RU2642640C2 - Одноразовая система для стерильного получения частиц из липидов и нуклеиновых кислот - Google Patents

Одноразовая система для стерильного получения частиц из липидов и нуклеиновых кислот Download PDF

Info

Publication number
RU2642640C2
RU2642640C2 RU2014122433A RU2014122433A RU2642640C2 RU 2642640 C2 RU2642640 C2 RU 2642640C2 RU 2014122433 A RU2014122433 A RU 2014122433A RU 2014122433 A RU2014122433 A RU 2014122433A RU 2642640 C2 RU2642640 C2 RU 2642640C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
lipid
solution
lipids
nucleic acids
organic
Prior art date
Application number
RU2014122433A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2014122433A (ru
Inventor
Виктор КНОПОВ
Ричард П. ВИТТЕ
Прия КАРМАЛИ
Робин ЛИ
Дэвид ВЕББ
Original Assignee
Нитто Денко Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Нитто Денко Корпорейшн filed Critical Нитто Денко Корпорейшн
Publication of RU2014122433A publication Critical patent/RU2014122433A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2642640C2 publication Critical patent/RU2642640C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/4833—Encapsulating processes; Filling of capsules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/06—Making microcapsules or microballoons by phase separation
    • B01J13/12—Making microcapsules or microballoons by phase separation removing solvent from the wall-forming material solution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/04—Making microcapsules or microballoons by physical processes, e.g. drying, spraying
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)

Abstract

Настоящая группа изобретений относится к области медицины, в частности фармакологии, и раскрывает систему для стерильного получения наночастиц липидов и нуклеиновых кислот и способ стерильного получения наночастиц липидов и нуклеиновых кислот. Настоящая группа изобретений позволяет получать однородные частицы липидов и нуклеиновых кислот с помощью простых стадий, воспроизводимо и в асептических условиях и может быть использована для доставки этого класса терапевтических молекул в клетки-мишени. 2 н. и 21 з.п. ф-лы, 13 табл., 7 пр, 1 ил.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке США 61/556124, поданной 4 ноября 2011, которая включена в настоящее описание посредством ссылки во всей ее полноте.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Описание касается системы для процесса формирования наночастиц липидов и нуклеиновых кислот просто и воспроизводимо в асептических условиях, включающей компоненты одноразового применения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Липиды являются потенциально полезными в качестве носителей для доставки терапевтических молекул, в частности для доставки нуклеиновых кислот. Липиды образуют липосомы, которые могут инкапсулировать, образовывать комплексы или захватывать молекулы нуклеиновых кислот, и таким образом улучшать доставку этого класса терапевтических молекул в клетки-мишени после введения, например, внутривенно для циркуляции. Их полезность в фармацевтических композициях ограничивается доступными методами для получения наночастиц липидов и нуклеиновых кислот воспроизводимым образом. Были разработаны различные методы для получения таких наночастиц.
Один способ для получения наночастиц, содержащих только липиды (везикулы) просто и воспроизводимо без обработки ультразвуком использует этанольную инжекцию, описанный Batzri et al., 1973, Biophys Biochem Acta 298: 1015-19, и Kremer et al., 1977, Biochemistry 16: 3932-35, в котором липиды, солюбилизированные в этаноле, инжектируют в водный раствор, что приводит к самопроизвольному образованию липосом.
Van Buitenen et al. US 7468151 описывает систему с замкнутым циклом для стерилизации микрочастиц, включая липосомы. Система включает в себя смесительную камеру, соединенную с ячейкой для тангенциальной фильтрации (TFF, фильтрование тангенциальным потоком). TFF-ячейка очищает жидкую дисперсию микрочастиц в асептических условиях. Жидкость закачивается асептически из смесительной камеры через TFF. Материал, остающийся в TFF (ретентат), рециркулируется через смесительную камеру и TFF-ячейку до тех пор, пока не будет очищен. Процесс очистки осуществляется в асептических условиях в одном аппарате без удаления микрочастиц в TFF-ретентате.
Другие описывают процесс получения частиц нуклеиновых кислот с липосомами с помощью специальных методов для комбинирования липидов и нуклеиновых кислот. Hirota et al., 1999, BioTechniques 27: 286-89, показывает, что липосомы, покрытые молекулами нуклеиновых кислот, образуются спонтанно, когда катионные липиды в этаноле вводят в водный раствор нуклеиновой кислоты. Maurer et al., 2001, Biophysical J, 80: 2310-26 и Maurer et al. US 7094423 описывают способ инкапсуляции молекулы нуклеиновых кислот в липосомы. Этот метод включает использование предварительно полученных липосом, содержащих катионный липид. Липосомы дестабилизируются добавлением этанола к водному раствору. Молекулы нуклеиновых кислот добавляются к дестабилизированному липиду. После удаления этанола липосома инкапсулирует нуклеиновую кислоту по мере того, как происходит риформинг. Альтернативный метод для инкапсуляции нуклеиновых кислот в липосомы демонстрируется в Semple et al., 2001, Biophys Biochem Acta 1510: 152-66 и Semple et al. US 6858225. Этот способ повышает эффективность инкапсуляции посредством использования ионизируемого катионного липида для образования липосом. Этанольный раствор липидов комбинируется с нуклеиновыми кислотами в забуференном водном растворе при низком значении рН. Этанол затем удаляют при повышении рН до нейтрального значения. Оба способа требуют дополнительной обработки полученных липосом, потому что агрегация во время восстановления приводит к широкому разбросу по размерам.
MacLachlan et al. US 7901708 описывает способ и устройство для получения однородных по размеру липосом, которые инкапсулируют нуклеиновую кислоту. Поток РНК в водном буфере смешивается с потоком катионных липидов в этаноле при приблизительно равных скоростях потока в Т-образном соединении, в котором липидные везикулы образуются мгновенно при высокой концентрации этанола (45%). Концентрации растворителя и растворенных веществ поддерживаются постоянными в течение всего процесса смешивания. Не используются никакие статические смесители, в которых липосомы разбавляются. Стабильные липосомы с нуклеиновой кислотой стерилизуют в конце процесса, непосредственно перед стадией стерильного заполнения.
Способы, описанные выше, требуют значительных трудозатрат, чтобы минимизировать бактериальное загрязнение в процессе получения липосом, в том числе автоклавирования, промывания, и удовлетворения бремени нормативно-правового соответствия. Таким образом, остается неудовлетворенной потребность в способе инкапсуляции нуклеиновых кислот без необходимости в интенсивных механических стадий обработки для приготовления предварительно полученных липосом и без необходимости в стадии обработки для уменьшения размера частиц липидов с нуклеиновой кислоты, чтобы получать монодисперсных образцы.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Одним объектом настоящего изобретения является система стерильного приготовления наночастиц липидов с нуклеиновой кислоты, включающая:
первый узел хранения органического липидного раствора, содержащего липиды в смешивающемся с водой органическом растворителе;
второй узел хранения водного раствора, содержащего терапевтическое лекарственное средство;
узел смешивания со статическим смесителем,
инжекционное средство для добавления органического раствора липидов в смесительную камеру;
третий узел хранения водного буфера;
узел разбавления;
концентрирующий узел, содержащий тангенциальный фильтр для концентрирования суспензии липосом и удаления органического растворителя; и
одноразовую подложку для сбора концентрированной суспензии липосом после удаления органического растворителя;
в которой узел смешивания содержит водный раствор лекарственного средства, и липидный раствор добавляется постепенно к раствору лекарственного средства в узле смешивания в течение по меньшей мере 5 минут с получением смеси липида и лекарственного средства, имеющей отношение липид: РНК не больше 12:1,
в которой смесь липида и лекарственного средства переносится в узел разбавления и разбавляется посредством добавления водного буфера;
и где система состоит из компонентов, которые являются стерилизуемыми и одноразовыми таким образом, чтобы быть адаптированными для одноразового использования. Система может дополнительно содержать узел приготовления органического раствора липидов, соединенный с первым узлом хранения. Система может дополнительно содержать фильтр для стерилизации органического раствора липидов в то время как указанный раствор переносится в первый узел хранения. Система может дополнительно содержать липидный раствор, раствор лекарственного средства, смесь липидов и лекарственного средства и суспензию, которые являются стерильными. Концентрирующий узел может содержать в себе диафрагменный дозировочный насос с насосной камерой одноразового использования. Липиды могут содержат катионный липид, вспомогательный липид, стерол, и конъюгат полиэтиленгликоль (РЕО)-липид, и дополнительно содержать нацеливающий липид. Терапевтическое лекарственное средство представляет собой молекулу дцРНК. Концентрация липидов и дцРНК в смеси состоит из липида: РНК с соотношением зарядов 2,5. Смешивающимся с водой органическим растворителем может быть этанол. Первый и второй растворы могут быть объединены при температуре от 35 до 40°С. Второй узел хранения может содержать терапевтическое лекарственное средство в водном буфере при рН от 3,5 до рН 4,5. Третий узел хранения может содержать водный буфер при нейтральном рН. Средний диаметр частицы липосомы, инкапсулирующей терапевтическое лекарственное средство, может составлять от 80 нм до 150 нм. Инжекционное средство содержит инжекционное отверстие, которое подает органический раствор к поверхности раздела воздух-вода водного раствора в узле смешивания или, альтернативно, инжекционное отверстие, которое погружено в водный раствор в узле смешивания и подает органический раствор туда. Система может дополнительно включать стадию лиофилизации. Стадия лиофилизации может включать стадию замораживания и стадию высушивания. Водный буфер может содержать сахарозу или трегалозу. Стадия замораживания может охлаждать смесь липидов и лекарственного средства на 1°С/минуту от 20 до -40°С.Стадия высушивания содержит стадию высушивания смеси липидов и лекарственного средства при температуре от около -15 до около -35°С.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 показывает одноразовую систему настоящего описания.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ВЫПОЛНЕНИЯ
Приведенное в настоящем изобретении описание относится к способу изготовления липид-инкапсулированных терапевтических молекул, включая отрицательно заряженные терапевтические полимеры, например, нуклеиновые кислоты, белки и пептиды. Приведенное в настоящем изобретении описание включает способ получения липид-инкапсулированных молекул нуклеиновых кислот. Способ особенно подходит для крупномасштабного производства частиц, состоящих из инкапсулированных в липосом терапевтических молекул. Способ обеспечивает неожиданный и удивительный результат, заключающийся в том, что полученные частицы являются монодисперсными (т.е. коэффициент полидисперсности менее 0,2 (PDI, ИПД), как определено в настоящем описании), узкое и равномерное распределение по размерам от 50 до 150 нм. Этот способ обеспечивает средство инкапсуляции посредством объединения липидов, солюбилизированных в смешивающемся с водой органическом растворителе, таком как этанол, с отрицательно заряженными терапевтическими полимерами, солюбилизированными в водном растворе, и удаления органического растворителя. Абсолютные и относительные концентрации липидов и отрицательно заряженных терапевтических полимеров являются достаточными для получения мелких частиц. Частицы, полученные способом, приведенным в описании, не требуют механической обработки, например, экструзии для получения монодисперсной популяции.
Способ в соответствии с настоящим описанием имеет преимущество по сравнению с предыдущими способами по простоте, с которой можно масштабировать до больших объемов и тем, что он малочувствителен к широкому диапазону температур, растворов, рН и времени обработки.
Способ в соответствии с настоящим описанием имеет преимущество по сравнению с предыдущими способами воспроизводимо производить однородную популяцию частиц без дополнительных стадий, требуемых для получения предварительно приготовленных везикул.
Способ в соответствии с настоящим описанием имеет преимущество по сравнению с предыдущими способами воспроизводимо производить однородную популяцию наночастиц без дополнительных стадий, требуемых для механического обработки частиц, образующихся при смешении липидов и отрицательно заряженных терапевтических полимеров. Эти дополнительные стадии включают в себя, например, обработку ультразвуком, гомогенизацию или экструзию, чтобы уменьшить их размер и достигнуть единообразия в терапевтически приемлемом диапазоне.
Способ в соответствии с настоящим описанием имеет преимущество достижения эффективности инкапсуляции нуклеиновой кислоты, равной или лучшей, чем предшествующие способы без дополнительных стадий обработки для получения наночастиц.
Другие преимущества способа в соответствии с настоящим описанием станут очевидными по мере того, как дополнительные детали будут обеспечиваться в приведенном в настоящем изобретении описании, касающегося липидных компонентов и условий.
Следующие сокращения используются в настоящем описании.
VF: продувочный фильтр
TG: датчик температуры
SUB: насадка одноразового использования
TFF: тангенциальный фильтр
РР: перистальтический насос
PG: манометр
Scale: средство измерения массы
Фиг. 1 показывает одноразовую систему, включающую в себя следующие элементы.
Липидный сток-раствор: этот сосуд содержит выбранные липиды в органическом, смешивающемся с водой растворителе. Этанол показан в качестве предпочтительного растворителя. Концентрация липидов может регулироваться для увеличения производительности. Сосуд состоит из одноразового мешка с TG и смесительных средств. Мешок имеет отверстия для добавления липидов в 96-100% этанол, VF, и выпускную трубку, которая контролируется с помощью клапана. Мешок находится в обогреваемом, многоразовом, электрически заземленном контейнере. Мешок имеет приспособление для добавления дополнительного этанола, чтобы разбавить липидный раствор до рабочей концентрации.
РР1: перистальтический насос 1. Он качает липидный сток-раствор из сосуда для липидного сток-раствора через фильтр 0,45/0,22 мкм в сосуд для отфильтрованного липидного сток-раствора.
Отфильтрованный липидный сток-раствор: этот сосуд содержит липиды при рабочей концентрации. Сосуд представляет собой одноразовый мешок со смесительными средствами и TG. Он имеет отверстия для ввода липидного сток-раствора в VF и выпускную трубку, которая регулируется с помощью клапана. Мешок расположен в обогреваемом, многоразовом, электрически заземленном контейнере со средством измерения массы.
Сток-раствор малой РНК: этот сосуд содержит выбранное лекарственное средство в водном буфере. миРНК является предпочтительным лекарственным средством, и цитратный буфер является предпочтительным буфером. Концентрация может регулироваться для увеличения производительности. Сосуд представляет собой одноразовый мешок со смесительными средствами. Мешок имеет отверстия для добавления растворенного вещества и растворителя, а также выпускную трубку, которая управляется посредством клапана. Мешок имеет приспособление для добавления дополнительного буфера для разбавления раствора РНК до рабочей концентрации.
РР2: перистальтический насос 2. Он качает сток-раствор миРНК из сосуда для миРНК через фильтр 0,45/0,22 мкм в сосуд для отфильтрованной миРНК.
Сток-раствор отфильтрованной миРНК: этот сосуд содержит миРНК в рабочей концентрации. Этот элемент содержит средство измерения массы. Сосуд представляет собой одноразовый мешок, расположенный в многоразовом контейнере. Он имеет отверстие(я) для сток-раствора миРНК и выпускной трубки, которая управляется с помощью клапана. Мешок расположен в многоразовом контейнере со средством измерения массы.
РР3: перистальтический насос 3 для передачи отфильтрованного липидного сток-раствора в сосуд с надписью Липосомальная миРНК в 35% этаноле. Он оборудован PG (PG1).
РР4: перистальтический насос 4 для передачи отфильтрованного сток-раствора миРНК в сосуд липосомальной миРНК в 35%-ном этаноле. Он также оборудован PG (PG2).
Липосомальная миРНК в 35% этаноле: этот сосуд содержит смесь липосом и лекарственного средства в 35%-ном этаноле. Этот узел содержит VF и TG. Отверстия для отфильтрованного сток-раствора липидов и миРНК отделены от выпускной трубки, которая контролируется с помощью клапана. Предпочтительный узел представляет собой одноразовый мешок, расположенный в многоразовой таре.
Фосфатный буфер: этот сосуд содержит буфер (предпочтительно фосфатный буфер), смесительные средства и средство измерения массы. Это большой сосуд с открывающейся крышкой, и выпускной трубкой с клапаном.
Отфильтрованный фосфатный буфер: этот сосуд соединен с сосудом для фосфатного буфера трубкой с фильтром 0,45/0,22 мкм и перистальтическим насосом. Он имеет средство смешивания и выпускную трубку с клапаном, ведущей к трубке через РР5 к сосуду с Липосомальной миРНК в 10%-ном этаноле и сосуду TFF SUB. Сосуд представляет собой многократно используемый контейнер, выстеленный одноразовым покрытием.
РР5: он качает отфильтрованный фосфатный буфер из сосуда для отфильтрованного фосфатного буфера в сосуд для липосомальной миРНК в 35%-ном этаноле и к сосуду TFF SUB. РР5 соединен с PG (PG4).
Липосомальная миРНК в 10% этаноле: этот сосуд содержит смесь липосом и лекарственного средства в 10%-ном этаноле после разбавления липосом и лекарственного средства в 35%-ном этаноле буфере в сосуде для отфильтрованного фосфатного буфера. Сосуд представляет собой многократно используемый контейнер, выстеленный одноразовым покрытием, с входом для раствора липосомальной миРНК, VF, со средством измерения массы и выпускным отверстием с клапаном, ведущим к сосуду TFF SUB.
РР6: он качает липосомы и лекарственное средство в 10% этаноле из сосуда для липосомальной миРНК в 10% этаноле через фильтр 0,45/0,22 мкм в сосуд TFF SUB.
TFF SUB: это сосуд содержит порты ввода для липосом и лекарственного средства в 10%-ном этаноле из сосуда для липосомной миРНК в 10%-ном этаноле, для буфера из сосуда для отфильтрованного фосфатного буфера и для ретентата из узла TFF, каждый с клапаном. Он также содержит VF и выпускное отверстие с его клапаном.
Дозировочный насос с одноразовым выходным патрубком насоса: этот насос высокого давления соединен с двумя PG (PG 3 и PG 4). Он передает липосомы и лекарственное средство от TFF SUB к узлу TFF.
TFF: данный узел идентифицируется как пара прямоугольников с диагональной линией. Во время работы этанольный раствор липосомы/лекарственное средство проходит через узел TFF для удаления этанола. Этанол, удаленный с помощью узла TFF, выходит из системы. Может работать параллельно более одного TFF, соединенных посредством вентилей. Раствор, не пропущенный мембраной (ретентат), выходит из TFF, рециркулирует к TFF SUB и возвращается через узел TFF, так как необходимо удалить весь этанол. Манометр (PG 4) контролирует давление ретентата. Газообразный азот, хранящийся в танке N2, используется для усиления дозирующего насоса, так как это необходимо для создания противодавления, и в конечном итоге облегчает передачу TFF-ретентата к первому 10 л SUB сосуду.
10 л SUB: это одноразовый сосуд, снабженный средством измерения массы. При необходимости SUS включают серию из трех 10 л SUB сосудов. TFF-ретентат прокачивают через 0,45/0,22 мкм фильтр для снижения общего количества микробов и для того, чтобы убедиться, что продукт полностью свободен от микробной контаминации в результате микробного загрязнения, которое может произойти при процессинге потока. Если вся технологическая линия действительно асептическая, то возможно опустить последние стадии фильтрации. Полученный TFF-ретентат упаковывается в процессе асептического розлива.
Асептический розлив: Эта стадия предшествует лиофилизации, которая выполняется как отдельный процесс с использованием различного оборудования. Стадия асептического заполнения до лиофилизации может включать добавление вещества-носителя, например, маннозы, глюкозы или других материалов для обеспечения объема или для стабилизации РНК в процессе стадии лиофилизации.
Система обеспечивает возможность ручной регулировки движением материалов через каждую стадию. Все детали, контактирующие с липидами, лекарственны средством, растворителями и буферами, являются одноразовыми и заменяемыми. Система показана для партии 10 л, и является масштабируемой до более чем 1000 л. Компоненты предназначены для использования один раз для партии липосома/лекарственное средство.
Способы для выполнения процесса производства представляют собой последовательность стадий, как показано в схеме (Фиг. 1) следующим образом.
Сток-растворы липидов и лекарственного средства получают По-отдельности в сосудах для сток-растворов липидов и миРНК. Сток-растворы могут быть получены при высокой концентрации. Смешивание происходит посредством перемешивания в сосудах для сток-растворов. Температуру липидного сток-раствора можно подогнать к заданной температуре. Сосуд, используемый для приготовления липидного сток-раствора, выбирается так, чтобы иметь минимальное количество испаряющегося вещества, если используется чистый органический растворитель при повышенной температуре.
Сток-растворы По-отдельности прокачивают через фильтр 0,45/0,22 мкм в сосуд для отфильтрованного липидного сток-раствора и в сосуд для отфильтрованного сток-раствора миРНК. Сток-растворы могут быть объединены с большим количеством растворителя, чтобы разбавить сток-раствор до или во время передачи в сосуды для отфильтрованных сток-растворов.
Таким же образом водный буфер получают в сосуде для фосфатного буфера, и проводят стерилизующую фильтрацию посредством прокачки в сосуд для отфильтрованного фосфатного буфера.
Отфильтрованный раствор миРНК перекачивается в сосуд для липосомальной миРНК в 35%-ном этаноле.
Липиды в органическом растворителе закачивают в водный раствор миРНК в сосуд для липосомальной миРНК в 35%-ном этаноле со скоростью, эффективной для образования частиц липиды-лекарственное средство в конечной концентрации 35% этанола при контролируемой заданной температуры при перемешивании водного раствора.
Добавление липида можно осуществлять через одно входное отверстие или несколько входных отверстий, через иглу или набор игл. Это может быть осуществлено сверху на поверхность водного раствора, или может вводиться в водный раствор ниже поверхности. Посредством введения или смешивания концентрация этанола раствора в сосуде для липосомальной миРНК в 35%-ном этаноле увеличивается до 30%, до 40%, предпочтительно до 35%. Увеличение происходит постепенно, образуя градиент от начального (предпочтительно 0%) до конечного (предпочтительно 35%) значения. Этот градиент может длиться от 1 минуты до 60 минут или дольше.
Как только раствор в сосуде для липосомной миРНК в 35%-ном этаноле достигает конечной концентрации этанола (предпочтительно 35%), раствор закачивается из сосуда для липосомной миРНК в 35%-ном этаноле и смешивается в линии с буфером, отдельно перекачиваемом из сосуда с отфильтрованным фосфатным буфером таким образом, чтобы разбавить смесь, в смешивающимся с водой спирте, предпочтительно от 10% до 20% этанола, наиболее предпочтительно 10% этанола, и передается в сосуд для липосомальной миРНК в 10%-ном этаноле.
10%-ный раствор этанола подвергается диафильтрации против водного буфера для удаления этанола.
TFF-Ретентат (0% этанола, 100% водный буфер) хранится в первом 10 л SUB.
TFF-Ретентат может быть при необходимости отфильтрован, чтобы уменьшить общее количество микробов для асептического розлива.
Асептический розлив включает стадию лиофилизации. Стадия лиофилизации отделена от процесса генерирования стерильного TFF-ретентата на стадии 10. То есть, эта стадия предпочтительно осуществляется в месте, отличном от SUS-узла, обеспечивающего TFF-ретентат. Углеводы, такие как сахароза или глюкоза, возможно добавлять до лиофилизации для стабилизации наночастиц и/или для добавления объема.
Липидная смесь, используемая в способе настоящего описания, содержит по меньшей мере положительно заряженный липид (катионный липид) в комплексе с отрицательно заряженными терапевтическими полимерами и липидным конъюгатом, содержащим полиэтиленгликоль (PEG-липид) для предотвращения агрегации. Катионный липид может иметь постоянный катионный заряд в широком диапазоне значений рН, может быть ионизируемым катионным липидом, который является заряженным при низком рН (менее чем рН 6) и без суммарного заряда при нейтральном рН (рН от 6,5 до 8), или комбинацией постоянно заряженных и ионизируемых катионных липидов. Липидная смесь может также содержать нацеливающий липид, полимер, стероид, фосфолипид или члена другой липидной группы, включающей жир, воск, жирорастворимый витамин, моноглицерид или диглицерид, жирные ацилы, глицеролипиды, глицерофосфолипиды, сфинголипиды, сахаролипиды и поликетиды. Этот способ также может быть использован для формирования липосом только с нейтральными или отрицательно заряженными компонентами.
Предпочтительно компоненты липидной смеси могут быть выбраны из следующих групп.
Катионный липид
В рамках настоящего описания раскрываются катионные липиды формулы I
Figure 00000001
в которых
Z = алкильный линкер, С2-С4алкил
Y = алкильный линкер, C1-С6алкил
R1 и R2 представляют собой каждый независимо, С10-С30алкил, С10-С30алкенил, или С10-С30алкинил, С10-С30алкил, С10-С20алкил, С12-С18алкил, С13-С17алкил, С13алкил, С10-С30алкенил, С10-С20алкенил. С12-С18алкенил, С13-С17алкенил, С17алкенил; R3 и R4 представляют собой каждый независимо, водород, C1-С6алкил, или -СН2СН2ОН, C1-С6алкил, C1-С3алкил; n равно 1-6; и X представляет собой противоион, включая любой азотный противоион, как этот термин легко понимается в данной области техники. Предпочтительные азотные противоионы включают галогены, с особенно предпочтительными хлоридом и бромидом. Другим предпочтительным противоионом является мезилат (-SO3CH3).
Примеры соединений формулы I включают:
Figure 00000002
и
Figure 00000003
и
Figure 00000004
Другие катионные липиды, заряженные при физиологическом значении рН, включают, но не ограничиваются этим, N,N-диолеил-N,N-диметиламмоний хлорид ("DODAC"); N-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмоний хлорид ("DOTMA"); N,N-дистеарил-N,N-диметиламмоний бромид ("DDAB"); N-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмоний хлорид ("DOTAP"); N-(1,2-димиристилоксипроп-3-ил)-N,N-диметил-N-гидроксиэтиламмоний бромид ("DMRIE»), 3β-(N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил)холестерин ("DC-Chol"), диоктадециламидоглицил карбоксиспермидин («DOGS»); и N-(L-(2,3-диолеилокси)пропил)-N-(2-(сперминкарбоксиамидо)этил)-N,N-диметиламмоний трифторацетат ("DOSPA»).
Ионизируемые катионные липиды
В рамках настоящего изобретения раскрываются ионизируемые катионные липиды формулы II
Figure 00000005
в которых
Z = алкильный линкер, С2-С4алкил, -CH2SCH2CH2-,
Y = алкильный линкер, C1-С6алкил,
R1 и R2 каждый независимо представляют собой С10-С30алкил, С10-С30алкенил, или С10-С30алкинил, С10-С30алкил, С10-С20алкил, С12-С18алкил, С13-С17алкил, С13алкил, С10-С30алкенил, С10-С20алкенил, С12-С18алкенил, С13-С17алкенил, С17алкенил; R3 и R4, каждый независимо представляют собой водород, C1-С6алкил, или -СН2СН2ОН, C1-С6алкил, C1-С3алкил.
Некоторые положительно заряженные липиды имеют pKa равным или около физиологического рН и являются катионными в мягких кислых условиях и слабо катионным при физиологическом значении рН. Такие ионизируемые катионные липиды включают, но не ограничиваются этим, ((2-((2-(диметиламино)этил)тио)ацетил)азанедиил) бис(этан-2,1-диил)дитетрадеканоат ("S104"), (Z)-((3-(диметиламино)пропаноил)азанедиил) бис(этан-2,1-диил)диолеат («i-Et-DODC»), N-(2,3-диолеилокси) пропил) N,N-диметиламмоний хлорид ("DODMA") и 1,2-диолеоил-3-диметиламмоний-пропан («DODAP»).
Figure 00000006
Figure 00000007
Признается, что ионизируемые липиды могут способствовать связыванию и/или высвобождению активного фармацевтического ингредиента (API), как показано ниже.
Figure 00000008
Нейтральные липиды
Примеры нейтральных липидов включают, но не ограничиваются этим, фосфолипиды, аминолипиды и сфинголипиды. Нейтральные липиды включают амфипатические липиды. Типичные примеры фосфолипидов включают, но не ограничиваются этим, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозит, фосфатидная кислота, пальмитоилолеоилфосфатидилхолин, лизофосфатидилхолин, лизофосфатидилэтаноламин, дипальмитоилфосфатидилхолин, диолеоилфосфатидилхолин, дистеароилфосфатидилхолин или дилинолеоилфосфатидилхолин. Другие соединения, несодержащие фосфора, такие как сфинголипиды, семейство гликосфинголипидов, диацилглицериды и 3-ацилоксикислоты, также находятся в группе, обозначенной как амфипатические липиды. Кроме того, амфипатический липид, описанный выше, можно смешивать с другими липидами, включая триглицериды и стеролы.
PEG-липиды
Компонентом, стабилизирующим бислой, является полиэтиленгликоль ("PEG"), конъюгированный с полярной головкой липида, например, фосфатидилэтаноламина. Другой компонент, стабилизирующий бислой, представляет собой PEG, конъюгированный с церамидом. PEG может быть конъюгирован с фосфатидилэтаноламином или, альтернативно, с церамидом с использованием стандартных реакций сочетания, известных и используемых специалистам в данной области техники. Кроме того, являются коммерчески доступными предварительно полученные конъюгаты PEG-фосфатидилэтаноламин («PEG-РЕ»).
ПЭГи различной молекулярной массы могут быть использованы для формирования компонентов, стабилизирующих бислой в соответствии с настоящим изобретением. ПЭГи различной молекулярной массы коммерчески доступны из нескольких различных источников или, альтернативно, они могут быть синтезированы с использованием стандартных методов полимеризации, хорошо известных специалистам в данной области техники. В предпочтительном в настоящее время варианте полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу в диапазоне от 200 до 10000 Да, предпочтительно от 500 до 4000 Да и наиболее предпочтительно от 1000 до 2000 Да. В общем, было обнаружено, что увеличение молекулярной массы PEG снижает концентрацию компонента, стабилизирующего бислой, необходимую для достижения стабилизации.
Фосфатидилэтаноламин, имеющий различные жирнокислотные группы с различной длиной цепи и степенью насыщенности, может быть конъюгирован с PEG с образованием компонента, стабилизирующего бислой. Такие фосфатидилэтаноламины являются коммерчески доступными, или могут быть изолированы или синтезированы с использованием традиционных методов, известных специалистам в данной области техники. Предпочтительными являются фосфатидилэтаноламины, содержащие насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты с длиной углеродной цепи в интервале от С10 до С20. Фосфатидилэтаноламины с моно- или диненасыщенными жирными кислотами и смеси насыщенных и ненасыщенных жирных кислот также могут быть использованы. Подходящие фосфатидилэтаноламины включают, но не ограничиваются этим, следующие: димиристоилфосфатидилэтаноламин (DMPE), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE) и дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE).
Приведенные выше композиции могут также включать PEG-конъюгированные липиды, которые известны в данной области техники, как таковые, включая PEG-фосфолипиды и PEG-церамиды, в том числе одну или несколько молекул, выбранных из следующих: PEG2000-DSPE, PEG2000-DPPE, PEG2000-DMPE, PEG2000-DOPE, PEG1000-DSPE, PEG1000-DPPE, PEG1000-DMPE, PEG1000-DOPE, PEG550-DSPE, PEG550-DPPE, PEG-550DMPE, PEG-1000DOPE, PEG-холестерин, РЕО2000-церамиды, PEG1000-церамиды, PEG750-церамиды и PEG550-церамиды.
Кроме того, композиции могут также включать монодисперсные (md) PEG-липиды, с общей формулой mdPEG-линкер-липид, с примерами включающими, но не ограничиваясь этим, 83-гидрокси-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81-гептакозаоксатриоктаконтил (2,3-бис(тетрадецилокси)пропил)карбамат ("HO-PEG1251-cBTP") и 134-гидрокси-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81,84,87,90,93,96,99,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132-тетратетраконтаоксатетратриаконтагектил (2,3-бис(тетрадецилокси)пропил)карбамат ("HO-PEG2000-cBTP") в качестве примеров.
Figure 00000009
Стероиды
Стероиды включают холестаны (например, холестерин), холаны и желчные кислоты (например, хенодезоксихолат и холат), эргостерол, ланостерин, кортикостероиды (например, глюкокортикоиды), прегнан (например, прогестерон), и фитостеролы. Они могут быть включены также в виде конъюгата с гидрофильным остатком, например полиэтиленгликолем. Предпочтительным стероидом является холестерин.
Нацеливающий липид
Пример нацеливающего липида представляет собой соединение формулы (А),
Figure 00000010
в котором липид (L) выбирается из группы, состоящей из DSPE, DOPE и DC; линкер (X) выбирается из группы, состоящей из отсутствия линкера, PEG550, PEG2000, PEG-глутамат (-Glu), Glu, С6, глицина и GluNH, N1,N19-бис(3-(2-(2-(3-аминопропокси)этокси)этокси)пропил)-4,7,10,13,16-пентаоксанонадекан-1,19-диамида; и ретиноид (R) выбирается из группы, состоящей из третиноина, адапалена, ретинола, 4-гидрокси(фенил)ретинамида (4-HPR), ретиноевой кислоты (витамина А), 9-(2,6,6-триметилциклогекс-1-ен-1-ил)нонановой кислоты, 3,7-диметил-9-(2,6,6-триметилциклогекс-1-ен-1-ил)нонановой кислоты, 3,7-диметил-9-(2,2,6-триметилциклогексил)нонановой кислоты, и любого частично или полностью насыщенного ретиноида или его производного.
Другой пример нацеливающего липида представляет собой соединение формулы (В),
Figure 00000011
в котором линкер (X) представляет собой N1,N19-бис(3-(2-(2-(3-аминопропокси)этокси)этокси)пропил)-4,7,10,13,16-пентаоксанонадекан-1,19-диамид ("бисамидо-PEG") или N1,N19-бис(16,20-диамино-15-оксо-4,7,10-триакса-14-азаикозил)-4,7,10,13,16-пентаоксанонадекан-1,19-диамид ("lys-бисамидо-PEG-lys"); и ретиноид (R) выбирается из группы, состоящей из третиноина, адапалена, ретинола, 4-гидрокси(фенил) ретинамида (4-HPR) и ретиноевой кислоты (витамина А), 9-(2,6,6-триметилциклогекс-1-ен-1-ил)нонановой кислоты, 3,7-диметил-9-(2,6,6-триметилциклогекс-1-ен-1-ил) нонановой кислоты, 3,7-диметил-9-(2,2,6-триметилциклогексил)нонановой кислоты, и любого частично или полностью насыщенного ретиноида или его производного.
Другие нацеливающие молекулы могут быть включены в липидную смесь, например, фолиевая кислота, витамин Е, пептидные лиганды и/или моноклональные антитела.
Композиции РНК-липидные частицы и составы
Настоящее описание включает композиции, содержащие липидную частицу с и без активного агента, в которой активный агент, если присутствует, ассоциирован с липидной частицей. В конкретных вариантах выполнения активный агент представляет собой терапевтический агент. В конкретных вариантах выполнения активный агент инкапсулирован в водном внутреннем пространстве липидной частицы. В других вариантах выполнения активный агент присутствует в одном или нескольких липидных слоях в липидной частице. В других вариантах выполнения активный агент связывается с внешней или внутренней липидной поверхностью липидной частицы.
В некоторых вариантах выполнения липидные частицы в соответствии с настоящим изобретением ассоциированы с нуклеиновой кислотой, что приводит к частице нуклеиновая кислота-липид. В конкретных вариантах выполнения нуклеиновая кислота полностью инкапсулирована в липидную частицу. Как используется в настоящем описании, термин "нуклеиновая кислота" означает включение любого олигонуклеотида или полинуклеотида. Фрагменты, содержащие до 50 нуклеотидов, обычно называются олигонуклеотидами, а более длинные фрагменты называются полинуклеотидами. В конкретных вариантах выполнения олигонуклеотиды в соответствии с настоящим изобретением имеют 15-50 нуклеотидов в длину.
Термины «полинуклеотид» и «олигонуклеотид» относятся к полимеру или олигомеру нуклеотидных или нуклеозидных мономеров, состоящих из природных оснований, сахаров и межсахаридных (остов) связях. Термины «полинуклеотид» и «олигонуклеотид» также включает полимеры или олигомеры, содержащие неприродные мономеры или их части, которые функционируют аналогичным образом. Такие модифицированные или замещенные олигонуклеотиды часто предпочтительнее, чем нативные формы из-за таких свойств, как, например, усиленное клеточное поглощение и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.
Олигонуклеотиды могут быть как олигодезоксирибонуклеотиды, так и олигорибонуклеотиды. Олигодезоксирибонуклеотид состоит из дезоксирибозы, соединенной ковалентно с фосфатом при 5'- и 3'-атомах углерода этого сахара с образованием неразветвленного полимера с регулярным чередованием мономерных единиц. Олигорибонуклеотид состоит из подобной повторяющейся структуры, где каждый нуклеотид имеет рибозную сахарную группу. Модифицированные молекулы рибозы, могут быть включены в олигорибонуклеотид.
Нуклеиновая кислота, которая присутствует в частице липидов с нуклеиновой кислотой в соответствии с настоящим изобретением, включает любую форму нуклеиновой кислоты, которая известна. Нуклеиновые кислоты, используемые в настоящем описании, могут быть одноцепочечными ДНК или РНК или двухцепочечными ДНК или РНК, или гибридами ДНК-РНК или гибридами РНК-ПНК и/или гибридами ДНК-ПНК ПНК-дуплексов. Примеры двухцепочечной ДНК включают структурные гены, гены, включая контролирующие и терминирующие области и самореплицирующиеся системы, такие как вирусная или плазмидная ДНК. Примеры двухцепочечной РНК включают миРНК и другие реагенты РНК-интерференции. Одноцепочечные нуклеиновые кислоты включают, например, антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, микроРНК и триплекс-образующие олигонуклеотиды.
Нуклеиновые кислоты могут быть различной длины, обычно зависящей от конкретной формы нуклеиновой кислоты. Например, в конкретных вариантах выполнения плазмиды или гены могут быть от около 1000 до 100000 нуклеотидных остатков в длину. В конкретных вариантах выполнения олигонуклеотиды могут варьироваться около от 10 до 100 нуклеотидов в длину. В различных родственных вариантах выполнения олигонуклеотиды, будь то одноцепочечный, двухцепочечный и трехцепочечный, может варьироваться в длину от около 10 до около 50 нуклеотидов, от около 21 до около 50 нуклеотидов, от около 15 до около 30 нуклеотидов, от около 20 до около 30 нуклеотидов в длину.
В конкретных вариантах выполнения олигонуклеотид (или его цепь) могут специфически гибридизоваться с или быть комплементарным целевому полинуклеотиду. «Специфически гибридизуется» и «комплементарный» являются выражениями, которые используются для указания достаточной степени комплементарности, такой, что стабильное и специфическое связывание происходит между ДНК или РНК мишени и олигонуклеотидом. Понятно, что олигонуклеотид может не быть на 100% комплементарен целевой последовательности нуклеиновой кислоты, чтобы быть специфически гибридизуемым. Олигонуклеотид является специфически гибридизуемым, когда связывание олигонуклеотида с мишенью препятствует нормальной функции молекулы-мишени, что вызывает потерю полезности или его экспрессии, и существует достаточная степень специфического спаривания оснований, чтобы избежать неспецифического связывания олигонуклеотида с нецелевыми последовательностями в условиях, в которых ожидается специфическое связывание, т.е. в физиологических условиях в случае анализов in vivo или терапевтического воздействия, или, в случае анализов in vitro, в условиях, в которых проводятся анализы. Таким образом, в других вариантах выполнения, этот олигонуклеотид включает 1, 2, или 3 замены оснований по сравнению с областью гена или последовательности мРНК, которая является целевой или с которой она специфически гибридизуется.
В конкретных вариантах выполнения частицы «нуклеиновая кислота-липид» могут быть ассоциированы с молекулами РНК-интерференции (РНКи). Способы РНК-интерференции с использованием молекулы РНКи, могут быть использованы для нарушения экспрессии гена или полинуклеотида, представляющего интерес. миРНК являются РНК-дуплексами обычно 15-30 нуклеотидов в длину, которые могут связываться с цитоплазматическим мультипротеиновым комплексом, известным как РНКи-индуцируемый комплекс сайленсинга (RISC). RISC, загруженный миРНК, опосредует деградацию гомологичных транскриптов мРНК; поэтому могут быть сконструированы миРНК для подавления экспрессии белка с высокой специфичностью. В отличие от других антисмысловых технологий миРНК функционируют через естественный механизм, вовлекающий контроль экспрессии генов через некодирующую РНК. Это, как правило, считается причиной, почему их активность является более мощной in vitro и in vivo, чем как антисмысловой олигонуклеотид, так и рибозимы. РНКи реагенты могут включать: гибриды смысловая ДНК: антисмысловая РНК, гибриды смысловая РНК: антисмысловая ДНК, и гибриды ДНК: ДНК способны опосредовать РНКи. Таким образом, могут быть использованы молекулы РНКи, содержащие любой из этих различных типов двухцепочечных молекул. Кроме того, следует понимать, что молекулы РНКи, могут быть использованы и вводиться в клетки в различных формах. Соответственно, используемые в настоящем описании молекулы РНКи охватывают любые и все молекулы, способные индуцировать реакцию РНКи в клетках, в том числе, но не ограничиваясь этим, двухцепочечные полинуклеотиды, содержащие две отдельные цепочки, т.е. смысловую цепь и антисмысловую цепь, например, малые интерферирующие РНК (миРНК); полинуклеотиды, содержащие шпилечные петли комплементарных последовательностей, которые образуют двухцепочечную область, например, молекулы шпРНКи, и экспрессионные векторы, которые экспрессируют один или несколько полинуклеотидов, способные образовывать отдельно или в сочетании с другим полинуклеотидом двухцепочечный полинуклеотид.
РНК-интерференция (РНКи) может быть использована для специфического ингибирования экспрессии полинуклеотидов-мишеней. Супрессия гена и экспрессии нуклеиновой кислоты, опосредованные двухцепочечной РНК, могут быть осуществлены в соответствии с настоящим изобретением посредством введения дцРНК, миРНК или шпРНК в клетки или организмы. миРНК может быть двухцепочечной РНК или гибридной молекулой, содержащей как РНК, так и ДНК, например, одноцепочечную РНК и одноцепочечную ДНК или sisiRNA.
Молекулы РНКи, нацеленные на конкретные полинуклеотиды, могут быть легко получены в соответствии с процедурами, известными в данной области техники.
Соответственно, специалисту в данной области техники должно быть понятно, что большое разнообразие различных молекул миРНК могут быть использованы для нацеливания на конкретный ген или транскрипт. В некоторых вариантах выполнения молекулы миРНК в соответствии с настоящим изобретением являются двухцепочечными и имеют 16-30 или 18-25 нуклеотидов в длину, включая каждое промежуточное целое число между ними.
Как правило, молекулы миРНК полностью комплементарны одной цепи молекулы ДНК-мишени. В других вариантах выполнения миРНК может иметь модифицированную композицию, такую как, например, 2'-деокси или 2'-O-метил модификации. Однако в предпочтительных вариантах выполнения полная цепь миРНК не состоит либо из 2'-дезокси, либо из 2'-O-модифицированных оснований.
В некоторых вариантах выполнения настоящее изобретение относится к способам и композициям для получения частиц липидов с инкапсулированными нуклеиновыми кислотами, в которых нуклеиновые кислоты инкапсулированы в липидном слое. Такие частицы липидов и нуклеиновой кислоты, содержащие миРНК-олигонуклеотиды, характеризуются с использованием различных биофизических параметров, включая: (1) соотношение нуклеиновой кислоты и липида; (2) эффективность инкапсуляции и (3) размер частиц. Желательными являются высокая эффективность инкапсуляции, хорошая устойчивость к нуклеазам и стабильность в сыворотке крови и контролируемый размер частиц, как правило, менее 200 нм в диаметре. Кроме того, природа полимера нуклеиновой кислоты имеет значение, так как модификация нуклеиновых кислот для придания устойчивости к нуклеазам добавляет к стоимости терапии, в то время как во многих случаях обеспечивается только ограниченная устойчивость. Если не указано иное, эти критерии рассчитываются в настоящем описании следующим образом:
Соотношение нуклеиновая кислота к липиду - это количество нуклеиновой кислоты в определенном объеме препарата, деленное на количество липида в том же объеме. Это может быть выражено как моль на моль или масса на массу, или масса на моль. Для конченых, готовых для введения препаратов, отношение нуклеиновая кислота: липид рассчитывается после диализа, хроматографии и/или обработки ферментом (например, нуклеазой), которая используется, чтобы удалить как можно больше внешней нуклеиновой кислоты, насколько это возможно.
Инкапсуляция
Для определения эффективности инкапсуляции (ЕЕ) миРНК, выражаемой как процент инкапсулированной миРНК в частицах липида-нуклеиновая кислота, используется RiboGreen-анализ следующим образом. Эта процедура может быть использована для определения концентрации в растворе дуплекса и одноцепочечной РНК или ДНК.
Оборудование включает в себя BioTek Instruments, Inc FLx800, пипетки с регулируемым объемом и вихревой смеситель. Реагенты включают воду, свободную от РНКазы (MilliQ класса или эквивалент), 20х ТЕ буфер "RNase free" (Invitrogen, Т11493, или эквивалент), Quant-iT RiboGreen Reagent (Invitrogen, R11491) и 10% Тритон X-100 в воде (Thermo Scientific, 28314, или эквивалент).
Приготовление 1X ТЕ буфера включает в себя перенос 38 мл воды, свободной от РНКазы, в центрифужную пробирку 50 мл с помощью 50 мл градуированного цилиндра; и пипетирование 2 мл раствора 20Х ТЕ-буфере в пробирку для центрифугирования и смешивания с использованием вортекса.
Получение 2% Тритон Х-100 и 1% Тритон Х-100 в 1X ТЕ-буфере включает пипетирование 2 мл или 1 мл, соответственно, 10% Тритон Х-100 в 15 мл коническую пробирку, свободную от РНКазы, добавляя 8 мл или 9 мл, соответственно, 1X ТЕ-буфера, и перемешивание раствора путем вращения сосуда для хорошего перемешивания.
Приготовление рабочего раствора RiboGreen включает в себя извлечение замороженного сток-раствора RiboGreen Reagent нагреванием до комнатной температуры и разбавлением 1:200 с ТЕ-буфером. Центрифужные пробирки заворачивали в алюминиевую фольгу, чтобы предотвратить избыточное освещение реакционного раствора.
Стандарт получается посредством приготовления раствора РНК в ТЕ-буфере, и раскапыванием в 96-луночный планшет. Образцы разводили до конечной концентрации приблизительно 80 мкг/мл миРНК и переносили в 96-луночный планшет, как показано на Фиг. 1. Рабочий раствор RiboGreen добавляли и смешивали с каждым образцом и стандартом. Образцы инкубировали в темноте в течение 1-2 минут перед анализом.
1% Тритон Х-100 в ТЕ-буфере затем добавляли для дублирования образцов и затем добавляли рабочий раствор RiboGreen.
Эффективность инкапсуляции определяется из флуоресцентных измерений с использованием среднего значения результатов флуоресценции от каждого образца с поправкой на измерения базовой линии среднего значения внешних образцов (флуоресценция RiboGreen reagent в отсутствие РНК), и после коррекции на 8% уменьшения интенсивности сигнала вследствие наличия Тритон Х-100. Эффективность инкапсуляции затем рассчитывается по следующей формуле:
ЕЕ=(Тритоновый образец-образец липосом)/(Тритоновый образец)
То есть, эффективность инкапсуляции представляет собой разницу между значением общей РНК (измеренной после растворения липосом с поверхностно-активным веществом) и значением интактных липосом, деленное на значение общей РНК. Флуоресценция, полученная от интактного образца липосом, состоит из свободной РНК в растворе плюс РНК, адсорбированной на внешней поверхности липосом.
Размер
Размер показывает размер (диаметр) образующихся частиц. Распределение по размеру может быть определено с использованием прибора динамического рассеяния света (DLS) Malvern Zetasizer Nano-ZS.
Эта процедура применяется для измерения среднего диаметра по объему, Z-среднего диаметра и полидисперсности для образцов липосом без остановки процесса. Полидисперсность представляет собой числовое значение для распределения частиц по размерам.
Измерения проводились при комнатной температуре. Образцы и реагенты должны быть доведены до комнатной температуры. Определяли средневзвешенный диаметр частиц и индекс полидисперсности.
Способ изготовления
Приготовление липосом
Липидную смесь можно солюбилизировать в смешивающемся с водой органическом растворителе, предпочтительно абсолютном этаноле. В большинстве вариантов выполнения органический растворитель используют в том виде, в котором он является коммерчески доступным.
В одном примерном варианте выполнения смесь липидов представляет собой смесь катионных аминолипидов, нейтральных липидов (отличных от аминолипидов), стероидов (например, холестерина), а PEG-модифицированные липиды (например, PEG-S-DMG, PEG-C-DOMG или PEGDMA) представляет собой со-солюбилизаторы в органическом растворителе. В предпочтительных вариантах выполнения липидная смесь состоит по существу из катионного аминолипида, нейтрального липида, холестерина и PEG-модифицированного липида. В других предпочтительных вариантах выполнения липидная смесь состоит из катионного липида, DOPE (или другого вспомогательного липида, либо ионизируемого, либо с перманентным катионным зарядом), холестерина и PEG-конъюгированного липида при различных молярных соотношениях. Предпочтительные мольные диапазоны находятся между 40 и 60 мол.% катионного липида, от 10 до 30% нейтрального липида, от 20 до 40% холестерина и от 1 до 10% PEG-модифицированного липида.
Нацеливающий липид может быть добавлен к липидной смеси, например, DIVA-PEG750-DIVA (или другой VA-конъюгированный нацеливающий липид) в мольном соотношении от 0,1 до 5 (нацеливающий липид: общие липиды).
Общая концентрация липидов составляет менее 25 мг/мл, предпочтительно менее 5 мг/мл. Липидную смесь фильтруют через мембранный, например, 0,45 или 0,2 мкм фильтр.
В соответствии с настоящим изобретением липидную смесь комбинируют с забуференным водным раствором. Буферный водный раствор может представлять собой раствор, в котором буфер имеет рН меньше, чем pKa протонированного липида в липидной смеси. Примеры подходящих буферов включают цитратный, фосфатный и ацетатный. Особенно предпочтительным буфером является цитратный буфер. Предпочтительными будут буфера в диапазоне концентраций 1-1000 мМ аниона, в зависимости от химического состава нуклеиновых кислот, которые будут инкапсулированы, и оптимизация концентрации буфера может быть значительной для достижения высоких уровней загрузки. Для этого может быть удобным прибавить криопротектор, и/или неионное растворенное вещество, которые будет уравновешивать осмотический потенциал через мембрану частиц, например, когда частицы диализуют для удаления этанола, повышения рН, или в смеси с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Количество нуклеиновой кислоты в буфере составляет от около 0,08 до 0,8 мг/мл.
Во время добавления этанола температура водного раствора составляет от 25 до 45°С, предпочтительно от 30 до 40°С. Раствор этанола добавляют к водному раствору либо посредством распыления на поверхность раздела воздух-вода, в узком потоке, либо через межфазную поверхность раздела жидкость-жидкость между этанолом, доставляемым через трубку, которая погружена и водным раствором.
Органический раствор добавляют самотеком или с помощью насоса, доставляющего органический раствор к водному раствору с контролируемой скоростью, предпочтительно с постоянной скоростью. Доставка органического раствора может быть завершена за от 1 мин до 100 мин, предпочтительно от 1 до 25 минут. Органический раствор может быть добавлен через одно распыление или струю, через трубку или сопло, или через системы с множеством сопел. Во время добавления органического раствора в водный раствор, получающийся раствор может перемешиваться посредством вихревого движения, встряхивания или рециркуляции. Дополнительная стадия приводит к конечной концентрации, которая предпочтительно составляет от 25 до 45% этанола, наиболее предпочтительно 35% этанола.
Конечный раствор обрабатывают для удаления органического растворителя, посредством диализа или фильтрации, предпочтительно посредством диафильтрации. По мере того как этанол удаляется, водный раствор преобразуется в раствор, забуференный при нейтральном рН, от рН 6,8 до рН 7,5, предпочтительно, рН 7,2, например фосфатный или HEPES буфер. Получающийся водный раствор предпочтительно стерилизуют перед хранением или использованием, например, фильтрованием через фильтр 0,22 мкм.
Липосомы, инкапсулирующие отрицательно заряженные терапевтические полимеры
Описанные в настоящем изобретении способы могут быть использованы для получения частиц липидов с отрицательно заряженным терапевтическим полимером, например, молекулой РНК. В способах, описанных в настоящем описании, смесь липидов комбинируется с водным раствором полимера. Полимер эффективно инкапсулируется в полученных липидных частицах.
Наночастицы могут включать полианионное активное вещество или терапевтический агент, например, РНК и один, два или три биосовместимых полимеров. Типичные терапевтические агенты включают нуклеиновые кислоты, противоопухолевые агенты, такие как таксаны.
Суммарный заряд отрицательно заряженного полимера, который должен быть меньше или равен числу положительных зарядов в липидной смеси, в момент прибавления составляет предпочтительно от 0,06 до 0,16 (по массе). Например, когда используется РНК, инкапсулированные нуклеиновые кислоты присутствуют в конечном соотношении РНК: липид от 0,06 до 0,16, заряд: заряд (-/+), предпочтительно от 1:2,5 до 1:1.
Когда смесь липидов содержит катионный липид с зарядом, липидные везикулы могут быть образованы в присутствии отрицательно заряженного полимера, чтобы инкапсулировать и захватить полимер. Получающиеся частицы могут быть нейтрализованы посредством увеличения рН среды до физиологического рН или выше. Везикулы, сформированные таким образом, обеспечивают составы одинакового размера везикул с высоким содержанием нуклеиновых кислот.
В любом случае везикулы, инкапсулирующие полимер (наночастицы), имеют размер в интервале от 50 до 150 нм.
В соответствии со способом, описанным в настоящем изобретении, липидную смесь комбинируют с забуференным водным раствором, который может содержать отрицательно заряженный полимер. Забуференный водный раствор может представлять собой раствор, в котором буфер имеет рН менее чем рКа протонированного липида в липидной смеси. Примеры подходящих буферов включают цитратный, фосфатный, ацетатный и MES. Особенно предпочтительным буфером является цитратный буфер. Предпочтительными будут буфера в диапазоне концентраций 1-1000 мМ аниона, в зависимости от химического состава полимера, который будет инкапсулирован, и оптимизация концентрации буфера может быть значительной для достижения высоких уровней загрузки.
Может быть удобным добавление криопротектора и/или неионного растворенного вещества, которое будет уравновешивать осмотический потенциал через мембрану частиц, когда частицы диализуют для удаления этанола, повышения рН, или при смешении с фармацевтически приемлемым носителем и/или разбавителем.
Для РНК схема описанного в настоящем описании процесса изображена на Фиг. 1. Растворы получаются растворением лиофилизованного или твердого материала в воде, предпочтительно забуференной при рН 3,5-4,5, например, с 50 мМ цитрата. Количество нуклеиновой кислоты в буфере составляет от 0,08 до 0,8 мг/мл. Во время добавления этанола температура водного раствора поддерживается от 25 до 45°С, предпочтительно от 30 до 40°С. При использовании одноцепочечной нуклеиновой кислоты краткое нагревание при повышенной температуре может быть полезно, например, 1-2 минут при 65°С.
Этанольный раствор добавляют к водному раствору либо посредством распыления на поверхности раздела воздух-вода, в узком потоке, либо через межфазную поверхность раздела жидкость-жидкость между этанолом, доставляемым через трубку, которая соединена с контейнером и водным раствором.
Органический раствор добавляют посредством доставки органического раствора к водному раствору с контролируемой скоростью, предпочтительно с постоянной скоростью. Доставка органического раствора может быть завершена за от 1 мин до 100 мин, предпочтительно от 1 до 25 минут. Органический раствор может быть добавлен через одно распыление или струю, через трубку или сопло или через систему со множеством сопел. Во время добавления органического раствора в водный раствор получающийся раствор может перемешиваться посредством вихревого движения, встряхивания или рециркуляции. Дополнительная стадия приводит к конечной концентрации достаточной, чтобы разрушить структуру липосомального бислоя, предпочтительно от 25 до 45% этанола, наиболее предпочтительно 35% этанола.
Для частиц липидов и нуклеиновых кислот конечная концентрация РНК составляет от 0,001 до 1 мг/мл, предпочтительно от 0,01 до 0,5 мг/мл, наиболее предпочтительно от 0,05 до 0,5 мг/мл. Окончательное соотношение лекарственное средство/липиды, составляет от 0,06 до 0,16 масса : масса (от 2,5:1 до 1:1, отношение заряд:заряд).
Конечный раствор обрабатывают для удаления органического растворителя, посредством диализа или фильтрации, предпочтительно посредством диафильтрации. В то время как этанол удаляется, водный раствор преобразуется в раствор, буферный при нейтральном рН, от рН 6,8 до рН 7,5, предпочтительно, рН 7,2, например фосфатный буфер. Получающийся водный раствор предпочтительно стерилизуют перед хранением или использованием, например, фильтрованием через фильтр 0,22 мкм.
Окончательная эффективность инкапсуляции получается больше, чем 85%. Окончательный средний диаметр частиц составляет от 50 до 150 нм. Индекс полидисперсности ПДИ получается меньше 0,2, предпочтительно меньше 0,1.
Лиофилизации
Настоящее изобретение относится в частности к лиофилизованной фармацевтической композиции, которая при восстановлении имеет минимальное количество крупных агрегатов. Такие большие агрегаты могут иметь размер больший, чем около 0,2 мкм, больше, чем около 0,5 мкм или больше, чем около 1 мкм, и могут быть нежелательными в восстановленном растворе. Размеры агрегатов могут быть измерены с использованием различных методов, включая те, которые указаны в Фармакопее США 32 <788>, которая включена в настоящее описании посредством ссылки. Исследования могут включать подсчет количества частиц в режиме светотени, тест подсчета микроскопических частиц, лазерную дифракцию и оптическое зондирование одиночных частиц. В одном варианте выполнения размер частиц в данном образце измеряется с помощью лазерной дифракции и/или оптического зондирования одиночных частиц. Динамическое рассеяние света (DLS) может быть использовано для измерения размера частиц, но оно опирается на броуновское движение, таким образом, методика не может обнаружить некоторые крупные частицы. Лазерная дифракция опирается на различия в показателе преломления между частицей и суспензионной средой. Методика способна обнаруживать частицы от субмикронного до миллиметрового диапазона. Относительно небольшие (например, около 1-5% по массе) количества более крупных частиц могут быть определены в суспензии наночастиц. Оптическое зондирование одиночных частиц (SPOS) использует исследование частиц методом затенения разбавленных суспензий для подсчета отдельных частиц около 0,5 мкм. Зная концентрацию частиц измеряемого образца, можно вычислить массовый процент агрегатов или концентрацию агрегатов (частицы/мл).
Образование агрегатов может происходить при замораживании и/или на стадии высушивания лиофилизации, например, за счет дегидратации поверхности частиц. Процесс замораживания имеет концентрирующий эффект, который может уменьшать расстояние между частицами, так как образуется лед (Alison et al., Biochim Biophys Acta. 2000 Sep 29; 1468 (1-2): 127-38; Armstrong and Anchordoquy, J Pharm Sci. 2004 Nov; 93(11): 2698-709). Это обезвоживание можно избежать с помощью лиопротекторов, таких как полисахариды, в суспензии перед лиофилизацией. Подходящие полисахариды включают сахарозу, лактулозу, лактозу, мальтозу, трегалозу или целлюлозу, койибиозу, нигерозу, изомальтозу, трегалозу, софорозу, ламинарибиозу, гентиобиозу, туранозу, мальтулозу, палатинозу, генциобиулозу, маннобиозу, мелибиозу, мелибиулозу, рутинозу, рутинулозу и ксилобиозу. В одном варианте выполнения композиция содержит полисахарид, который является сахарозой. В другом варианте выполнения композиция содержит полисахарид, который является трегалозой. Результаты заявителей показывают, если сравнивать с исходной суспензией, что при восстановлении получаются эквивалентные распределения по размерам, определенные методом DLS.
Ранее считалось, что витрификация, процесс иммобилизации макромолекул в стеклообразном наполнителе, не является фактором, вносящем вклад в предотвращение агрегации липосом, и что необходимы гипертонические растворы сахара (Alison et al.). Авторы настоящего изобретения обнаружили, что результаты стадий замораживания и высушивания лиофилизации зависят от определенного соотношения липид: полисахарид (масса : масса), которое обеспечивает средства для предотвращения этой агрегации липосом, нарушения липосомального диффузионного барьера и высвобождения инкапсулированных РНК с образованием липоплексов нуклеиновых кислот. В одном варианте выполнения композиция содержит от 12 до 15% (масса : масса) сахарозы и от 5 до 20 мг/мл липида, предпочтительно 12% сахарозы и 9 мг/мл липида. Более предпочтительно, чтобы композиция также содержала бы буфер, наиболее предпочтительно HEPES при нейтральном рН.
Стадии лиофилизации проводятся в подходящей стеклянной емкости, предпочтительно 10 мл, цилиндрическом стеклянном флаконе. Стеклянный флакон должен выдерживать резкие изменения температуры от менее чем -40°С до выше комнатной температуры в короткие периоды времени, и равномерно уменьшаться. Композиция, содержащая наполнитель и липосомы, инкапсулирующие нуклеиновую кислоту, добавляют во флакон, предпочтительно в объеме 3 мл, предпочтительно с 9 мг/мл липида.
Стадия лиофилизации может включать замораживание композиции при температуре выше, чем около -40°С, или, например, меньше чем около -30°С, образуя замороженную композицию; и высушивание замороженной композиции с образованием лиофилизованной композиции. Стадия замораживания предпочтительно приводит к линейному уменьшению температуры до конечной течение около 6 минут, предпочтительно при 1°С/мин от 20 до -40°С. Более предпочтительно может быть использована сахароза при 12-15%, и стадия высушивания при около 50-150 мТорр, сначала при низкой температуре от около -15 до около -35°С, а затем при более высокой температуре от комнатной температуры до около 25°С, и завершается в течение от трех до семи дней. В другом варианте выполнения настоящего изобретения может быть использована трегалоза и стадия высушивания при около 50-100 мТорр, сначала при низкой температуре от около 0 до около -15°С, а затем при более высокой температуре.
Другим объектом настоящего изобретения является способ предотвращения существенной агрегации частиц в фармацевтической композиции наночастиц, включающий добавление сахара и соли в лиофилизируемую композицию для предотвращения агрегации и высвобождения нуклеиновой кислоты из внутренней части липосомы.
Фармацевтические композиции
Липидные частицы настоящего изобретения, особенно в сочетании с терапевтическим агентом, могут быть приготовлены в виде фармацевтической композиции, например, которая дополнительно содержит фармацевтически приемлемый разбавитель, вспомогательное вещество или носитель, такой как физиологический раствор или фосфатный буфер, выбранный в соответствии со способом введения и стандартной фармацевтической практикой.
В конкретных вариантах выполнения фармацевтические композиции, содержащие частицы липидов и нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением, получают согласно стандартным методикам и дополнительно содержат фармацевтически приемлемый носитель. Как правило, физиологический раствор будет использоваться в качестве фармацевтически приемлемого носителя. Другие подходящие носители включают, например, воду, забуференную воду, 0,9% солевой раствор, 0,3% глицин, сахар или полисахарид, например, сахарозу и/или трегалозу, и тому подобное, включая гликопротеины для повышенной стабильности, такие как альбумин, глобулин, липопротеины. Могут быть включены объемообразующие агенты, криопротекторы и/или лиопротекторы, а также акцепторы металлов, например, ЭДТА. В композиции, содержащих физиологический раствор или другие солесодержащие носители, носитель предпочтительно добавляют после образования липидной частицы. Таким образом, после того как образуются композиции липидов и нуклеиновых кислот, композиции могут быть разбавлены в фармацевтически приемлемых носителях, таких как нормальный физиологический раствор.
Получающиеся фармацевтические препараты могут быть стерилизованы с помощью обычных, хорошо известных способов стерилизации. Водные растворы могут быть упакованы для использования или отфильтрованы в асептических условиях и лиофилизованы, причем лиофилизированный препарат объединяют со стерильным водным раствором перед введением. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, такие как агенты, регулирующие рН, и буферные агенты, агенты, регулирующие тоничность, и т.п., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция и т.д. Кроме того, липидная суспензия может включать агенты, защищающие липиды, которые защищают липиды против свободных радикалов и пероксидативного повреждения липидов при хранении. Липофильные ловушки для свободных радикалов, например, α-токоферол и водорастворимые железоспецифичные хелатирующие агенты, такие как ферриоксамин, являются подходящими.
Концентрация липидной частицы или частицы липидов и нуклеиновых кислот в фармацевтических препаратах может широко варьировать, т.е. от менее чем около 0,01%, обычно по при или по меньшей мере от около 0,05-5% до более чем 10-30% по массе, и будет выбираться в первую очередь по объемам жидкости, вязкости и т.п., в соответствии с конкретным выбранным способом введения. Например, концентрация может быть увеличена, чтобы понизить жидкостную нагрузку, связанную с лечением. Это может быть особенно желательно у пациентов с застойной сердечной недостаточностью, ассоциированной с атеросклерозом или тяжелой формой гипертонической болезни. Альтернативно, комплексы, состоящие из липидов, вызывающих раздражение, могут быть разбавлены до низких концентраций, чтобы уменьшить воспаление в месте введения. В одной группе вариантов выполнения нуклеиновая кислота будет иметь прикрепленную метку и будет использоваться для диагностики (указывая на присутствие комплементарной нуклеиновой кислоты). В этом случае количество вводимых комплексов будет зависеть от конкретной используемой метки, болезненного диагностируемого состояния и решения врача, но обычно составляет от около 0,01 до около 50 мг на килограмм массы тела, предпочтительно между около 0,001 и около 5 мг/кг массы тела.
Способ применения
Липидные частицы, описанные в настоящем изобретении, могут быть использованы для доставки нуклеиновой кислоты в клетку in vitro или в in vivo. Хотя следующее описание различных методов с использованием липидных частиц и связанных с ними фармацевтических композиций в соответствии с настоящим изобретением иллюстрируются посредством описания частиц липидов и нуклеиновых кислот, следует понимать, что эти способы и композиции могут быть легко адаптированы для доставки любого терапевтического средства для лечения любого заболевания или расстройства, которые извлекло бы выгоду от такого лечения.
В некоторых вариантах выполнения настоящее изобретение обеспечивает способы введения нуклеиновой кислоты в клетку. Предпочтительными нуклеиновыми кислотами для введения в клетки являются миРНК, иммуностимулирующие олигонуклеотиды, плазмиды, антисмысловые и рибозимы. Эти способы могут быть осуществлены посредством контактирования частиц или композиций в соответствии с настоящим изобретением с клетками в течение периода времени, достаточного для того, чтобы произошла внутриклеточная доставка.
Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть адсорбированы на почти любым типом клеток. После адсорбции частицы липидов и нуклеиновых кислот могут быть либо эндоцитированы частью клеток, обменом липидов с клеточными мембранами, либо слиться с клетками. Перенос или инкорпорация нуклеиновой кислоты как части комплекса может происходить через любой из этих путей. Без намерения ограничиваться по отношению к объему изобретения, можно считать, что в случае частиц, поглощенных клеткой посредством эндоцитоза, частицы затем взаимодействуют с эндосомальной мембраной, что приводит к дестабилизации эндосомальной мембраны, возможно, посредством формирования небислойных фаз, приводящих к введению инкапсулированной нуклеиновой кислоты в клеточную цитоплазму. Аналогичным образом в случае прямого слияния частиц с плазматической мембраной клетки, если имеет место слияние, липосомальная мембрана интегрируется в клеточную мембрану и содержимое липосомы смешивается с внутриклеточной жидкостью. Контакт между клетками и композициями липидов и нуклеиновых кислот, если осуществляется in vitro, будет происходить в биологически совместимой среде. Концентрация композиции может широко варьировать в зависимости от конкретного применения, но обычно составляет от 1 мкмоль до 10 ммоль. В некоторых вариантах выполнения обработка клеток с композициями липидов и нуклеиновых кислот обычно будет осуществляться при физиологических температурах (37°С) в течение периода времени от 1 до 24 часов, предпочтительно от 2 до 8 часов. Для применения in vitro, доставка нуклеиновых кислот может быть осуществлена в любую клетку, выращенную в культуре, будь она растительного или животного происхождения, позвоночных и беспозвоночных, и из любой ткани или типа. В предпочтительных вариантах выполнения клетки будут животными клетками, более предпочтительно клетками млекопитающих и наиболее предпочтительно клетками человека.
В одной группе вариантов выполнения суспензия частиц липидов и нуклеиновой кислоты добавляют к клеткам с конфлюентностью 60-80%, имеющим плотность клеток от около 103 до около 105 клеток/мл, более предпочтительно около 2×104 клеток/мл. Концентрация суспензии, добавляемой к клеткам, предпочтительно составляет от около 0,01 до 20 мкг/мл, более предпочтительно около 1 мкг/мл.
Типичные области применения включают использование хорошо известных процедур для обеспечения внутриклеточной доставки миРНК для нокдауна или сайленсинга конкретных клеточных мишеней. В качестве альтернативы применения включают доставку последовательностей ДНК или мРНК, которые кодируют терапевтически полезные полипептиды.
Способы в соответствии с настоящим изобретением могут быть осуществлены in vitro, ex vivo или in vivo. Например, композиции в соответствии с настоящим изобретением могут также использоваться для доставки нуклеиновых кислот в клетки в живом организме с использованием способов, которые известны специалистам в данной области техники.
Что касается введения in vivo, фармацевтические композиции предпочтительно вводить парентерально, т.е. внутрисуставно, внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно или внутримышечно. В конкретных вариантах выполнения, фармацевтические композиции вводятся внутривенно или внутрибрюшинно с помощью болюсной инъекции.
В других способах фармацевтические препараты можно вводить в контакт с тканью-мишенью посредством непосредственного нанесения препарата на ткань. Нанесение может быть сделано посредством местной, «открытой» или «закрытой» процедуры. Термин «местное» означает непосредственное нанесение фармацевтического препарата на ткань, подвергающейся воздействию условий среды, такую, как кожа, ротовая часть глотки, наружный слуховой проход и тому подобное. «Открытые» процедуры являются такими процедурами, которые включают надрезание кожи пациента и непосредственную визуализацию основной ткани, на которую фармацевтические препараты наносятся. Это обычно достигается посредством хирургического вмешательства, такого как торакотомии для доступа к легким, брюшная лапаротомии для доступа к брюшной полости или другого прямого хирургического подхода к ткани-мишени. «Закрытые» процедуры являются инвазивными процедурами, в которых внутренние ткани-мишени непосредственно не визуализируются, но становятся доступными через проникающие инструменты через небольшие раны на коже. Например, препараты могут быть введены в брюшину лаважной иглой. Кроме того, фармацевтические препараты могут быть введены к мозговым оболочкам или к спинному мозгу посредством инфузии во время люмбальной пункции с последующим соответствующим позиционированием пациента, как обычно практикуется в спинномозговой анестезии или метризамидной визуализации спинного мозга. Кроме того, препараты могут быть введены через эндоскопические устройства.
Композиции липидов нуклеиновых кислот также могут быть введены в виде аэрозоля, вдыхаемого в легкие, или посредством прямой инъекции в месте заболевания.
Способы в соответствии с настоящим изобретением могут быть осуществлены в различные субъекты или хозяев. Предпочтительные субъекты или хозяева включают виды млекопитающих, таких как люди, нечеловекообразные приматы, собаки, кошки, крупный рогатый скот, лошади, овцы и тому подобное. В конкретных вариантах выполнения субъектом является млекопитающее, такое как человек, нуждающийся в лечении или профилактике заболевания или расстройства, например, субъект с диагнозом или рассматриваемый как с повышенным риском заболевания или расстройства.
Дозы для частиц липидов и терапевтического агента в соответствии с настоящим изобретением будут зависеть от соотношения терапевтического агента и липидов и от мнения ведущего врача, основанного на возрасте, массе и состояния пациента.
В одном варианте выполнения настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида. Эти методы обычно включают контактирование клетки с липидной частицей в соответствии с настоящим изобретением, которая ассоциирована с нуклеиновой кислотой, способной модулировать экспрессию целевого полинуклеотида или полипептида. Как используется в настоящем описании, термин «модулировать» относится к изменению экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида. В разных вариантах выполнения модулирование может означать увеличение или усиление, или это может означать, уменьшение или ослабление. Способы измерения уровня экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида известны и доступны в данной области техники и включают, например, способы, использующие полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (RT-PCR) и иммуногистохимические методы. В конкретных вариантах выполнения уровень экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида увеличивается или уменьшается по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, или более чем на 50% по сравнению с соответствующей контрольной величиной.
Например, если желательна повышенная экспрессия полипептида, нуклеиновая кислота может представлять собой экспрессионный вектор, который включает в себя полинуклеотид, который кодирует желаемый полипептид. С другой стороны, если желательно снижение экспрессии полинуклеотида или полипептида, тогда нуклеиновая кислота может представлять собой, например, антисмысловой олигонуклеотид, миРНК, или микроРНК, которые содержит полинуклеотидную последовательность, которая специфически гибридизуется с полинуклеотидом, который кодирует целевой полипептид, тем самым нарушая экспрессию целевого полинуклеотида или полипептида. Альтернативно, нуклеиновая кислота может быть плазмидой, которая экспрессирует такой антисмысловой олигонуклеотид, миРНК или микроРНК.
В конкретных вариантах выполнения нуклеиновая кислота - активное вещество или терапевтический агент выбирается из миРНК, микроРНК, антисмыслового олигонуклеотида и плазмиды, способной экспрессировать миРНК, микроРНК или антисмысловой олигонуклеотид, и в котором миРНК, микроРНК или антисмысловая РНК состоит из олигонуклеотида, который специфически связывается с полинуклеотидом, который кодирует полипептид или его комплемент, таким образом, что экспрессия полипептида уменьшается.
В других вариантах выполнения нуклеиновая кислота представляет собой плазмиду, которая кодирует полипептид или его функциональный вариант или фрагмент, такой, что экспрессия полипептида или функционального варианта или фрагмента увеличивается.
В родственных вариантах выполнения настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или расстройства, характеризующихся избыточной экспрессией полипептида у субъекта, включающий введение субъекту фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением, в котором выбрано терапевтическое средство из миРНК, микроРНК, антисмыслового олигонуклеотида и плазмиды, способной экспрессировать миРНК, микроРНК или антисмысловой олигонуклеотид и в котором миРНК, микроРНК или антисмысловая РНК содержит олигонуклеотид, который специфически связывается с полинуклеотидом, который кодирует полипептид или его комплементарную цепь.
В другом родственном варианте выполнения настоящее изобретение включает способ лечения заболевания или расстройства, характеризующиеся сверхэкспрессией полипептида у субъекта, включающий введение субъекту фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением, в которой терапевтическое средство представляет собой плазмиду, кодирующую полипептид или его функциональный вариант или его фрагмент.
Примеры
Пример 1
Наночастицы липосомы/РНК и наночастицы только из липидов готовили в соответствии с Фиг. 1 в различных масштабах, в диапазоне от 20 л до 200 л, используя 2 различных миРНК.
Сток раствор липидов смешивали следующим образом. Все липидные компоненты (катионный липид, DOPE, холестерин, PEG-конъюгированные липиды и DIVA-PEG750-DIVA растворяли в абсолютном этаноле до массовой концентрации 4,5 мг/мл. Липиды в этаноле нагревали до 35-40°С и перемешивали до тех пор, пока они не растворятся.
Липидный раствор перекачивали из сосуда с липидным сток-раствором через фильтр 0,45/0,22 мкм в сосуд для отфильтрованного липидного сток-раствора.
миРНК солюбилизировали в 50 мМ цитратном буфере в сосуде для сток-раствора миРНК при концентрации 0,26 мг/мл или 0,16 мг/мл в зависимости от окончательного соотношения миРНК и липидов. Раствор миРНК перекачивали из сосуда для сток-раствора миРНК через фильтр 0,45/0,22 мкм в сосуд для липосомальной миРНК в 35%-ном этаноле.
В сосуде для липосомной миРНК в 35%-ном этаноле доводили до 35-40°С при непрерывном перемешивании содержимого. Липидный раствор распыляли на поверхности буфера, содержащего миРНК, с использованием сопла для спонтанного образования липосом, нагруженных миРНК. Липиды комбинировали с миРНК для достижения конечного соотношении общих липидов и миРНК либо 14:1, либо 9:1 (масса : масса) и концентрации этанола 35%.
Липосомальный раствор затем разбавляли в 0,22 мкм фильтрованном буфере PBS в 20 л мешке одноразового использования Flex Boy до конечной концентрации этанола 10%. Получающийся липосомальный раствор концентрировали и подвергали диафильтрации против 10х объемов PBS для удаления этанола и замены буфера. Стадии полной концентрации и диафильтрации осуществляли с использованием насоса Quattro Flow (диафрагма), оборудованного насосной камерой одноразового использования, гибких труб одноразового использования и мембранных патронов одноразового использования с полыми волокнами. Конечную суспензию фильтровали через фильтр 0,45/0,22 мкм для снижения общего количества микробов в конечную сборную бутылку одноразового использования. Результаты показаны в таблице 1.
Figure 00000012
Приготовление липосом
В одном примерном варианте выполнения смесь липидов, представляющую собой смесь катионных аминолипидов, нейтральных липидов (отличных от аминолипидов), стероида (например, холестерина) и PEG-модифицированных липидов (например, PEG-S-DMG, PEG-C-DOMG или PEGDMA), совместно солюбилизировали в органическом растворителе. В предпочтительных вариантах выполнения липидная смесь состоит по существу из катионного аминолипида, нейтрального липида, холестерина и PEG-модифицированного липида. В дополнительных предпочтительных вариантах выполнения липидная смесь состоит из катионного липида, DOPE (или другого вспомогательного липида, либо ионизируемого, либо с перманентным катионным зарядом), холестерина и PEG-конъюгированного липида при различных молярных соотношениях. Предпочтительные мольные диапазоны находятся между 40 и 60 мол.% катионного липида, от 10 до 30% нейтрального липида, от 20 до 40% холестерина и от 1 до 10% PEG-модифицированного липида. Может быть добавлен нацеливающий липид к липидной смеси, например, DIVA-PEG750-DIVA (или другой VA-конъюгированный нацеливающий липид) в мольном соотношении от 0,1 до 5 (нацеливающий липид: общие липиды). Липидная смесь может также включать смесь полимеров или технологических добавок, которые могут быть природного происхождения (например, хитозан) или синтетического (например, ПЭИ) происхождения. Общая концентрация липидов составляет менее 25 мг/мл, предпочтительно менее 5 мг/мл. Липидную смесь фильтровали через мембранный фильтр, например через 0,45 или 0,2 мкм.
В соответствии с настоящим изобретением липидную смесь смешивали с забуференным водным раствором. Буферный водный раствор может представлять собой раствор, в котором буфер имеет рН меньше, чем рКа в протонируемых липидов в липидной смеси. Примеры подходящих буферов включают цитратный, фосфатный, ацетатный и MES. Особенно предпочтительным буфером является цитратный буфер. Предпочтительные буферы будут иметь концентрацию в диапазоне 1-1000 мМ аниона, в зависимости от химического состава нуклеиновых кислот, которые будут инкапсулированы, и оптимизация концентрации буфера может быть значительной для достижения высоких уровней загрузки. Альтернативно может быть использована чистая вода, подкисленная до рН 5-6 с помощью HCl, H2SO4, или тому подобное. Это может быть удобно для неионного растворенного вещества, которое будет выравнивать осмотический потенциал через мембрану частиц, например, когда частицы диализуются для удаления этанола, при повышении рН, или при смешивании с фармацевтически приемлемым носителем, таким как нормальный физиологический раствор. Буфер может также включать технологические добавки (например, полоксамеры, поверхностно-активные вещества, детергенты), объемные наполнители (например, маннит) или криопротекторы (например, сахароза, трегалоза, галактоза, инулин). Количество нуклеиновой кислоты в буфере составляет от около 0,08 до 0,8 мг/мл.
Во время добавления этанола температура водного раствора и этанола составляет от 25 до 45°С, предпочтительно от 30 до 40°С. Раствор этанола добавляли к водному раствору через поверхность «жидкость-жидкость» и этанол доставляли через трубку или форсунку, которая погружена в водный раствор.
Органический раствор добавляли с помощью насоса, доставляющего органический раствор к водному раствору с контролируемой скоростью, предпочтительно с постоянной скоростью. Доставка органического раствора может быть завершена в течении от 1 мин до 100 минут, предпочтительно в течении от 2 до 20 минут. Органический раствор может быть добавлен через единственное отверстие или сопло или через несколько отверстий или систему сопел. Диаметр отверстия единственного (или многосоплового устройства) может составлять от 10 до 1000 мкм, предпочтительно от 300 до 600 мкм. Добавление может быть осуществлено посредством применения давления от 0 до 30 psi (фунтов на квадратный дюйм) к потоку органического раствора, для облегчения доставки в дисперсию. Во время добавления органического раствора в водный раствор получающийся раствор перемешивается посредством вихревого движения или рециркуляции. Стадия добавления приводит к конечной концентрации, которая предпочтительно составляет от 25 до 45% этанола, наиболее предпочтительно 35% этанола.
Конечный раствор обрабатывали для удаления органического растворителя, посредством диализа или предпочтительно посредством диафильтрации. По мере того как удаляется этанол, водный раствор конвертируется в раствор, забуференный при нейтральном рН, от рН 6,8 до рН 7,5, предпочтительно, рН 7,2, например фосфатный буфер. Буфер может также включать технологические добавки (например, полоксамеры, поверхностно-активные средства, детергенты), объемообразующие агенты (например, маннит) или криопротекторы (например, сахароза, трегалоза, галактоза, инулин). Полученный водный раствор предпочтительно стерилизовали перед хранением или использованием, например, фильтрованием через фильтр 0,22 мкм.
Этот способ получения липосом может быть использован в связи с многообразием SUS, включающей систему SUS-подузлов. Эта коллекторная система может состоять из следующих подузлов: узел смешивания липидов, состоящий из мешка смешивания липидов для приготовления липидного раствора в смешивающемся с водой органическом растворителе, мешка для хранения липидов, и средство передачи липидного раствора из липидного узла к узлу хранения липидов; узел смешивания РНК, состоящий из мешка смешивания РНК для приготовления раствора РНК, мешка для хранения РНК, и средство передачи раствора РНК из узла в узел хранения РНК; средство передачи липидного раствора из мешка для хранения липидов к раствору РНК; и системы для диафильтрации, состоящей из мембран полых волокон, одноразовой головки диафрагменного насоса, а также различных мешков для хранения.
SUS-оборудование может быть предварительно стерилизовано и использоваться с использованием стерильных соединений/разъемов для получения липосом с использованием асептического процесса. Асептическое проведение процесса устраняет необходимость окончательной стерильной фильтрации (0,22 мкм). Отсутствие фильтра 0,22 мкм позволяет использовать более широкий диапазон размеров частиц (>200 нм) для осуществления процесса и решает любые возможные проблемы совместимости фильтра и лекарственного средства.
Пример 2: Влияние концентрации на размер частиц РНК-липиды.
Этот пример описывает эффект миРНК и концентрации липидов на размер частиц.
Для получения наночастиц методом, описанным в настоящем изобретении, катионный липид, DOPE, холестерин, PEG-BML и DIV A-PEG750-DIV А солюбилизировали в абсолютном этаноле при молярном соотношении 50:10:38:2:5, соответственно. миРНК солюбилизировали в 50 мМ цитратном буфере при рН 4,5.
Буфер, содержащий миРНК, доводили до 35-40°С при непрерывном перемешивании в сосуде для смешивания. Смесь этанол/липид затем распыляли на поверхности буфера, содержащего миРНК, с использованием коллектора/сопловой решетки для спонтанного образования липосом, нагруженных миРНК. Концентрации липидов и РНК доводили до конечного диапазона концентраций миРНК от 0,05 до 0,5 мг/мл, до отношения лекарственное средство: липид 0,08 (масса : масса), а также концентрации этанола 35%. Соотношение липидов и миРНК поддерживали постоянным для всех исследуемых условий.
Липосомы, нагруженные миРНК, разбавляли до ~ 10% этанола, чтобы стабилизировать частицы, и подвергали диафильтрации против 10Х объемов PBS (рН 7,2) для удаления этанола и замены буфера. Конечный продукт фильтровали через PES фильтр 0,22 мкм, стерилизующего класса, для снижения общего количества микробов. Объемный средний размер частиц и индекс полидисперсности (PDI) были определены с использованием динамического рассеяния света (DLS). Результаты показаны в таблице 2.
Figure 00000013
Результаты показывают, что размер частиц возрастает с увеличением концентрации миРНК (в мг/мл). Снижение концентраций липидов и миРНК (сохраняя тот же относительный показатель) уменьшает размер частиц, а при увеличении концентрации увеличивает размер частиц. Конечные концентрации миРНК от 0,05 до 0,5 мг/мл продуцируют наночастицы со средним диаметром частиц от 96,7 до 141,9 нм, менее чем 150 нм, и с показателем полидисперсности менее чем 0,2 во всех случаях.
Частицы размером менее 150 нм с PDI менее 0,2 продуцируются с помощью способа, описанного в настоящем описании, без приготовления предварительно сформированных пустых липидных везикул и/или без механической обработки.
Пример 3: Влияние технологических параметров на формирование частиц РНК-липиды
Этот пример описывает влияние различных параметров процесса на формирование частиц РНК-липиды. Некоторые параметры подверглись проверке во время этого эксперимента, в том числе температуру, концентрацию этанола, буфера, соотношения липид: миРНК, и тип сопла, используемого для диспергирования липидного раствора.
HEDC, DOPE, холестерин, PEG-BML и DIVA-PEG750-DIVA растворяли в абсолютном этаноле при молярном соотношении 40:30:25:5:2. Буфер, содержащий миРНК, доводили до указанной температуры при непрерывном перемешивании в сосуде для смешивания. Смесь этанол/липид затем распыляли на поверхности буфера, содержащего миРНК, с использованием сопла для спонтанного образования липосом, нагруженных миРНК. Липиды комбинировали с миРНК так, чтобы достичь конечной концентрации миРНК 0,1 мг/мл при указанном соотношении лекарственное средство/липиды и указанного конечного процента этанола.
миРНК солюбилизировали в цитратном буфере, который варьировался в концентрации от 25 до 100 мМ и рН 3,5 до рН 6,5. Температура смеси варьировалась от 25 до 45°С. Конечная концентрация этанола варьировалась от 25 до 45%. Соотношение лекарственное средство: липид (масса/масса) варьировалась от 0,07 до 0,11. Внутренний диаметр (ID) гидратационного сопла варьировался от 0,005 до 0,125 дюйма. Каждое условие осуществляли в виде измерения для сравнения влияние каждого параметра процесса. Если не указано иначе, каждое условие осуществляли в 50 мМ цитратном буфере, рН 4,5, 35°С, 35% конечной этанол, соотношение лекарственное средство: липиды 0,07 и внутренний диаметра сопла 0,005 дюйма.
Липосомы, нагруженные миРНК, разбавляли до 10% этанола, чтобы стабилизировать частицы, и подвергали диафильтрации против 10Х объемов PBS (рН 7,2) для удаления этанола и замены буфера. Конечный продукт фильтровали через PES фильтр 0,22 мкм, стерилизующего класса, для снижения общего количества микробов.
Таблица 3 показывает влияние рН на средний диаметр и PDI наночастиц липидов и нуклеиновых кислот. Увеличение буфера рН приводило к увеличению размера частиц, хотя и менее чем 150 нм среднего размера частиц.
Figure 00000014
Таблица 4 показывает эффект концентрации буфера на различные параметры. Результаты показали, что увеличение концентрации буфера понижает восстановление миРНК. Средний диаметр частиц и PDI детектировался как неизменный. Минимальный размер частиц наблюдался рН 3,5 и максимум восстановления миРНК наблюдался для 25 мМ цитратного буфера.
Figure 00000015
Таблица 5 показывает, что увеличение температуры гидратации от 25 до 45°С, уменьшал размер частиц от 135,7 до 102,2 нм при одновременном повышении восстановления миРНК с 80% до 87%. Увеличение конечного процента этанола увеличивал размер частиц при отсутствии эффекта на восстановление миРНК, но снижал эффективность инкапсуляции до 88%.
Figure 00000016
Таблица 6 показывает, что увеличение пониженного соотношения лекарственное средство: липид увеличило восстановление миРНК с 80 до 87%. Максимальное восстановление наблюдалось при соотношении лекарственное средство: липиды 0,07 (масса : масса). Все остальные измеряемые свойства не изменялись при изменении соотношения лекарственное средство: липиды. Этот результат является удивительным и неожиданным с точки зрения раскрытия Maurer et al. и Semple et al., которые оба описывают, что оптимальное восстановление составляет при соотношении лекарственное средство: липиды (масса : масса) равным или большим, чем 0,16 (липид: лекарственное средство (масса : масса) равна или меньше чем 6,25). Текущие результаты подтверждают, что по методике, описанной в настоящем изобретении, получается противоположная тенденции.
Figure 00000017
Таблица 7 показывает, что увеличение внутреннего диаметра сопла в 25 раз не повлияло на размер частиц, эффективность инкапсуляции или восстановление миРНК. Существует значительная гибкость в значении отверстии сопла, используемого для добавления этанола/липидов к поверхности буфера. Такая гибкость может обеспечить большое преимущество при масштабировании.
Figure 00000018
Пример 4: Сравнение описанного способа с контрольными способами для серийного производства липосом
Эти сравнительные результаты способа, описанного в настоящем изобретении для получения частиц липид/нуклеиновая кислота, со способом, описанным в Semple, et al. патент США 6858225 (контрольный способ или контрольная композиция, используемая контрольным способом) получали в соответствии с композицией примера 3 или, используя контрольный способ.
Композицию в соответствии с примером 3, состоящая из катионного липида, DOPE, холестерина, PEG-конъюгированного липида, и нацеливающего липида совместно солюбилизировали в молярном соотношении 40:30:25:5:2 (см. пример 2 выше).
Контрольную композицию, состоящую из DODAP, DSPC, холестерина и PEG-ССВ-14, совместно солюбилизировали в молярном соотношении 25:20:45:10.
В способе в соответствии с примером 3 липиды солюбилизировали при 4,32 мг/мл в абсолютном этаноле, а миРНК солюбилизировали при 0,163 мг/мл в 50 мМ цитрата, рН 4,5. Раствор миРНК доводили до 35 до 40°С при непрерывном перемешивании в сосуде для смешения. Смесь этанол/липид затем распыляли на поверхности буфера, содержащего миРНК, с использованием устройства коллектор/сопло. Конечная концентрация этанола составляла 35%, и конечное соотношение липид/миРНК составляло 14:1 (масса : масса). Полученные частицы затем разбавляли до 10% этанола, а затем подвергали диафильтрации против 10-кратного объема PBS (рН 7,2).
В контрольном способе липиды солюбилизировали при 25 мг/мл в абсолютном этаноле, а миРНК солюбилизировали при 4,17 мг/мл в 300 мМ цитрата, рН 4,0. Буфер, содержащий миРНК, выдерживали при комнатной температуре при непрерывном перемешивании в сосуде для смешения. Смесь этанол/липид затем распыляли на поверхность буфера, содержащего миРНК, с использованием единственного сопла для спонтанного образования липосом, нагруженных миРНК. Конечная концентрация этанола составила 40%, а конечное соотношение липид/миРНК составило 6:1 (масса : масса). После смешивания суспензию липид/миРНК переносили в экструдер на 10 мл, снабженный двумя 100 нм поликарбонатными мембранами, и предварительно преинкубировали при 65°С. Суспензию подвергали экструзии с использованием десяти проходов при 300 фунтов на кв. дюйм. Получающиеся частицы подвергали диафильтрации против 10х объемов PBS, рН 7,2.
Частицы, получающиеся по каждому способу, пропускали через фильтр 0,22 мкм. Средний размер частиц, PDI и ЕЕ измеряли, как описано в настоящем изобретении.
Способ в соответствии с примером 3 продуцировал более мелкие липидные наночастицы, чем в контрольном способе без стадии экструзии. Размер частиц, полученных контрольным способом, измеряли перед экструзией. Частицы, полученные из композиции NDT-0009 с использованием контрольного способа, имели средний размер частиц больше, чем частицы 250 нм. После экструзии и диафильтрации средний размер частиц уменьшается до 128 нм. Способ в соответствии с примером 3 продуцировал частицы со средним размером частиц менее 150 нм без экструзии. Аналогичная тенденция наблюдалась, исходя из контрольной композиции.
Способ в соответствии с примером 3 показал себя более эффективным при инкапсуляции миРНК в липидные наночастицы, чем контрольный способ. Эффективность инкапсуляции (ЕЕ) частицами, полученными способом примера 3 выше, чем у частиц, образованных посредством контрольного способа (измеренной до диафильтрации в обоих продуктах). ЕЕ частиц, полученных способом в соответствии с примером 3, больше, чем 95% выше, чем ЕЕ, определенным для частиц, образованных контрольным способом. В контрольном способе большая часть свободной миРНК удаляется после диафильтрации, что приводит к улучшению ЕЕ конечного продукта.
Способ в соответствии с примером 3 продуцирует наночастицы с более высокой эффективностью инкапсуляции, чем контрольный способ. Окончательное восстановление миРНК способом в соответствии с примером 3 было более чем в два раза больше, по сравнению с восстановлением, которое получается по контрольному способу (72% против 33%), как измерено после диафильтрации для обоих продуктов. Эти данные отражают улучшение ЕЕ, а также отсутствие стадии экструзии в способе в соответствии с примером 3. Способ в соответствии с примером 3 обеспечивает лучшее восстановление миРНК, потому что дополнительная стадия экструзии контрольного способа структурно изменяет липосомы, по-видимому, миРНК диссоциирует из частиц. Эти результаты показывают, что способ, описанный в настоящем изобретении, обеспечивает несколько преимуществ по сравнению с контрольным способом за счет уменьшения количества стадий процесса при одновременном повышении эффективности инкапсуляции и выхода наночастиц со средним размером частиц менее 150 нм.
Пример 5: Сравнение вариабельности при масштабировании серийного производства липосом
Способ, который описан в примере 3, осуществляли с различными композициями липидов, которые включали комбинацию перманентно заряженного (HEDC) катионного липида и ионизируемого (S104) катионной липидной молекулы. HEDC, S104, DOPE, холестерин, PEG-BML и DIVA-PEG750-DIVA растворяли в абсолютном этаноле при молярном соотношении 20:20:30:25:5:2. При масштабировании оценивали различные молекулы миРНК, различные объемы партий и различные соотношения миРНК (лекарственное средство)/липиды. Таблица 8 обобщает результаты, характеризующие наночастицы, полученные в ряде условий.
Figure 00000019
Приведенные результаты показывают, что способ, описанный в настоящем изобретении, является вполне надежным. Похожие размер частиц и PDI были получены при масштабировании, охватывающим до 50-кратный диапазон. Размер частиц систематически был менее 100 нм, с выходами продукта >90%. Значения индекса полидисперсности находились в очень низком диапазоне, что свидетельствует о почти монодисперсной популяции везикул.
Пример 6: Сравнение вариабельности при масштабировании серийного производства липосом для композиций, содержащих сахарозу
Способ, который описан в примере 3, осуществляли с HEDC, S104, DOPE, холестерином, PEG-BML и DIVA-PEG750-DIVA, растворенными в этаноле при молярном соотношении 20:20:30:25:5:2. Сахарозу включали в препарат везикул, как описано в настоящем изобретении. Партии различных объемов оценивали и подвергали замораживанию-оттаиванию. Таблица 9 суммирует результаты, характеризующие получающиеся наночастицы в результате ряда условий.
Figure 00000020
Настоящие результаты показывают, что замораживание-оттаивание не изменяют свойства липидных наночастиц. Результаты также показали, что вариабельность между партиями является довольно низкой, и что способ воспроизводимо производит однородные наночастицы.
Установлены условия для стабилизации частиц лекарственное средство: липид посредством лиофилизации. Частицы лекарственное средство: липид, полученные в соответствии с примером 2, могут быть лиофилизированы без потери активности. Конечная концентрация сахарозы, при которой были сформированы частицы лекарственное средство: липид, составила 8% (масса/объем). Лиофилизированные препараты восстанавливали добавлением дистиллированной воды и измеряли их трансфекционную активность в легких мышей после внутривенной инъекции. Замораживание и оттаивание восстановленного препарат не влияло на активность. Результаты, представленные в таблице 10, демонстрируют, что частицы, полученные при использовании настоящего способа, описанные в настоящем изобретении, сохраняют свои свойства во время лиофилизации и, следовательно, являются стабильными. В частности, размер частиц является стабильным и сохраняется до, во время и после лиофилизации.
Figure 00000021
Стабильность частиц является функцией липидной композиции, значений липид: РНК (масса : масса) и выбора полисахарида, используемого в композиции. Методический подход, описанный в настоящем изобретении для получения стабильных композиций комплексов липид: РНК, обладающих высокой биологической активностью в in vivo, предоставляет преимущества для разработки фармацевтически приемлемых препаратов, и, следовательно, облегчает доставку РНК на основе липосом.
Пример 7: Погруженная инжекция липидов
Способ, как описано в примере 3, осуществляли посредством модифицированного получения везикул с использованием погруженной инжекции. HEDC, S104, DOPE, холестерин, PEG-BML и DIVA-PEG750-DIVA растворяли в этаноле при молярном соотношении 20:20:30:25:5:2. Таблица 11 суммирует результаты, характеризующие наночастицы, полученные в результате способа погруженной инжекции по сравнению со способом добавления на поверхность. Настоящие результаты показывают удивительный и неожиданный результат: средний размер частиц существенно уменьшается, когда липиды добавляли к водной фазе посредством погруженной инжекции.
Figure 00000022
Такой же способ получения использовали для полученных липосом, содержащих сахарозу в буфере. Таблица 12 суммирует результаты, характеризующие наночастицы, полученные при различном времени прибавления, а Таблица 13 суммирует результаты, характеризующих наночастицы, полученные с использованием поверхностного прибавления по сравнению с погруженной инжекцией.
Figure 00000023
Figure 00000024
Приведенные результаты показывают удивительный и неожиданный результат: средний размер частиц существенно уменьшался, когда липиды добавляли к водной фазе посредством погруженной инжекции с временем прибавления менее 2 минут. Приведенные результаты также показывают удивительные результаты: средний размер частиц существенно уменьшался, когда липиды добавляли к водной фазе посредством погруженной инжекции.

Claims (49)

1. Система для стерильного получения наночастиц липидов и нуклеиновых кислот, где нуклеиновые кислоты представляют собой молекулы РНК, включающая:
первый узел хранения органического липидного раствора, содержащего липиды в смешивающемся с водой органическом растворителе;
второй узел хранения водного раствора, содержащего нуклеиновые кислоты;
узел смешивания;
инжекционное средство для добавления органического раствора липидов в смесительную камеру;
третий узел хранения водного буфера;
узел разбавления;
концентрирующий узел, содержащий тангенциальный фильтр для концентрирования и удаления органического растворителя; и
сосуд для сбора концентрированной суспензии липосом после удаления органического растворителя,
где система содержит компоненты, которые являются стерилизуемыми и одноразовыми таким образом, чтобы быть адаптированными для одноразового использования.
2. Система по п. 1, дополнительно содержащая узел приготовления органического раствора липидов, соединенный с первым узлом хранения.
3. Система по п. 1, дополнительно содержащая фильтр для стерилизации органического раствора липидов, тогда как указанный раствор переносится в первый узел хранения.
4. Система по п. 1, в которой концентрирующий узел содержит насос с насосной камерой одноразового применения.
5. Система по п. 1, в которой инжекционное средство содержит инжекционный порт, который доставляет органический раствор к границе раздела воздух-вода водного раствора в узле смешивания.
6. Система по п. 1, в которой инжекционное средство содержит инжекционный порт, который погружен в водный раствор в узле смешивания и доставляет органический раствор к нему.
7. Система по п. 1, в которой узел смешивания предназначен для смешивания органического липидного раствора, перенесенного из первого узла хранения, и водного раствора нуклеиновых кислот, перенесенного из второго узла хранения, для получения смеси липидов и нуклеиновых кислот, и в которой инжекционное средство предназначено для добавления органического липидного раствора из первого узла хранения в водный раствор нуклеиновых кислот, содержащийся в узле смешивания, таким образом, чтобы возникал градиент концентрации органического растворителя раствора в узле смешивания от начального значения до конечного значения.
8. Система по п. 7, в которой инжекционное средство предназначено для добавления органического раствора в водный раствор посредством распыления на поверхности раздела воздух-вода или на межфазную поверхность раздела жидкость-жидкость.
9. Способ стерильного получения наночастиц липидов и нуклеиновых кислот, включающий применение системы, которая содержит
первый узел хранения органического липидного раствора, содержащего липиды в смешивающемся с водой органическом растворителе;
второй узел хранения водного раствора, содержащего нуклеиновые кислоты;
узел смешивания со статическим смесителем;
инжекционное средство для добавления органического раствора липидов в смесительную камеру;
третий узел хранения водного буфера;
узел разбавления;
концентрирующий узел, содержащий тангенциальный фильтр для концентрирования суспензии липосом и удаления органического растворителя; и
одноразовую подложку для сбора концентрированной суспензии липосом после удаления органического растворителя;
где система содержит компоненты, которые являются стерилизуемыми и одноразовыми таким образом, чтобы быть адаптированными для одноразового использования,
где способ осуществляется так, что узел смешивания содержит водный раствор нуклеиновых кислот, и липидный раствор добавляют при постоянной скорости к раствору нуклеиновых кислот в узле смешивания, так что доставка органического раствора завершается за от 1 мин до 100 мин, и так что достигается отношение нуклеиновая кислота : липид от 0,06 до 0,16 (мас. : мас.).
10. Способ по п. 9, в котором липидный раствор, раствор нуклеиновых кислот, смесь липидов и нуклеиновых кислот и суспензия являются стерильными.
11. Способ по п. 9, в котором липиды содержат катионный липид, вспомогательный липид, стерол и конъюгат полиэтилен (PEG)-липид.
12. Способ по п. 9, в котором липидный раствор содержит соединение, выбранное из:
- соединения формулы (А)
Figure 00000025
в которой липид (L) выбирается из группы, состоящей из DSPE, DOPE и DC; линкер (X) выбирается из группы, состоящей из отсутствия линкера, PEG550, PEG2000, PEG-глутамат (-Glu), Glu, С6, глицина и GluNH, N1,N19-бис(3-(2-(2-(3-аминопропокси)этокси)этокси)пропил)-4,7,10,13,16-пентаоксанонадекан-1,19-диамида; и ретиноид (R) выбирается из группы, состоящей из третиноина, адапалена, ретинола, 4-гидрокси(фенил)ретинамида (4-HPR), ретиноевой кислоты, 9-(2,6,6-триметилциклогекс-1-ен-1-ил)нонановой кислоты, 3,7-диметил-9-(2,6,6-триметилциклогекс-1-ен-1-ил)нонановой кислоты, 3,7-диметил-9-(2,2,6-триметилциклогексил)нонановой кислоты, и любого частично или полностью насыщенного ретиноида, и
- соединения формулы (В),
Figure 00000026
в которой линкер (X) представляет собой N1,N19-бис(3-(2-(2-(3-аминопропокси)этокси)этокси)пропил)-4,7,10,13,16-пентаоксанонадекан-1,19-диамид или N1,N19-бис(16,20-диамино-15-оксо-4,7,10-триакса-14-азаикозил)-4,7,10,13,16-пентаоксанонадекан-1,19-диамид; и
ретиноид (R) выбирается из группы, состоящей из третиноина, адапалена, ретинола, 4-гидрокси(фенил)ретинамида (4-HPR) и ретиноевой кислоты, 9-(2,6,6-триметилциклогекс-1-ен-1-ил)нонановой кислоты, 3,7-диметил-9-(2,6,6-триметилциклогекс-1-ен-1-ил)нонановой кислоты, 3,7-диметил-9-(2,2,6-триметилциклогексил)нонановой кислоты, и любого частично или полностью насыщенного ретиноида.
13. Способ по п. 9, в котором нуклеиновая кислота представляет собой молекулу дцРНК.
14. Способ по п. 9, в котором смешиваемый с водой органический растворитель представляет собой этанол.
15. Способ по п. 9, в котором первый и второй растворы объединяются при температуре от 35 до 40°С.
16. Способ по п. 9, в котором второй узел хранения содержит нуклеиновую кислоту в водном буфере при рН от 3,5 до 6,5.
17. Способ по п. 9, в котором третий узел хранения содержит водный буфер при нейтральном рН.
18. Способ по п. 9, в котором средний диаметр частиц липосом, инкапсулирующих нуклеиновую кислоту, составляет от 50 нм до 150 нм.
19. Способ по п. 9, дополнительно включающий стадию лиофилизации.
20. Способ по п. 19, в котором стадия лиофилизации включает стадию замораживания и стадию высушивания.
21. Способ по п. 19, в котором водный буфер содержит сахарозу или трегалозу.
22. Способ по п. 20, в котором стадия замораживания охлаждает смесь липидов и нуклеиновых кислот на 1°С/мин от 20 до -40°С.
23. Способ по п. 20, в котором стадия высушивания включает стадию высушивания смеси липидов и нуклеиновых кислот при температуре от около -15 до около -35°С.
RU2014122433A 2011-11-04 2012-11-02 Одноразовая система для стерильного получения частиц из липидов и нуклеиновых кислот RU2642640C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161556124P 2011-11-04 2011-11-04
US61/556,124 2011-11-04
PCT/IB2012/002916 WO2013064911A2 (en) 2011-11-04 2012-11-02 Single use system for sterilely producing lipid-nucleic acid particles

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2014122433A RU2014122433A (ru) 2015-12-10
RU2642640C2 true RU2642640C2 (ru) 2018-01-25

Family

ID=47178988

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2014122432A RU2647476C2 (ru) 2011-11-04 2012-11-02 Способ получения липидных наночастиц для доставки лекарственного средства
RU2014122433A RU2642640C2 (ru) 2011-11-04 2012-11-02 Одноразовая система для стерильного получения частиц из липидов и нуклеиновых кислот

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2014122432A RU2647476C2 (ru) 2011-11-04 2012-11-02 Способ получения липидных наночастиц для доставки лекарственного средства

Country Status (21)

Country Link
US (1) US8956572B2 (ru)
EP (4) EP2773328A2 (ru)
JP (3) JP6133883B2 (ru)
KR (2) KR102046968B1 (ru)
CN (2) CN103906503B (ru)
AU (2) AU2012356239B2 (ru)
CA (2) CA2853685C (ru)
CY (1) CY1121495T1 (ru)
DK (1) DK2773326T3 (ru)
ES (1) ES2721325T3 (ru)
HR (1) HRP20190481T1 (ru)
HU (1) HUE043809T2 (ru)
LT (1) LT2773326T (ru)
PL (1) PL2773326T3 (ru)
PT (1) PT2773326T (ru)
RS (1) RS58562B1 (ru)
RU (2) RU2647476C2 (ru)
SI (1) SI2773326T1 (ru)
TR (1) TR201904389T4 (ru)
TW (3) TWI618548B (ru)
WO (2) WO2013064911A2 (ru)

Families Citing this family (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
DE19177059T1 (de) 2010-10-01 2021-10-07 Modernatx, Inc. N1-methyl-pseudouracile enthältendes ribonucleinsäuren sowie ihre verwendungen
WO2012135805A2 (en) 2011-03-31 2012-10-04 modeRNA Therapeutics Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
LT3682905T (lt) 2011-10-03 2022-02-25 Modernatx, Inc. Modifikuoti nukleozidai, nukleotidai ir nukleorūgštys bei jų naudojimas
US9579338B2 (en) 2011-11-04 2017-02-28 Nitto Denko Corporation Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery
PL2791160T3 (pl) 2011-12-16 2022-06-20 Modernatx, Inc. Kompozycje zmodyfikowanego mrna
US9320297B2 (en) 2012-03-22 2016-04-26 Lemniscate Innovations Llc Spherification/reverse spherification automated and integrated system and method
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
DE18200782T1 (de) 2012-04-02 2021-10-21 Modernatx, Inc. Modifizierte polynukleotide zur herstellung von proteinen im zusammenhang mit erkrankungen beim menschen
PL3489220T3 (pl) 2012-06-08 2021-11-02 Nitto Denko Corporation Lipidy do preparatów do dostarczania środka terapeutycznego
RS63237B1 (sr) 2012-11-26 2022-06-30 Modernatx Inc Terminalno modifikovana rnk
AU2014215421A1 (en) 2013-02-05 2015-08-13 1Globe Health Institute Llc Biodegradable and clinically-compatible nanoparticles as drug delivery carriers
WO2014152211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US11377470B2 (en) 2013-03-15 2022-07-05 Modernatx, Inc. Ribonucleic acid purification
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
SI3019619T1 (sl) 2013-07-11 2021-12-31 Modernatx, Inc. Sestave, ki zajemajo sintetične polinukleotide, ki kodirajo proteine, pozvezane s crispr, in sintetične sgrna, ter metode uporabe
CA2923029A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
EP3041938A1 (en) 2013-09-03 2016-07-13 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
CA2921161A1 (en) 2013-09-24 2015-04-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the manufacture of lipid nanoparticles
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EA201690675A1 (ru) 2013-10-03 2016-08-31 Модерна Терапьютикс, Инк. Полинуклеотиды, кодирующие рецептор липопротеинов низкой плотности
CN103599549A (zh) * 2013-11-22 2014-02-26 大连民族学院 一种siRNA/抗癌药物联合转运复合载体及其制备方法和应用
AU2015249553B2 (en) 2014-04-23 2021-03-04 Modernatx, Inc. Nucleic acid vaccines
JP6782171B2 (ja) 2014-07-02 2020-11-11 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド メッセンジャーｒｎａのカプセル化
WO2016011226A1 (en) 2014-07-16 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
US10342761B2 (en) * 2014-07-16 2019-07-09 Novartis Ag Method of encapsulating a nucleic acid in a lipid nanoparticle host
US20170210788A1 (en) 2014-07-23 2017-07-27 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
WO2016045732A1 (en) * 2014-09-25 2016-03-31 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Stable formulations of lipids and liposomes
AU2015373071B2 (en) * 2014-12-29 2022-03-31 Toray Industries, Inc. Composition containing nucleic acid molecule stably
AU2016222746A1 (en) 2015-02-24 2017-09-07 The University Of British Columbia Continuous flow microfluidic system
CN107921381B (zh) * 2015-04-28 2021-11-09 不列颠哥伦比亚大学 一次性微流控盒
PT3303583T (pt) 2015-05-29 2020-07-07 Curevac Ag Um método para produção e purificação de rna, compreendendendo pelo menos um passo de filtração por fluxo tangencial
PT3324932T (pt) * 2015-07-22 2021-04-06 Nitto Denko Corp Composições e métodos para formas de liófilos de nanopartículas
US11564893B2 (en) 2015-08-17 2023-01-31 Modernatx, Inc. Methods for preparing particles and related compositions
US9938572B1 (en) * 2015-09-08 2018-04-10 Raindance Technologies, Inc. System and method for forming an emulsion
ES2908449T3 (es) 2015-09-17 2022-04-29 Modernatx Inc Polinucleótidos que contienen una región de cola estabilizadora
HUE057613T2 (hu) 2015-09-17 2022-05-28 Modernatx Inc Vegyületek és készítmények terápiás szerek intracelluláris bejuttatására
AU2016342045A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
EP3964200A1 (en) 2015-12-10 2022-03-09 ModernaTX, Inc. Compositions and methods for delivery of therapeutic agents
US10799463B2 (en) 2015-12-22 2020-10-13 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
DK3394093T3 (da) 2015-12-23 2022-04-19 Modernatx Inc Fremgangsmåder til anvendelse af ox40-ligand-kodende polynukleotider
AU2016385135B2 (en) 2016-01-06 2022-02-17 The University Of British Columbia Bifurcating mixers and methods of their use and manufacture
WO2017120612A1 (en) 2016-01-10 2017-07-13 Modernatx, Inc. Therapeutic mrnas encoding anti ctla-4 antibodies
SG11201807780XA (en) 2016-03-10 2018-10-30 Lonza Ag Customizable facility
US10689873B2 (en) 2016-03-10 2020-06-23 Lonza Ltd Customizable facility
US20200315967A1 (en) * 2016-06-24 2020-10-08 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles
US11191849B2 (en) 2016-06-30 2021-12-07 Arbutus Biopharma Corporation Compositions and methods for delivering messenger RNA
CN109715782A (zh) * 2016-08-02 2019-05-03 隆扎有限公司 可定制设施
WO2018035388A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
US20200283743A1 (en) 2016-08-17 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
WO2018035476A1 (en) * 2016-08-18 2018-02-22 Troy Bremer Delivery of urea to cells of the macula and retina using liposome constructs
EP3315125A1 (en) * 2016-10-31 2018-05-02 Silence Therapeutics (London) Ltd Lipid nanoparticle formulation
WO2018089540A1 (en) * 2016-11-08 2018-05-17 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
WO2018170336A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle formulation
HRP20230063T1 (hr) 2017-03-15 2023-03-17 Modernatx, Inc. Spoj i pripravci za intracelularnu isporuku terapijskih sredstava
DK3596042T3 (da) 2017-03-15 2022-04-11 Modernatx Inc Krystalformer af aminolipider
US20200405639A1 (en) 2017-04-14 2020-12-31 The Broad Institute, Inc. Novel delivery of large payloads
WO2018232120A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
US11786607B2 (en) 2017-06-15 2023-10-17 Modernatx, Inc. RNA formulations
EP3651733A4 (en) * 2017-07-10 2021-04-07 ImmunoVaccine Technologies Inc. PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS, METHOD OF MANUFACTURING USING LIPID VESICLE PARTICLES OF DEFINED SIZE, AND USES THEREOF
EP3662913A4 (en) 2017-08-04 2021-06-30 Kyowa Kirin Co., Ltd. LIPID NANOPARTICLES CONTAINING NUCLEIC ACID
JP2019043216A (ja) 2017-08-30 2019-03-22 いすゞ自動車株式会社 ステアリング装置
MX2020002348A (es) 2017-08-31 2020-10-08 Modernatx Inc Métodos de elaboración de nanopartículas lipídicas.
US11395799B2 (en) 2017-10-20 2022-07-26 BioNTech SE Preparation and storage of liposomal RNA formulations suitable for therapy
WO2019088193A1 (ja) * 2017-11-01 2019-05-09 国立大学法人大阪大学 所望の粒径を有する脂質粒子を製造するための方法および装置の開発
WO2019090411A1 (en) * 2017-11-09 2019-05-16 Immmunovaccine Technologies Inc. Pharmaceutical compositions, methods for preparation comprising sizing of lipid vesicle particles, and uses thereof
WO2019094983A1 (en) 2017-11-13 2019-05-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for treating cancer by targeting the clec2d-klrb1 pathway
US10968257B2 (en) 2018-04-03 2021-04-06 The Broad Institute, Inc. Target recognition motifs and uses thereof
WO2019204451A1 (en) * 2018-04-17 2019-10-24 Carnegie Mellon University Enhanced lipid nanoparticle drug delivery using a negatively charged polymer
WO2020047061A1 (en) * 2018-08-29 2020-03-05 Translate Bio, Inc. Improved process of preparing mrna-loaded lipid nanoparticles
EP3853305B1 (en) 2018-09-19 2024-10-02 ModernaTX, Inc. High-purity peg lipids and uses thereof
MA53650A (fr) 2018-09-19 2021-07-28 Modernatx Inc Lipides peg et leurs utilisations
CN113271926A (zh) * 2018-09-20 2021-08-17 摩登纳特斯有限公司 脂质纳米颗粒的制备及其施用方法
WO2020061426A2 (en) * 2018-09-21 2020-03-26 Acuitas Therapeutics, Inc. Systems and methods for manufacturing lipid nanoparticles and liposomes
PT3864163T (pt) 2018-10-09 2024-04-30 Univ British Columbia Composições e sistemas que compreendem vesículas competentes para transfeção isentas de solventes orgânicos e detergentes e métodos relacionados com as mesmas
EP3866825A1 (en) * 2018-10-19 2021-08-25 Translate Bio, Inc. Pumpless encapsulation of messenger rna
MX2021009245A (es) * 2019-01-31 2021-11-12 Modernatx Inc Metodos de preparacion de nanoparticulas lipidicas.
US20220177863A1 (en) 2019-03-18 2022-06-09 The Broad Institute, Inc. Type vii crispr proteins and systems
EP3942050A4 (en) * 2019-03-19 2023-02-22 Arcturus Therapeutics, Inc. PROCEDURE FOR THE PRODUCTION OF LIPID-COATED RNA NANOPARTICLES
AU2020269626A1 (en) 2019-05-07 2021-10-28 Universidade Do Minho Method for production of liposomes
WO2020236972A2 (en) 2019-05-20 2020-11-26 The Broad Institute, Inc. Non-class i multi-component nucleic acid targeting systems
JOP20220037A1 (ar) 2019-08-14 2023-01-30 Acuitas Therapeutics Inc جسيمات نانوية دهنية محسنة لتوصيل الأحماض النووية
AU2020342668A1 (en) 2019-09-06 2022-03-03 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle compositions comprising closed-ended DNA and cleavable lipids and methods of use thereof
JP7271374B2 (ja) * 2019-09-10 2023-05-11 株式会社東芝 分析方法、分析基体、分析キット及び分析装置。
TW202124360A (zh) 2019-09-19 2021-07-01 美商現代公司 用於治療劑之細胞內遞送之支鏈尾端脂質化合物及組合物
EP4061797A1 (en) 2019-11-22 2022-09-28 Generation Bio Co. Ionizable lipids and nanoparticle compositions thereof
KR102409145B1 (ko) * 2020-03-23 2022-06-15 프레스티지바이오로직스 주식회사 항체 의약품 제조 공정을 위한 버퍼 조제 및 이송 시스템
CN111467321A (zh) * 2020-03-26 2020-07-31 深圳市新合生物医疗科技有限公司 一种mRNA核酸类药物胞内递送系统、制备方法和应用
KR20230065281A (ko) 2020-09-13 2023-05-11 아크투루스 쎄라퓨틱스, 인크. 큰 rna의 지질 나노입자 캡슐화
CN112843019A (zh) * 2021-01-27 2021-05-28 江苏普瑞康生物医药科技有限公司 一种核酸脂质纳米粒组合物，包含其的药物制剂，及其制备方法和应用
WO2022177977A1 (en) * 2021-02-16 2022-08-25 The Johns Hopkins University Methods for preparation of plasmid dna/lipid particles with defined size for in vitro and in vivo transfection
WO2022175366A1 (en) 2021-02-17 2022-08-25 Secoya Technologies Method for producing lipid nanoparticles and lipid nanoparticles resulting therefrom
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
US20240165044A1 (en) * 2021-04-22 2024-05-23 Inventage Lab Inc. Lipid nanoparticle preparation method and preparation apparatus therefor
AU2022291742A1 (en) 2021-06-14 2023-12-21 Generation Bio Co. Cationic lipids and compositions thereof
EP4412591A1 (en) * 2021-10-06 2024-08-14 leon-nanodrugs GmbH Method for preparing lipid nanoparticles
AU2022383068A1 (en) 2021-11-08 2024-05-02 Orna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions for delivering circular polynucleotides
CN116549626A (zh) * 2022-01-27 2023-08-08 深圳瑞吉生物科技有限公司 一种载核酸脂质纳米颗粒冻干制剂及其制备方法与应用
WO2023161350A1 (en) 2022-02-24 2023-08-31 Io Biotech Aps Nucleotide delivery of cancer therapy
WO2023196818A1 (en) 2022-04-04 2023-10-12 The Regents Of The University Of California Genetic complementation compositions and methods
KR102475540B1 (ko) * 2022-04-26 2022-12-08 주식회사 무진메디 약물이 담지된 지질 나노입자 제조 방법 및 제조 장치
WO2023239756A1 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle compositions and uses thereof
WO2024102677A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions
TW202425959A (zh) 2022-11-08 2024-07-01 美商歐納醫療公司 遞送多核苷酸的脂質及奈米顆粒組合物
WO2024102762A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
WO2024119051A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Novel polyglycerol-conjugated lipids and lipid nanoparticle compositions comprising the same
WO2024119103A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Lipid nanoparticles comprising nucleic acids and lipid-anchored polymers
WO2024119039A2 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Stealth lipid nanoparticles and uses thereof
WO2024119074A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Stealth lipid nanoparticle compositions for cell targeting
WO2024129982A2 (en) 2022-12-15 2024-06-20 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions and methods
WO2024136254A1 (ko) * 2022-12-20 2024-06-27 (주)인벤티지랩 저농도 이온화 지질을 포함하는 지질나노입자 및 이의 제조 방법
WO2024205657A2 (en) 2023-03-29 2024-10-03 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle compositions for delivering polynucleotides

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6858225B2 (en) * 1997-05-14 2005-02-22 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-encapsulated polyanionic nucleic acid
WO2005090403A2 (en) * 2004-03-12 2005-09-29 Biovest International, Inc. Method and apparatus for antibody purification
US7468151B2 (en) * 2001-10-26 2008-12-23 Octoplus Sciences B.V. Method for the preparation of purified microparticles
WO2010021865A1 (en) * 2008-08-18 2010-02-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel lipid nanoparticles and novel components for delivery of nucleic acids

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01501228A (ja) * 1986-09-18 1989-04-27 リポソーム　テクノロジー，インコーポレイテッド 高濃度リポソーム処理方法
US4781871A (en) * 1986-09-18 1988-11-01 Liposome Technology, Inc. High-concentration liposome processing method
US4895452A (en) 1988-03-03 1990-01-23 Micro-Pak, Inc. Method and apparatus for producing lipid vesicles
EP0706374B1 (en) * 1993-06-30 1997-12-10 Genentech, Inc. Method for preparing liposomes
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
CA2222328C (en) 1995-06-07 2012-01-10 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US6395302B1 (en) 1996-11-19 2002-05-28 Octoplus B.V. Method for the preparation of microspheres which contain colloidal systems
EP1146959B1 (en) 1998-11-13 2008-06-04 William A. Heriot Apparatus for liposome production
US6855296B1 (en) 1998-11-13 2005-02-15 Optime Therapeutics, Inc. Method and apparatus for liposome production
US7094423B1 (en) 1999-07-15 2006-08-22 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for preparation of lipid-encapsulated therapeutic agents
AU769357B2 (en) * 1999-07-15 2004-01-22 University Of British Columbia, The Methods for preparation of lipid-encapsulated therapeutic agents
EP1203614A1 (de) 2000-11-03 2002-05-08 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von Lipidvesikeln
US7223887B2 (en) 2001-12-18 2007-05-29 The University Of British Columbia Multivalent cationic lipids and methods of using same in the production of lipid particles
EP1471885A4 (en) 2002-01-09 2009-04-22 Transave Inc EFFECTIVE ENCAPSULATION IN A LIPOSOME
US6712963B2 (en) 2002-06-14 2004-03-30 Scilog, Llc Single-use manifold for automated, aseptic transfer of solutions in bioprocessing applications
CA2491164C (en) 2002-06-28 2012-05-08 Cory Giesbrecht Method and apparatus for producing liposomes
FR2856940B1 (fr) * 2003-07-04 2007-02-09 Stedim Sa Systeme clos a usage unique de melange, de stockage et d'homogeneisation de liquides en conditions propres ou steriles
AU2005250500B2 (en) 2004-06-04 2011-06-23 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Disposable bioreactor systems and methods
US7410587B2 (en) 2004-08-03 2008-08-12 Scilog, Inc. Liquid handling for filtration and preparative chromatography
US7404969B2 (en) * 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
AU2006274413B2 (en) 2005-07-27 2013-01-10 Arbutus Biopharma Corporation Systems and methods for manufacturing liposomes
JP5336853B2 (ja) * 2005-11-02 2013-11-06 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド 修飾ｓｉＲＮＡ分子およびその使用法
CA2649025A1 (en) 2006-04-11 2007-10-18 Wingturf Co., Ltd. Production method of liposome dispersion and production equipment thereof
EP1920765A1 (en) 2006-11-07 2008-05-14 Medigene AG Liposome preparation by single-pass process
JP5749494B2 (ja) 2008-01-02 2015-07-15 テクミラ ファーマシューティカルズ コーポレイション 核酸の送達のための改善された組成物および方法
JP5322476B2 (ja) 2008-03-31 2013-10-23 テルモ株式会社 リポソームの製造装置およびリポソームの製造方法
US8231787B2 (en) 2008-05-06 2012-07-31 Spf Innovations, Llc Tangential flow filtration system
SG196818A1 (en) 2008-10-16 2014-02-13 Marina Biotech Inc Processes and compositions for liposomal and efficient delivery of gene silencing therapeutics
CN102231952A (zh) * 2008-11-17 2011-11-02 安龙制药公司 用于核酸运载系统的可释放阳离子脂质
WO2010080724A1 (en) * 2009-01-12 2010-07-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel lipid nanoparticles and novel components for delivery of nucleic acids
JP5684729B2 (ja) * 2009-01-20 2015-03-18 メッド コート エービーＭｅｄ Ｃｏａｔ Ａｂ 新規コーティング組成物とその使用
FR2943560B1 (fr) * 2009-03-24 2011-05-27 Jean Pascal Zambaux Bioreacteur jetable et systeme d'agitation a usage unique
EP2496700B1 (en) * 2009-11-04 2017-03-01 The University Of British Columbia Nucleic acid-containing lipid particles and related methods
DK2506857T3 (en) * 2009-12-01 2018-05-07 Translate Bio Inc SUPPLY OF MRNA FOR AMPLIFICATION OF PROTEINS AND ENZYMES IN HUMAN GENETIC DISEASES
EP2526113B1 (en) * 2010-01-22 2016-08-10 Sirna Therapeutics, Inc. Post-synthetic chemical modification of rna at the 2'-position of the ribose ring via "click" chemistry
WO2011127255A1 (en) 2010-04-08 2011-10-13 Merck Sharp & Dohme Corp. Preparation of lipid nanoparticles
DK2998289T3 (da) * 2011-06-08 2019-09-16 Nitto Denko Corp Forbindelser til at målrette lægemiddellevering og fremme sirna-aktivitet

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6858225B2 (en) * 1997-05-14 2005-02-22 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-encapsulated polyanionic nucleic acid
US7468151B2 (en) * 2001-10-26 2008-12-23 Octoplus Sciences B.V. Method for the preparation of purified microparticles
WO2005090403A2 (en) * 2004-03-12 2005-09-29 Biovest International, Inc. Method and apparatus for antibody purification
WO2010021865A1 (en) * 2008-08-18 2010-02-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel lipid nanoparticles and novel components for delivery of nucleic acids

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDREAS WAGNERA et.al. Liposomes produced in a pilot scale: production, purification and efficiency aspects. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. Volume 54, Issue 2, September 2002, Pages 213-219. *

Also Published As

Publication number Publication date
JP6149041B2 (ja) 2017-06-14
US20130164400A1 (en) 2013-06-27
CA2853689A1 (en) 2013-06-27
KR20140097276A (ko) 2014-08-06
TWI615156B (zh) 2018-02-21
RS58562B1 (sr) 2019-05-31
KR102056702B1 (ko) 2019-12-17
CN103906503B (zh) 2016-12-14
EP2773326A2 (en) 2014-09-10
JP6442551B2 (ja) 2018-12-19
CN103906503A (zh) 2014-07-02
RU2014122433A (ru) 2015-12-10
US8956572B2 (en) 2015-02-17
KR102046968B1 (ko) 2019-12-02
EP2773328A2 (en) 2014-09-10
TW201731491A (zh) 2017-09-16
WO2013093648A2 (en) 2013-06-27
LT2773326T (lt) 2019-04-25
TWI618548B (zh) 2018-03-21
EP3485875A1 (en) 2019-05-22
CN103906504A (zh) 2014-07-02
JP2014534232A (ja) 2014-12-18
WO2013093648A3 (en) 2013-10-24
HRP20190481T1 (hr) 2019-05-03
TW201325634A (zh) 2013-07-01
JP6133883B2 (ja) 2017-05-24
DK2773326T3 (en) 2019-04-15
WO2013064911A2 (en) 2013-05-10
AU2012330819B2 (en) 2017-08-31
HUE043809T2 (hu) 2019-09-30
CA2853685C (en) 2019-09-03
CA2853689C (en) 2020-06-30
JP2015502345A (ja) 2015-01-22
WO2013064911A3 (en) 2013-10-24
JP2017165748A (ja) 2017-09-21
SI2773326T1 (sl) 2019-04-30
ES2721325T3 (es) 2019-07-31
CA2853685A1 (en) 2013-05-10
EP2773326B1 (en) 2019-02-20
KR20140101748A (ko) 2014-08-20
CY1121495T1 (el) 2020-05-29
AU2012330819A1 (en) 2014-05-15
TR201904389T4 (tr) 2019-04-22
PT2773326T (pt) 2019-04-23
AU2012356239B2 (en) 2016-09-22
RU2014122432A (ru) 2015-12-10
AU2012356239A1 (en) 2014-05-29
RU2647476C2 (ru) 2018-03-15
EP3673898A1 (en) 2020-07-01
CN103906504B (zh) 2017-11-17
TWI626952B (zh) 2018-06-21
PL2773326T3 (pl) 2019-06-28
TW201323020A (zh) 2013-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2642640C2 (ru) Одноразовая система для стерильного получения частиц из липидов и нуклеиновых кислот
US10155945B2 (en) Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery
US10624852B2 (en) Liposomes comprising a calcium phosphate-containing precipitate
US20120021042A1 (en) Efficient Method For Loading Amphoteric Liposomes With Nucleic Acid Active Substances
AU2005326371A1 (en) Composition for inhibiting expression of target gene
WO2024167924A2 (en) Multi-functional lipid nanoparticles and uses thereof