CN103599549A - 一种siRNA/抗癌药物联合转运复合载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种siRNA/抗癌药物联合转运复合载体及其制备方法和应用。该复合载体组成包括由阳离子类脂和脂溶性药物构成的药物脂质体和压缩的siRNA，其中所述阳离子类脂与脂溶性药物的质量比为200∶1～1∶1，所述药物脂质体和压缩siRNA的质量比为20∶1～0.5∶1。本发明以氨基甲酸型阳离子类脂为主要材料制备脂质体，采用阳离子高聚物压缩沉默基因(siRNA)方法实现对基因的有效包封，经过靶向和长循环修饰，最终得到共载抗癌药物和沉默基因(siRNA)的纳米尺寸的新型复合载体。本发明的复合载体制备方法简单、高效，制备出的复合载体毒性低、转染率高，在物理学表征和体外生物学研究中得到了良好的评价效果。

Description

一种siRNA/抗癌药物联合转运复合载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种药物和基因的联合转运复合载体，特别涉及一种抗癌药物和压缩siRNA的联合转运新型复合载体。

背景技术

靶向药物和基因的联合转运治疗是一种利用载体将目的药物和基因高效传递到靶细胞或靶组织中适时释放药物和基因以达到协同治疗目标的生物医学治疗方法。在同一载体系统中联合转运药物和siRNA作用于癌细胞比单独转运siRNA或药物进行配合治疗更有效[1]。目前联合转运的想法已被提出，在同一个输送系统中联合转运药物和siRNA有望解决癌细胞容易产生的多重耐药性的问题。目前，构建一种安全高效的用于联合转运的载体已成为研究的热点。

目前来看，可用于联合转运的非病毒载体按材料可以分为三大类：多聚物类、无机纳米类、脂质类[2]。

多聚物纳米载体，已被用做药物、蛋白以及核酸的载体。由于其良好的生物相容性和运输核酸(DNA或siRNA)转染率高，聚合物纳米粒子已被用于联合转运药物和siRNA。PEI由于其可与siRNA高效复合并进行细胞内传递，而被用做转运siRNA的非病毒载体。但由于PEI分子量大使得PEI纳米载体毒性也较大。但有研究表明可生物降解的聚己酸内酯(PCL)可以通过二硫键或酯键共价连接低分子量的PEI链，并且通过调整N/P比和PEG修饰制备的FA-PEG-PGA修饰的PEI-PCL纳米载体，可以有效的降低毒性。另一种降低毒性的方法就是接枝硬脂酸(SA)。但其临床应用还有很多亟待解决的问题。

无机纳米材料，由于其本身具有独特的物理化学性质，如其可调节的特性，因此在生物方面的应用越来越多，介孔二氧化硅纳米粒子已有多种应用，比如作为转运siRNA或药物的载体，由于其巨大的比表面积和较大的孔体积，可调的孔径，使其可以作为大量载药的有效载体。近年来，无机纳米材料作为药物载体的应用研究取得了较大的进展，但其生物安全性一直是一个颇具争议的问题，尚需要长期的深入研究。

脂质体纳米载体，在核酸转运方面存在着明显的优势，脂质体可运载不同大小的基因片段，其基因内容量大大超过其它载体；在运输过程中可抵御核酸酶的作用，延缓基因降解；基因导入细胞后，脂质体即被降解，磷脂可被细胞生物膜利用[3]。但是脂质体作为转运载体也有其不足，如血液稳定性差、脂质体的低靶向性和内涵体逃逸的阻碍等。为克服脂质体的不足之处，科学工作者们在脂质体制备材料、脂质体修饰以及脂质体构建方式等多方面一直都在在进行研究工作，1996年Lee and Huang制备了阴离子脂质体-聚阳离子-DNA复合载体，是一种由聚L-赖氨酸压缩DNA构成致密压缩颗粒，压缩颗粒由阴离子脂质体外壳包被的被称为LPD的载体。后来发现用硫酸鱼精蛋白压缩核酸(DNA或RNA)构建的载体比用聚L-赖氨酸压缩构建的载体有更高的转染效率，现在硫酸鱼精蛋白被广泛用于核酸的压缩。主要将这一成果用作转运核酸或疫苗等方面的载体[4～7]。压缩可以定义为核酸分子由无规则卷曲变为紧密状态的过程，在压缩过程中，伸展的核酸链形成紧密压缩颗粒，使其尺寸惊人的减小。由此可见，上述脂质体-多聚压缩体复合载体的制备方法的采用可以提高转染效率。但是上述复合载体都是用DOTAP以及胆固醇等类脂制备的，其毒性的降低和修饰还相对较为保守，新型阳离子类脂的应用以及新的脂质体构建方法的配方条件优化将有望解决毒性和输送效率问题。

在脂质体修饰方面，靶向和长循环修饰相对较为普遍，已有这方面的研究专利，利用叶酸和运铁蛋白的阳离子脂质体达到脂质体基因传递的靶向(公开号：CN1904055A)[8]。

在药物应用方面，水溶性差对一个药物来说是很棘手的问题[9]。近年来，有不少科研工作者，为解决这一问题进行了大量的研究工作，脂质体作为给药载体可以有效的实现药物的靶向，提高药物的局部保存浓度，延长药物作用时间，增强对肿瘤的杀伤力，减少对正常细胞的毒副作用[10]。在脂质体载药方面，继阿霉素脂质体被FDA批准后，紫杉醇、两性霉素B和盐酸多柔比星脂质体已经被SFDA批准上市，吲哚美辛、羟基喜树碱、尿激酶、前列地尔脂质体等多种脂质体品种也已经被SFDA注册受理。相对于片剂、胶囊等常规剂型，作为新制剂技术的脂质体仍处于发展阶段[11]。

综上所述，近几十年非病毒载体的研究取得了很多可喜的成果，现在很多研究小组针对相应的非病毒载体的缺点进行的改进研究工作也在大量的进行，但是非病毒载体的转染效率低，细胞毒性较大，靶向性有待加强；其运送系统的颗粒较大，容易引发免疫反应和被机体所清除的问题也亟待研究解决。本发明提供一种可用于共载药物和siRNA的新型复合载体的构建优选配方，构建出了多个用于癌症治疗的可实现高效输送脂溶性药物和siRNA的低毒复合载体。

参考文献

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发明内容

本发明的目的在于提供一种同时装载药物和压缩siRNA的联合转运复合载体。本发明的联合转运复合载体，毒性低，转染率高，且因为在同一个输送系统中联合转运药物和siRNA会更有效克服肿瘤细胞的耐受性包括联合转运可以有效克服癌细胞容易产生的多重耐药性。

本发明的目的是用如下技术方案来实现的。

一种复合载体，其组成包括由阳离子类脂和脂溶性药物构成的药物脂质体和压缩siRNA，其中所述阳离子类脂与脂溶性药物的质量比为200∶1～1∶1，所述药物脂质体和压缩siRNA的质量比为20∶1～0.5∶1。

优选的，所述的阳离子类脂与脂溶性药物的质量比为20∶1～10∶1，更优选20∶1。

优选的，所述的药物脂质体和压缩siRNA的质量比为16∶1～2∶1，更优选8∶1～3∶1。

在上述技术方案中，所述阳离子类脂优选为氨基甲酸酯型阳离子类脂。

进一步的，所述氨基甲酸酯型阳离子类脂具有通式I的结构：

其中：

X^-选自卤素离子、H₂PO₄ ^-、HCO₃ ^-、NO₃ ^-、HSO₃ ^-、CH₃COO^-、葡萄糖酸根、葡萄糖醛酸根、半乳糖酸根、半乳糖醛酸根、丙酸根（CH₃CH₂COO^-）和甲磺酸根（CH₃SO₃ ^-）；

其中所述葡萄糖酸根（A1）、葡萄糖醛酸根（A2）、半乳糖酸根（A3）、半乳糖醛酸根（A4）结构如下：

R₁选自C_1-20烷基、十八烯基（C₁₇H₃₄CH₂-）和胆固醇基；

其中所述胆固醇基（A5）结构如下：

R₂选自C_1-6烷基、C_1-6羟烷基、葡萄糖基、半乳糖基、甘露糖基和叶酸酯基；

其中所述葡萄糖基（A6）、半乳糖基（A7）、甘露糖基（A8）、叶酸酯基（A9）的结构如下：

在上述技术方案中，X^-优选选自卤素离子、HCO₃ ^-、HSO₃ ^-、葡萄糖酸根、半乳糖酸根、半乳糖醛酸根、丙酸根或甲磺酸根；更优选X^-选自卤素离子或半乳糖酸根。

在上述技术方案中，R₁优选选自C_12-18烷基，油烯基和胆甾醇基；更优选R₁选自C₁₂烷基、C₁₄烷基、油烯基和胆甾醇基。

在上述技术方案中，R₂优选选自C_1-3烷基、C_1-3羟烷基、半乳糖基、甘露糖基和叶酸基；更优选R₂选自甲基、乙基、羟乙基、半乳糖基和叶酸基。

本发明中，所述卤素离子为F^-、Cl^-、Br^-、I^-；所述“烷基”包括直链烷基和支链烷基，例如“C_1-6烷基”包括C_1-4烷基、C_1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其他基团。

上述技术方案中，所述脂溶性药物优选为抗癌药物。

进一步的，所述抗癌药物可以为紫杉醇、白藜芦醇、β-榄香烯、冬凌草甲素等。

上述技术方案中，所述压缩siRNA是siRNA中加入阳离子多聚体和带负电荷的辅助压缩物压缩而成，其中所述阳离子多聚体与siRNA的质量比为0.25∶1～5∶1，优选为1∶1～5∶1，更优选为1∶1～3∶1。加入带负电荷的辅助压缩物使压缩siRNA的结构更紧密和稳定。

进一步的，所述阳离子多聚体为聚偶磷氮、阳离子多肽、多聚氨基酯或多聚氨基磷酸酯(polyphosphoramidate)；所述带负电荷的辅助压缩物为糖胺聚糖、质粒DNA或0.4～200kbp的DNA分子。其中所述阳离子多肽可以为多聚鸟氨酸、多聚赖氨酸、精蛋白等。

本发明的另一方面，本发明提供上述技术方案中所述的复合载体的制备方法，具体包括如下步骤：

①药物脂质体的制备：按配比将阳离子类脂和脂溶性药物在脂溶性有机溶剂中混合，搅拌溶解后，氮气吹膜，真空干燥过夜，加入45～55℃超纯水并在45～55℃下水浴2～3h，在55℃反复超声震荡至澄清，制得药物脂质体；

②联合转运复合载体的制备：将步骤①得到的药物脂质体与压缩siRNA按配比混合，漩涡震荡混匀，室温孵育15～20min，得到复合载体。

上述制备方法中，所述压缩siRNA用如下方法制备：将阳离子多聚体与siRNA按质量比为0.25∶1～5∶1混合，加入与siRNA质量比为1∶1的带负电荷的辅助压缩物，漩涡震荡混匀，室温孵育10～20min，即得压缩siRNA；其中所述阳离子多聚体为聚偶磷氮、阳离子多肽、多聚氨基酯或多聚氨基磷酸酯(polyphosphoramidate)；所述带负电荷的辅助压缩物为糖胺聚糖、质粒DNA或0.4～200kbp的DNA分子。其中所述阳离子多肽可以为多聚鸟氨酸、多聚赖氨酸、精蛋白等。

上述制备方法中所述阳离子类脂为具有通式I的结构的氨基甲酸酯型阳离子类脂，其中各个取代基的定义，均与上述复合载体的技术方案中所述的定义相同。

上述制备方法中，步骤②得到的复合载体进一步进行PEG化长循环修饰和/或叶酸靶向性修饰。

所述PEG化或叶酸靶向性修饰是采用本领域技术人员常使用的修饰方法来进行，在本发明中不再详细表述。复合载体的修饰，可以进行PEG化或叶酸靶向性修饰，也可以同时进行PEG化和叶酸靶向性修饰。

在具体实施方式中，将步骤②制备的复合载体按总脂质与DSPE-PEG(2000)Folate摩尔比为10∶1～5∶1混合，漩涡震荡混匀，在55℃～60℃孵育20min，即得PEG化-叶酸靶向修饰的复合载体。

本发明的再一方面，本发明提供上述技术方案中所述的复合载体在制备抗癌药物中的应用或在输送抗癌药物和肿瘤治疗基因中的应用。将具有抗癌活性的脂溶性药物和压缩siRNA用本发明的方法制备成复合载体，用于癌症的治疗，因为在同一个输送系统中联合转运药物和siRNA会更有效克服肿瘤细胞的耐受性包括联合转运可以有效克服癌细胞容易产生的多重耐药性。

本发明的复合载体具有对药物的高包封率，实验结果表明，本发明的复合载体对紫杉醇包封率均大于75%，最高可达97.6%。另外本发明的复合载体的粒径小于400nm，最小可达到100nm以下，有效提高药物和基因的转运效率，是现有技术未能达到的效果。

本发明的有益效果：本发明提供一种新的同时装载药物和压缩siRNA的联合转运复合载体。本发明的复合载体采用新型阳离子类脂，极好的降低了构建脂质体的细胞毒性。本发明的复合载体优化阳离子多聚体压缩siRNA的配比，提高了对siRNA的有效装载量，同时减小了复合载体的粒径。本发明的复合载体在经过叶酸对复合载体的靶向修饰后，还可实现对肿瘤细胞的靶向性，并克服由于表面电位所引起对正常细胞毒性的缺点。利用PEG化的修饰方法增强该复合载体在含血清培养基中或血液循环中的稳定性，以保证复合载体对天然药物和siRNA的缓释作用。本发明的复合载体的制备方法简单、高效，制备出的复合载体毒性低、转染率高，在物理学表征和体外生物学研究中针对该复合载体运载药物和siRNA的能力设计的实验均已得到了良好的评价效果。本发明将有望成功开发出安全高效、靶向性强的、可用于联合转运的新型阳离子脂质体复合载体。

附图说明

图1A为复合载体PF-DDCTMA-TAX20/1的Zeta电位检测图；图1B是复合载体PF-DDCTMA-TAX+D20/1的粒径检测图。

图2A是鱼精蛋白与siRNA的电泳延滞实验结果；其中泳道1～8为鱼精蛋白与siRNA按质量比分别为0/1、0.2/1、0.5/1、1/1、2/1、3/1、4/1、5/1的鱼精蛋白-siRNA压缩稀释液。

图2B～I是紫杉醇脂质体DDCTMA-TAX200/1(实施例1)，DDCTMA-TAX100/1(实施例3)，DDCTMA-TAX20/1(实施例5)，DDCTMA-TAX+D20/1(实施例6)，DDCTMA-TAX10/1(实施例7)，DDCTMA-TAX+D10/1(实施例8)，BE-DDCDMA-TAX+D10/1(实施例10)，IE-DDCDMA-TAX+D10/1(实施例11)及其与压缩siRNA以不同比例混合制备的未修饰的复合载体的电泳延滞实验结果。B～I中，B～H第1泳道Marker为LambdaDNA/EcoR I+Hind III Markers，I中第1泳道Marker为DL2000；第2泳道为裸siRNA；第3泳道为裸的鱼精蛋白压缩siRNA；4～9泳道分别为紫杉醇脂质体与压缩siRNA以不同比例混合制备的未修饰的复合载体。其中第2～3泳道为电泳延滞实验的实际对照组，Marker仅作为判断电泳操作无误的参照。

图3～图5是高效液相色谱测定紫杉醇包封率的部分谱图，其中图3是实施例7制备的紫杉醇脂质体的高效液相色谱图；图4是空白脂质体的高效液相色谱图；图5是紫杉醇标准品的高效液相色谱图。

图6是用倒置荧光显微镜进行检测的Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测结果，其中A为空白对照(Control)的检测结果；B为阳性对照，即与压缩siRNA复合的空白脂质体(DDCTMA+D)的细胞凋亡检测结果；C、D、E、F分别为实施例6(FP-DDCTMA-TAX+D20/1)、实施例5(FP-DDCTMA-TAX20/1)、实施例3(FP-DDCTMA-TAX100/1)、实施例1(FP-DDCTMA-TAX200/1)制备得到的复合载体的细胞凋亡检测结果。

图7是本发明的复合载体（PF-DDCTMA-TAX+D20/1）作为siRNA转染载体转染NCI-H460(人大细胞肺癌细胞)的检测结果，其中图A1-A6依次是紫杉醇脂质体与制备的压缩6FAM-siRNA质量比为1/1、2/1、3/1、4/1、6/1、8/1的复合载体的转染效果；图B1-B3为对照组即依次为裸5’-6FAM suvivin siRNA、鱼精蛋白压缩的5’-6FAM suvivin siRNA和Lipofectamine2000的转染效果。

图8是本发明的复合载体转染过程中对A549细胞毒性的测定结果，MTT比色法检测。复合载体中紫杉醇脂质体与压缩siRNA的质量比为4/1；Lipofectamine2000对照组中Lipofectamine2000与siRNA的质量比为3/1。

图9是本发明的复合载体转染过程中对A549细胞毒性的测定结果，MTT比色法检测；其中横坐标为复合载体制备过程中采用的阳离子类脂与紫杉醇的质量比，不同棒图所各表示本发明实施例制备的复合载体，其具体名称中括号内的参数表示复合载体中紫杉醇脂质体与压缩siRNA的质量比。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明所述实施例中选用的氨基甲酸酯型阳离子类脂分别为DDCTMA、BE-DDCDMA、IE-DDCDMA、CE-DDCDMA，其制备方法及结构鉴定结果如下：

DDCTMA即化合物N-[1-(2,3-双十二烷基氨基甲酰基)丙基]-N,N,N-三甲基碘化铵的制备方法以及其结构鉴定结果：

(1)3-二甲氨基-1,2-丙二醇(DAP)的合成

在装有温度计、回流管和滴液漏斗的250ml三口瓶中加入68.3g的33%二甲胺水溶液和40%的氢氧化钠水溶液20ml，磁力搅拌下滴加22g的3-氯-1,2-丙二醇。滴加完毕后，放入70℃反应3h后停止反应，得到淡黄色液体；经常压蒸馏除去体系中剩余的二甲胺，蒸馏除水，经过滤、除盐后得到棕黄色液体；该液体经高温减压蒸馏，收集117～118℃/15mmHg馏分，得到淡黄色透明粘稠液体。

(2)N,N-二甲基-(2，3-双十二烷基氨基甲酸酯)丙胺的合成

在装有具N2保护、温度计、回流管和滴液漏斗的250ml三口瓶中加入50ml甲苯和6.82g的羰基二咪唑(CDI)，水浴恒温60℃，磁力搅拌下滴加溶解有2.38g的DAP的甲苯溶液30ml，滴加时间约1h，共计反应3h。然后磁力搅拌下缓慢滴加溶解有7.78g的十二胺的甲苯溶液50ml，在60℃下恒温反应3h(滴加速度1～2滴/秒)。将反应混合物旋转减压蒸干溶剂甲苯，得到胶状白色固体。用乙醇重结晶1次，即得白色晶亮状产物。

(3)N-[1-(2,3-双十二烷基氨基甲酰基)丙基]-N,N,N-三甲基碘化铵的合成

分别在高压釜中加入2.0g的步骤(2)得到的N,N-二甲基-(2，3-双烷基氨基甲酸酯)丙胺，在通风厨中，避光，用量筒量取一定量的卤代烷(溴甲烷、碘甲烷、碘乙烷等)或卤代醇(2-氯乙醇、2-溴乙醇、2-碘乙醇等)等10ml碘甲烷，加入反应釜中，迅速密封反应釜。将反应釜置于有防护挡板的实验台上，磁力搅拌下缓慢升温，在80℃恒温反应24h。反应结束后，自然冷却至室温，冰浴将高压釜冷却至0℃。通风厨中打开釜盖，稍加热蒸去未反应的卤代烷或卤代醇等季铵化试剂。所得即为反应粗产物，以氯仿溶剂溶解结晶数次，得到白色粉末状固体，红外快速干燥箱中干燥1～2h，得最终产物，其结构表征如下：IR,(KBr)ν/cm^-1:3456(ν_NH),1720(ν_C=O),1517(δ_NH),1246(ν_COC);¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:6.00(m,1H,OCH),5.47～5.34(d,2H,2×NH),4.36～4.16(4H,NH(C=O)OCH₂CH,CHCH₂N),3.50(s,9H,N(CH₃)₃),3.20～3.12(t,4H,2×CH₂NH(C=O)O),1.53～1.51(m,4H,2×CH₂CH₂NH),1.26(s,36H,2×(CH₂)₉),0.90～0.86(t,J=7.2,6H,2×CH₃).¹³C NMR(400MHz,CDCl₃)δ:155.62～154.52(C=O),66.56(OCH),66.20(OCH₂),63.10(NCH₂),54.82(N(CH₃)₃),41.38～41.18(NHCH₂),31.92(CH₂CH₂CH₃),29.85～29.28((CH₂)₆,NHCH₂CH₂),26.93～26.80(CH₂CH₂CH₂NH),22.69(CH₂CH₃),14.14(CH₃).ESI-MS,m/z:Found[M-I]⁺,556.15,C₃₂H₆₆IN₃O₄calcd for[M-I]⁺,556.51.

BE-DDCDMA即化合物N-[1-(2,3-双十四烷基氨基甲酰基)丙基]-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵的制备方法及其结构鉴定结果：

(1)3-二甲氨基-1,2-丙二醇(DAP)的合成

在装有温度计、回流管和滴液漏斗的250ml三口瓶中加入70.5g的33%二甲胺水溶液和40%的氢氧化钠水溶液20ml，磁力搅拌下滴加44.1g的3-氯-1,2-丙二醇。滴加完毕后，放入70℃反应3h后停止反应，得到淡黄色液体；经常压蒸馏除去体系中剩余的二甲胺，蒸馏除水，经过滤、除盐后得到棕黄色液体；该液体经高温减压蒸馏，收集117～118℃/15mmHg馏分，得到淡黄色透明粘稠液体。

(2)N,N-二甲基-(2，3-双十二烷基氨基甲酸酯)丙胺的合成

在装有具N₂保护、温度计、回流管和滴液漏斗的250ml三口瓶中加入50ml甲苯和6.78g的羰基二咪唑(CDI)，水浴恒温50℃，磁力搅拌下滴加溶解有2.18g的DAP的甲苯溶液30ml，滴加时间约1h，共计反应3h。然后磁力搅拌下缓慢滴加溶解有7.70g的十二胺的甲苯溶液50ml，在50℃下恒温反应3h(滴加速度1～2滴/秒)。将反应混合物旋转减压蒸干溶剂甲苯，得到胶状白色固体。用乙醇重结晶1次，即得白色晶亮状产物。

(3)N-[1-(2,3-双十四烷基氨基甲酰基)丙基]-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵的合成

分别在高压釜中加入2.0g的步骤(2)得到的N,N-二甲基-(2，3-双烷基氨基甲酸酯)丙胺，在通风厨中，避光，用量筒量取25ml溴乙醇，加入反应釜中，迅速密封反应釜。将反应釜置于有防护挡板的实验台上，磁力搅拌下缓慢升温，在85℃恒温反应30h。反应结束后，自然冷却至室温，冰浴将高压釜冷却至0℃。通风厨中打开釜盖，稍加热蒸去未反应的试剂。所得即为反应粗产物，以氯仿溶剂溶解结晶数次，得到白色粉末状固体，红外快速干燥箱中干燥1～2h，得最终产物，其结构表征如下：IR,(KBr)ν/cm^-1:3329(ν_NH),1712(ν_C=O),1535(δ_NH),1256(ν_COC);¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:6.20(m,1H,OCH),5.82～5.5.43(d,2H,2×NH),4.96(s,1H,HOCH₂)4.21～4.14(6H,NH(C=O)OCH₂CH,CHCH₂N,HOCH₂),3.87～3.74(m,2H,NCH₂CH₂OH)3.43(s,6H,N(CH₃)₂),3.20～3.10(t,4H,2×CH₂NH(C=O)O),1.51(m,4H,2×CH₂CH₂NH),1.26(s,36H,2×(CH₂)₉),0.90～0.86(t,J=7.2,6H,2×CH₃).¹³C NMR(400MHz,CDCl₃)δ:155.78～154.64(C=O),67.41(OCH),66.43(OCH₂),64.73(NCH₂CH),63.35(NCH₂CH₂OH),55.70(NCH₂CH₂OH),53.32～53.10(N(CH₃)₂),41.38～41.21(NHCH₂),32.93(CH₂CH₂CH₃),29.91～29.33((CH₂)₆,NHCH₂CH₂),26.95～26.84(CH₂CH₂CH₂NH),22.70(CH₂CH₃),14.14(CH₃);ESI-MS,m/z:Found[M-Br]⁺,586.10,C₃₃H₆₈BrN₃O₅calcd for[M-Br]⁺,586.52.

IE-DDCDMA即化合物N-[1-(2,3-双十二烷基氨基甲酰基)丙基]-N,N-二甲基-N-羟乙基碘化铵的制备方法及其结构鉴定结果：

在通风厨中，避光，分别在高压釜中加入2.0g的上述实施例1中得到的N,N-二甲基-(2，3-双烷基氨基甲酸酯)丙胺(DDCDMA)和30ml碘乙醇，加入反应釜中，迅速密封反应釜。将反应釜置于有防护挡板的实验台上，磁力搅拌下缓慢升温，在65℃恒温反应20h。反应结束后，自然冷却至室温，冰浴将高压釜冷却至0℃。通风厨中打开釜盖，稍加热蒸去未反应的试剂。所得即为反应粗产物，以氯仿溶剂溶解结晶数次，得到白色粉末状固体，红外快速干燥箱中干燥1～2h，得最终产物，其结构表征如下：IR,(KBr)ν/cm^-1:3344(ν_NH),1701(ν_C=O),1533(δ_NH),1248(ν_COC);¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:5.90～5.87(m,1H,OCH),5.53～5.50(d,2H,2×NH),4.26～4.10(7H,NH(C=O)OCH₂CH,CHCH₂N,HOCH₂,HOCH₂),3.91～3.76(m,2H,NCH₂CH₂OH)3.44(s,6H,N(CH₃)₂),3.22～3.10(t,4H,2×CH₂NH(C=O)O),1.51(m,4H,2×CH₂CH₂NH),1.26(s,36H,2×(CH₂)₉),0.90～0.86(t,J=7.2,6H,2×CH₃).¹³C NMR(400MHz,CDCl₃)δ:155.95～154.80(C=O),67.45(OCH),66.44(OCH₂),65.27(NCH₂CH),63.65(NCH₂CH₂OH),55.89(NCH₂CH₂OH),53.66～53.58(N(CH₃)₂),41.60～41.42(NHCH₂),32.15(CH₂CH₂CH₃),30.09～29.55((CH₂)₆,NHCH₂CH₂),27.17～27.06(CH₂CH₂CH₂NH),22.92(CH₂CH₃),14.37(CH₃);ESI-MS,m/z:Found[M-I]⁺,586.10,C₃₃H₆₈IN₃O₅calcd for[M-I]⁺,586.52.

CE-DDCDMA即化合物N-[1-(2,3-双十二烷基氨基甲酰基)丙基]-N,N-二甲基-N-羟乙基氯化铵制备方法及其结构鉴定结果：

在通风厨中，避光，分别在高压釜中加入2.0g的上述实施例1中得到的N,N-二甲基-(2，3-双烷基氨基甲酸酯)丙胺(DDCDMA)和25ml氯乙醇，加入反应釜中，迅速密封反应釜。将反应釜置于有防护挡板的实验台上，磁力搅拌下缓慢升温，在70℃恒温反应18h。反应结束后，自然冷却至室温，冰浴将高压釜冷却至0℃。通风厨中打开釜盖，稍加热蒸去未反应的试剂。所得即为反应粗产物，以氯仿溶剂溶解结晶数次，得到白色粉末状固体，红外快速干燥箱中干燥1～2h，得最终产物，其结构表征如下：IR,(KBr)ν/cm^-1:3329(ν_NH),1712(ν_C=O),1535(δ_NH),1261(ν_COC);¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:6.47(m,1H,OCH),6.01～5.45(d,2H,2×NH),4.21～4.11(7H,NH(C=O)OCH₂CH,CHCH₂N,HOCH₂,HOCH₂),3.78～3.69(m,2H,NCH₂CH₂OH)3.40(s,6H,N(CH₃)₂),3.11～3.01(t,4H,2×CH₂NH(C=O)O),1.50(m,4H,2×CH₂CH₂NH),1.25(s,36H,2×(CH₂)₉),0.90～0.86(t,J=7.2,6H,2×CH₃).¹³C NMR(400MHz,CDCl₃)δ:156.05～154.97(C=O),67.80(OCH),66.67(OCH₂),65.27(NCH₂CH),63.57(NCH₂CH₂OH),55.98(NCH₂CH₂OH),53.55～53.29(N(CH₃)₂),41.61～41.45(NHCH₂),32.14(CH₂CH₂CH₃),30.16～29.53((CH₂)₆,NHCH₂CH₂),27.16～27.06(CH₂CH₂CH₂NH),22.90(CH₂CH₃),14.32(CH₃);ESI-MS,m/z:Found[M-Cl]⁺,586.10,C₃₃H₆₈ClN₃O₅calcd for[M-Cl]⁺,586.52.

本发明所述DSPE-PEG(2000)Folate(购自Avanti Polar Lipids,Inc)，具有式Ⅱ的结构式：

实施例1

称量一定质量的新型阳离子类脂DDCTMA，DDCTMA与紫杉醇按质量比200/1溶于1ml三氯甲烷中，待充分溶解后，氮气吹膜，真空干燥过夜，加入55℃超纯水1ml并在55℃下水浴2～3h，55℃反复超声震荡至澄清，制得紫杉醇脂质体(DDCTMA-TAX200/1)。

siRNA的压缩：硫酸盐鱼精蛋白(属于阳离子多聚体)溶于5%的葡萄糖水溶液中，siRNA与透明质酸(属于糖胺聚糖)按质量比1∶1混合，将上述混合液滴加到硫酸鱼精蛋白溶液中，硫酸盐鱼精蛋白与siRNA的质量比为5∶1，漩涡震荡混匀，室温孵育20min，即得压缩siRNA，备用。

将紫杉醇脂质体与制备的压缩siRNA按1/1、3/1、6/1、10/1质量比混合，轻微漩涡震荡，室温孵育15～20min，得到未修饰的复合载体。

将上述制备的复合载体进一步修饰，得到靶向长循环复合载体。具体方法为：将所述复合载体中总脂质与DSPE-PEG(2000)Folate(PF)按摩尔比为20∶1混合，漩涡震荡混匀，在55℃孵育20min，即得靶向长循环复合载体(PF-DDCTMA-TAX200/1)。

实施例2

称量一定质量的新型类脂DDCTMA，DDCTMA与紫杉醇按质量比200/1溶于1ml三氯甲烷中，待充分溶解后，加入与DDCTMA摩尔比为1/1的DOPE，氮气吹膜，真空干燥过夜，加入55℃超纯水1ml并在55℃下水浴2～3h，55℃反复超声震荡至澄清，制得紫杉醇脂质体(DDCTMA-TAX+D200/1)。

siRNA的压缩：硫酸盐鱼精蛋白溶于5%的葡萄糖水溶液中，硫酸盐鱼精蛋白与siRNA按质量比为4∶1混合，漩涡震荡混匀，室温孵育20min，即得压缩siRNA，备用。

将紫杉醇脂质体与制备的压缩siRNA按1/1、2/1、3/1、4/1、5/1、10/1质量比混合，轻微漩涡震荡，室温孵育15～20min，得到未修饰的复合载体。

将上述制备的复合载体进一步修饰，得到靶向长循环复合载体。具体方法为：所述复合载体中总脂质与DSPE-PEG(2000)Folate(PF)按摩尔比为20∶1混合，漩涡震荡混匀，在55℃孵育20min，即得靶向长循环复合载体(PF-DDCTMA-TAX+D200/1)。

实施例3

称量一定质量的新型类脂DDCTMA，DDCTMA与紫杉醇按质量比100/1溶于1ml三氯甲烷中，待充分溶解后，氮气吹膜，真空干燥过夜，加入50℃超纯水1ml并在50℃下水浴2～3h，55℃反复超声震荡至澄清，制得紫杉醇脂质体(DDCTMA-TAX100/1)。

siRNA的压缩：硫酸盐鱼精蛋白溶于5%的葡萄糖水溶液中，siRNA与透明质酸按质量比1∶1混合，将上述混合液滴加到硫酸鱼精蛋白溶液中，硫酸盐鱼精蛋白与siRNA的质量比为2∶1，漩涡震荡混匀，室温孵育20min，即得压缩siRNA，备用。

将紫杉醇脂质体与制备的压缩siRNA按1/1、4/1、8/1、12/1、16/1、20/1质量比混合，轻微漩涡震荡，室温孵育15～20min，得到未修饰的复合载体。

将上述制备的复合载体进一步修饰，得到靶向长循环复合载体。具体方法为：所述复合载体中总脂质与DSPE-PEG(2000)Folate(PF)按摩尔比为15∶1混合，漩涡震荡混匀，在55℃孵育20min，即得靶向长循环复合载体(PF-DDCTMA-TAX100/1)。

实施例4

称量一定质量的新型类脂DDCTMA，按DDCTMA与紫杉醇的质量比100/1溶于1ml三氯甲烷中，待充分溶解后，加入与DDCTMA摩尔比为1/1的DOPE，氮气吹膜，真空干燥过夜，加入55℃超纯水1ml并在55℃下水浴2～3h，55℃反复超声震荡至澄清，制的紫杉醇脂质体(DDCTMA-TAX+D100/1)。

siRNA的压缩：硫酸盐鱼精蛋白溶于5%的葡萄糖水溶液中，siRNA与透明质酸按质量比1∶1混合，将上述混合液滴加到硫酸鱼精蛋白溶液中，硫酸盐鱼精蛋白与siRNA的质量比为2∶1，漩涡震荡混匀，室温孵育20min，即得压缩siRNA，备用。

将紫杉醇脂质体与制备的压缩siRNA按1/1、4/1、8/1、12/1、16/1质量比混合，轻微漩涡震荡，室温孵育15～20min，得到未修饰的复合载体。

将上述制备的复合载体进一步修饰，得到靶向长循环复合载体。具体方法为：所述复合载体中总脂质与DSPE-PEG(2000)Folate(PF)按摩尔比为15∶1混合，漩涡震荡混匀，在55℃孵育20min，即得靶向长循环复合载体(PF-DDCTMA-TAX+D100/1)。

实施例5

称量一定质量的新型类脂DDCTMA，按DDCTMA与紫杉醇的质量比20/1溶于1ml三氯甲烷中，待充分溶解后，氮气吹膜，真空干燥过夜，加入55℃超纯水1ml并在55℃下水浴2～3h，55℃反复超声震荡至澄清，制得紫杉醇脂质体(DDCTMA-TAX20/1)。

siRNA的压缩：硫酸盐鱼精蛋白溶于5%的葡萄糖水溶液中，siRNA与透明质酸按质量比1∶1混合，将上述混合液滴加到硫酸鱼精蛋白溶液中，硫酸盐鱼精蛋白与siRNA的质量比为2∶1，漩涡震荡混匀，室温孵育20min，即得压缩siRNA，备用。

将紫杉醇脂质体与制备的压缩siRNA按1/1、4/1、8/1、12/1、16/1质量比混合，轻微漩涡震荡，室温孵育15～20min，得到未修饰的复合载体。

将上述制备的复合载体进一步修饰，得到靶向长循环复合载体。具体方法为：所述复合载体中总脂质与DSPE-PEG(2000)Folate(PF)按摩尔比为10∶1混合，漩涡震荡混匀，在55℃孵育20min，即得靶向长循环复合载体(PF-DDCTMA-TAX20/1)。

实施例6

称量一定质量的新型类脂DDCTMA，按DDCTMA与紫杉醇的质量比20/1溶于1ml三氯甲烷中，待充分溶解后，加入与DDCTMA摩尔比为1/1的DOPE，氮气吹膜，真空干燥过夜，加入55℃超纯水1ml并在55℃下水浴2～3h，55℃反复超声震荡至澄清，制的紫杉醇脂质体(DDCTMA-TAX+D20/1)。

siRNA的压缩：硫酸盐鱼精蛋白溶于5%的葡萄糖水溶液中，硫酸盐鱼精蛋白与siRNA按质量比为1∶1混合，漩涡震荡混匀，室温孵育20min，即得压缩siRNA，备用。

将紫杉醇脂质体与制备的压缩siRNA按1/1、2/1、3/1、4/1、6/1、8/1、12/1、16/1、20/1质量比混合，轻微漩涡震荡，室温孵育15～20min，得到未修饰的复合载体。

将上述制备的复合载体进一步修饰，得到靶向-长循环复合载体。具体方法为：所述复合载体中总脂质与DSPE-PEG(2000)Folate(PF)按摩尔比为10∶1混合，漩涡震荡混匀，在55℃孵育20min，即得靶向长循环复合载体(PF-DDCTMA-TAX+D20/1)。

实施案7

称量一定质量的新型类脂DDCTMA，按DDCTMA与紫杉醇的质量比10/1溶于1ml三氯甲烷中，待充分溶解后，氮气吹膜，真空干燥过夜，加入55℃超纯水1ml并在55℃下水浴2～3h，55℃反复超声震荡至澄清，制的紫杉醇脂质体(DDCTMA-TAX10/1)。

siRNA的压缩：硫酸盐鱼精蛋白溶于5%的葡萄糖水溶液中，硫酸盐鱼精蛋白与siRNA按质量比为0.5∶1混合，漩涡震荡混匀，室温孵育20min，即得压缩siRNA，备用。

将紫杉醇脂质体与制备的压缩siRNA按的质量比混合，轻微漩涡震荡，室温孵育15～20min，得到未修饰的复合载体。

将上述制备的复合载体进一步修饰，得到靶向长循环复合载体。具体方法为：所述复合载体中总脂质与DSPE-PEG(2000)Folate(PF)按摩尔比为10∶1混合，漩涡震荡混匀，在55℃孵育20min，即得靶向长循环复合载体(PF-DDCTMA-TAX10/1)。

实施例8

称量一定质量的新型类脂DDCTMA，按DDCTMA与紫杉醇的质量比10/1溶于1ml三氯甲烷中，待充分溶解后，加入与DDCTMA摩尔比为1/1的DOPE，氮气吹膜，真空干燥过夜，加入55℃超纯水1ml并在55℃下水浴2～3h，55℃反复超声震荡至澄清，制的紫杉醇脂质体(DDCTMA-TAX+D10/1)。

siRNA的压缩：硫酸盐鱼精蛋白溶于5%的葡萄糖水溶液中，siRNA与透明质酸按质量比1∶1混合，将上述混合液滴加到硫酸鱼精蛋白溶液中，硫酸盐鱼精蛋白与siRNA的质量比为0.5∶1，漩涡震荡混匀，室温孵育20min，即得压缩siRNA，备用。

将紫杉醇脂质体与制备的压缩siRNA按1/1、4/1、8/1、12/1、16/1质量比混合，轻微漩涡震荡，室温孵育15～20min，得到未修饰的复合载体。

将上述制备的复合载体进一步修饰，得到靶向长循环复合载体。具体方法为：所述复合载体中总脂质与DSPE-PEG(2000)Folate(PF)按摩尔比为10∶1混合，漩涡震荡混匀，在55℃孵育20min，即得靶向长循环复合载体(PF-DDCTMA-TAX+D10/1)。

实施例9

称量一定质量的新型类脂CE-DDCDMA，按CE-DDCDMA与紫杉醇的质量比5/1溶于1ml三氯甲烷中，待充分溶解后，加入与CE-DDCDMA摩尔比为1/1的DOPE，氮气吹膜，真空干燥过夜，加入55℃超纯水1ml并在55℃下水浴2～3h，55℃反复超声震荡至澄清，制的紫杉醇脂质体(CE-DDCDMA-TAX+D5/1)。

siRNA的压缩：硫酸盐鱼精蛋白溶于5%的葡萄糖水溶液中，siRNA与透明质酸按质量比1∶1混合，将上述混合液滴加到硫酸鱼精蛋白溶液中，硫酸盐鱼精蛋白与siRNA的质量比为0.25∶1，漩涡震荡混匀，室温孵育15min，即得压缩siRNA，备用。

将紫杉醇脂质体与制备的压缩siRNA按1/1、2/1、4/1、6/1质量比混合，轻微漩涡震荡，室温孵育15～20min，得到未修饰的复合载体。

将上述制备的复合载体进一步修饰，得到靶向长循环复合载体。具体方法为：所述复合载体中总脂质与DSPE-PEG(2000)Folate(PF)按摩尔比为10∶1混合，漩涡震荡混匀，在55℃孵育20min，即得靶向长循环复合载体(PF-CE-DDCDMA-TAX+D5/1)。

实施例10

称量一定质量的新型类脂BE-DDCDMA，按BE-DDCDMA与紫杉醇的质量比10/1溶于1ml三氯甲烷中，待充分溶解后，加入与BE-DDCDMA摩尔比为1/1的DOPE，氮气吹膜，真空干燥过夜，加入55℃超纯水1ml并在55℃下水浴2～3h，55℃反复超声震荡至澄清，制得紫杉醇脂质体(BE-DDCDMA-TAX+D10/1)。

siRNA的压缩：硫酸盐鱼精蛋白溶于5%的葡萄糖水溶液中，siRNA与透明质酸按质量比1∶1混合，将上述混合液滴加到硫酸盐鱼精蛋白溶液中，硫酸盐鱼精蛋白与siRNA的质量比为0.5∶1，漩涡震荡混匀，室温孵育20min，即得压缩siRNA，备用。

将紫杉醇脂质体与制备的压缩siRNA按1/1、4/1、6/1、8/1、10/1质量比混合，轻微漩涡震荡，室温孵育15～20min，得到未修饰的复合载体。

将上述制备的复合载体进一步修饰，得到靶向长循环复合载体。具体方法为：所述复合载体中总脂质与DSPE-PEG(2000)Folate(PF)按摩尔比为10∶1混合，漩涡震荡混匀，在55℃孵育20min，即得靶向长循环复合载体(PF-BE-DDCDMA-TAX+D10/1)。

实施例11

称量一定质量的新型类脂IE-DDCDMA，按IE-DDCDMA与紫杉醇的质量比10/1溶于1ml三氯甲烷中，待充分溶解后，加入与IE-DDCDMA摩尔比为1/1的DOPE，氮气吹膜，真空干燥过夜，加入55℃超纯水1ml并在55℃下水浴2～3h，55℃反复超声震荡至澄清，制的紫杉醇脂质体(IE-DDCDMA-TAX+D10/1)。

siRNA的压缩：硫酸盐鱼精蛋白溶于5%的葡萄糖水溶液中，siRNA与透明质酸按质量比1∶1混合，将上述混合液滴加到硫酸鱼精蛋白溶液中，硫酸盐鱼精蛋白与siRNA按质量比为0.5∶1，漩涡震荡混匀，室温孵育20min，即得压缩siRNA，备用。

将紫杉醇脂质体与制备的压缩siRNA按1/1、4/1、6/1、8/1、10/1质量比混合，轻微漩涡震荡，室温孵育15～20min，得到未修饰的复合载体。

将上述制备的复合载体进一步修饰，得到靶向长循环复合载体。具体方法为：所述复合载体中总脂质与DSPE-PEG(2000)Folate(PF)按摩尔比为10∶1混合，漩涡震荡混匀，在55℃孵育20min，即得靶向长循环复合载体(PF-IE-DDCDMA-TAX+D10/1)。

实施例12复合载体的形态及粒径检测

采用激光散射粒度仪(HORIBA纳米粒度仪SZ-100)在25℃，光散射角度90°条件下测定制备的靶向长循环复合载体的粒径及其Zeta电位，用移液枪取20μl实施例1～实施例11制备的靶向长循环复合载体稀释于1ml超纯水中分别进行粒径和Zeta电位检测，结果见表1。图1A为复合载体PF-DDCTMA-TAX20/1的Zeta电位检测图，图1B是复合载体PF-DDCTMA-TAX+D20/1的粒径检测图。

表1的结果显示，不同配方的复合载体粒径范围＜400nm，在转染的有效粒径(＜1μm)范围之内。

实施例13siRNA电泳延滞实验

①鱼精蛋白-siRNA电泳延滞实验

采用siRNA电泳延滞实验，检测鱼精蛋白与siRNA在不同质量比时其相应的电荷比情况，进一步得出压缩的有效比例。将鱼精蛋白与siRNA按质量比依次为0/1、0.2/1、0.5/1、1/1、2/1、3/1、4/1、5/1分别稀释于15μl RPMI1640培养液中轻微漩涡震荡混匀，室温孵育20min，取2μl的6×DNA Loading buffer依次加入上述15μl鱼精蛋白-siRNA压缩稀释液中混匀，并依次上样于1.2%的琼脂糖凝胶上样孔中，电压设为90V，电泳40min。制胶时已加入核酸染液NA-Red，电泳结束后直接在凝胶成像系统Gene Genius Bio-imaging System(SYNGENE公司)中观察siRNA电泳延滞图并照相。电泳结果如图2A所示，其中泳道1～8为鱼精蛋白与siRNA按质量比分别为0/1、0.2/1、0.5/1、1/1、2/1、3/1、4/1、5/1的鱼精蛋白-siRNA压缩稀释液。

图2的A结果显示，随着鱼精蛋白质量的增加，延滞效果也逐渐明显，在质量比为2/1时已基本延滞，质量比为3/1时已完全延滞。有效延滞比例为1/1～5/1，优选比例1/1～3/1。

②紫杉醇脂质体-压缩siRNA电泳延滞实验

采用siRNA电泳延滞实验，检测优化阳离子类脂(DDCTMA)与药物质量比为200/1、100/1、20/1(+D)、10/1(+D)的紫杉醇脂质体与siRNA有效的延滞比例范围。

在上述实施例中按不同比例的DDCTMA与紫杉醇制备的紫杉醇脂质体以及其与压缩siRNA以不同比例混合制备的复合载体为样品，采用琼脂糖凝胶电泳，具体方法如下：首先将一定量的Luciferase siRNA与硫酸鱼精蛋白(protaminesulfate,Sigam公司)按比例混合，用旋涡振荡器轻微震荡充分混匀，室温孵育20min制得压缩的Luciferase siRNA，将上述压缩siRNA稀释于RPMI1640培养液(pH7.0～7.5)中；分别取一定体积紫杉醇脂质体(脂质体浓度为1μg/μl)稀释于RPMI1640培养液中，使其分别制成10μl的体系，然后分别取5μl上述压缩的Luciferase siRNA的稀释液滴加到相应的10μl紫杉醇脂质体稀释液中，使得紫杉醇脂质体和Luciferase siRNA的质量比(μg/μg)分别为1/1～20/1，用旋涡振荡器充分混匀，室温温育20min，使其形成未修饰的复合载体溶液。取15μl上述复合载体溶液与2μl的6×DNA Loading Dye(Fermentas公司)，混匀备用；取4μl LambdaDNA/EcoRI+HindⅢMarker(0.1μg/μl，Fermentas公司)与11μl的RPMI1640培养液混匀。将上述制备的Marker以及复合载体溶液依次点样于事先制备的1.2%琼脂糖凝胶中，电压设为90V，电泳40min或60min。NA-Red染色后在凝胶成像系统Gene Genius Bio-imaging System(SYNGENE公司)中观察siRNA电泳延滞图并照相。

图2的B～I依次为上述实施例中制备得到的紫杉醇脂质体DDCTMA-TAX200/1(实施例1)，DDCTMA-TAX100/1(实施例3)，DDCTMA-TAX20/1(实施例5)，DDCTMA-TAX+D20/1(实施例6)，DDCTMA-TAX10/1(实施例7)，DDCTMA-TAX+D10/1(实施例8)，BE-DDCDMA-TAX+D10/1(实施例10)，IE-DDCDMA-TAX+D10/1(实施例11)及其与浓缩siRNA以不同比例混合制备的未修饰的复合载体(采用的是PEG化和靶向性修饰之前的复合载体)的电泳结果。

图2的B～H中，第1泳道Marker为Lambda DNA/EcoR I+Hind III Markers，I中第一泳道Marker为DL2000；第2泳道为裸siRNA；第3泳道为裸的鱼精蛋白压缩siRNA；4～9泳道分别为紫杉醇脂质体与鱼精蛋白压缩的siRNA依次为1/1～20/1不等的质量梯度比例，具体质量比描述如下：图2的B中依次为1/1、2/1、3/1、4/1、5/1、10/1，C中依次为1/1、4/1、8/1、12/1、16/1、20/1，D中依次为1/1、2/1、3/1、4/1、6/1，E中依次为4/1、8/1、12/1、16/1、20/1，F中依次为1/1、2/1、4/1、6/1，H中依次为1/1、4/1、8/1、12/1、16/1，G中依次为1/1、2/1、3/1、4/1、5/1、6/1，I中依次为6/1、8/1、10/1、12/1、14/1。

图2的B～I结果显示，以第2泳道的裸siRNA以及第3泳道的压缩siRNA为对照，随着复合载体中紫杉醇脂质体质量的增加，压缩siRNA的延滞效果明显增强。在紫杉醇脂质体与鱼精蛋白压缩的siRNA比例在1/1～20/1的范围均有较好的siRNA延滞效果，在3/1～20/1范围内其延滞效果更好。在复合载体进行PEG化和靶向性修饰之前，进行siRNA延滞实验，以优化紫杉醇脂质体和鱼精蛋白压缩的siRNA的质量比，使其电荷比在有利于制备的复合载体的稳定性和有效性的范围内。分析上述电泳延滞实验，紫杉醇脂质体与压缩siRNA质量比优选2/1～16/1，更优选3/1～8/1。

实施例14紫杉醇脂质体包封率检测

采用高效液相色谱法检测紫杉醇脂质体包封率。第一步，制作紫杉醇的标准曲线，色谱条件如下：采用C₁₈柱子，紫外检测器波长设为227nm，柱温为37℃，流动相为水和乙腈且采用梯度洗脱的方法检测，梯度洗脱参数见表2。在此条件下将配制的紫杉醇标准品(浓度分别为0.005、0.01、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12μg/μl)依次进样，每个浓度重复进样3次，记录色谱峰并对其积分、分析，以峰面积(Y)和质量浓度(X)作标准曲线，进行线性回归得出标准曲线方程：y=4.2E+7x+1.1E+5，R²=0.975。第二步，检测紫杉醇脂质体中紫杉醇的包封率，将紫杉醇脂质体在同上述标准曲线的色谱条件下直接进样，对未纯化的紫杉醇脂质体进行分离检测，记录紫杉醇脂质体和游离紫杉醇的色谱峰图，分别积分并通过标准曲线方程计算，得到包封的药物量和游离紫杉醇的量，包封率计算方法：包封率=(投入药量-游离药量)/投入药量×100%。实施例1～10中制备得到的紫杉醇脂质体的紫杉醇包封率均大于75%，最高可达97.6%(实施例5和实施例8制备的紫杉醇脂质体)。图3为实施例7中制备的紫杉醇脂质体的紫外检测光谱，图4和图5分别为空白脂质体(由类脂DDCTMA制备)和紫杉醇标准品的紫外检测光谱。图3～图5的光谱图中可以看出，空白脂质体的保留时间为2.489min，紫杉醇标准品保留时间为27.091min，紫杉醇脂质体的保留时间为2.398min，游离紫杉醇的保留时间为27.862min。分析可知，紫杉醇脂质体中被包封的紫杉醇和空白脂质体的保留时间基本一致，以紫杉醇脂质体的形式出峰；未被包封的紫杉醇则和紫杉醇标准品的保留时间基本一致，以游离紫杉醇的形式出峰。由此可计算紫杉醇脂质体的包封率。

表2.梯度洗脱参数表

实施例15体外细胞实验

①凋亡检测实验

将A549细胞(人类肺腺癌细胞)种植于24孔细胞培养板中，每孔加入500μl约含6×10⁴个细胞，在RPMI1640培养液中培养，等到细胞密度达80～90%时，移去生长培养基，用等量(500μl)RPMI1640(无血清)培养基清洗，再用400μlRPMI1640(无血清)培养基替换。依次加入本发明的复合载体3.75μl稀释于100μl培养基中(按紫杉醇与脂质体比例不同每孔含紫杉醇依次为0.012、0.024、0.12、0.24μg)细胞转染24h后，采用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)定性检测细胞凋亡情况。以不加复合载体为空白对照，以空白脂质体(DDCTMA+D)作为阳性对照。Annexin V是一种分子量为35.8KD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)高亲和力特异结合。FITC-Annexin V结合到凋亡细胞后，在蓝色光的激发下，发出绿色荧光，区分出凋亡细胞与正常细胞。碘化丙啶(Propidium iodide，PI)是一种核酸染料，它不能穿透完整细胞膜，但对凋亡晚期细胞和死细胞的破损细胞膜能够穿透，并使细胞核红染。将FITC-Annexin V与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞区分开来。用倒置荧光显微镜定性观察实验结果。

图6的A～F是用倒置荧光显微镜检测的部分细胞凋亡实验的结果，其中A为空白对照(Control)的检测结果；B为阳性对照，即与压缩siRNA复合的空白脂质体(DDCTMA+D)的细胞凋亡检测结果；C、D、E、F分别为实施例6(FP-DDCTMA-TAX+D20/1)、实施例5(FP-DDCTMA-TAX20/1)、实施例3(FP-DDCTMA-TAX100/1)、实施例1(FP-DDCTMA-TAX200/1)制备得到的复合载体的细胞凋亡检测结果。结果表明：加入复合载体的板孔中的癌细胞凋亡数量明显多于对照组中的细胞凋亡，直观定性说明此复合载体确实可用于药物控释，明显促进癌细胞凋亡。

②FAM标记siRNA转染实验

将NCI-H460细胞(人大细胞肺癌细胞)种植于24孔细胞培养板中，每孔加入500μl约含6×10⁴个细胞，在含血清和双抗的RPMI1640培养液中培养，转染时细胞密度达到80～90%，移去生长培养基，用等量(500μl)RPMI1640(无血清)培养基清洗，再用400μl RPMI1640(无血清)培养基替换。

按照实施例6制备复合载体，其中的siRNA用5’-6FAM suvivin siRNA，将复合载体稀释液100μl依次加入24孔培养板中(每孔含siRNA为0.6μg)，轻轻摇匀，并设有裸5’-6FAM suvivin siRNA、鱼精蛋白压缩的5’-6FAM suvivin siRNA和Lipofectamine2000作为对照组，置于37℃，5%CO₂培养6h。取出24孔细胞培养板用PBS(500μl/孔)洗2次，在荧光显微镜下快速观察并拍照。

由于6FAM是一种绿色荧光基团，由蓝光激发，只有成功转染的细胞才能看到6FAM绿色荧光，故在荧光显微镜下可以观察到复合载体中标记的siRNA的转染效果。

实验结果如图7，其中图A1-A6依次是紫杉醇脂质体与制备的压缩6FAM-siRNA质量比为1/1、2/1、3/1、4/1、6/1、8/1的复合载体的转染效果图；图B1-B3为对照组，图B1为裸6FAM-siRNA的转染效果图，由图可知裸siRNA几乎没有转染能力；图B2为鱼精蛋白压缩的6FAM-siRNA的转染效果图，与裸6FAM-siRNA相比转染率稍有增加；图B3为Lipofectamine2000与未经压缩的6FAM-siRNA质量比为3/1的转染效果；对比图7中所有结果，直观分析可知，图A3的复合载体即紫杉醇脂质体与制备的压缩6FAM-siRNA质量比为3/1时6FAM标记siRNA转染效果比商品化试剂Lipofectamine2000的转染率要高；图A4中即紫杉醇脂质体与6FAM-siRNA质量依次为4/1时与Lipofectamine2000的转染率相当。由此可见，本研究中构建的复合载体确实有效的提高了载体对siRNA的转染效率，具有进一步开发的实际应用价值。

③毒性研究(MTT比色法)

将A549(人类肺腺癌细胞)细胞种植于96孔细胞培养板中，每孔种植1.5×10⁵个细胞，RPMI1640培养液总体积100μl。将细胞放置在37℃，5%CO₂孵育16～24h，细胞密度约80～90%。移去生长培养基，用等量(100μl)RPMI1640(无血清)培养基清洗，再用50μl RPMI1640(无血清)培养基替换。

按实施例1～8制备复合载体，将各复合载体稀释液50μl分别加入96孔细胞培养板孔中，轻轻摇匀，并设有阴性空白对照，以及空白脂质体和Lipofectamine2000作为阳性对照组，置于37℃，5%CO₂孵育24h。每孔细胞中加入20μlMTT(Sigma,5mg/ml)，37℃，5%CO₂孵育培养4h。小心弃去所有培养液，晾干，加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，将96孔细胞培养板放入SUNRISE酶标仪中设置震荡10min，使结晶物溶解，然后继续在SUNRISE酶标仪中测定各孔在570nm处的吸光值，读出原始数据。

基于MTT比色法的检测原理为：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在570nm波长处测定其吸光值，可间接反映活细胞数量。故此，以空白对照(未转染细胞)的吸光值为100%，计算转染后细胞存活的百分率(%)。计算公式为：

细胞存活率(%)=[A]_样品/[A]_对照×100%

[A]_样品为测试孔的吸光值，[A]_对照为阴性空白对照孔的吸光值。

实验结果如图8～9，图8中横坐标为加入的本发明复合载体，复合载体中紫杉醇脂质体与压缩siRNA的质量比为4/1。图9中横坐标为复合载体制备过程中采用的阳离子类脂与紫杉醇的质量比；不同棒图分别表示本发明实施例制备的复合载体，其具体名称中括号内的参数表示复合载体中紫杉醇脂质体与压缩siRNA的质量比。由图8～9可知，在载体（紫杉醇脂质体）/siRNA=4/1时，本发明的复合载体、空白脂质体和Lipofectamine2000作用于A549细胞后其细胞存活率相当(对细胞的毒性相当)，大约在70%～80%左右；不考虑复合载体包裹转运的药物紫杉醇存在促使细胞凋亡的影响，实验结果表明，细胞存活率大约在50%～110%范围内，分析结果表明：随着脂质体在复合载体中所占质量比例的增加，对癌细胞的毒性也在增高；其中分析图9可知，紫杉醇脂质体/siRNA=8/1时毒性明显较高，随着复合载体中脂药比（阳离子类脂与紫杉醇）的减小(药物浓度的增加)或复合载体质量的增加，细胞存活率逐渐下降。优选比例紫杉醇脂质体/siRNA=4/1在各复合载体条件下细胞存活率均在可接受范围内，约为：50%～90%，多数集中在70%～85%。其中部分比例的复合载体的毒性明显低于对照的商品化试剂Lipofectamine2000，具有实际应用价值。

Claims (10)

1.一种复合载体，其组成包括由阳离子类脂和脂溶性药物构成的药物脂质体和压缩的siRNA，其中所述阳离子类脂与脂溶性药物的质量比为200∶1～1∶1，所述药物脂质体和压缩siRNA的质量比为20∶1～0.5∶1。

2.根据权利要求1所述的复合载体，其特征在于，所述阳离子类脂为氨基甲酸酯型阳离子类脂。

3.根据权利要求2所述的复合载体，其特征在于，所述氨基甲酸酯型阳离子类脂具有通式I的结构：

其中：

X^-选自F^-、Cl^-、Br^-、I^-、H₂PO₄ ^-、HCO₃ ^-、NO₃ ^-、HSO₃ ^-、CH₃COO^-、葡萄糖酸根、葡萄糖醛酸根、半乳糖酸根、半乳糖醛酸根、丙酸根和甲磺酸根；

R₁选自C_1-20烷基、十八烯基和胆固醇基；

R₂选自C_1-6烷基、C_1-6羟烷基、葡萄糖基、半乳糖基、甘露糖基和叶酸酯基。

4.根据权利要求1所述的复合载体，其特征在于，所述脂溶性药物为抗癌药物。

5.根据权利要求4所述的复合载体，其特征在于，所述抗癌药物为紫杉醇、白藜芦醇、β-榄香烯、冬凌草甲素。

6.根据权利要求1所述的复合载体，其特征在于，所述压缩siRNA是siRNA中加入阳离子多聚体和带负电荷的辅助压缩物压缩而成，其中所述阳离子多聚体与siRNA的质量比为0.25∶1～5∶1。

7.根据权利要求6所述的复合载体，其特征在于，所述阳离子多聚体为聚偶磷氮、阳离子多肽、多聚氨基酯或多聚氨基磷酸酯；所述带负电荷的辅助压缩物为糖胺聚糖、质粒DNA或0.4～200kbpDNA分子。

8.权利要求1所述的复合载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

①按配比将阳离子类脂和脂溶性药物在脂溶性有机溶剂中混合，超声震荡溶解后，氮气吹膜，真空干燥过夜，加入45～55℃超纯水并在45～55℃下水浴2～3h，在55℃反复超声震荡至澄清，制得药物脂质体；

②将步骤①得到的药物脂质体与压缩siRNA按配比混合，漩涡震荡混匀，室温孵育15～20min，得到复合载体。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤②的复合载体进行PEG化长循环修饰和/或叶酸靶向性修饰。

10.权利要求1～7的任一项所述的复合载体在制备抗癌药物中的应用或在输送抗癌药物和肿瘤治疗基因中的应用。

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