат, содержащий эту соль Download PDFInfo
- Publication number
- RU2649401C2 RU2649401C2 RU2016114322A RU2016114322A RU2649401C2 RU 2649401 C2 RU2649401 C2 RU 2649401C2 RU 2016114322 A RU2016114322 A RU 2016114322A RU 2016114322 A RU2016114322 A RU 2016114322A RU 2649401 C2 RU2649401 C2 RU 2649401C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- kifgslafl
- acetate
- salt
- purity
- mobile phase
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 title claims description 19
- AHOKKYCUWBLDST-QYULHYBRSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)[C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 AHOKKYCUWBLDST-QYULHYBRSA-N 0.000 claims abstract description 113
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 62
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 34
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 9
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 57
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 42
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 24
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 19
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 10
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 8
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 claims description 7
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 7
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 6
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 claims description 6
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 claims description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 2
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 claims description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 19
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical group ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- KQIADDMXRMTWHZ-UHFFFAOYSA-N chloro-tri(propan-2-yl)silane Chemical compound CC(C)[Si](Cl)(C(C)C)C(C)C KQIADDMXRMTWHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- -1 carbation cation Chemical class 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- SJVFAHZPLIXNDH-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-phenylpropanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C1=CC=CC=C1 SJVFAHZPLIXNDH-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 3
- CBPJQFCAFFNICX-IBGZPJMESA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-methylpentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 CBPJQFCAFFNICX-IBGZPJMESA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- REITVGIIZHFVGU-IBGZPJMESA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](COC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 REITVGIIZHFVGU-IBGZPJMESA-N 0.000 description 2
- UMRUUWFGLGNQLI-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-6-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 UMRUUWFGLGNQLI-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 2
- QWXZOFZKSQXPDC-NSHDSACASA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 QWXZOFZKSQXPDC-NSHDSACASA-N 0.000 description 2
- QXVFEIPAZSXRGM-DJJJIMSYSA-N (2s,3s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-methylpentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 QXVFEIPAZSXRGM-DJJJIMSYSA-N 0.000 description 2
- NDKDFTQNXLHCGO-UHFFFAOYSA-N 2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)NCC(=O)O)C3=CC=CC=C3C2=C1 NDKDFTQNXLHCGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- CMWYAOXYQATXSI-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylformamide;piperidine Chemical compound CN(C)C=O.C1CCNCC1 CMWYAOXYQATXSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IWDCLRJOBJJRNH-UHFFFAOYSA-N p-cresol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1 IWDCLRJOBJJRNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-2-[chloro(diphenyl)methyl]benzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-7-azabenzotriazole Chemical compound C1=CN=C2N(O)N=NC2=C1 FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007821 HATU Substances 0.000 description 1
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108090000279 Peptidyltransferases Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003875 Wang resin Substances 0.000 description 1
- NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N [4-[(4-methylphenyl)methoxy]phenyl]methanol Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1COC1=CC=C(CO)C=C1 NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- YBCVMFKXIKNREZ-UHFFFAOYSA-N acoh acetic acid Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O YBCVMFKXIKNREZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012155 injection solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
- A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/08—Solutions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/82—Translation products from oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/10—Protein-tyrosine kinases (2.7.10)
- C12Y207/10001—Receptor protein-tyrosine kinase (2.7.10.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Mycology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области фармацевтической технологии и относится к ацетату KIFGSLAFL в форме твердого аморфного вещества, способу его получения и фармацевтическому препарату пептидной вакцины, содержащему указанный ацетат. Ацетат KIFGSLAFL обладает хорошей чистотой, стабильностью и растворимостью в воде. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 13 пр.
Description
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области фармацевтической технологии, а также к соли пептидной вакцины и способу ее получения, в частности, к ацетату пептида KIFGSLAFL, способу его получения и к фармацевтическому препарату, содержащему такой ацетат.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Рак молочной железы (ВСа) является наиболее распространенной формой рака, диагностируемой у женщин, и вторым ведущим фактором смертности от рака у женщин (RiesLAG et al., SEER Cancer Statistics Review, 1975-2003, National Cancer Institute, Bethesda, MD). В течение последних 20 лет значительный прогресс в лечении рака молочной железы существенно улучшил выживаемость без признаков заболевания (DFS - disease-free survival). Например, для блокировки специфического клеточного процесса с целью замедления прогрессирования заболевания или предотвращения рецидива заболевания была применена терапия с использованием антител, которые реагируют с опухолеассоциированным антигеном. Несмотря на то что лечение рака молочной железы в последние годы прогрессировало, достаточное количество пациентов, в конечном счете, умерли от рецидивов заболевания. Таким образом, терапия с целью профилактики, замедления или подавления рецидива заболевания является необходимой.
Вакцина является достойной внимания моделью для такой терапии и профилактики из-за удобства введения и высокой эффективности, наблюдаемой при лечении инфекционных заболеваний. В теории, принцип создания вакцины довольно прост. Однако на практике, в разработке эффективной противораковой вакцины для лечения солидных опухолей процент успеха невелик.
KIFGSLAFL (нонапептид с аминокислотной последовательностью Lys-Ile-Phe-Gly-Ser-Leu-Ala-Phe-Leu, также известный как HER2/neu 369-377), пептидная последовательность протоонкогена HER2/neu, стимулирует цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), предназначена для вакцины, направленной на предотвращение и/или лечение рака и, в общем и целом, используется в клинических исследованиях в настоящее время (Zaks Т et al., Immunization with a peptide epitope (369-377) from HER-2/neu leads to peptide specific cytotoxic T lymphocytes that fail to recognize HER-2/neu+tumors, Cancer Research, 1998, 58(21): 4902-8; Knutson KL et al., Immunization of cancer patients with HER-2/neu, HLA-A2 peptide, p 369-377, fesults in short-lived peptide-specific immunity, Clin Cancer Res 2002, 8(5): 1014-1018).
Однако образцы KIFGSLAFL, использованные в клинических испытаниях раскрытых технологий, находятся в растворе ДМСО, обладают низкой стабильностью при комнатной температуре и нуждаются в хранении при низкой температуре -20°С и оттаивании перед использованием. До сих пор не известно ни одного соединения или смеси этого полипептида, которые были бы стабильны при комнатной температуре.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Одной из целей настоящего изобретения является получение ацетата KIFGSLAFL для существенного улучшения чистоты, растворимости в воде и стабильности исходных материалов.
При этом, указанный KIFGSLAFL представляет собой нонапептид со следующей аминокислотной последовательностью:
известный также как HER2/neu 369-377, и молекулярной формулой указанного ацетата KIFGSLAFL является C50H78N10O11⋅С2Н4О2.
Вышеуказанный ацетат KIFGSLAFL, предпочтительно приготовленный и полученный способом по настоящему изобретению, имеет очень высокую лекарственную чистоту. Чистота составляет ≥95%, предпочтительно, ≥98% и, более предпочтительно, ≥99%. Обеспечение эффективности и безопасности лекарственного средства является очень важным для коммерческого развития.
Так как в ходе синтеза KIFGSLAFL образуется большое количество примесей, существует очевидная техническая сложность в получении соли KIFGSLAFL высокой чистоты, и трудно выделить одну соль с высокой степенью чистоты.
Согласно настоящему изобретению в результате множества экспериментов предложен способ получения ацетата KIFGSLAFL, включающий в себя следующие стадии:
(1) Получение сырого KIFGSLAFL
Синтезируют пептидную смолу KIFGSLAFL в соответствии с аминокислотной последовательностью (9→1) твердофазным способом с использованием Fmoc-технологии, отщепляют Fmoc с помощью трифторуксусной кислоты с получением сырого KIFGSLAFL, процесс включает в себя следующие стадии:
(1.1) Используют чувствительную к воздействию кислоты смолу с Fmoc-Leu-OH (такую, как смола Ванга или 2-хлор-тритил-смола) в качестве сырья для реакции с раствором пиперидина, удаляют защитную группу Fmoc и получают Leu-смолу после промывания растворителем.
(1.2) В соответствии с твердофазным способом синтеза пептидов, Leu-смолу приводят в реакцию с Fmoc-защищенными аминокислотами последовательно, с получением нонапептид-KIFGSLAFL-смолы. Проводят транспептидазную реакцию с конденсирующим агентом последовательно в течение периода времени, промывают растворителем, удаляют защитную Fmoc-группу, затем промывают растворителем, осуществляют конденсацию со следующей Fmoc-защищенной аминокислотой.
Fmoc-защищенные аминокислоты соединяют с Leu-смолой в следующем порядке: Fmoc-Phe-ОН, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc Phe-OH, Fmoc-Ile-OH и Fmoc-Lys(Boc)-OH.
Предпочтительными конденсирующими агентами являются HATU, HBTU, ВОР, PyBOP, DIC/HOBt, DIC/HOAt и т.д.
(1.3) Обрабатывают KIFGSLAFL-смолу лизирующим раствором трифторуксусной кислоты с получением раствора KIFGSLAFL в трифторуксусной кислоте, добавляют диэтиловый эфир для осаждения, центрифугируют и отмывают с получением сырого KIFGSLAFL. Лизирующий раствор трифторуксусной кислоты представляет собой реагент улавливания карбкатиона, содержащий трифторуксусную кислоту 50-95% (об./об.), остальное - дихлорметан или далее 1-10% (об./об.) воды, фенола, п-крезола, анизола, тиоанизола, 1,2-дитиогликоля, триизопропилхлоросилана (TIS) и других реагентов улавливания карбкатиона.
(2) Очистка KIFGSLAFL
Растворяют сырой KIFGSLAFL, приготовленный и полученный на стадии (1) в смешанном растворе ацетонитрила и воды, фильтруют, очищают фильтрат путем обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с получением чистого раствора KIFGSLAFL в смеси ацетонитрил/вода.
Для очистки путем обращенно-фазовой ВЭЖХ, предпочтительно используют С4, С8 или С18 алкил-привитый силикагель в качестве неподвижной фазы, более предпочтительно, С18-алкил-привитый силикагель; температуру колонки поддерживают, предпочтительно, 20-35°С, более предпочтительно, 25-30°С; в качестве подвижной фазы используют раствор ацетонитрил/вода, содержащий трифторуксусную кислоту, где концентрация трифторуксусной кислоты составляет от 0,02% до 0,5% (об./об.), предпочтительно от 0,05% до 0,2% (об./об.). Предпочтительное содержание ацетонитрила в подвижной фазе в объемных процентах составляет от 10% до 80% для градиентного элюирования от низкой концентрации к высокой концентрации, более предпочтительно, от 20% до 50%.
(3) Преобразование в соль (преобразование в ацетат)
Проводят обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию с чистым KIFGSLAFL, приготовленным и полученным на стадии (2), с помощью уксусной кислоты в растворе ацетонитрил/вода в качестве подвижной фазы, с получением раствора ацетата KIFGSLAFL.
Для преобразования в соль путем обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, в качестве неподвижной фазы предпочтительно используют С4 или С8 или С18 алкил-привитый силикагель, более предпочтительно С18 алкил-привитый силикагель; температуру колонки поддерживают 20-35°С, более предпочтительно 25-30°С; в качестве подвижной фазы используют ацетонитрил/водный раствор, содержащий уксусную кислоту, где концентрация уксусной кислоты составляет от 0,02% до 0,5% (об./об.), предпочтительно от 0,05% до 0,2% (об./об.).
Предпочтительное содержание ацетонитрила в подвижной фазе в объемных процентах составляет от 2% до 80% для градиентного элюирования от низкой концентрации к высокой концентрации, более предпочтительно, сначала осуществляют, по меньшей мере, в размере одного объема колонки, изократическое или градиентное элюирование от 2% до 4%, с последующим изократическим или градиентным элюированием от низкого к высокому градиенту от 20% до 50%.
(4) Удаление растворителя с получением твердого вещества ацетата KIFGSLAFL
Один из способов заключается в концентрации при пониженном давлении и высушивании раствора ацетата KIFGSLAFL, приготовленного и полученного на указанной выше стадии (3) с получением твердого вещества ацетата KIFGSLAFL.
Другой способ заключается в концентрации (при пониженном давлении) раствора ацетата KIFGSLAFL, приготовленного и полученного на вышеуказанной стадии (3), осаждение ацетата KIFGSLAFL, центрифугирование для получения осадка, вакуумная сушка с получением твердого вещества ацетата KIFGSLAFL.
Другой целью настоящего изобретения является предложение ацетата KIFGSLAFL в виде аморфного твердого вещества, рентгеновская дифрактограмма которого не содержит характерного для кристалла дифракционного пика. Аморфное твердое вещество ацетат KIFGSLAFL очевидно обладает лучшей стабильностью и растворимостью в воде, являясь, таким образом, более удобным для приготовления лекарственных средств, в частности, для применения препарата в инъекционной форме.
Согласно настоящему изобретению в результате множества экспериментов предложен способ получения аморфного твердого вещества ацетата KIFGSLAFL, включающий в себя следующие стадии:
Доведение значения рН раствора ацетата KIFGSLAFL, приготовленного и полученного на вышеуказанной стадии (3), до значения рН 4 с помощью уксусной кислоты, концентрация при пониженном давлении до выпадения в осадок ацетата KIFGSLAFL, понижение температуры до значения ниже 5°С, центрифугирование для получения осадка, вакуумная сушка при температуре ниже 30°С с получением гомогенного аморфного твердого вещества ацетата KIFGSLAFL.
Рентгеновская дифрактограмма получена с помощью следующего способа детекции. Модель прибора: рентгеновский дифрактометр Empyrean; условия тестирования: Cu Kα1 излучение, напряжение 40 кВ, ток 40 мА, угловой диапазон 2θ 3°-50°, вертикальная щель 1/32°, горизонтальная щель 1/16°, горизонтальная щель 7,5 мм, шаг 0,02°, экспозиция на шаг 40 с.
Указанный аморфный твердый ацетат KIFGSLAFL детектируют в ИК-области спектра методом прессования таблеток с KBr, и его поглощение ИК-излучения имеет пики при 3288 см-1, 3065 см-1, 2958 см-1, 1632 см-1, 1527 см-1, 1404 см-1 и 698 см-1.
Указанный аморфный твердый ацетат KIFGSLAFL детектируют с помощью масс-спектрометрии ESI (ионизация в электроспрее), с пиком молекулярных ионов 995.9, что, в основном, соответствует вычисленной молекулярной массе для KIFGSLAFL.
Аморфное твердое вещество ацетат KIFGSLAFL растворяют в смешанном растворе ацетонитрила и воды (объемное соотношение = 5:95) и анализируют методом ВЭЖХ в следующих условиях: используют С18-привитый силикагель (250×4,6 мм, 5 мкм) в качестве неподвижной фазы, ацетонитрил - в качестве подвижной фазы А, 0,1 моль/л раствор дигидрофосфата натрия (значение рН доведено до рН 3,0 фосфорной кислотой) - в качестве подвижной фазы В, проводят градиентное элюирование (относительно подвижной фазы А, от 5% до 45% с временем элюирования 20 мин, затем переходят к 45% изократическому элюированию подвижной фазы А), со скоростью пропускания 1 мл/мин. Длины волн детектирования составляют 195 нм (0-8 мин) и 230 нм (8-50 мин). Времена элюирования уксусной кислоты и целевого пептида KIFGSLAFL составляют приблизительно 4,6 мин и 21 мин, соответственно.
Другой целью данного изобретения является создание фармацевтического препарата пептидной вакцины, содержащего вышеуказанный ацетат KIFGSLAFL, который может быть преобразован с фармацевтически приемлемым растворителем в инъекционный лекарственный препарат для пациентов. Фармацевтически приемлемый растворитель включает воду для инъекций, стерильную воду и т.д.
Эффективность и безопасность такого лекарственного препарата является существенно улучшенной, так как ацетат KIFGSLAFL по изобретению, в частности, его аморфный твердый продукт, имеет хорошую чистоту и стабильность и превосходно растворяется в воде.
Указанный фармацевтический препарат содержит один или более лекарственных эксципиентов или не содержит их. Фармацевтический препарат по настоящему изобретению может быть в любой порошковой форме для парентерального введения, например, в форме лиофилизированного порошка, суспензии или инъекционного препарата и т.д.
Указанный фармацевтический препарат может быть предпочтительно использован для лечения рака молочной железы и рецидива рака молочной железы.
Если не указано иное, ацетат KIFGSLAFL имеет молекулярную формулу C50H78N10O11⋅C2H4O2.
Сокращения различных реагентов в данном изобретении, определены следующим образом:
По сравнению с известными технологиями, изобретение имеет следующие характерные преимущества и положительные эффекты:
1. По сравнению с KIFGSLAFL и сульфатом KIFGSLAFL, предложенный в настоящем изобретении ацетат KIFGSLAFL существенно улучшает чистоту, стабильность и растворимость в воде лекарственных препаратов и, в достаточной мере, обеспечивает лекарственную безопасность и эффективность.
2. Аморфное твердое вещество ацетат KIFGSLAFL, предложенный в настоящем изобретении, имеет превосходную стабильность и растворимость в воде, ускоряет повторное растворение лекарственного средства при использовании в качестве инъекций и имеет лучшую стабильность растворенного ацетата KIFGSLAFL, чем растворитель для инъекций (такой как диметилсульфоксид, ДМСО). Аморфное твердое вещество ацетат KIFGSLAFL, предложенный в настоящем изобретении, в соответствии со свойствами растворимости и стабильности, представляет собой более выгодную форму для приготовления фармацевтического препарата, может в достаточной степени обеспечить удобное использование фармацевтического препарата и будет безопасным и эффективным в применении.
3. В настоящем изобретении предложен способ получения высокочистого ацетата KIFGSLAFL и преодолены технические трудности в существующих технологиях получения соли и повышения чистоты. Способ может быть осуществлен в мягких условиях, условия способа могут быть легко воспроизведены и стоимость производства может быть значительно снижена.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1 показан спектр дифракции рентгеновских лучей аморфного твердого вещества ацетата KIFGSLAFL.
На фиг. 2 показан ИК-спектр аморфного твердого вещества ацетата KIFGSLAFL.
На фиг. 3 показаны спектры масс-спектрометрии ESI аморфного твердого вещества ацетата KIFGSLAFL.
ВАРИАНТЫ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Следующие ниже варианты реализации изобретения и прилагаемые чертежи иллюстрируют изобретение, но никоим образом не ограничивают его.
Вариант реализации 1, получение сырого KIFGSLAFL
1. Взвешивали 40 г Fmoc-Leu-смолы Ванга (со степенью замещения: 0,8 ммоль/г), добавляли 300 мл DMF для набухания смолы на 30 мин. Удаляли DMF путем вакуумной фильтрации, и добавляли 300 мл 20%-ного раствора пиперидин/DMF для протекания реакции в течение 30 мин. Проводили фильтрацию с отсосом и промывали смолу с 6×150 мл DMF.
2. Добавляли 24,8 г Fmoc-Phe-OH, 8,6 г HOBt и 150 мл DMF, хорошо перемешивали, добавляли 9,5 мл DIC и перемешивали в водяной бане при температуре 28-30°С в течение 4-5 часов, определяли обесцвечивание смолы методом Kaiser, проводили фильтрование с отсасыванием и промывали смолу с 2×200 мл DMF, добавляли 300 мл 20% раствора пиперидина/DMF для протекания реакции в течение 30 мин, проводили фильтрование и промывали смолу с 6×200 мл DMF.
3. В отношении стадии 2, присоединяли следующую аминокислоту по порядку. Последовательность и дозировка аминокислот были следующими: Fmoc-Ala-OH, 19,9 г, Fmoc-Leu-OH, 22,6 г, Fmoc-Ser(tBu)-OH 24,5 г, Fmoc-Gly-OH, 19,0 г, Fmoc-Phe-OH 24,8 г, Fmoc-Ile-OH 22,6 г и Fmoc-Lys(Boc)-OH 30,0 г.
4. Промывали смолу последовательно дихлорметаном и метиловым спиртом, сушили под вакуумом с получением пептид-KIFGSLAFL-смолы.
5. Взвешивали 10 г пептидной смолы, добавляли 100 мл лизирующего раствора (TFA/TIS/H2O=95/2,5/2,5, об./об./об.), и перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре, фильтровали смолу и промывали смолу соответствующим количеством лизирующего раствора, комбинировали промывочную жидкость с фильтратом, добавляли 1 л диэтилового эфира при перемешивании для получения осадка, центрифугировали и несколько раз промывали диэтиловым эфиром, сушили под вакуумом с получением сырого KIFGSLAFL.
Вариант реализации 2, очистка KIFGSLAFL
Растворяли 5 г сырого KIFGSLAFL, полученного в варианте реализации 1, в 100 мл воды, содержащей 10% ацетонитрила в объемном соотношении, и фильтровали, фильтрат очищали на колонке С18 с высотой наполнения 250 мм и диаметром 15 мм, проводили градиентное элюирование (В: 20-50%, время элюирования: 60 мин) с водой, содержащей 0,1% трифторуксусную кислоту в качестве подвижной фазы А, и ацетонитрилом, содержащим 0,1% трифторуксусную кислоту в качестве подвижной фазы В, со скоростью пропускания 600 мл/мин, с длиной волны детектирования 230 нм, собирали компоненты основного пика, определяли степень очистки собранной жидкости с помощью аналитической ВЭЖХ, комбинировали порции с чистотой выше 98%, для получения чистого раствора KIFGSLAFL, определяли степень очистки собранной жидкости с помощью аналитической ВЭЖХ, и получали чистоту 98,6% и выход 45%.
Условия определения содержания трифторуксусной кислоты и целевого пептида с помощью аналитической ВЭЖХ были следующими: ВЭЖХ: Chuangxin Tongheng LC300, неподвижная фаза: С18-привитый силикагель (250×4,6 мм, 5 мкм), подвижная фаза А: ацетонитрил и подвижная фаза В: 0,1 моль/л раствор дигидрофосфата натрия (значение рН доводили до 3,0 фосфорной кислотой). Проводили градиентное элюирование (пропускали подвижную фазу А с градиентом от 5% до 45%, со временем элюирования 20 мин, а затем переходили к 45% изократическому элюированию подвижной фазы А) со скоростью пропускания 1 мл/мин и длинами волн детектирования 195 нм (0-8 мин) и 230 нм (8-50 мин). Времена элюирования для трифторуксусной кислоты и целевого пептида были приблизительно 4,9 мин и 21 мин, соответственно.
Условия для определения чистоты целевых пептидов с помощью аналитической ВЭЖХ были следующими: ВЭЖХ: Chuangxin Tongheng LC300, неподвижная фаза: С18-привитый силикагель (250×4,6 мм, 5 мкм), подвижная фаза: смешанный раствор 0,1 моль/л дигидрофосфата натрия (значение рН доведено до рН 3,0 фосфорной кислотой) и ацетонитрила (при объемном соотношении 7:3), со скоростью пропускания 1 мл/мин и длиной волны детектирования 230 нм. Время элюирования для целевого пептида составляло приблизительно 10 мин.
Вариант реализации 3, получение свободного пептида KIFGSLAFL
Охлаждали раствор KIFGSLAFL, полученный в варианте реализации 2 до 0-5°С, и по каплям при перемешивании добавляли 5% раствор NaOH до достижения значения рН 10, концентрировали при пониженном давлении до выпадения в осадок массы гелеобразных преципитатов, центрифугировали, промывали небольшим количеством ледяной воды, осаждали и сушили под вакуумом с получением белого твердого вещества с чистотой 98,1%.
Вариант реализации 4, получение раствора ацетата KIFGSLAFL
Раствор KIFGSLAFL, полученный в варианте 2, после соответствующей концентрации очищали с помощью С18-колонки, с высотой наполнения 250 мм и диаметром 150 мм. Элюировали водным раствором, содержащим в объемном соотношении 0,1% уксусной кислоты и 3% ацетонитрила в течение 15 мин, при скорости пропускания 800 мл/мин. Затем проводили градиентное элюирование (В: 20% - 40%, время элюирования: 50 мин) с водой, содержащей 0,1% уксусной кислоты в качестве подвижной фазы А, и ацетонитрилом, содержащим 0,1% уксусной кислоты, в качестве подвижной фазы В, с длиной волны детектирования 230 нм, собирали компоненты основного пика раствора ацетата KIFGSLAFL с чистотой 99,6% и выходом 90%.
Вариант реализации 5, получение аморфного твердого вещества ацетата KIFGSLAFL
Доводили значение рН раствора ацетата KIFGSLAFL, полученного в варианте реализации 4 до рН 4 с помощью уксусной кислоты, концентрировали при пониженном давлении до выпадения в осадок массы гелеобразных преципитатов, охлаждали до температуры 0-5°С, центрифугировали для получения осадка, сушили под вакуумом при 30°С с получением твердого вещества белого цвета.
Согласно определению аналитической ВЭЖХ в варианте реализации 2, время элюирования уксусной кислоты было приблизительно 4,6 мин. Как показали измерения, массовый процент уксусной кислоты в образце был 5,7%. Чистота KIFGSLAFL была 99,5%.
Условия детекции рентгенодифракционным методом были следующими: модель прибора: рентгеновский дифрактометр Empyrean; условия тестирования: Cu Kα1 излучение, напряжение: 40 кВ, ток: 40 мА, угловой диапазон 2θ: 3°-50°, вертикальная щель: 1/32°, горизонтальная щель: 1/16°, горизонтальная щель: 7,5 мм, шаг: 0,02°, экспозиция на шаг: 40 с. Рентгеновский дифракционный спектр показан на фиг. 1.
ИК-спектр поглощения, полученный методом прессования таблеток с KBr показан на фиг. 2.
Результат масс-спектрометрической детекции ESI (электроспрейной ионизацией) показан на фиг. 3, где 995,9 m/z пик был М+Н+, что в основном соответствовало рассчитанной молекулярной массе KIFGSLAFL.
Вариант реализации 6, получение KIFGSLAFL⋅H2SO4
Охлаждали раствор KIFGSLAFL, полученный в варианте 2 до 0-5°С, и добавляли по каплям при перемешивании раствор NaOH в соотношении по массе 5% до достижения значения рН 10, концентрировали при пониженном давлении до осаждения массы гелеобразных преципитатов, центрифугировали и промывали небольшим количеством ледяной воды, растворяли твердое вещество в растворе ацетонитрила с объемным отношением 50%, добавляли H2SO4 в количестве 0,5 моль H2SO4 на моль Е75, хорошо перемешивали (рН 6), и осуществляли вращательное испарение и концентрацию при пониженном давлении в водяной бане при температуре 30°С в течение 2~3 ч, лиофилизировали с получением твердого продукта.
Вариант реализации 7, определение стабильности KIFGSLAFL и ацетата KIFGSLAFL
Изучали стабильность следующих образцов в стерильных условиях при 25°С и относительной влажности 50%:
Образец 1 представлял собой аморфный твердый продукт по варианту реализации 5. Образец 2 представлял собой раствор по варианту реализации 4, который был разбавлен ДМСО до приблизительно 1 мг/мл и профильтрован через мембранный фильтр с пористостью 0,2 мкм. Образец 3 представлял собой твердый продукт по варианту реализации 3. Образец 4 представлял собой твердый продукт по варианту реализации 3, который растворяли в ДМСО, разбавляли до приблизительно 1 мг/мл и фильтровали через мембранный фильтр с пористостью 0,2 мкм. Образец 5 представлял собой твердый продукт по варианту реализации 6. Чистоту каждого образца определяли с помощью ВЭЖХ, и получили следующие результаты:
Экспериментальные результаты, приведенные выше, показывают, что: стабильность твердого вещества KIFGSLAFL (образец 3) и раствора ДМСО (образец 4) в имеющихся технологиях явно уступали аморфному твердому веществу ацетата KIFGSLAFL (образец 1) и раствору ацетата KIFGSLAFL в ДМСО (пример 4); и стабильность аморфного твердого вещества ацетата KIFGSLAFL (образец 1) была, очевидно, выше, чем стабильность раствора ДМСО (образец 2) и KIFGSLAFL⋅H2SO4 (образец 5).
Вариант реализации 8, определение растворимости
Добавляли твердые продукты вариантов реализации 3, 5 и 6 в определенное количество воды для инъекций с температурой 25°С в небольшие пробирки, соответственно, помещали в шейкеры с постоянной температурой, наблюдали условия растворения. Условия растворения были следующими:
Экспериментальные результаты, приведенные выше, показывают, что: растворимость аморфного твердого вещества ацетата KIFGSLAFL (образец варианта реализации 5) в воде значительно превосходит растворимость твердого вещества KIFGSLAFL из имеющихся технологий и растворимость KIFGSLAFL⋅H2SO4, что делает ацетат KIFGSLAFL более удобным для приготовления лекарственного средства.
Вариант реализации 9, получение продукта пептидной вакцины
Получали ацетат KIFGSLAFL способом по варианту реализации 5 в стерильных условиях, точно взвешивали (1 мг/доза по KIFGSLAFL), упаковывали и запечатывали в стеклянные бутылки, с получением продукта пептидной вакцины.
Вариант реализации 10
Соответствующим образом концентрировали раствор KIFGSLAFL, полученный в варианте реализации 2, очищали на колонке С18 с высотой наполнения 250 мм и диаметром 150 мм. Проводили градиентное элюирование (В: 20% - 40%, время элюирования: 50 мин) с водой, содержащей 0,1% уксусную кислоту в объемном соотношении в качестве подвижной фазы А и ацетонитрилом в качестве подвижной фазы В, со скоростью пропускания 800 мл/мин, длиной волны детектирования 230 нм, собирали компоненты основного пика и получали раствор KIFGSLAFL, концентрировали при пониженном давлении и лиофилизировали с получением твердого вещества белого цвета. В соответствии с ВЭЖХ детекцией в варианте реализации 2, массовый процент уксусной кислоты был 4,8%, а массовый процент трифторуксусной кислоты был 1,9%.
Вариант реализации 11
Проводили хроматографическую очистку сырого KIFGSLAFL, полученного в варианте реализации 1 методом по варианту реализации 2, чтобы собрать компоненты основного пика.
Определяли чистоту собранной жидкости с помощью аналитической ВЭЖХ, комбинировали порции с чистотой выше 92% с получением раствора KIFGSLAFL, определяли чистоту собранной жидкости с помощью аналитической ВЭЖХ с получением чистоты 95,1%, проводили преобразование в соль методом хроматографии по варианту реализации 4 и собирали компоненты основного пика с получением раствора ацетата KIFGSLAFL с чистотой 95,3%, концентрировали полученный раствор ацетата KIFGSLAFL при пониженном давлении досуха, сушили в вакууме при температуре ниже 40°C с получением твердого вещества белого цвета. Общий выход был 60%. Чистота KIFGSLAFL, как было определено методом ВЭЖХ по варианту реализации 2, соответствовала 94,1%.
Вариант реализации 12
Проводили хроматографическую очистку сырого KIFGSLAFL, полученного в варианте реализации 1 методом по варианту реализации 2, собирали компоненты основного пика. Определяли чистоту собранной жидкости с помощью аналитической ВЭЖХ, комбинировали порции с чистотой выше 92% с получением раствора KIFGSLAFL, определяли чистоту собранной жидкости с помощью аналитической ВЭЖХ с получением чистоты 95,1%. Проводили преобразование в соль с помощью хроматографии по варианту реализации 4 и собирали компоненты основного пика с получением раствора ацетата KIFGSLAFL с чистотой 95,3% и общим выходом 60%, процессировали методом по варианту реализации 5 с получением твердого продукта белого цвета, представляющего собой аморфное твердое вещество ацетат KIFGSLAFL с чистотой 95,3%.
Вариант реализации 13
Проводили хроматографическую очистку сырого KIFGSLAFL, полученного в варианте реализации 1, способом по варианту реализации 2 со сбором компонентов основного пика, определяли чистоту собранной жидкости с помощью аналитической ВЭЖХ, комбинировали порции с чистотой выше 96% с получением раствора KIFGSLAFL, определяли чистоту собранной жидкости с помощью аналитической ВЭЖХ с получением чистоты 97,5%, проводили преобразование в соль хроматографическим способом по варианту реализации 4 и собирали компоненты основного пика с получением раствора ацетата KIFGSLAFL с чистотой 98,1% и общим выходом 45%, процессировали способом по варианту реализации 5 с получением твердого вещества белого цвета, представляющего собой аморфное твердое вещество ацетат KIFGSLAFL с чистотой 98,0%.
Из-за образования большого количества примесей в ходе синтеза KIFGSLAFL, промышленное получение соли KIFGSLAFL высокой чистоты технологически затруднительно, и было трудно выделить одну соль с высокой степенью чистоты. Как указывалось в варианте реализации 10, синтетический продукт может легко образовывать смешанные соли, такие как соли уксусной кислоты, трифторуксусной кислоты и т.д., которые трудно отделить и очистить для получения одной чистой соли.
Изобретатель смог получить продукты с чистотой менее 95%, используя традиционные в данной области техники схемы разделения и методы очистки, такие как схема в варианте реализации 11, идущая вразрез с применением продукта в медицине. Однако чистота продукта повышалась до 95% или даже до 98% при использовании предпочтительных схем очистки, разработанных в результате большого количества экспериментов, таких как схемы в вариантах реализации 12 и 13, которые преодолевают трудности получения соли KIFGSLAFL высокой чистоты и делают возможными промышленное производство тестируемого продукта и применение его в медицине.
Вышеперечисленные варианты реализации представляют собой предпочтительные варианты реализации изобретения и не являются ограничениями. Любые другие изменения, модификации, замены, комбинации и упрощения, без отклонения от сущности и принципов настоящего изобретения, будут эквивалентными вариантами и будут включены в объем правовой охраны данного изобретения.
Claims (9)
1. Ацетат KIFGSLAFL в виде аморфного твердого вещества, молекулярная формула которого представляет собой C50H78N10O11⋅C2H4O2, при этом чистота ацетата KIFGSLAFL составляет ≥98%, рентгеновская дифрактограмма указанного ацетата KIFGSLAFL не содержит характерного для кристалла дифракционного пика, и поглощение в ИК-области спектра для ацетата KIFGSLAFL имеет пики при 3288 см-1, 3065 см-1, 2958 см-1, 1632 см-1, 1527 см-1, 1404 см-1 и 698 см-1.
2. Ацетат по п. 1, отличающийся тем, что чистота ацетата KIFGSLAFL составляет ≥99%.
3. Фармацевтический препарат пептидной вакцины для предотвращения и/или лечения рака молочной железы, содержащий ацетат KIFGSLAFL в виде аморфного твердого вещества по любому из пп. 1, 2 и один или более фармацевтически приемлемый растворитель, причем препарат приготовлен в виде инъекционного лекарственного препарата для пациентов.
4. Фармацевтический препарат по п. 3, в котором растворитель содержит воду для инъекций или стерильную воду.
5. Способ получения ацетата KIFGSLAFL в виде аморфного твердого вещества по п. 1, включающий следующие стадии:
(1) синтез пептидной смолы KIFGSLAFL в соответствии с аминокислотной последовательностью (9→1) твердофазным способом с использованием Fmoc-технологии, отщепление Fmoc с помощью трифторуксусной кислоты с получением неочищенного KIFGSLAFL;
(2) очистка KIFGSLAFL: растворение и фильтрация неочищенного KIFGSLAFL, проведение очистки путем обращенно-фазовой ВЭЖХ со смесью ацетонитрил/вода, содержащей трифторуксусную кислоту, в качестве подвижной фазы, сбор компонентов основного пика;
(3) преобразование в соль: проведение преобразования в соль компонентов основного пика, собранных на стадии (2), с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ со смесью ацетонитрил/вода, содержащей уксусную кислоту, в качестве подвижной фазы, сбор компонентов основного пика;
при этом для очистки на стадии (2) и для преобразования в соль на стадии (3) соответственно используют С4, С8 или С18 алкил-привитый силикагель в качестве неподвижной фазы; температура колонки составляет 20-35°С; в качестве подвижной фазы при очистке на стадии (2) используют 0,02%-0,5% (об./об.) трифторуксусную кислоту и в качестве подвижной фазы при преобразовании в соль на стадии (3) используют 0,02%-0,5% (об./об.) уксусную кислоту; (4) концентрация и сушка при пониженном давлении, доведение значения рН раствора ацетата KIFGSLAFL после преобразования в соль до значения рН 4 с помощью уксусной кислоты, концентрация при пониженном давлении до выпадения в осадок ацетата KIFGSLAFL, понижение температуры до значения ниже 5°С, центрифугирование для получения осадка, вакуумная сушка при температуре ниже 30°С.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310447114.6 | 2013-09-26 | ||
| CN201310447114 | 2013-09-26 | ||
| PCT/CN2014/087506 WO2015043497A1 (zh) | 2013-09-26 | 2014-09-26 | 一种多肽疫苗的盐及其制备方法和含有该盐的药物制品 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016114322A RU2016114322A (ru) | 2017-10-31 |
| RU2649401C2 true RU2649401C2 (ru) | 2018-04-03 |
Family
ID=52742076
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016114322A RU2649401C2 (ru) | 2013-09-26 | 2014-09-26 | Соль пептидной вакцины, способ ее получения и фармацевтический препарат, содержащий эту соль |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20160229891A1 (ru) |
| EP (1) | EP3050895A4 (ru) |
| JP (1) | JP6392330B2 (ru) |
| KR (1) | KR101802485B1 (ru) |
| CN (1) | CN104513293A (ru) |
| CA (1) | CA2925535A1 (ru) |
| RU (1) | RU2649401C2 (ru) |
| WO (1) | WO2015043497A1 (ru) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114384188A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-04-22 | 湖南中晟全肽生化有限公司 | 一种长肽的溶解及检测方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008150577A1 (en) * | 2007-06-01 | 2008-12-11 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | Vaccine for the prevention of breast cancer relapse |
| RU2010135965A (ru) * | 2008-02-01 | 2012-03-10 | Альфа-О Пептидес Аг (Ch) | Самоорганизующиеся пептидные наночастицы, полезные в качестве вакцин |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996018409A1 (en) * | 1994-12-14 | 1996-06-20 | The Scripps Research Institute | In vivo activation of tumor-specific cytotoxic t cells |
| US20040121946A9 (en) * | 2000-12-11 | 2004-06-24 | John Fikes | Inducing cellular immune responses to her2/neu using peptide and nucleic acid compositions |
| SE0300207D0 (sv) * | 2003-01-29 | 2003-01-29 | Karolinska Innovations Ab | New use and composition |
| WO2007110765A2 (en) * | 2006-03-28 | 2007-10-04 | Wockhardt Ltd | Processes for the preparation of octreotide |
| EP2062909A1 (en) * | 2007-11-21 | 2009-05-27 | SOLVAY (Société Anonyme) | Peptide production and purification process |
-
2014
- 2014-09-12 CN CN201410467004.0A patent/CN104513293A/zh active Pending
- 2014-09-26 RU RU2016114322A patent/RU2649401C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2014-09-26 US US15/023,805 patent/US20160229891A1/en not_active Abandoned
- 2014-09-26 KR KR1020167007821A patent/KR101802485B1/ko active IP Right Grant
- 2014-09-26 EP EP14850072.1A patent/EP3050895A4/en not_active Withdrawn
- 2014-09-26 CA CA2925535A patent/CA2925535A1/en not_active Abandoned
- 2014-09-26 JP JP2016518164A patent/JP6392330B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2014-09-26 WO PCT/CN2014/087506 patent/WO2015043497A1/zh active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008150577A1 (en) * | 2007-06-01 | 2008-12-11 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | Vaccine for the prevention of breast cancer relapse |
| RU2010135965A (ru) * | 2008-02-01 | 2012-03-10 | Альфа-О Пептидес Аг (Ch) | Самоорганизующиеся пептидные наночастицы, полезные в качестве вакцин |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20160229891A1 (en) | 2016-08-11 |
| CA2925535A1 (en) | 2015-04-02 |
| RU2016114322A (ru) | 2017-10-31 |
| JP2016539082A (ja) | 2016-12-15 |
| CN104513293A (zh) | 2015-04-15 |
| EP3050895A1 (en) | 2016-08-03 |
| WO2015043497A1 (zh) | 2015-04-02 |
| EP3050895A4 (en) | 2017-03-01 |
| JP6392330B2 (ja) | 2018-09-19 |
| KR101802485B1 (ko) | 2017-11-28 |
| KR20160068749A (ko) | 2016-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2668560C2 (ru) | Конъюгированная вакцина на основе пептида антигена wt1 | |
| EP1961761A1 (en) | Novel peptide compound | |
| EP2611825B1 (en) | Solid phase synthesis of h(gly2)glp-2 | |
| WO2022234853A1 (ja) | Ｈｒａｓおよびｎｒａｓに対して選択的なｋｒａｓ阻害作用を有する環状化合物 | |
| WO2023214576A1 (ja) | Ｈｒａｓおよびｎｒａｓに対して選択的なｋｒａｓ阻害作用を有する環状化合物 | |
| RU2649401C2 (ru) | Соль пептидной вакцины, способ ее получения и фармацевтический препарат, содержащий эту соль | |
| JP2024512074A (ja) | 免疫調節剤 | |
| CN111040020A (zh) | 一种烯烃硫醚类订书肽及其制备方法与应用 | |
| US20230041996A1 (en) | Calcium-sensing receptor agonist compound and application thereof | |
| IT9019914A1 (it) | Composti immunogenici, il procedimento per la loro sintesi e loro impiego per la preparazione di vaccini antimalaria | |
| KR20130060267A (ko) | 펩타이드계 물질의 결정체 및 그의 제조방법과 용도 | |
| KR20190103986A (ko) | 지질화 펩타이드의 수용성 염과 이의 제조 방법 및 용도 | |
| CN112851755B (zh) | 一种线性脂肽化合物及其制备方法与应用 | |
| CN105017401B (zh) | 一种齐考诺肽的纯化方法 | |
| CN111918859B (zh) | 稠合三环γ-氨基酸衍生物的盐的晶型及制备和应用 | |
| CN114478700B (zh) | 鸡冠花子中荨麻科类型环肽的制备方法及其在抗肿瘤药物中的应用 | |
| CN110938115B (zh) | 一种西那普肽全液相合成方法 | |
| KR102559329B1 (ko) | 신규한 프로탁 키메라 화합물, 이를 포함하는 표적 단백질 분해를 통한 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물 | |
| CN114222578B (zh) | 钙敏感受体激动剂化合物及其应用 | |
| CN112300250B (zh) | 阿尼芬净类似物及其制备方法 | |
| WO2022257940A1 (zh) | 钙敏感受体激动剂化合物的盐酸盐及药物组合物和其应用 | |
| JPH10500404A (ja) | 混合したμアゴニスト／δアンタゴニストの性質を有する新規なオピオイドペプチド類似体 | |
| WO2023069994A1 (en) | Immunomodulators | |
| EP2415780A1 (en) | Synthetic peptide and uses thereof | |
| WO2023088236A1 (zh) | Mt1-mmp的双环肽配体及其缀合物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190927 |