RU2628807C2

RU2628807C2 - Технология изготовления макромолекулярных микросфер

Info

Publication number: RU2628807C2
Application number: RU2012131203A
Authority: RU
Inventors: Фанг ФАНГ; Майкл П. МАЛАХОВ
Original assignee: Ансун Биофарма, Инк.
Priority date: 2006-01-24
Filing date: 2012-07-11
Publication date: 2017-08-22
Also published as: US20120116062A1; US8623419B2; KR102109867B1; JP5457680B2; CN101404980A; CN104758253A; RU2008134282A; WO2007114881A1; IL193001A0; US20180071219A1; BRPI0706947B8; CA2639925C; KR20170091184A; US10583086B2; JP2013064010A; US20150290134A1; BRPI0706947A8; AU2007233349A1; KR20080090525A; KR102180849B1

Abstract

Группа изобретений относится к медицине и касается композиции микрочастиц, включающих сиалидазный слитый белок и сульфат магния или сульфат натрия. Группа изобретений также касается композиции микрочастиц, содержащих сиалидазный слитый белок, полученной способом, включающим добавление противоиона, выбранного из цитрата натрия, сульфата натрия, сульфата кальция, сульфата калия и сульфата магния, к водному раствору, содержащему слитый белок, добавление органического растворителя, выбранного из метанола, этанола, 1-пропанола, изопропанола, трет-бутилового спирта и бутанола, к данному раствору и постепенное охлаждение раствора до температуры ниже 25°С; и касается способа лечения гриппа или парагриппа, включающего введение пациенту указанных композиций. Группа изобретений обеспечивает эффективную доставку активного вещества в дыхательные пути и стабильность в течение длительного времени. 3 н. и 32 з.п. ф-лы, 12 табл., 12 пр.

Description

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Преимущество приоритета заявлено в отношении предварительной заявки США №60/762002, поданной 24 января 2006 г. под названием "Технология изготовления макромолекулярных микросфер". Там, где допустимо, эта заявка включена во всей своей полноте посредством ссылки.

Кроме того, данная заявка является родственной заявке США с серийным №11/657812 (дело патентного поверенного №21865-004001/6504, поданное 24 января 2007 г.). Данная заявка также является родственной публикациям США №№ US 20050004020 A1 и US 20050112751 A1. Там, где допустимо, каждая из этих заявок включена во всей своей полноте посредством ссылки.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Введение белков животным, в том числе людям, в пищевых добавках или в качестве терапевтических средств уже известно в течение некоторого времени. Белки для терапевтического введения или введения с пищей обычно доступны либо в виде (1) концентратов или порошков, которые вводят непосредственно или разводят в выбранной жидкости перед применением; или (2) жидких препаратов.

Изготовление и доставка полезных терапевтических белков в форме порошка или частиц находится в сфере усиленной исследовательской и опытно-конструкторской деятельности в фармацевтической промышленности. Что касается терапевтической эффективности, то желательно иметь однородный препарат. Например, для введения в легкие, в идеальном случае белок получен в форме дискретных микросфер, представляющих собой твердые или полутвердые частицы с диаметром от 0,5 до 5,0 микрона. Также желательно, чтобы частицы имели как можно более высокое содержание белка и сохраняли свою активность для концентрированной доставки и терапевтической эффективности.

Предшествующие способы получения белковых микрочастиц или наночастиц включали такие сложные стадии, как смешивание с органическими полимерами и/или образование решетчатой матрицы с полимерами; распылительная сушка, распылительная сублимационная сушка или методы с использованием сверхкритических жидких антирастворителей, в которых используют специальное и сложное оборудование; или лиофилизация с последующим измельчением или размалыванием, которая часто приводит к получению неоднородных частиц, подлежащих дополнительной сортировке. Часто предшествующие способы изготовления твердых белковых препаратов включают такие стадии обработки, как нагревание, которое приводит к денатурации белка и нарушает его активность. Кроме того, некоторые способы не обеспечивают максимального извлечения из раствора в твердый препарат.

Соответственно, существует необходимость в способе получения белковых и других макромолекулярных микрочастиц, который не требует сложного или специального оборудования и который дает однородные по размеру микрочастицы для доставки. Кроме того, существует необходимость в способе получения микрочастиц, которые содержат высокие концентрации белка или макромолекул относительно других компонентов, которые стабильны и сохраняют свою активность в течение длительных периодов времени при их хранении при температуре окружающей среды и которые не содержат значительного количества денатурированного белка. Также существует необходимость в способе получения микрочастиц белков и других макромолекул, в которых по существу весь белок или макромолекула в исходном веществе переходит в препарат микрочастиц с минимальной потерей. Также существует необходимость в микрочастицах белков или других макромолекул, имеющих указанные свойства, для введения, например, в виде терапевтического средства или пищевой добавки.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении предложены способы получения белковых и других макромолекулярных микрочастиц, которые не требуют сложного или специального оборудования и в которых дают однородные по размеру микрочастицы для доставки; способы получения микрочастиц, которые содержат высокие концентрации белка или макромолекул относительно других компонентов, которые стабильны и сохраняют свою активность в течение длительных периодов времени при хранении их при температуре окружающей среды и которые не содержат значительного количества денатурированного белка. Также предложены способы получения микрочастиц белков и других макромолекул, где по существу весь белок или макромолекула в исходном веществе переходит в препарат микрочастиц с минимальной потерей. Также предложены микрочастицы белков и других макромолекул, обладающих указанными свойствами, для введения, например, в виде терапевтического средства или пищевой добавки.

Способы изготовления композиции на основе белка, сами композиции на основе белка, комбинации и изделия, предложенные ниже, характеризуются различными ингредиентами, стадиями изготовления и биофизическими, физическими, биохимическими и химическими параметрами. Как будет очевидно специалисту в данной области техники, композиции и способы, предложенные в данном изобретении, включают любые и все изменения и комбинации ингредиентов, стадии и/или параметры, описанные ниже.

В данном изобретении предложены способы изготовления композиции на основе белка. Способ, предложенный в данном изобретении, может быть использован для изготовления композиций из других макромолекул помимо белков, включая ДНК, РНК, ПНК (пептидонуклеиновая кислота), липиды, олигосахариды и их комбинации.

Способы, предложенные в данном изобретении, могут включать стадии:

а) добавления противоиона к раствору, содержащему белок в водном растворителе;

б) добавления органического растворителя к данному раствору; и

в) постепенного охлаждения раствора до температуры ниже примерно 25°C, в результате чего образуется композиция, содержащая микрочастицы, содержащие белок, где стадии (а), (б) и (в) осуществляют одновременно, последовательно, с перерывами или в любом порядке.

В одном воплощении стадии осуществляют последовательно (а), (б) и затем (в). В другом воплощении способ изготовления композиции на основе белка включает осуществление стадий (а) и (б) одновременно или последовательно в любом порядке с последующим осуществлением стадии (в).

Образующиеся микрочастицы могут быть получены путем осаждения, разделения фаз или образования коллоида. В некоторых аспектах способы, предложенные в данном изобретении, также включают отделение микрочастиц от раствора для удаления компонентов, не являющихся микрочастицами. Эта стадия разделения может быть осуществлена после вышеупомянутой стадии (в). Разделение может быть осуществлено, например, посредством седиментации, фильтрации и/или сублимационной сушки.

Способы, предложенные в данном изобретении, включают добавление органического растворителя к водному растворителю, содержащему белок. В некоторых воплощениях органический растворитель смешивается или частично смешивается с водным растворителем. В других воплощениях способов, предложенных в данном изобретении, органический растворитель выбран из алифатических спиртов, ароматических спиртов, хлороформа, диметилхлорида, многоатомных сахарных спиртов, ароматических углеводородов, альдегидов, кетонов, сложных эфиров, простых эфиров, диоксанов, алканов, алкенов, конъюгированных диенов, дихлорметана, ацетонитрила, этилацетата, полиолов, полиимидов, полимеров сложных эфиров, полиальдегидов и их смесей. Например, если органический растворитель представляет собой алифатический спирт, то он может представлять собой изопропанол. В способах, предложенных в данном изобретении, количество добавленного органического растворителя может варьировать. Например, количество добавленного органического растворителя может составлять от примерно 0,1% или 0,1% до примерно 50% или 50% (об./об.). В других воплощениях количество добавленного органического растворителя составляет от примерно 1% или 1% до примерно 30% или 30% (об./об.), от примерно 5% или 5% до примерно 30% или 30% (об./об.), от примерно 10% или 10% до примерно 30% или 30% (об./об.) или от примерно 15% или 15% до примерно 20% или 20% (об./об.).

Противоион, используемый в способах, предложенных в данном изобретении, может представлять собой анионное соединение, катионное соединение и/или цвиттерионное соединение. Например, если противоион представляет собой анионное соединение, то он может быть глицином, цитратом натрия, сульфатом натрия, сульфатом цинка, сульфатом магния, сульфатом калия или сульфатом кальция. В способах, предложенных в данном изобретении, концентрация органического растворителя, добавленного к раствору, может варьировать. Например, концентрация противоиона, добавленного к раствору, может составлять от примерно 0,1 мМ или 0,1 мМ до примерно 100 мМ или 100 мМ. В других воплощениях концентрация противоиона, добавленного к раствору, составляет от примерно 0,2 мМ или 0,2 мМ до примерно 50 мМ или 50 мМ, от примерно 0,3 мМ или 0,3 мМ до примерно 30 мМ или 30 мМ, от примерно 0,5 мМ или 0,5 мМ до примерно 20 мМ или 20 мМ, или от примерно 1 мМ или 1 мМ до примерно 10 мМ или 10 мМ. В конкретном воплощении концентрация противоиона, добавленного к раствору, составляет примерно 5 мМ или 5 мМ.

В одном из аспектов способов, предложенных в данном изобретении, pH раствора, содержащего белок, равен или ниже pI белка. В некоторых аспектах pH раствора составляет от примерно 4,0 или 4,0 до примерно 9,0 или 9,0. В других аспектах pH раствора составляет от примерно 4,5 или 4,5 до примерно 8,0 или 8,0, от примерно 4,5 или 4,5 до примерно 6,5 или 6,5, или от примерно 4,5 или 4,5 до примерно 5,5 или 5,5.

Белок, который используется в предложенных в данном изобретении способах изготовления композиции на основе белка, может быть выбран из сиалидаз, сиалидазных слитых белков, протеаз, протеазных ингибиторов, цитокинов, инсулина, гормона роста человека, кальцитонина, рекомбинантной ДНКазы человека, интерферонов и паратиреоидного гормона. В одном воплощении, где белок представляет собой протеазный ингибитор, он представляет собой протеазный ингибитор 8 (PI8) человека. В другом воплощении белок представляет собой сиалидазный слитый белок. В некоторых аспектах, где белок представляет собой сиалидазный слитый белок, он содержит каталитический домен сиалидазы и якорный домен, причем каталитический домен сиалидазы в сиалидазном слитом белке является лишь частью сиалидазы. Сиалидаза может представлять собой, например сиалидазу Actinomyces viscosus, сиалидазу Clostridium perfringens, сиалидазу Arthrobacter ureafaciens, сиалидазу Micromonospora viridifeciens, сиалидазу Neu2 человека или сиалидазу Neu4 человека.

В одном из аспектов, где сиалидаза представляет собой сиалидазу Actinomyces viscosus, аминокислотная последовательность каталитического домена содержит последовательность аминокислотных остатков, начиная с любой из аминокислот от аминокислоты 270 до аминокислоты 290 и заканчивая любой аминокислотой от аминокислоты 665 до аминокислоты 901 из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO:1. Например, в одном воплощении последовательность каталитического домена сиалидазы содержит последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:2. В другом воплощении последовательность каталитического домена содержит последовательность аминокислотных остатков, начиная с аминокислоты 274 и заканчивая аминокислотой 681 из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO:1. В другом воплощении последовательность каталитического домена содержит последовательность аминокислотных остатков, начиная с аминокислоты 274 и заканчивая аминокислотой 666 из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO:1. В другом воплощении последовательность каталитического домена содержит последовательность аминокислот, начиная с аминокислоты 290 и заканчивая аминокислотой 681 из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO:1.

В одном из аспектов, где белок, используемый в предложенных в данном изобретении способах изготовления композиции на основе белка, представляет собой сиалидазный слитый белок, который содержит якорный домен, якорный домен представляет собой гликозаминогликан(GAG)-связывающий домен. В другом аспекте GAG-связывающий домен выбран из GAG-связывающего домена тромбоцитарного фактора 4 человека, GAG-связывающего домена интерлейкина 8 человека, GAG-связывающего домена антитромбина III человека, GAG-связывающего домена апопротеина Е человека, GAG-связывающего домена человеческого ангиогенез-ассоциированного белка, участвующего в миграции клеток (angio-associated migratory protein), и GAG-связывающего домена амфирегулина человека. В конкретных воплощениях аминокислотная последовательность GAG-связывающего домена содержит последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8.

В некоторых аспектах, где белок, используемый в предложенных в данном изобретении способах изготовления композиции на основе белка, представляет собой сиалидазный слитый белок, аминокислотная последовательность сиалидазного слитого белка содержит последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:9, последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:10, последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:11, последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:12, последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:13, последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:14, или последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:17.

В одном из аспектов количество белка в микрочастицах, получаемых способами, предложенными в данном изобретении, относительно общего количества белка в растворе со стадии (а) составляет от примерно 80% или 80% до более чем примерно 99% или 99%. В другом аспекте изготовленная композиция микрочастиц, изготовленная способами, предложенными в данном изобретении, также может содержать кислотоустойчивые покрывающие агенты, устойчивые к протеазам покрывающие агенты, энтеросолюбильные покрывающие агенты, наполнители, эксципиенты, неактивные ингредиенты, усилители стабильности, модификаторы вкуса и/или запаха или маскирующие агенты, витамины, терапевтические агенты, антиоксиданты, иммуномодуляторы, модификаторы трансмембранного транспорта, агенты, предотвращающие слеживание, хитозаны или усилители текучести.

Раствор и/или изготовленная композиция в соответствии со способами, предложенными в данном изобретении, в одном из аспектов могут дополнительно содержать активный агент. В некоторых воплощениях активный агент выбран из противодиабетических средств, противосудорожных средств, аналгетиков, противопаркинсонических средств, противовоспалительных средств, антагонистов кальция, анестетиков, противомикробных средств, противомалярийных средств, противопаразитарных средств, антигипертензивных средств, антигистаминов, жаропонижающих средств, альфа-адренергических агонистов, альфа-блокаторов, биоцидов, бактерицидных веществ, бронходилататоров, бета-адренергических блокирующих лекарственных средств, контрацептивов, сердечно-сосудистых лекарственных средств, ингибиторов кальциевых каналов, успокоительных средств, диагностических веществ, диуретиков, электролитов, ферментов, снотворных средств, гормонов, гипогликемических средств, гипергликемических средств, средств, способствующих мышечному сокращению, миорелаксантов, противоопухолевых средств, гликопротеинов, нуклеопротеинов, липопротеинов, офтальмических средств, транквилизаторов, седативных средств, стероидов, симпатомиметиков, парасимпатомиметиков, транквилизаторов, лекарственных средств для лечения мочевых путей, вакцин, вагинальных лекарственных средств, витаминов, минералов, нестероидных противовоспалительных лекарственных средств, ангиотензин-превращающих ферментов, полинуклеотидов, полипептидов и полисахаридов. В другом воплощении активным агентом является пищевая добавка.

Способы, предложенные в данном изобретении, включают постепенное охлаждение раствора до температуры ниже примерно 25°C. В одном воплощении температура составляет от примерно 4°C до примерно -45°C. В другом воплощении температура составляет от примерно 2°C до примерно -20°C. В другом воплощении температура составляет от примерно 2°C до примерно -15°C. В другом воплощении температура лежит в интервале от примерно 0°C или 0°C до примерно -2°C или -2°C и от примерно -15°C или -15°C до примерно -20°C или -20°C. Постепенное охлаждение может быть осуществлено при разнообразных скоростях. Например, охлаждение может быть осуществлено со скоростью от примерно 0,01°C/мин или 0,01°C/мин до примерно 20°C/мин или 20°C/мин. В других воплощениях постепенное охлаждение осуществляется со скоростью от примерно или 0,05°C/мин либо примерно или 0,1°C/мин до примерно или 10°C/мин либо примерно или 15°C/мин, от примерно или 0,2°C/мин до примерно или 5°C/мин, или от примерно или 0,5°C/мин до примерно или 2°C/мин. В конкретном воплощении постепенное охлаждение осуществляется со скоростью примерно или 1°C/мин.

В одном из аспектов размер микрочастиц, изготовленных способами, предложенными в данном изобретении, составляет от примерно 0,001 мкм или 0,001 мкм до примерно 50 мкм или 50 мкм. В других воплощениях размер микрочастиц составляет от примерно 0,3 мкм или 0,3 мкм до примерно 30 мкм или 30 мкм, от примерно 0,5 мкм или 0,5 мкм до примерно 10 мкм или 10 мкм, от примерно 0,5 мкм или 0,5 мкм до примерно 5,0 мкм или 5,0 мкм, от примерно 1,0 мкм или 1,0 мкм до примерно 5,0 мкм или 5,0 мкм, или от примерно 1,0 мкм до примерно 2,0, 3,0, 4,0 или 5,0 мкм.

В некоторых аспектах способов, предложенных в данном изобретении, изготовленная композиция на основе белка имеет срок годности от примерно одной недели до примерно 1 месяца, от примерно 1 месяца до примерно шести месяцев, от примерно шести месяцев до примерно одного года, от примерно 1 года до примерно 2 лет, или от примерно 2 лет до примерно 5 лет при температуре примерно 55°C, 50°C, 45°C, 44°C, 42°C, 40°C, 39°C, 38°C, 37°C или ниже. 54. В другом аспекте содержание влаги в микрочастицах регулируют, в результате чего по меньшей мере примерно 90% активности белка сохраняется после хранения в течение от примерно шести месяцев до примерно 1 года при температуре примерно 25°C. В другом аспекте содержание влаги в микрочастицах регулируют, в результате чего по меньшей мере примерно 90% микрочастиц не агрегирует после хранения в течение от примерно шести месяцев до примерно 1 года при температуре примерно 25°C.

В конкретном аспекте способов, предложенных в данном изобретении, белок представляет собой слитый белок, содержащий каталитический домен сиалидазы и якорный домен, причем каталитический домен сиалидазы является лишь частью сиалидазы в слитом белке, органический растворитель добавлен в количестве от примерно 5% или 5% до примерно 20% или 20% (об./об.), противоион добавлен в количестве от примерно 1 мМ или 1 мМ до примерно 5 мМ или 5 мМ, а pH раствора доведен до величины от примерно 4,5 или 4,5 до примерно 5,5 или 5,5. В одном воплощении этого аспекта каталитический домен сиалидазы происходит из Actinomyces viscosus, и якорный домен представляет собой GAG-связывающий домен амфирегулина человека. Кроме того, pH составляет примерно 5,0 и/или противоион выбран из глицина, цитрата натрия, сульфата натрия, сульфата цинка, сульфата магния, сульфата калия или сульфата кальция. В другом воплощении этого аспекта органический растворитель представляет собой изопропанол. В одном воплощении этого аспекта изготовленная композиция содержит микрочастицы, содержащие белок в качестве единственного активного ингредиента (т.е. состоящие по существу из него). В другом воплощении способ включает отделение микрочастиц от раствора для удаления компонентов, не являющихся микрочастицами, например, седиментацией, фильтрацией и/или сублимационной сушкой.

В некоторых воплощениях этого аспекта содержание влаги в микрочастицах составляет от примерно 6% до примерно 12% или от примерно 7% до примерно 10,5%.

В данном изобретении предложены композиции, содержащие микрочастицы сиалидазы или сиалидазного слитого белка. Если белок представляет собой сиалидазный слитый белок, то он может содержать каталитический домен сиалидазы и якорный домен. В некоторых аспектах сиалидаза в композиции представляет собой сиалидазу Actinomyces viscosus, сиалидазу Clostridium perfringens, сиалидазу Arthrobacter ureafaciens, сиалидазу Micromonospora viridifaciens, сиалидазу Neu2 человека или сиалидазу Neu4 человека.

В одном из аспектов, где сиалидаза в композиции представляет собой сиалидазу Actinomyces viscosus, аминокислотная последовательность каталитического домена содержит последовательность аминокислот, начиная с любого из аминокислотных остатков от аминокислоты 270 до аминокислоты 290 и заканчивая любым из аминокислотных остатков от аминокислоты 665 до аминокислоты 901 из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO:1. Например, последовательность каталитического домена может содержать последовательность аминокислот, начиная с аминокислоты 274 и заканчивая аминокислотой 681 из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO:1, последовательность аминокислот, начиная с аминокислоты 290 и заканчивая аминокислотой 666 из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO:1, или последовательность аминокислот, начиная с аминокислоты 290 и заканчивая аминокислотой 681 из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO:1. В другом воплощении последовательность каталитического домена сиалидазы содержит последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO:2.

В одном из аспектов, где композиция содержит микрочастицы сиалидазного слитого белка, якорный домен сиалидазного слитого белка представляет собой гликозаминогликан(GAG)-связывающий домен. В другом аспекте GAG-связывающий домен выбран из GAG-связывающего домена тромбоцитарного фактора 4 человека, GAG-связывающего домена интерлейкина 8 человека, GAG-связывающего домена антитромбина III человека, GAG-связывающего домена апопротеина Е человека, GAG-связывающего домена человеческого ангиогенез-ассоциированного белка, участвующего в миграции клеток, и GAG-связывающего домена амфирегулина человека. В конкретных воплощениях аминокислотная последовательность GAG-связывающего домена содержит последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8.

Сиалидазные слитые белки композиций, предложенных в данном изобретении, могут содержать, например последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 или SEQ ID NO:17.

Количество белка в микрочастицах композиций, предложенных в данном изобретении, может варьировать. Например, количество белка в микрочастицах может составлять от примерно 60% до более чем примерно 99% (масс./масс.). В одном воплощении количество белка в микрочастицах составляет от примерно 65% до примерно 90% (масс./масс.). В другом воплощении количество белка в микрочастицах составляет от примерно 70% до примерно 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% (масс./масс.). Количество белка в микрочастицах композиций, предложенных в данном изобретении, также может составлять от примерно 90% до примерно 99% (масс./масс.).

Микрочастицы в композициях, предложенных в данном изобретении, также могут содержать кислотоустойчивые покрывающие агенты, устойчивые к протеазам покрывающие агенты, энтеросолюбильные покрывающие агенты, наполнители, эксципиенты, неактивные ингредиенты, усилители стабильности, модификаторы вкуса и/или запаха или маскирующие агенты, витамины, терапевтические агенты, антиоксиданты, иммуномодуляторы, модификаторы трансмембранного транспорта, агенты, предотвращающие слеживание, хитозаны или усилители текучести.

В одном из аспектов композиции, предложенные в данном изобретении, также могут содержать активный агент. Активный агент может представлять собой пищевую добавку, противодиабетические средства, противосудорожные средства, аналгетики, противопаркинсонические средства, противовоспалительные средства, антагонисты кальция, анестетики, противомикробные средства, противомалярийные средства, противопаразитарные средства, антигипертензивные средства, антигистамины, жаропонижающие средства, альфа-адренергические агонисты, альфа-блокаторы, биоциды, бактерицидные вещества, бронходилататоры, бета-адренергические блокирующие лекарственные средства, контрацептивы, сердечно-сосудистые лекарственные средства, ингибиторы кальциевых каналов, успокоительные средства, диагностические вещества, диуретики, электролиты, ферменты, снотворные средства, гормоны, гипогликемические средства, гипергликемические средства, средства, способствующие мышечному сокращению, миорелаксанты, противоопухолевые средства, гликопротеины, нуклеопротеины, липопротеины, офтальмические средства, транквилизаторы, седативные средства, стероиды, симпатомиметические средства, парасимпатомиметические средства, транквилизаторы, лекарственные средства для лечения мочевых путей, вакцины, вагинальные лекарственные средства, витамины, минералы, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, ангиотензин-превращающие ферменты, полинуклеотиды, полипептиды и полисахариды.

Композиции, предложенные в данном изобретении, могут иметь срок годности различной продолжительности. В одном из аспектов срок годности составляет от примерно одной недели до примерно 1 месяца, от примерно 1 месяца до примерно шести месяцев, от примерно шести месяцев до примерно одного года, от примерно 1 года до примерно 2 лет, или от примерно 2 лет до примерно 5 лет при температуре примерно 55°C, 50°C, 45°C, 44°C, 42°C, 40°C, 39°C, 38°C, 37°C или ниже. В конкретном аспекте содержание влаги в микрочастицах регулируют, в результате чего по меньшей мере примерно 90% активности белка сохраняется после хранения в течение от примерно шести месяцев до примерно 1 года при температуре примерно 25°C.

Микрочастицы в композициях, предложенных в данном изобретении, также могут содержать противоион, такой как, например, анион, катион или цвиттерион. В некоторых воплощениях противоион выбран из глицина, цитрата натрия, сульфата натрия, сульфата цинка, сульфата магния, сульфата калия или сульфата кальция. Количество противоиона в микрочастице может варьировать. Например, количество противоиона в микрочастицах может составлять от примерно 0,5% или 0,5% до примерно 5% или 5% (масс./масс.), от примерно 0,5% или 0,5% до примерно 2% или 2% (масс./масс.), или от примерно 1% или 1% до примерно 2% или 2% (масс./масс.).

В некоторых воплощениях содержание влаги в микрочастицах в композициях, предложенных в данном изобретении, составляет от примерно 6% или 6% до примерно 12% или 12%, или от примерно 7% или 7% до примерно 10,5% или 10,5%.

Композиции, предложенные в данном изобретении, могут быть изготовлены в виде препаратов для многих способов введения. Например, композиции могут быть введены перорально, например путем проглатывания, внутривенно, интраназально, парентерально, подкожно или внутримышечно. Композиции также могут быть изготовлены в виде препаратов для легочного или офтальмического введения. В конкретном аспекте композиция, предложенная в данном изобретении, предназначена для ингаляции.

Композиции, предложенные в данном изобретении, могут быть получены в виде таблеток, каплет, гелей, ампул, предварительно заполненных шприцев, ингаляторов, электростатических устройств и других устройств для доставки. Доставляемая дозировка композиций может составлять от примерно 0,5 мг белка на дозу до примерно 100 мг белка на дозу, или примерно 0,75 мг, 1 мг, 1,5 мг, 2 мг, 3 мг, 5 мг, 10 мг, 15 мг, 20 мг, 30 мг, 40 мг, 45 мг, 50 мг, 55 мг или 60 мг белка на дозу. Частота введения дозы, например, для лечения или профилактики гриппа, может составлять от трех или более раз в сутки до двух раз в сутки, до одного раза в сутки, до двух раз в неделю, до одного раза в неделю, до одного раза каждые две недели или реже, чем один раз каждые две недели. В целях профилактики введение обычно может быть осуществлено порядка примерно один раз каждые две недели или с меньшей частотой, как, например, один раз каждые три недели или один раз каждые четыре недели или дольше.

Размер микрочастиц в композициях, предложенных в данном изобретении, может варьировать. Например, размер микрочастиц может составлять от примерно 0,001 мкм или 0,001 мкм до примерно 50 мкм или 50 мкм. В некоторых воплощениях размер микрочастиц составляет от примерно 0,3 мкм или 0,3 мкм до примерно 30 мкм или 30 мкм, от примерно 0,5 мкм или 0,5 мкм до примерно 10 мкм или 10 мкм, от примерно 0,5 мкм или 0,5 мкм до примерно 5,0 мкм или 5,0 мкм, от примерно 1,0 мкм или 1,0 мкм до примерно 5,0 мкм или 5,0 мкм, или от примерно 1,0 мкм до примерно 2,0, 3,0, 4,0 или 5,0 мкм.

Кроме того, в данном изобретении предложены изделия, включающие композицию, содержащую микрочастицы сиалидазы или сиалидазного слитого белка, упаковочный материал для композиции и этикетку, на которой указано, что данная композиция предназначена для терапевтического показания. В одном воплощении терапевтическим показанием является грипп. Изделие также может включать ингалятор для легочного введения композиции. В некоторых воплощениях ингалятор представляет собой сухой порошковый ингалятор, дозирующий ингалятор или электростатическое устройство для доставки.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

А. Определения

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном описании, имеют такое же значение, которое обычно подразумевается специалистом в данной области техники, к которой относится изобретение (я). Все патенты, заявки на патент, опубликованные заявки и публикации, последовательности из Genbank, веб-сайты и другие опубликованные материалы, на которые приведены ссылки во всем описании данного изобретения, если не указано иное, включены посредством ссылки во всей своей полноте. В случае, если имеется множество определений для приведенных в данном описании терминов, доминирующими являются приведенные в данном разделе. Если делается ссылка на URL (определитель местонахождения ресурса) или другой такой идентификатор или адрес, то понятно, что такие идентификаторы могут меняться, а конкретная информация из интернета может приходить и уходить, однако эквивалентную информацию можно найти путем поиска в интернете. Ссылка на нее служит доказательством доступности и публичного распространения такой информации.

Используемый в данном описании термин "макромолекула" применяется для обозначения молекулы, состоящей из двух или более мономерных субъединиц или их производных, которые соединены связью, или любой макромолекулы, которая может образовывать третичную структуру. Макромолекула может представлять собой, например, полинуклеотид, молекулы нуклеиновых кислот, включая ДНК, рНК и пептидонуклеиновую кислоту (ПНК), полипептид, белок, углевод или липид, или их производные или комбинации, например, молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую часть пептидонуклеиновой кислоты или гликопротеин, соответственно. Способы, композиции, комбинации, наборы и изделия, предложенные в данном изобретении, хотя они описаны со ссылкой на белки, могут быть адаптированы для применения с другими макромолекулами, которые определены и предложены в данном изобретении.

Термин "по существу" или "существенный", используемый в данном описании, обычно означает по меньшей мере примерно 60% или 60%, примерно 70% или 70%, либо примерно или ровно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или выше относительно ссылочного соединения, такого как, например, нуклеиновокислотная или белковая последовательность, или первоначального состава объекта. Таким образом, композиция, содержащая микрочастицы, отделенные "по существу" от всех других примесей и/или ингредиентов, включая противоионы, соли и растворители из коктейль-раствора, подразумевает, что по меньшей мере примерно 60% или 60%, примерно 70% или 70%, либо примерно или ровно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более высокие количества примесей и/или реагентов удалены из коктейль-раствора, в котором образуются микрочастицы. Термин "по существу идентичный" или "по существу гомологичный" или "аналогичный" варьирует в контексте понимания специалистами в релевантной области техники и обычно означает идентичность по меньшей мере примерно на 60% или 60%, примерно 70% или 70%, либо примерно или ровно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше.

Термин "состоит по существу из" или "состоящий по существу из", используемый в данном описании, относится к объекту, из которого удалены или от которого отделены по существу все другие компоненты/ингредиенты, не ассоциирующиеся с данным объектом или его свойствами. Таким образом, композиция "состоящая по существу из микрочастиц" означает, что все другие ингредиенты, такие как примеси и растворители, по существу удалены из раствора/суспензии, содержащего/содержащей микрочастицы.

Термин "микрочастица", используемый в данном описании, является взаимозаменяемым с термином "микросфера" и относится к частицам с размером в диапазоне (средняя длина, ширина или диаметр) от примерно или 0,001 микрона (мкм) до примерно или 500 микрон, которые содержат макромолекулу и доставляют интересующий агент, такой как лекарственное средство или пищевая добавка, субъекту. Агент может представлять собой макромолекулу, например, белок, нуклеиновую кислоту, липид или полисахарид, или макромолекула, образующая микрочастицу, может представлять собой носитель для активного агента, такого как лекарственное средство или пищевая добавка. Микрочастицы также могут содержать синтетические макромолекулы, включая полимеры, такие как полиэтиленгликоль (PEG), полимолочная кислота (PLA), сополимер полимолочной и полигликолевой кислот (PLGA), и природные полимеры, такие как альбумин, желатин, хитозан и декстран. "Микрочастицы", которые описаны в данном изобретении, могут состоять и могут быть изготовлены только из одной конкретной природной или синтетической макромолекулы, или из более чем одного типа той же природной или синтетической макромолекулы (например, более чем одного типа белка), или из комбинаций более чем одного другого типа природной или синтетической макромолекулы (например, белка и нуклеиновой кислоты или белка и синтетического полимера).

Кроме того, термин "микрочастица", используемый в данном описании, обычно относится к частице, которая не является твердой формой самого раствора, из которого ее получают, хотя замороженные и/или высушенные частицы раствора, содержащего макромолекулы, также охватываются данным изобретением. Скорее, микрочастица, как использовано в данном описании, обычно представляет собой ансамбль фракции компонентов раствора, включая соли, противоионы, растворители и другие ингредиенты, который образуется в результате процесса, включающего осаждение, седиментацию, разделение фаз и образование коллоида, но не ограничивается этим.

Термин "осаждение", используемый в данном описании, относится к процессу, в результате которого интересующее растворенное вещество или растворенные вещества в растворе, такие как компоненты микрочастицы, больше не остаются в растворе, а образуют фазу, которая отделена от растворителя или растворителей, используемых для образования раствора. Осаждение микрочастицы и регулирование размера осажденной микрочастицы может быть осуществлено различными способами, включая, но не ограничиваясь этим, регулирование температуры, ионной силы, pH, диэлектрической постоянной, концентрации противоиона, концентрации органического растворителя, добавление полиэлектролитов или полимеров, поверхностно-активных веществ, детергентов или их комбинаций.

Термин "разделение фаз", используемый в данном описании, относится к превращению одной гомогенной фазы, такой как раствор, в две или более фаз, такой как суспензия твердых частиц в растворителе или растворе.

Термин "седиментация", используемый в данном описании, относится к движению частиц, таких как микрочастицы, которые находятся в суспензии в жидкости или которые образуются в растворе в ответ на внешнюю силу, такую как сила тяжести, центробежная сила или сила электрического поля.

Термин "раствор" используется в данном описании взаимозаменяемо с термином "коктейль-раствор" и относится к гомогенной смеси двух или более ингредиентов в одной фазе, твердой, жидкой или газообразной, в которой отдельные ингредиенты распознаются только на молекулярном уровне. Раствор может представлять собой жидкость, в которой одно или более растворенных веществ, таких как соли, растворены в таком растворителе, как вода или спирт, или растворены в смеси смешивающихся растворителей, такой как смесь воды и этилового спирта. Кроме того, раствор может представлять собой замороженную форму жидкого раствора.

Термин "смешивающийся", используемый в данном описании, относится к способности одного или более компонентов, таких как жидкости, твердые вещества и газы, смешиваться друг с другом с образованием одной гомогенной фазы. Таким образом, две жидкости являются смешивающимися, если они могут быть смешаны с образованием одной гомогенной жидкости, отдельные компоненты которой распознаются только на молекулярном уровне. Если компоненты являются "частично смешивающимися", это означает, что они могут быть смешаны с образованием одной гомогенной фазы в определенном диапазоне концентраций, но не в других диапазонах концентраций. Как использовано в данном описании, если растворитель является "частично смешивающимся" с другим растворителем, это означает, что он смешивается в концентрации примерно или 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% или ниже (объем/объем (об./об.)) при смешивании с другим растворителем.

Как использовано в данном описании, "несмешивающийся" означает, что когда смешиваются два или более компонентов, таких как жидкости, твердые вещества или газы, они образуют более чем одну фазу. Например, когда органический растворитель не смешивается с водным растворителем (например, гексан и вода), тогда органический растворитель заметен в виде отдельного слоя, который не смешивается со слоем водного растворителя.

Используемый в данном описании термин "полипептид" означает по меньшей мере две аминокислоты или два аминокислотных производных, включая аминокислоты с измененной массой и аналоги аминокислот, которые связаны пептидной связью, которая может представлять собой модифицированную пептидную связь. Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются в данном описании по существу как синонимы, хотя среднему специалисту будет известно, что пептиды обычно содержат от менее, чем примерно пятидесяти до примерно одной сотни аминокислотных остатков, и что белки часто получены из природного источника и могут содержать, например, посттрансляционные модификации.

Полипептид или белок может транслироваться с полинуклеотида, который может включать по меньшей мере часть кодирующей последовательности или часть нуклеотидной последовательности, которая не транслируется в природе вследствие того, например, что она локализована в рамке считывания, отличной от кодирующей рамки, или она является интронной последовательностью, 3'- или 5'-нетранслируемой последовательностью, регуляторной последовательностью, такой как промотор или тому подобное. Полипептид также может быть синтезирован химически и может быть модифицирован с использованием химических или ферментативных методов после трансляции или химического синтеза. Полипептид может быть посттрансляционно модифицирован в результате фосфорилирования (фосфопротеины), гликозилирования (гликопротеины, протеогликаны) и тому подобного, что может быть осуществлено в клетке или в реакции in vitro.

Используемый в данном описании термин "слитый белок" относится к белку, представляющему собой конъюгат доменов, полученных из более чем одного белка или полипептида. Домен может представлять собой полипептидную метку (tag), такую как метка HiS₆. Конъюгаты могут быть получены путем соединения доменов в результате химического конъюгирования, технологии рекомбинантной ДНК или комбинаций рекомбинантной экспрессии и химического конъюгирования.

Специалистам в данной области известно множество химических линкеров, и они включают, но не ограничиваются этим, аминокислотные и пептидные мостики, обычно содержащие от одной до примерно 60 аминокислот, типично от примерно 10 до 30 аминокислот, гетеробифункциональные расщепляемые перекрестные линкеры, включая, но не ограничиваясь этим, N-сукцинимидил-(4-йодацетил)аминобензоат, сульфосукцинимидил-(4-йодацетил)аминобензоат, 4-сукцинимидил-оксикарбонил-а-(2-пиридилдитио)толуол, сульфосукцинимидил-6-[а-метил-а-(пиридилдитиол)толуамидо]гексаноат, N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат, сукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)-пропионамидо]гексаноат, сульфосукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)-пропионамидо]гексаноат, 3-(2-пиридилдитио)пропионилгидразид, реагент Эллмана, дихлортриазиновую кислоту и S-(2-тиопиридил)-L-цистеин.

Термин "сиалидазный слитый белок", используемый в данном описании, относится к слитому белку, в котором один или более чем один домен представляет собой сиалидазу или ее часть, сохраняющую по меньшей мере примерно 60% или 60%, примерно 70% или 70%, или примерно или 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более своей каталитической активности. Сиалидазный слитый белок, как использовано в данном описании, также может относиться к слитому белку, который содержит белок или полипептид, по существу гомологичный сиалидазе и обладающий ферментативной активностью сиалидазы.

Термин "каталитический домен" белка, как использовано в данном описании, относится к белку или полипептиду, в котором только часть последовательности, которая по существу гомологична сиалидазе, представляет собой последовательность аминокислотных остатков, включающую домен, ответственный за каталитическую активность белка (например, остатки 274-666 в SEQ ID NO:1 идентифицированы как каталитический домен сиалидазы Actinomyces viscosus), или его каталитически активные фрагменты. Каталитический домен или его каталитически активный фрагмент сохраняет по меньшей мере примерно 60% или 60%, примерно 70% или 70%, или примерно или 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более каталитической активности белка.

Используемый в данном описании термин "характеристика текучести" относится к свойству, которое отражает способность "течь", при этом "текучесть" является свойством, позволяющим веществу выливаться и принимать форму контейнера, в который его выливают, без затруднений вследствие, например, агрегации. Жидкости обычно обладают свойством "текучести", что обычно отражает их деформируемость, т.е. они могут изменять свою форму. Термин "жидкость", используемый в данном описании, охватывает коллоиды, содержащие жидкости, включая эмульсии, аэрозоли и газы. Жидкости, аэрозоли и газы с суспензиями твердых частиц, таких как микрочастицы, также считаются "жидкостью", как определено в данном описании.

Как использовано в данном описании, эмульсию определят как коллоид двух несмешивающихся жидкостей, первой жидкости и второй жидкости, где первая жидкость диспергирована во второй жидкости.

Как использовано в данном описании, поверхностно-активные вещества (или "поверхностно-активные агенты") представляют собой структуры химического или естественного происхождения, которые при растворении в водном растворе уменьшают поверхностное натяжение раствора или межфазное натяжение между двумя или более фазами в растворе. Молекулы поверхностно-активного вещества обычно являются амфифильными и содержат гидрофильные головные группы и гидрофобные хвосты. Молекулы поверхностно-активного вещества могут действовать в качестве стабилизаторов и/или улучшать характеристики текучести микрочастиц, предложенных в данном изобретении.

Как использовано в данном описании, комбинация относится к любой ассоциации двух или более объектов с полезной целью. Например, комбинация микрочастиц и ингалятора может быть использована для легочной доставки терапевтического агента.

Как использовано в данном описании, композиция относится к любой смеси. Она может представлять собой раствор, суспензию, жидкость, порошок, пасту, водную, неводную или любую их комбинацию.

Как использовано в данном описании, набор относится к комбинации, в которой компоненты упакованы возможно с инструкциями по применению и/или реагентами и устройством для применения с данной комбинацией.

Как использовано в данном описании, термин "фермент" означает белок, катализирующий химическую реакцию или биологический процесс. Ферменты обычно облегчают и/или ускоряют такие реакции и процессы. Кроме того, ферменты обычно обладают специфичностью к конкретным реакции или процессу, превращая конкретный набор реагентов в конкретные продукты.

Используемый в данном описании термин "коллоид" относится к дисперсии твердых частиц, таких как микрочастицы, в жидкости, такой как раствор, в котором образуются микрочастицы. Термин "стабильность коллоида" относится к коллоиду, в котором частицы по существу не агрегированы. Например, стабильный коллоид представляет собой коллоид, в котором примерно 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% или меньше твердых частиц, таких как микрочастицы, образовали агрегаты.

Термин "агломераты" относится к ассоциации одной или более частиц, таких как микросферы, слабо удерживаемых друг с другом за счет ван-дер-ваальсовых сил, или поверхностного натяжения, или электростатических сил, или их комбинаций. В некоторых случаях ассоциации, удерживаемые электростатическими силами, могут быть определены как "флокуляты". Для задач данного изобретения термин "агломераты" также охватывает "флокуляты". Обычно агломераты могут легко разрушаться под действием сил сдвига в воздухе или жидкости. Термин "диспергировать" или "дисперсность" относится к способности частиц "течь", т.е. к степени, с которой движение не затруднено присутствием, например, агрегатов.

Термин "агрегаты" относится к ассоциации одной или более частиц, таких как микросферы, аморфные осажденные вещества, кристалло- или стеклоподобные частицы или их комбинации. Обычно агрегаты нелегко разрушить, что подавляет их способность диспергировать или образовывать гомогенные суспензии или образовывать аэрозоли с желаемыми свойствами.

Термин "неденатурированный", используемый в данном описании, приведен со ссылкой на белки и обозначает конформацию белка, т.е. его вторичную структуру, третичную структуру, четвертичную структуру или их комбинации, которые по существу не отличаются от белка в его природном состоянии. Термины "неденатурированный" и "нативный" используются в данном описании взаимозаменяемо и означают белок, который сохраняет всю или по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% своей длины и/или природной конформации. Термины "неденатурированный" или "нативный", которые используются в данном описании взаимозаменяемо, включают природное состояние белка в клетке, такое как его длина и конформация, включающую вторичную, третичную и четвертичную структуры. Как определено в данном описании, "неденатурированные" или "нативные" белки, в том числе белки в композициях, предложенных в данном изобретении, обычно сохраняют всю или по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% нормальной активности или функции белков в их природном состоянии, например, в качестве питательного вещества, обеспечивающего аминокислотные строительные блоки, антиоксиданта, фермента, антитела, регулятора генной экспрессии, каркаса и т.д.

Используемые в данном описании термины "активность" или "функция" являются взаимозаменяемыми с термином "биологическая активность" и относятся к активностям in vivo соединения, такого как белок, витамин, минеральное или лекарственное средство, или физиологическим ответам, которые являются результатом введения in vivo соединения, композиции или другой смеси. Таким образом, термин "активность" охватывает терапевтические эффекты и фармацевтическую активность соединений, композиций и смесей. Биологические активности также можно наблюдать в системах in vitro, созданных для тестирования или применения таких активностей.

Как использовано в данном описании, "функциональная активность" также является взаимозаменяемой с "активностью", "биологической активностью" или "функцией" и относится к полипептиду или его участку, который демонстрирует одну или более активностей, ассоциированных с нативным или неденатурированным белком. Функциональные активности включают, но не ограничиваются этим, биологическую активность, каталитическую или ферментативную активность, антигенность (способность связываться с полипептидом или конкурировать с ним за связывание с антителом к полипептиду), иммуногенность, способность образовывать мультимеры и способность специфически связываться с рецептором или лигандом к данному полипептиду.

Термин "денатурированный", используемый в данном описании, относится к белку, который отличается от его нативной или неденатурированной конформации, т.е. его вторичной, третичной или четвертичной структуры или их комбинаций. Обычно измененная конформация возникает в результате стадий процесса, которые включают пастеризацию, облучение, нагревание, химические реагенты, действие ферментов, воздействие кислот или щелочей и ионный обмен и любые их комбинации. Денатурация белка обычно приводит к ухудшению всех или некоторых, обычно более чем на 50% и по меньшей мере примерно на 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% исходных свойств, включая активность и функцию белка в его нативном или неденатурированном состоянии.

Используемый в данном описании термин "пищевая добавка" означает вещество или композицию, которые предоставляют питательные вещества, включая витамины, минералы, жирные кислоты, аминокислоты, углеводы, ферменты, белки, биохимические реагенты и их метаболиты, травы и другие растения, реципиенту, такому как животное, включая человека. Питательные вещества, доставляемые реципиенту с помощью пищевых добавок, могут включать питательные вещества, необходимые для жизнедеятельности, хорошего здоровья, лечения заболевания или предупреждения заболевания, которые отсутствуют или которых недостаточно в питании реципиента, и питательные вещества, которые, как считают, улучшают здоровье, предотвращают заболевание или лечат заболевание, но не рассматриваются в качестве необходимых для жизнедеятельности или хорошего здоровья.

Как использовано в данном описании, "гидрофобный" относится к веществу, которое не является заряженным или поляризованным за счет заряда, или не является достаточно заряженным или поляризованным за счет заряда для того, чтобы образовывать связи с водой или другими полярными растворителями. Гидрофобные лиганды могут образовывать ассоциаты друг с другом или с другими неполярными молекулами или растворителями в присутствии воды или полярного растворителя посредством гидрофобных взаимодействий. Кроме того, обычно гидрофобный лиганд более растворим в неполярных растворителях, чем в полярных растворителях. Примеры неполярных растворителей включают алканы, такие как гексан, простые алкиловые эфиры, такие как диэтиловый эфир, ароматические углеводороды, такие как бензол, и алкилгалогениды, такие как метиленхлорид и четыреххлористый углерод, моно-, ди- и триглицериды, жирные кислоты, такие как олеиновая, линолевая, пальмитиновая, стеариновая, их конъюгированные формы и их сложные эфиры.

Используемый в данном описании термин "терапевтический агент" означает агент, который после введения реципиенту, в том числе людям, эффективно улучшает или устраняет симптомы или проявления наследственного или приобретенного заболевания или который излечивает указанное заболевание.

Как использовано в данном описании, термин "срок годности" или "стабильность" относится к промежутку времени после изготовления композиции микрочастиц, в течение которого композиция сохраняет по меньшей мере примерно или 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%о или 99% исходной активности белка, присутствующей в композиции, и другие общие физические характеристики микросфер, такие как размер, форма и распределение частиц по их аэродинамическим размерам. Так, например, композиция, которая стабильна в течение или имеет срок годности 30 суток при комнатной температуре, определенной в данном описании как диапазон от примерно 18°C до примерно 25°C, 26°C, 27°C или 28°C, будет иметь по меньшей мере примерно 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% исходной активности белка, присутствующего в композиции, через 30 суток после хранения при температуре от 18°C до примерно 25°C, 26°C, 27°C или 28°C. Срок годности композиций микрочастиц, предложенных в данном изобретении, обычно составляет по меньшей мере примерно 10 суток при 55°C, по меньшей мере примерно 2-3 недели при 42°C и по меньшей мере примерно восемь месяцев или больше при 25°C, однако в данном изобретении рассматриваются композиции микрочастиц с любой продолжительностью срока годности при любой температуре, которые получены способами, предложенными в данном изобретении.

Как использовано в данном описании, "биологически активный агент", "активный агент", "биологический агент" или "агент" представляет собой любое вещество, которое при введении в организм вызывает желаемый биологический ответ, такой как изменение функции организма на клеточном, тканевом или органном уровне и/или изменение внешнего вида, например массы и формы тела. Такое вещество может представлять собой любой синтетический или природный элемент или соединение, белок, клетку или ткань, включая фармацевтическое средство, лекарственное средство, терапевтическое средство, пищевую добавку, травянистое растение, гормон или тому подобное или любые их комбинации. Данные термины также охватывают фармацевтически приемлемые фармакологически активные производные этих активных агентов, конкретно упомянутых в данном описании, включая, но не ограничиваясь этим, соли, сложные эфиры, амиды, пролекарства, активные метаболиты, изомеры, фрагменты, аналоги и тому подобное. Когда используют термины "биологически активный агент", "биологический агент" и "агент" или когда специально идентифицируют конкретный активный агент, то подразумевается, что они включают активный агент сам по себе, а также фармацевтически приемлемые, фармакологически активные соли, сложные эфиры, амиды, пролекарства, активные метаболиты, изомеры, фрагменты и аналоги.

Как использовано в данном описании, "субъект" определяют как животное, включая млекопитающее, типично человека.

Как использовано в данном описании, "терапевтически эффективное количество" относится к количеству активного агента для желаемого терапевтического, профилактического или другого биологического эффекта или ответа, когда композиция введена субъекту в стандартной лекарственной форме. Конкретное количество активного агента в дозировке будет широко варьировать в соответствии с такими условиями, как природа активного агента, природа состояния, которое лечат, возраст и размер субъекта. Как использовано в данном описании, "фармацевтически приемлемые производные" соединения включают их соли, сложные эфиры, простые енольные эфиры, сложные енольные эфиры, кислоты, основания, сольваты, гидраты или пролекарства. Такие производные могут быть легко получены специалистами в данной области техники с использованием известных способов получения таких производных. Полученные соединения могут быть введены животным или людям без существенных токсических эффектов и являются либо фармацевтически активными, либо представляют собой пролекарства. Фармацевтически приемлемые соли включают, но не ограничиваются этим, соли аминов, таких как, но не ограничиваясь этим, N,N'-дибензилэтилендиамин, хлорпрокаин, холин, аммиак, диэтаноламин и другие гидроксиалкиламины, этилендиамин, N-метилглюкамин, прокаин, N-бензилфенетиламин, 1-пара-хлорбензил-2-пирролидин-1-илметил-бензимидазол, диэтиламин и другие алкиламины, пиперазин и трис(гидроксиметил)аминометан; соли щелочных металлов, таких как, но не ограничиваясь этим, литий, калий и натрий; соли щелочноземельных металлов, таких как, но не ограничиваясь этим, барий, кальций и магний; соли переходных металлов, таких как, но не ограничиваясь этим, цинк; и другие соли металлов, такие как, но не ограничиваясь этим, гидрофосфат натрия и динатрийфосфат; и также включая, но не ограничиваясь этим, соли минеральных кислот, такие как, но не ограничиваясь этим, гидрохлориды и сульфаты; и соли органических кислот, такие как, но не ограничиваясь этим, ацетаты, лакгаты, малаты, тартраты, цитраты, аскорбаты, сукцинаты, бутираты, валераты и фумараты. Фармацевтически приемлемые сложные эфиры включают, но не ограничиваются этим, алкиловые, алкениловые, алкиниловые, ариловые, гетероариловые, аралкиловые, гетероаралкиллвые, циклоалкиловые и гетероциклиловые эфиры кислотных групп, включая, но не ограничиваясь этим, карбоновые кислоты, фосфорные кислоты, фосфиновые кислоты, сульфоновые кислоты, сульфиновые кислоты и бороновые кислоты.

Как использовано в данном описании, "лечение" означает любой образ действия, при котором улучшаются или иначе благоприятно изменяются один или более симптомов состояния, расстройства или заболевания. Лечение также охватывает любое фармацевтическое применение композиций в данном описании, такое как применение для лечения гриппа.

Как использовано в данном описании, "органический растворитель" относится к растворителю, представляющему собой органическое соединение, которое является любым членом большого класса химических соединений, молекулы которых содержат углерод и водород. Такие растворители могут включать, например, соединения из следующих классов: алифатических или ароматических спиртов, полиолов, альдегидов, алканов, алкенов, алкинов, амидов, аминов, ароматических соединений, азосоединений, карбоновых кислот, сложных эфиров, диоксанов, простых эфиров, галогеноалканов, иминов, имидов, кетонов, нитрилов, фенолов и тиолов.

Как использовано в данном описании, "водный растворитель" относится к воде или смеси растворителей, содержащей по меньшей мере примерно 50% или 50%, по меньшей мере примерно 60% или 60%, по меньшей мере примерно 70% или 70%, либо примерно или 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большее количество воды. Термин "водный растворитель", используемый в данном описании, также относится к растворам, содержащим воду в качестве растворителя, таким как буферы, солевые растворы, растворы, содержащие противоионы и другие вещества, которые являются растворимыми в воде.

Используемый в данном описании термин "pH" или "изоэлектрическая точка" относится к pH, при котором на белке или полипептиде нет результирующего заряда.

Используемый в данном описании термин "противоион" относится к заряженной или поляризованной за счет заряда молекуле, которая может инициировать образование микрочастицы из макромолекулы, такой как белок, нуклеиновая кислота, липид или олигосахарид. Например, в случае слитого белка DAS181 (SEQ ID NO:17) противоионом является сульфат натрия, поскольку он может инициировать образование микрочастиц в способах, предложенных в данном изобретении, тогда как глицин, хлорид натрия или ацетат натрия обычно не подходят в качестве противоионов для DAS181. Является ли заряженная молекула противоионом, можно определить эмпирически на основании параметров, включая, но не ограничиваясь этим, тип белка, pH, ионную силу, тип используемого органического растворителя и наличие солей и дополнительных ингредиентов, таких как активные агенты. Как предложено и описано в данном изобретении, противоионы могут быть анионными или имеющими результирующий отрицательный заряд либо поляризованную за счет заряда группу(ы), катионными или имеющими результирующий положительный заряд либо поляризованную за счет заряда группу(ы), или цвиттерионными и обладающими как отрицательно, так и положительно заряженными либо поляризованными за счет заряда группами.

Используемый в данном описании термин "охлаждение" относится к снижению температуры до желаемой температуры для получения микрочастиц или, как только микрочастицы получены, к дальнейшему снижению температуры до желаемой температуры для получения сухих препаратов микрочастиц посредством испарения растворителей (например, в процессе сублимационной сушки). Термин "постепенное охлаждение", или "постепенно охлаждаемый", или "постепенно охлажденный", используемый в данном описании, означает, что снижение температуры до желаемой температуры от температуры окружающей среды (от примерно или 18°C до примерно или 30°C) с целью образования микрочастиц происходит со скоростью или в течение количества времени, подходящей(его) для генерирования микрочастиц в растворе до того, как раствор подвергнут замораживанию. Такое постепенное охлаждение отличается, например, от мгновенного замораживания, распылительной сушки или распылительной сублимационной сушки, в результате чего весь раствор превращается в твердую форму без образования отдельных микрочастиц.

Скорость постепенного охлаждения определяют эмпирически на основании типа макромолекулы, растворителей, противоионов и других ингредиентов, а также способа охлаждения (например, с использованием теплообменника, холодильника или морозильной камеры либо сублимационной сушилки), и она может варьировать, например, в течение количества времени, необходимого для образования микрочастиц, составляющего от примерно или 1 мин, 2 мин, 3 мин, 5 мин, 7 мин, 10 мин, 15 мин, 20 мин, 25 мин, 30 мин, 1 ч, 2 ч, 5 ч или 10 ч до примерно или 1,5 мин, 2 мин, 3 мин, 5 мин, 7 мин, 10 мин, 15 мин, 20 мин, 25 мин, 30 мин, 1 ч, 2 ч, 5 ч, 10 ч или 15 ч.

Используемый в данном описании термин "охлаждение" относится к снижению температуры до желаемой температуры для получения микрочастиц или, как только микрочастицы желаемых размеров получены, к дальнейшему снижению температуры до желаемой температуры для получения сухих препаратов микрочастиц посредством испарения растворителей (например, в процессе сублимационной сушки). Термин "постепенное охлаждение", или "постепенно охлаждаемый", или "постепенно охлажденный", используемый в данном описании, означает, что снижение температуры до желаемой температуры от температуры окружающей среды, при которой был образован коктейль-раствор (от примерно или 15°C до примерно или 50°C, обычно от примерно или 18°C до примерно или 30°C) с целью образования микрочастиц происходит со скоростью или в течение количества времени, подходящей(его) для генерирования микрочастиц желаемых размеров в растворе до того, как раствор подвергнут замораживанию. Такое постепенное охлаждение отличается, например, от мгновенного замораживания, распылительной сушки или распылительной сублимационной сушки, в результате чего весь раствор превращается в твердую форму без образования отдельных микрочастиц.

Скорость постепенного охлаждения определяют эмпирически на основании типа макромолекулы, растворителей, противоионов и других ингредиентов, а также способа охлаждения (например, с использованием теплообменника, холодильника или морозильной камеры либо сублимационной сушилки), и она может варьировать, например, в течение количества времени, необходимого для образования микрочастиц, составляющего от примерно или 0,1 с, 0,2 с, 0,5 с, 1 с, 10 с, 20 с, 30 с, 40 с, 50 с, 1 мин, 2 мин, 3 мин, 5 мин, 7 мин, 10 мин, 15 мин, 20 мин, 25 мин, 30 мин, 1 ч, 2 ч, 5 ч или 10 ч до примерно или 1,5 мин, 2 мин, 3 мин, 5 мин, 7 мин, 10 мин, 15 мин, 20 мин, 25 мин, 30 мин, 1 ч, 2 ч, 5 ч, 10 ч или 15 ч.

Микрочастицы желаемого размера также могут быть образованы, например, посредством быстрого охлаждения коктейля (например, с использованием теплообменника) и поддержания суспензии микрочастиц в течение некоторого периода времени без существенных температурных изменений, затем мгновенного замораживания коктейля.

Температура, при которой образуются микрочастицы, также определяется эмпирически на основании типа макромолекулы, растворителей, противоионов и других ингредиентов, а также способа и равномерности охлаждения, и может варьировать от примерно или 15°C, 10°C, 8°C, 5°C, 3°C, 2°C, 1°C, -2°C, -5°C, -7,5°C, -10°C, -15°C, -20°C, -25°C, -30°C, -35°C, -40°C или -45°C.

Используемый в данном описании термин "распылительная сушка" относится к процессу, при котором раствор, содержащий макромолекулу, такую как белок, превращается в форму сухих частиц в результате распыления в горячую высушивающую среду, обычно в течение периода времени от примерно нескольких миллисекунд до 1-2 секунд до нескольких десятков секунд. Термин "распылительная сублимационная сушка", используемый в данном описании, относится к процессу, при котором раствор, содержащий макромолекулу, такую как белок, распыляют в криогенную среду, такую как жидкий азот, с получением замороженных капелек раствора, которые затем могут быть подвергнуты сушке лиофилизацией. Термин "мгновенное замораживание", или "быстрое замораживание", или "ускоренное замораживание", как взаимозаменяемо использовано в данном описании, относится к замораживанию растворителя или раствора, включая растворы, содержащие такие макромолекулы, как белки, путем погружения контейнера с хорошими теплообменными свойствами (например, тонкостенного стакана или металлической пробирки), содержащего растворитель или раствор, в жидкий азот или выливания раствора непосредственно в жидкий азот. "Мгновенное замораживание" и "быстрое замораживание" обычно происходит в течение периода времени от примерно нескольких миллисекунд до 1-2 секунд до нескольких десятков секунд.

Термин "лиофилизировать" или "лиофилизация", используемый в данном описании, является синонимом "сублимационной сушке" и относится к процессу, при котором раствор, включая эмульсию, коллоид или суспензию, замораживают, а растворители испаряются непосредственно в парообразном состоянии, оставляя после этого твердые компоненты.

Б. Способы изготовления композиций макромолекулярных микрочастиц

В данном изобретении предложены способы получения микросфер с высоким содержанием таких макромолекул, как белок. Микросферы, предложенные в данном изобретении, получены путем контролируемого осаждения в присутствии противоиона и органического растворителя. Микросферы подходят для получения фармацевтических композиций, которые могут быть доставлены пациенту способами доставки, включая способы легочного, парентерального и пероральноого введения. Способ также может быть осуществлен в периодическом или непрерывном режиме для повышения эффективности и производительности.

Микросферы, изготовленные способами, предложенными в данном изобретении, полезны в качестве профилактических, терапевтических или диагностических агентов для лечения или диагностики болезненных состояний у субъекта in vivo или in vitro. Размеры микросфер, полученных способами, предложенными в данном изобретении, можно регулировать путем корректировки параметров, включающих тип и концентрацию органического растворителя, концентрацию белка или макромолекулы, ионную силу, тип и концентрацию противоиона, скорость и продолжительность охлаждения, с целью получения микросфер в широком диапазоне размеров от 0,001 микрона до 50 микрон или больше, с помощью которых можно доставлять терапевтические агенты желаемым путем, включая легочный (например, частицы от 1 микрона до 5 микрон для доставки в горло, трахею и бронхи для лечения гриппа и других респираторных инфекций), подкожный, внутримышечный, внутривенный и другие пути (например, используя частицы в размере десятков микрон), передавать активные компоненты ингаляционной терапии субъектам, представляющим собой человека.

Стадии способа, предложенного в данном изобретении, включают: объединение раствора, содержащего макромолекулу, с противоионом и органическим растворителем и постепенное охлаждение полученного раствора до температуры, при которой образуются микрочастицы. В одном воплощении стадии могут быть описаны следующим образом:

1) добавление к раствору, содержащему макромолекулу, такую как белок, нуклеиновая кислота, олигосахарид или липид, противоиона и органического растворителя в концентрациях, не вызывающих осаждения макромолекул при температуре окружающей среды;

2) осаждение: охлаждение коктейля макромолекулы/растворителя для инициации образования микросфер; и

3) дегидратация: замораживание суспензии и удаление органического растворителя и воды посредством сублимации (сублимационной сушки, например, при температуре от примерно -20°C до примерно -80°C, или от примерно -30°C до примерно -80°C, или от примерно -40°C до примерно -80°C, или от примерно -45°C до примерно -80°C, или от примерно -45°C до примерно -75°C).

Вышеупомянутые стадии способа могут быть осуществлены последовательно, с перерывами или одновременно в любом порядке. В одном воплощении противоион и органический растворитель добавляют одновременно или последовательно в любом порядке к раствору, содержащему макромолекулу, с последующим охлаждением. В других воплощениях перед добавлением противоиона и органического растворителя раствор, содержащий макромолекулу, может быть предварительно охлажден до температуры, подходящей для образования микросфер. Например, предварительно охлажденный водный раствор такой макромолекулы, как белок, может быть объединен с сульфатом аммония и ацетонитрилом для образования микросфер.

Изготовленную суспензию микрочастиц можно превратить в сухой порошок посредством дополнительного охлаждения до температуры ниже точки замерзания и последующего удаления легко испаряющихся веществ (воды, органического растворителя и, если возможно, противоиона) путем, например, сублимации с использованием стандартной сублимационной сушилки.

В одном воплощении микросферы, образованные путем приведения макромолекулы в контакт с противоионом и органическим растворителем и воздействия на них низкой температуры, отделяют от суспензии способами, включающими методики седиментации или фильтрации. После выделения из исходной смеси для осаждения микросферы могут быть промыты и/или объединены с другими веществами, которые улучшают и/или модифицируют характеристики макромолекул и микросфер.

В другом воплощении микросферы, изготовленные способами, предложенными в данном изобретении, не имеют прямого терапевтического эффекта, но служат в качестве микроносителей для другого терапевтического агента(ов) или активного агента(ов), включая пищевые добавки. Терапевтические агенты могут быть добавлены в момент осаждения или могут быть добавлены в суспензию образовавшихся микросфер перед лиофилизацией. Альтернативно, можно изготовить смесь терапевтических агентов в сухом порошке, состоящем из микросфер.

Без связи с какой-либо теорией отметим, что в одном из аспектов способы, предложенные в данном изобретении, позволяют осуществить образование микросфер путем: (1) нейтрализации зарядов на поверхности макромолекулы под действием противоиона и (2) уменьшения растворимости макромолекул, вызванного воздействием объединенных эффектов добавленного органического растворителя и постепенного охлаждения.

В результате выбора подходящего pH в диапазоне от примерно или pH 2,0 до примерно или pH 10,5 или больше, в зависимости от макромолекулы, противоиона и органического растворителя, в присутствии подходящего количества противоиона, значительного количества заряженных групп, в некотором воплощении все заряженные группы на поверхности макромолекулы могут быть нейтрализованы. Уменьшение полярности раствора путем добавления подходящего органического растворителя далее может инициировать образование микросфер посредством осаждения, разделения фаз, образования коллоида или другого подобного способа.

Альтернативно, без связи с какой-либо теорией отметим, что в некоторых воплощениях наблюдаемое явление осаждения микросфер также можно объяснить космотропным (структурообразующим) эффектом противоионов и органических растворителей вследствие взаимодействия с молекулами воды водного раствора, содержащего макромолекулу при низких температурах. Независимо от лежащего в основе механизма, в способах, предложенных в данном изобретении, добавление относительно небольших количеств органического растворителя и противоиона в водный или другой гидрофильный раствор, содержащий макромолекулу, и охлаждение данного раствора приводит к производству композиций, содержащих микросферы макромолекул(ы).

В одном воплощении постепенное охлаждение коктейль-раствора может быть осуществлено путем пропускания коктейль-раствора через теплообменник. Температура теплообменника и скорость протекания коктейля через теплообменник могут быть отрегулированы таким образом, что коктейль либо предварительно будет охлаждаться перед образованием микросфер, либо охлаждаться до температуры, при которой образуются микросферы.

В другом воплощении микросферы, образованные способами, предложенными в данном изобретении, концентрируют или выделяют из суспензии такими способами, как методы седиментации или фильтрации. По мере образования микросфер их рост (размер) можно контролировать, регулируя ионную силу, полярность, pH или другие параметры суспензии. Отделение микросфер от жидкой фазы коктейль-раствора может быть осуществлено центрифугированием, фильтрацией (полое волокно, тангенциальный поток и т.д.) или с использованием других методик. Изготовленные микросферы или их концентрированные суспензии могут быть лиофилизированы или высушены на воздухе.

В некоторых воплощениях микросферы, выделенные из исходной смеси осаждения, или высушенные микросферы могут быть повторно разведены перед введением в качестве терапевтического агента или носителя либо могут быть суспендированы в растворах, которые содержат агенты, модифицирующие характеристики микросфер. Модифицирующие агенты могут включать, но не ограничиваются этим, наполнители, эксципиенты, неактивные ингредиенты, усилители стабильности, модификаторы вкуса и/или запаха или маскирующие агенты, витамины, терапевтические агенты, антиоксиданты, иммуномодуляторы, модификаторы трансмембранного транспорта, агенты, предотвращающие слеживание, энтеросолюбильные покрывающие агенты, агенты, придающие устойчивость к кислотам, например к кислотам пищеварительной системы, агенты, придающие устойчивость к протеазам, хитозаны, полимеры и усилители текучести.

Образование и характеристики микросфер, изготовленных способами, предложенными в данном изобретении, могут быть определены эмпирически путем изменения параметров, включая: природу и концентрацию макромолекулы, pH коктейль-раствора, природу и концентрацию противоиона, природу и концентрацию органического растворителя, ионную силу и скорость охлаждения, при которой осуществляется постепенное охлаждение. Стадии способов, предложенных в данном изобретении, делают данный способ пригодным к высокопроизводительному скринингу, например в микропланшетном формате, для определения подходящих комбинаций макромолекулы, органического растворителя, противоиона, pH, ионной силы и линейного изменения температур охлаждения для образования микросфер.

Макромолекулы

Макромолекулы, которые могут быть использованы для образования микросфер в соответствии со способами, предложенными в данном изобретении, включают ряд терапевтических агентов, диагностических агентов, пищевых агентов и других активных агентов. Терапевтические агенты включают антибиотики, вакцины, гематопоэтические средства, противоинфекционные средства, противоязвенные средства, антиаллергические агенты, жаропонижающие средства, аналгетики, противовоспалительные агенты, средства против деменции, противовирусные агенты, противоопухолевые агенты, антидепрессанты, психотропные агенты, кардиотонические средства, противоаритмические агенты, вазодилататоры, антигипертензивные агенты, противодиабетические агенты, антикоагулянты и снижающие холестерин агенты. Другие примеры подходящих макромолекул включают белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы, белковые конъюгаты, вирусы, вирусные частицы и их смеси.

Макромолекулы могут быть охарактеризованы по их способности взаимодействовать с противоионом и органическим растворителем, такими как цитрат (противоион) и изопропанол (растворитель), с образованием интактных, дискретных микросфер с высоким содержанием макромолекул. Содержание макромолекулы в микросферах может варьировать от примерно или 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше микросфер по массе (масс/масс). В некоторых воплощениях содержание макромолекул в микросфере по существу такое же, что и первоначальное количество макромолекулы в растворе перед образованием микросфер.

Макромолекулы, используемые для получения микросфер способами, предложенными в данном изобретении, могут включать пептиды, в том числе полипептиды и белки, углеводы, в том числе полисахариды, и нуклеиновые кислоты (ДНК, РНК или ПНК). В некоторых воплощениях макромолекулы представляют собой белки, включая терапевтические белки, такие как DAS181 (сиалидазный слитый белок, имеющий последовательность аминокислотных остатков, приведенную в SEQ ID NO:17), альфа1-антитрипсин, PI8, эглин с, экотин, апротинин, рекомбинантная ДНКаза человека, инсулин, интерфероны, рекомбинантная ДНКаза человека (rhДНКаза), полезная, например, в лечении муковисцидоза в качестве ингаляционного терапевтического средства (Genentech); см. также Shak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 9188-9192 (1990)), человеческий сывороточный альбумин, гормон роста человека, паратиреоидный гормон и кальцитонин. В некоторых воплощениях белок представляет собой DAS181, противоионом является сульфат натрия или цитрат натрия, а органическим растворителем является изопропанол.

В способах, предложенных в данном изобретении, можно избежать использования таких условий, как нагревание, которые могут денатурировать белок и уменьшать его активность. Поэтому микросферы, полученные в соответствии со способами, предложенными в данном изобретении, могут быть использованы для получения вакцин или других терапевтических лекарственных средств, для которых необходимо присутствие белков или пептидов в их нативной конформации.

Концентрация макромолекулы в растворе, используемая в процессе осаждения микросфер, может составлять от примерно или 0,1 мг/мл до примерно или 0,2, 0,5, 0,8, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 12,0, 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0, 50,0, 60,0, 70,0, 80,0, 90,0, 100 или 200 мг/мл. В некоторых воплощениях концентрация составляет от примерно или 1 мг/мл до примерно или 20 мг/мл. Для достижения образования микросфер желаемого размера концентрация макромолекулы, в зависимости от характеристик макромолекулы (pi, гидрофобности, растворимости, стабильности и т.д.) и других параметров способа, может быть определена эмпирически. Как правило, макромолекулы с более низкой растворимостью в растворителе (обычно водном растворителе) перед добавлением противоиона и органического растворителя могут быть использованы в более низких концентрациях (0,1-5 мг/мл) для образования микросфер в соответствии с приведенными в данном описании способами, в то время как макромолекулы с большей растворимостью могут быть использованы в концентрации 1-20 мг/мл или выше. Если наблюдается образование аморфных агрегатов или агрегированных микросфер, концентрацию макромолекулы обычно следует уменьшить, чтобы уменьшить или предотвратить такую агрегацию.

Природа и концентрация противоиона

Противоион может представлять собой любое соединение, способное к нейтрализации одной или более противоположно заряженных групп на макромолекуле при pH, при котором осуществляют данный способ. Для образования микросфер pH может быть определен эмпирически в зависимости от характеристик макромолекулы (рК, pI, природы и количества заряженных групп, распределения заряженных групп на поверхности, растворимости и структурной стабильности при разных pH условиях). Как правило, если осаждение осуществляют при pH ниже pK макромолекулы, то могут быть использованы анионные противоионы. Как правило, если осаждение осуществляют при pH выше pK макромолекулы, то могут быть использованы катионные противоионы. Противоион может быть выбран эмпирически на основании его пригодности к образованию микросфер. В некоторых воплощениях противоион может иметь молекулярную массу 60 Да или больше либо примерно 75 Да или больше.

Противоионы могут быть анионными, катионными или цвиттерионными. Анионные противоионы могут быть неорганическими (фосфат, сульфат, тиоцианат, тиосульфат, гипохлорат, нитрат, бром, йод и т.д.) или органическими соединениями, несущими поляризуемые за счет заряда группы, включая группы енол, гидрокси, -SH, карбоновую, карбоксиметил, сульфопропил, сульфоновую и фосфорную. Органические соединения, несущие другие анионные группы или имеющие отрицательный заряд вследствие других молекулярных характеристик, также могут быть использованы. Соединения, которые можно использовать в качестве анионных противоионов, также включают, но не ограничиваются этим, следующее: оксалоацетат, малат, малеат, оксалат, пируват, цитрат, сукцинат, фумарат, кетоглутарат, бутантрикарбоновую кислоту, гидромуконовую кислоту, циклобутандикарбоновую кислоту, диметилмалеат, дезоксирибонуклеиновую кислоту, полиглутаминовую кислоту, фолиевую кислоту, молочную кислоту, аскорбиновую кислоту, карминовую кислоту, сорбиновую кислоту, малоновую кислоту, EDTA (этилендиаминтетрауксусную кислоту), MOPS (морфолинпропансульфоновую кислоту), TES (н-[трис(гидроксиметил)]-2-аминоэтансульфоновую кислоту), MES (2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту), PIPES (пиперазин-N,N-бис-2-этансульфоновую кислоту), пиридин, трицин, глицин, глицилглицин, бетаин, серную кислоту, тиосерную кислоту, фосфорную кислоту, аденозинтрифосфат, азотную кислоту, итаконовую кислоту, пивалиновую кислоту, диметилмалоновую кислоту и перхлорную кислоту. В некоторых воплощениях в способах, предложенных в данном изобретении, в качестве противоионов используют итаконовую, пивалиновую, диметилмалоновую и янтарную кислоты.

Катионные противоионы могут быть неорганическими (аммоний, фосфоний, сульфоний, цезий, рубидий и т.д.) или органическими соединениями, несущими группы, известные как амин, амид, имин, имид, гуанидин, имидазол, диоксан, анилин. Органические соединения, которые несут другие катионные группы или которые имеют поляризуемость за счет положительного заряда благодаря другим молекулярным характеристикам, также могут быть использованы. Соединения, которые могут быть использованы в качестве катионных противоионов, также включают, но не ограничиваются этим, следующее: трис, бис-трис, бис-трис-пропан, диаминопропан, пиперазин, пиперадин, пентиламин, диаминобутан, пропиламин, триметиламин, триэтиламик, спермин, спермидин, путресцин, кадаверин, этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, имидазол, тетраметиламмоний, триметиламмоний, аммоний, цезий, рубидий, имидазол, полиэтиленимин, DEAE (диэтиламиноэтил), ТЕАЕ (триэтиламиноэтил), QAE (четвертичный аминоэтил).

Кроме того, могут быть использованы цвиттерионные противоионы с любыми заряженными группами в любой комбинации. Соединения, которые могут быть использованы в качестве цвиттерионных противоионов, включают, но не ограничиваются этим, следующее: HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновую кислоту), BICINE (N,N'-бис(2-гидроксиэтилглицин)), глицин, глицилглицин, 6-аминогексановую кислоту, пиперидиновую кислоту, природные и неприродные аминокислоты (например, гистидин, глутамин, аргинин, лизин). Противоионы могут быть использованы в виде кислот (например, серной кислоты) или оснований (например, имидазола) или их солей (например, сульфата натрия или имидазол-НСl). Противоионы, которые могут быть использованы в способах, предложенных в данном изобретении, включают противоионы, перечисленные в Национальном формуляре, фармакопее США, Японской фармакопее или Европейских фармакопеях, клиническая безопасность которых была продемонстрирована (лимонная кислота, яблочная кислота, аминокислоты, сульфат и т.д.). В некоторых воплощениях противоионы, используемые в способах, предложенных в данном изобретении, включают противоионы, безопасность которых была установлена или которые подпадают под категорию GRAS (в целом признаны безопасными). Противоионы (или их соли) могут быть твердыми при комнатной температуре (примерно 25°C) или при предполагаемой температуре использования и хранения). Также можно использовать комбинации двух или более противоионов. Летучие и жидкие противоионы также можно использовать в способах, предложенных в данном изобретении.

Концентрацию противоиона обычно поддерживают от примерно 0,1 мМ до примерно 0,2, 0,5, 0,8, 1,0, 2,0, 3,0, 5,0, 7,0, 10,0, 15,0, 20,0, 30,0, 40,0, 50,0, 60,0, 70,0, 80,0, 90,0 и 100,0 мМ. В некоторых воплощениях концентрация противоиона составляет от примерно или 0,5 мМ до примерно или 20 мМ. В зависимости от характеристик макромолекулы (pI, гидрофобности, растворимости, стабильности и т.д.) и других параметров способа концентрациию противоиона можно определить эмпирически, используя, например, высокопроизводительный формат, как предложено в данном изобретении. Как правило, образование микросфер большего размера, аморфных агрегатов или агрегированных микросфер указывает на то, что концентрация противоиона должна быть уменьшена, хотя нарушение в образовании микросфер (разрушенные стеклоподобные кристаллы или хлопья) или образование микросфер ниже желаемого размера указывает на то, что концентрация противоиона должна быть увеличена.

Природа и концентрация органического растворителя

Органический растворитель, добавляемый в коктейль в способах, предложенных в данном изобретении, обычно может быть смешан с водой и выбран из спиртов (метанола, этанола, 1-пропанола, изопропанола, бутанола, трет-бутилового спирта), хлороформа, диметилхлорида, многоатомных сахарных спиртов (глицерина, эритрола, арабита, ксилита, сорбита, маннита), ароматических углеводородов, альдегидов, кетонов, сложных эфиров, простых эфиров (диэтилового эфира), алканов (гексана, циклогексана, петролейного эфира), алкенов, конъюгированных диенов, толуола, дихлорметана, ацетонитрила, этилацетата, полиолов, полиимидов, полимеров сложных эфиров, полиальдегидов и их смесей. В некоторых воплощениях органический растворитель может быть летучим. В других воплощениях, когда желательно включение органического растворителя в микросферы, можно использовать нелетучие органические растворители, которые придают, например, новые характеристики микросферам (например, замедленное высвобождение или дополнительную механическую прочность). Обычно концентрацию противоиона можно поддерживать от примерно или 0,1% до примерно или 0,5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40% или 50% (объем/объем (об./об.)). В некоторых воплощениях концентрация органического растворителя составляет от примерно или 1% до примерно или 30% (об./об.). Органические соединения, являющиеся частично смешивающимися или полностью несмешивающимися с водой, также могут быть использованы.

Органические растворители, которые могут быть использованы в способах, предложенных в данном изобретении, включают спирты и другие растворители, перечисленные в качестве растворителей класса 3 и 2 в Согласованном трехстороннем руководстве Международной конференции по гармонизации (Примеси: руководство по остаточным растворителям) (International Conference on Harmonisation (ICH) Harmonised Tripartite Guideline (Impurities: Guideline for Residual Solvents), трактовка безопасности которых доказана в фармацевтической и пищевой отраслях промышленности.

В зависимости от характеристик макромолекулы (гидрофобности, растворимости, стабильности и т.д.) и других параметров способа выбор и концентрацию органического растворителя можно оптимизировать, например, используя высокопроизводительный скрининг на титрационных микропланшетах или похожих чипах либо на другом устройстве. Как правило, нерегулируемое осаждение до начала охлаждения, образование микросфер больше обычного размера, аморфных агрегатов, агрегированных микросфер или липких агрегатов указывает на то, что концентрация органического растворителя должна быть уменьшена, хотя имеется нарушение при образовании микросфер (разрушенные стеклоподобные кристаллы или хлопья) или образование микросфер ниже желаемого размера указывает на то, что концентрация противоиона должна быть увеличена.

pH

Кроме того, для инициации образования микросфер, противоион также может служить в качестве буфера. Альтернативно, в некоторых воплощениях для получения желаемого pH можно использовать буферное соединение. В некоторых воплощениях молекулярная масса буферного соединения составляет 60 Да или больше. В зависимости от характеристик макромолекулы (рI, гидрофобности, растворимости и стабильности при конкретном pH и т.д.) и других параметров способа можно эмпирически регулировать оптимальный pH для достижения образования микросфер желаемых размеров и сохранения активности макромолекулы. Как правило, нарушение в образовании микросфер (разрушенные стеклоподобные кристаллы или хлопья) указывает на то, что в используемых условиях белок может быть слишком растворимым. Образование аморфных агрегатов может указывать на то, что процесс осаждения контролируется в недостаточной степени и белок может оказаться нестабильным или нерастворимым при используемом pH.

Если макромолекула представляет собой белок, обнаружено, что определенные комбинации белок/противоион могут вызывать немедленное и нерегулируемое осаждение при определенных величинах pH. Способы высокопроизводительного скрининга, предложенные в данном изобретении, могут быть использованы для эмпирического определения соответствующей комбинации белка, pH и противоиона для образования микросфер желаемых размеров. Это легко исправить путем изменения pH коктейля, посредством использования другого противоиона или путем уменьшения концентрации белка в коктейле. Как правило, для образования микросферы на основе белка величина pH ниже pI белка обеспечивает оптимальное образование микросфер.

Ионная сила

Ионную силу коктейль-раствора можно модулировать посредством концентрации противоиона или посредством других солей, таких как хлориды или ацетаты. В некоторых воплощениях для получения микросфер никакой дополнительной соли не требуется. В некоторых воплощениях ионную силу можно регулировать для сохранения структурной целостности и активности макромолекулы. Примеры других применений, где присутствие конкретных солей может оказаться полезным, включают препараты парентеральных и других лекарственных средств или пищевые продукты, в которых при повторном разведении микросфер может потребоваться специфическая тоничность или буферная емкость.

Линейное изменение температур охлаждения

Сначала, перед охлаждением, коктейль, содержащий макромолекулу, противоион и органический растворитель, готовят при температуре, при которой макромолекула является растворимой, обычно от примерно -15°C до примерно 30°C. В некоторых воплощениях первоначальная температура перед охлаждением соответствует температуре окружающей среды (18-25°C). Микросферы образуются в результате такого процесса, как осаждение, разделение фаз или образование коллоида по мере постепенного охлаждения до температуры ниже той, при которой макромолекула растворена и находится в растворе. Скорость, с которой осуществляют охлаждение, может регулировать образование и другие характеристики, например размер, микросфер. Как правило, когда макромолекула представляет собой белок, мгновенное замораживание в жидком азоте не приводит к образованию микросфер.

Скорость, с которой осуществляют охлаждение и замораживание коктейля (линейное изменение температур охлаждения), может определять конечный размер микросфер. Как правило, более быстрое линейное изменение температур охлаждения приводит к образованию более мелких микросфер, тогда как более медленное линейное изменение температур охлаждения приводит к образованию более крупных микросфер. Без связи с какой-либо теорией отметим, что скорость охлаждения может определять скорость: (1) нуклеации, которая приводит к образованию исходно более мелких микросфер, и (2) процесса слияния, при котором исходные микросферы коалесцируют (агрегируют) и конденсируются в более крупные микросферы. Слияние более мелких частиц в более крупные частицы является времязависимым процессом, который может быть определен, например, по продолжительности, в течение которой жидкая суспензия микросфер существует до замораживания. Вследствие обратимой природы связей между определенными макромолекулами, такими как некоторые белки, в композициях микросфер, предложенных в данном изобретении, более мелкие микросферы, конденсирующиеся в более крупные частицы, могут образовывать микросферы с гладкими поверхностями. В зависимости от желаемого размера микрочастиц скорость охлаждения может составлять от примерно 0,01°C/мин или 0,01°C/мин до примерно 20°C/мин или 20°C/мин; от примерно или 0,05°C/мин, либо примерно или 0,1°C/мин до примерно или 10°C/мин, либо примерно или 15°C/мин, от примерно или 0,2°C/мин до примерно или 5°C/мин, от примерно или 0,5°C/мин до примерно или 2°C/мин, либо примерно или 1°C/мин. В некоторых воплощениях линейное изменение температур охлаждения может составлять от 0,1°C в минуту до примерно 40°C в минуту. В других воплощениях линейное изменение температур охлаждения может составлять от примерно 0,5°C в минуту до 15°C в минуту.

В зависимости от конкретных требований в некоторых воплощениях может быть желательно адаптировать способ получения к конкретному оборудованию. В некоторых воплощениях для охлаждения можно использовать лиофилизатор с терморегулируемыми полками. Если полученные микросферы больше желаемых, то для достижения желаемого уменьшения размера микросфер можно модифицировать другие параметры способа, включающие концентрацию макромолекулы, органический растворитель, противоион, ионную силу и/или pH.

Для достижения более быстрого линейного изменения температур охлаждения (меньшего размера частиц) коктейль-раствор можно пропустить через теплообменник, например, который используется в непрерывном режиме. Если необходимо увеличить размер микросфер, увеличение концентрации одного из ингредиентов коктейля (макромолекулы, органического растворителя, противоиона) может обеспечить желаемое увеличение размера микросфер.

Как правило, для предотвращения образования агрегатов и кристаллов охлаждение следует осуществлять равномерно и с постоянной скоростью. В зависимости от концентрации органического растворителя осаждение макромолекулы в микросферы может происходить несколькими путями. При более высоких концентрациях органического растворителя (примерно 5%-40% в зависимости от фактических используемых компонентов) микросферы обычно могут образовываться, когда коктейль-раствор все еще находится в жидкой форме. При более низких концентрациях органического растворителя (2-25% в зависимости от фактических используемых компонентов) сначала могут образовываться кристаллы льда, после чего "вытесняемые" макромолекулы и органический растворитель могут достичь критической локальной концентрации и выпасть в осадок. Дальнейшее уменьшение температуры в придонном слое поддона лиофилизатора может приводить к полному затвердению жидкой суспензии и последующему вытеснению органического растворителя в верхний слой. Избыток органического растворителя в верхнем слое может вызывать нерегулируемое осаждение макромолекулы и агрегацию микросфер. Обычно этот эффект можно ослабить путем выбора соответствующих соотношений компонентов - макромолекулы, противоиона, органического растворителя, солей и т.д. - в коктейле. Кроме того, поддержание тонкого слоя коктейля в поддоне для лиофилизации или перемешивание коктейля в процессе его охлаждения может предотвратить образование агрегатов и кристаллов и позволить получить на выходе однородные микросферы. Например, если используют относительно низкую концентрацию изопропанола (например, 2-6%), и тонкий слой коктейля наливают в поддон (10-20 мм), и поддон помещают на предварительно охлажденную полку (от -30 до -75°C), то могут быть получены однородные микросферы.

Способы, предложенные в данном изобретении, могут приводить к тому, что по существу все содержимое или весь белок либо другая макромолекула будут включены из раствора в микросферы.

Высокопроизводительный скрининг условий образования микрочастиц и оптимизация образования частиц

В зависимости от характеристик макромолекулы состав коктейль-раствора, используемого для получения микросфер в соответствии со способами, предложенными в данном изобретении, можно оптимизировать. Оптимизация может быть быстро осуществлена в среде или высокопроизводительном формате с использованием, например, титрационного микропланшета(ов) или чипов, где можно одновременно проводить скрининг от десятков, до сотен, до тысяч, до десятков тысяч коктейлей. В некоторых воплощениях может быть осуществлен скрининг ряда величин pH в сочетании с катионными, анионными или цвиттерионными противоионами и органическими растворителями в различных концентрациях. Например, скрининг может быть осуществлен с использованием нескольких идентичных титрационных микропланшетов, в каждый из которых представляющая интерес макромолекула добавлена в различных концентрациях. Для каждого набора тестируемых условий скрининг может быть осуществлен в двух повторностях. В некоторых воплощениях с целью допущения хорошего теплообмена между полкой лиофилизатора и дном лунок можно использовать микропланшеты с плоскодонными лунками с отломанной кромкой (skirt) титрационного микропланшета. Микропланшеты можно разместить на полках лиофилизатора и охладить для образования микросфер и последующего затвердевания суспензий. После замораживания содержимого лунок можно приложить вакуум. В конце лиофилизации содержимое одного из двух дублирующих планшетов можно развести водой или выбранным буфером с целью обнаружения определенных условий, делающих макромолекулу нерастворимой или уменьшающих ее активность. Условия, которые приводят к получению вещества, которое может быть легко повторно солюбилизировано, или обеспечивают микросферы с желаемыми характеристиками, могут быть подвергнуты дальнейшему анализу с использованием спектроскопических, хроматографических, ферментативных или других анализов для подтвержения сохранения нативной структуры и активности. Лиофилизированное вещество в дублирующем планшете можно использовать для микроскопии с целью определения возможности образования микросфер. Условия, при которых происходит образование микросфер, могут быть дополнительно модифицированы и точно отрегулированы для получения микросфер желаемых размера и характеристик.

Могут быть предложены наборы для осуществления высокопроизводительных скринингов, и они могут содержать все ингредиенты, используемые в способах, предложенных в данном изобретении, включающие одно или более из следующего: макромолекулу, например, белок, буферы, изготовленный заранее коктейль известного состава (органический растворитель, противоион) и/или соли. Наборы могут содержать 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100 или более (обычно 96 или более) буферов с заданными pH, противоионом, ионной силой и органическим растворителем в каждом титрационном микропланшете. Титрационный микропланшет, поставляемый с набором, можно модифицировать таким образом, чтобы дно лунок находилось в непосредственном контакте с полкой лиофилизатора.

В. Композиции микрочастиц макромолекул

Макромолекулы, содержащиеся в композициях микрочастиц, полученных способами, предложенными в данном изобретении, по существу не изменяются структурно и химически в результате применения этих способов. Например, если макромолекула представляет собой зеленый флуоресцентный белок или красный флуоресцентный белок, их флуоресценция и нативная конформация и активность белков сохраняются в микрочастицах. Сухие микросферы, полученные в результате испарения по существу всех растворителей и/или влаги за исключением растворителя и других компонентов, ассоциированных с микросферами, можно хранить, и их активность по существу можно восстановить после разведения. Относительно низкое содержание влаги в микрочастицах, полученное в данном изобретении, например от примерно или 0,1% до примерно или 0,2%, 0,3%, 0,5%, 1,0%, 2,0%, 3,0%, 4,0%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5%, 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5%, 10,0%, 10,5%, 11,0%, 11,5%, 12,0%, 12,5%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20%, может обеспечить улучшенную стабильность. Микросферы, полученные способами, предложенными в данном изобретении, также являются однородными по размеру и форме, и могут быть получены воспроизводимым образом с желаемыми характеристиками.

Другие методики, традиционно используемые для получения сухих препаратов (осаждение солью, осаждение спиртом или ацетоном, лиофилизация, например), могут вызывать полную или частичную денатурацию таких макромолекул, как белки. Кроме того, для микросфер, изготовленных способами, предложенными в данном изобретении, нет необходимости в сложной или специальной распылительной сушке, распылительной сублимационной сушке, процессах, основанных на использовании сверхкритических флюидных антирастворителей, или процессах размалывания (см., например, Laube BL. The expanding role of aerosols in systemic drug delivery, gene therapy, and vaccination. Respir. Care 2005; 50(9): 1161-1176; Taylor G, Gumbleton M. Aerosols for Macromolecule Delivery: Design Challenges and Solutions. American Journal of Drug Delivery 2004; 2(3): 143-155; Smyth HDC, Hickey AJ. Carriers in Drug Powder Delivery. Implications for Inhalation System Design. American Journal of Drug Delivery 2005; 3(2): 117-132; Cryan SA. Carrier- based strategies for targeting protein and peptide drugs to the lungs. AAPS J. 2005; 7(1): E20-E41; LiCalsi C, Maniac: MJ, Christensen T, Phillips E, Ward GH, Witham C. A powder formulation of measles vaccine for aerosol delivery. Vaccine 2001; 19(17-19): 2629-2636; Maa YF, Prestreiski SJ. Biopharmaceutical powders: particle formation and formulation considerations. Curr. Pharm. Biotechnol. 2000; 1(3): 283-302; Maa YF, Nguyen PA, Hsu SW. Spray-drying of air-liquid interface sensitive recombinant human growth hormone. J. Pharm. Sci. 1998; 87(2): 152-159; Vanbever R, Mintzes JD, Wang J et al. Formulation and physical characterization of large porous particles for inhalation. Pharm. Res. 1999; 16(11): 1735-1742; Bot Al, Tarara ТЕ, Smith DJ, Bot SR, Woods CM, Weers JG. Novel lipid-based hollow-porous microparticles as a platform for immunoglobulin delivery to the respiratory tract. Pharm. Res. 2000; 17(3): 275-283; Maa YF, Nguyen PA, Sweeney T, Shire SJ, Hsu CC. Protein inhalation powders: spray drying vs spray freeze drying. Pharm. Res. 1999; 16(2): 249-254; Sellers SP, Clark GS, Sievers RE, Carpenter JF. Dry powders of stable protein formulation from aqueous solutions prepared using supercritical CO(2)-assisted aerosolization. J. Pharm. Sci. 2001; 90(6): 785-797; Garcia-Contreras L, Morcol T, Bell SJ, Hickey AJ. Evaluation of novel particles as pulmonary delivery systems for insulin in rats. AAPS Pharm. Sci. 2003; 5(2): E9; Pfutzner A, Flacke F, Pohl R et al. Pilot study with technosfere/PTH(1-34) - a new approach for effective pulmonary delivery of parathyroid hormone (1-34). Horm. Metab. Res. 2003; 35(5): 319-323; Alcock R, Blair JA, O'Mahony DJ, Raoof A, Quirk AV. Modifying the release of leuprolide from spray dried OED microparticles. J. Control. Release 2002; 82(2-3): 429-440; Grenha A, Seijo B, Remunan-Lopez C. Microencapsulated chitosan nanoparticles for lung protein delivery. Eur. J. Pharm. Sci. 2005; 25(4-5): 427-437; Edwards DA, Hanes J, Caponetti G et al. Large porous particles for pulmonary drug delivery. Science 1997; 276(5320): 1868-1871; McKenna BJ, Birkedal H, Bartl MH, Deming TJ, Stucky GD. Micrometer-sized scberical assemblies of polypeptides and small molecules by acid-base chemistry. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 2004; 43(42): 5652-5655; Oh M, Mirkin CA. Chemically tailorable colloidal particles from infinite coordination polymers. Nature 2005; 438(7068): 651-654; патент США №5981719; патент США №5849884 и патент США №6090925; заявка на патент США №20050234114; патент США №6051256).

Микрочастицы, изготовленные способами, предложенными в данном изобретении, могут быть любой формы и могут иметь размеры (среднюю ширину или диаметры) в диапазоне от примерно или 0,001 микрона до примерно или 0,002, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 1,0, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8.0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0 или 50,0 или больше микрон. Для легочного введения в альвеолы размер может составлять от примерно 0,1 микрона или меньше до примерно 0,5 микрона. Для. легочного введение в горло, трахею и бронхи размер может составлять от примерно или 0,5 микрона до примерно или 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 или 6,5 микрона, или в некоторых воплощениях от примерно или 1,0 микрона до примерно или 2,0 микрона. В некоторых воплощениях микрочастицы являются по существу сферическими по форме.

Макромолекулы, которые могут быть использованы для образования микрочастиц в соответствии со способами, предложенными в данном изобретении, могут включать терапевтические и диагностические агенты, обработанные пищевые продукты, пищевые добавки и полимеры. В некоторых воплощениях для модификации растворимости микросфер и/или повышения их механической прочности в коктейль композиции могут быть включены сшивающие агенты, соли или другие соединения. В некоторых воплощениях микросферы, которые являются нерастворимыми в большинстве водных или органических растворителей, могут быть использованы для изготовления таких частиц, как хроматографические смолы и диспергируемые абразивные материалы. В других воплощениях микросферы с частичной растворимостью в таких растворителях, как фармацевтические разбавители для доставки, могут быть полезны в изготовлении активного агента или терапевтических препаратов с замедленным высвобождением.

В некоторых воплощениях микрочастицы, предложенные в данном изобретении, могут быть использованы в комбинации с ингаляционным устройством для доставки терапевтической дозы макромолекулярных микросфер в дыхательные пути и легкие субъекта. Например, если макромолекула представляет собой белок DAS181 (последовательность, приведенная в SEQ ID NO:17), микросферы от примерно 0,5 микрона до примерно 8 микрон, или от примерно 1 микрона до примерно 5 микрон могут быть получены способами, предложенными в данном изобретении, с использованием сульфата натрия в качестве противоиона и изопропанола в качестве органического растворителя. Для DAS181-микросфер, которые вводят для предупреждения или лечения вирусных инфекций, начинающихся в дыхательных путях, таких как грипп, может быть желательно, чтобы микросферы осаждались в горле, трахее или бронхах. Слитый белок DAS181, изготовленный в виде микросфер, может действовать путем разрушения рецепторных сиаловых кислот в горле/трахее/бронхах, предупреждая таким образом связывание вируса и инфицирование в этих участках. Для оптимальной доставки ОА8181-микросфер в участки, где может начаться респираторная вирусная инфекция, т.е. в горло, трахею или бронхи, микросферы не должны быть (а) такими большими, чтобы они улавливались внешним краем ротовой полости (т.е. слишком большие микросферы, примерно 8 микрон или больше); или (б) такими маленькими, чтобы они абсорбировались глубоко в легких и всасывались системно в кровоток через альвеолы, где они не активны и/или могут быть токсичны (т.е. 0,5 микрона или меньше). Для доставки DAS181-микросфер в горло, трахею и бронхи обычно может подойти диапазон размеров от примерно 1 микрона до примерно 5,5-6 микрон.

Ингалятор можно использовать для лечения любого медицинского состояния, при котором белок или другая макромолекула могут быть введены посредством ингаляционной терапии. Типичные ингаляционные устройства могут включать сухие порошковые ингаляторы, дозирующие ингаляторы и электростатические устройства для доставки. Типичные применения устройства для доставки включают доставку инсулина и других терапевтических белков глубоко в легкое.

В некоторых воплощениях микросферы, изготовленные способами, предложенными в данном изобретении, также могут быть доставлены посредством перорального проглатывания, интраназально, внутривенно, внутримышечно, подкожно и с помощью других способов доставки, подходящих для доставки терапевтических молекул. Размер препаратов микросфер для легочной доставки обычно может лежать в диапазоне от примерно 0,5 микрона до примерно 5-6 микрон, в то время как размер препаратов, предназначенных для других типов доставки, таких как подкожная доставка, парентеральная доставка или внутримышечная доставка, может лежать в диапазоне от примерно или 10 микрон до примерно или 30, 40 или 50 микрон.

В некоторых воплощениях микросферы, предложенные в данном изобретении, не имеют никакого прямого терапевтического эффекта, но могут служить в качестве микроносителей для другого терапевтического агента(ов). Примеры макромолекул, полезных для изготовления таких микросфер, включают, но не ограничиваются этим, полисахариды, гликаны, белки, пептиды, полимеры или их комбинации. Терапевтические агенты или другие активные агенты могут быть добавлены в момент образования микросфер или добавлены в суспензию образованных микросфер. Альтернативно, терапевтические агенты могут быть смешаны с сухими композициями микросфер путем смешивания, галтования или других методик, практикуемых в фармацевтической и пищевой отраслях промышленности.

В некоторых воплощениях в коктейль-раствор препарата для модификации растворимости микросфер и/или повышения их механической прочности могут быть включены сшивающие агенты, липофильные вещества, соли, например соли со слабой растворимостью в водных растворителях, или их комбинации либо другие соединения. Медленное растворение микросфер может быть полезно в терапевтических средствах с замедленным высвобождением, доставляемых посредством перорального проглатывания, ингаляции, интраназально, внутривенно, внутримышечно, подкожно и другими способами доставки, подходящими для доставки терапевтических молекул. В некоторых воплощениях микросферы могут быть доставлены посредством перорального проглатывания в форме пилюли или капсулы с энтеросолюбильным покрытием, которые подвергаются эндоцитозу в двенадцатиперстной кишке, и макромолекула высвобождается в кровоток или другое место воздействия.

В некоторых воплощениях микросферы можно сделать нерастворимыми путем частичной денатурации макромолекулы, которая после доставки ренатурирует и становится биодоступной.

В других воплощениях микросферы являются по существу сферическими по форме и могут иметь средние диаметры в диапазоне от примерно 0,1 микрона до 30,0 микрона. В еще одном другом воплощении средний диаметр микросфер может лежать в диапазоне от примерно 0,5 микрона до 5,0 микрона или от примерно 1,0 микрона до 2,0 микрона.

В еще одном другом аспекте данного изобретения предложены устройства и способы доставки микросфер субъекту, такому как животное или человек, нуждающемуся в медицинском лечении. Подходящие способы доставки могут включать парентеральные, такие как в/м (внутримышечный), в/в (внутривенный) и п/к (подкожный), и непарентеральные, такие как пероральный, трансбуккальный, интратекальный, назальный, легочный, трансдермальный, через слизистые и тому подобные способы доставки. Устройства для доставки могут включать шприцы, как безыгольные, так и игольные, и ингаляторы.

Устройства для доставки могут содержать однократную дозу микросфер для лечения состояния, которое поддается лечению посредством быстрого или замедленного высвобождения макромолекулы in vivo. Количество микросфер, присутствующих в однократной дозе, зависит от типа и активности макромолекулы. Однократная доза может быть выбрана для достижения замедленного высвобождения в течение периода времени, который был оптимизирован для лечения конкретного медицинского состояния. Например, если макромолекула представляет собой слитый белок DAS181 (SEQ ID NO:17), доставляемая дозировка композиций микросфер, содержащих DAS181, может составлять от примерно 0,5 мг белка на дозу до примерно 100 мг белка на дозу, или примерно 0,75 мг, 1 мг, 1,5 мг, 2 мг, 3 мг, 5 мг, 10 мг, 15 мг, 20 мг, 30 мг, 40 мг, 45 мг, 50 мг, 55 мг или 60 мг белка на дозу.

Макромолекулярный компонент микросферы может представлять собой любую молекулу, способную образовывать микросферы в соответствии со способами, предложенными в данном изобретении. В некоторых воплощениях макромолекула представляет собой белок, включая ферменты и рекомбинантные белки, пептиды, углеводы, полисахариды, углевод- или полисахарид-белковые конъюгаты, нуклеиновые кислоты, вирус, вирусные частицы, конъюгаты небольших молекул (таких как гаптен) и белков или их смеси. Органическое или неорганическое природное или синтетическое фармацевтическое соединение или лекарственное средство может быть включено в микросферы путем присоединения лекарственного средства к макромолекуле, такой как белок, и затем образования микросферы из комплекса или конъюгата макромолекулы и лекарственного средства. Специалистам в данной области будет очевидно, что соединение, не способное образовывать третичную и четвертичную структуру, может быть "сформировано" в микросферу посредством включения соединения в молекулу носителя или связывания соединения с молекулой носителя, имеющего третичную и четвертичную структуру. Специалистам в данной области также будет очевидно, что макромолекула может предсталять собой часть такой молекулы, как, например, пептид, одноцепочечный сегмент двуцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты или вирусную частицу либо другую макромолекулу, имеющую третичную и четвертичную структуру.

Термин "макромолекула" также может включать в себя множество макромолекул и включает комбинации различных макромолекул, например комбинация фармацевтического соединения и аффинной молекулы для направленной доставки фармацевтического соединения к ткани, органу или опухоли, требующим лечения. Аффинная молекула может представлять собой, например, лиганд или рецептор. Примеры лигандов могут включать вирусы, бактерии, полисахариды или токсины, которые могут действовать в качестве антигенов для генерирования иммунного ответа при введении животному и вызывать продуцирование антител.

В некоторых воплощениях макромолекула представляет собой терапевтический белок, включая, но не ограничиваясь этим, сиалидазу, сиалидазный слитый белок, слитый белок, содержащий каталитический домен сиалидазы, слитый с GAG-связывающим доменом, протеазу, протеазный ингибитор, инсулин, интерфероны, гормон роста человека, кальцитонин, rhДНКазу или паратиреоидный гормон, а содержание белка микросфер может составлять от примерно или 50% до примерно или 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше. Для введения в легкие микросферы могут иметь средний размер в диапазоне от примерно или 0,5 микрона до примерно или 5,0 микрона, а в некоторых воплощениях от примерно или 1 микрона до примерно или 2 микрон.

Другие белки, которые могут быть использованы для образования микросфер способами, предложенными в данном изобретении, могут включать, но не ограничиваться этим, терапевтические белки, в том числе DAS181 (DAS181; SEQ ID NO:17), α1-антитрипсин, экотин, эглин с, серпин, пульмозим (rhДНКаза), бетаксолол™, диклофенак™, доксорубицин, ацетилцистеин, рифампин™, лейпролида ацетат, высвобождающий фактор лютеинизирующего гормона (LHRH), (D-Tryp6)-LHRH, нафарелина ацетат, инсулин, натрий инсулин, цинк инсулин, протамин, лизоцим, альфа-лактальбумин, основный фактор роста фибробластов (bFGF), бета-лактоглобулин, трипсин, кальцитонин, паратиреоидный гормон, карбоангидразу, овальбумин, бычий сывороточный альбумин (БСА), человеческий сывороточный альбумин (HSA), фосфорилазу b, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу, IgG (иммуноглобулин G), фибриноген, поли-L-лизин, IgM (иммуноглобулин М), дНК, десмопрессина ацетат, высвобождающий фактор гормона роста (GHRF), соматостатин, антид, фактор VIII, G-CSF/GM-CSF (фактор, стимулирующий образование колоний гранулоцитов (и макрофагов)), гормон роста человека (hGH), бета-интерферон, антитромбин III, альфа-интерферон, альфа-интерферон 2b.

Ингаляционное устройство может быть использовано для доставки терапевтического белка, такого как белки, перечисленные выше, или других микросфер на основе макромолекул в дыхательные пути и легкие субъекта. Белковые микросферы могут быть получены, например, путем приведения водного раствора белка в контакт с ионом карбоновой кислоты, таким как цитрат, или сульфатом либо другим противоионом и органическим растворителем, таким как изопропанол, и охлаждения раствора с целью образования микросфер. Белок может представлять собой терапевтический белок, такой как сиалидаза, протеазный ингибитор, инсулин, гормон роста человека, кальцитонин, rhДНКаза или паратиреоидный гормон, и содержание белка в микросферах может составлять от примерно или 70% до примерно или 90% или больше, 95% или больше, или по меньшей мере примерно 99% или больше. Для введения в легкие микросферы, например DAS181-микросферы, могут быть отсортированы по размеру для того, чтобы иметь средний диаметр в диапазоне от примерно 0,5 микрона до 5,0 микрона или от примерно 1 микрона до примерно 2 микрон.

Условия инкубации для образования микросфер можно оптимизировать с целью включения по меньшей мере примерно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или больше от общего количества макромолекул, присутствующих в растворе перед образованием микросфер, путем регулирования параметров, включая pH, температуру, концентрацию макромолекулы или продолжительность взаимодействия или инкубации.

В некоторых воплощениях молекула или соединение, с использованием которых не образуются микросферы с желаемыми характеристиками, могут быть включены в микросферы, имеющие желаемые характеристики, например размер, профиль доставки, механическую прочность, посредством включения соединения в молекулу носителя или связывания соединения с молекулой носителя, который может образовывать микросферы с желаемыми характеристиками. В некоторых воплощениях макромолекула-носитель представляет собой белок, и молекула или соединение связываются внутри и/или на поверхности микросферы. В некоторых воплощениях молекула или соединение также могут служить в качестве противоиона и инициировать и/или ускорять образование микросфер.

При изготовлении микросфер, содержащих белок, для минимизации денатурации белка в процессе образования микросфер перед охлаждением коктейля может быть добавлен стабилизатор белков, такой как глицерин, жирные кислоты, сахара, такие как сахароза, ионы, например цинка, хлорида натрия, или любые другие стабилизаторы белков, известные специалистам в данной области.

В некоторых воплощениях на поверхность микросфер дополнительно может быть нанесено покрытие из подходящих молекул и/или агентов покрытия, например, придающих устойчивость к таким кислотам, как кислоты пищеварительной системы, или протеазам. В других воплощениях микросферы могут быть нековалентно покрыты такими соединениями, как жирные кислоты или липиды. Покрытие можно наносить на микросферы путем погружения в солюбилизированное покрывающее вещество с последующим распылением микросфер вместе с данным веществом или путем использования других способов, известных специалистам в данной области техники. В некоторых воплощениях жирные кислоты или липиды добавляют непосредственно в образующий микросферы коктейль-раствор.

Образование микросфер путем уменьшения температуры может быть осуществлено с использованием большого числа традиционных способов в периодическом или непрерывном режимах. Кроме того, образование микросфер может быть инициировано другими способами, включая, но не ограничиваясь этим, изменение атмосферного давления, силы тяготения или поверхностного расширения, включая введение затравки. Образование микросфер может происходить сразу после воздействия этих условий, или может потребоваться длительный период времени, как предложено в данном изобретении.

Белки

Типичные белки, которые могут быть использованы для образования микрочастиц способами, предложенными в данном изобретении, описаны ниже.

Сиалидазы

Сиалидазы, также обозначаемые как нейраминидазы и N-ацилнейраминосилгликогидролазы, представляют собой семейство экзогликозидаз, катализирующих удаление концевых остатков сиаловой кислоты из сиало-гликоконъюгатов. Сиаловые кислоты представляют собой семейство α-кетокислот с 9 углеродными скелетами, которые обычно находят в крайних положениях олигосахаридных цепей, присоединенных к гликопротеинам и гликолипидам. Эти молекулы вовлечены в разнообразные биологические функции и процессы, такие как регуляция врожденного иммунитета, клеточная адгезия и взаимодействие между воспалительными клетками и клетками-мишенями, возможно опосредованные через связывание различных лектинов (Varki et al. (1992) Curr. Opin. Cell Biol. 4: 257-266). Кроме того, сиаловые кислоты являются отличными источниками углерода, азота, энергии и предшественниками биосинтеза клеточной стенки. Кроме того, сиаловые кислоты на эукариотических клетках могут быть использованы в качестве рецепторов или корецепторов для патогенных микроорганизмов, включая, но не ограничиваясь этим, вирус гриппа, вирус парагриппа, некоторые коронавирусы и ротавирусы, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Helicobacter pylori и Pseudomonas aeruginosa. Наиболее известным членом семейства сиаловых кислот является N-ацетилнейраминовая кислота (Neu5Ac), которая является предшественником в биосинтезе большинства других типов. В природе обнаружены два основных типа связи между Neu5Ac и предпоследними остатками галактозы углеводных боковых цепей - Neu5Ac α(2,3)-Gal и Neu5Ac α(2,6)-Gal. Обе молекулы, Neu5Ac α(2,3)-Gal и Neu5Ac α(2,6)-Gal, могут распознаваться вирусами гриппа и использоваться в качестве рецептора, посредством которого вирус связывается и инициирует инфекцию. Однако вирусы гриппа человека, по-видимому, предпочитают Neu5Ac α(2,6)-Gal, тогда как вирусы птичьего и лошадиного гриппа предпочтительно распознают Neu5Ac α(2,3)-Gal (Ito et al. (2000) Microbiol. Immunol. 44: 423-730). Эпителий дыхательных путей человека экспрессирует обе формы сиаловых кислот, но α(2,6)-связанная сиаловая кислота присутствует в значительно большем количестве по сравнению с α(2,3)-связанной сиаловой кислотой. Низкое относительное содержание α(2,3)-связанной сиаловой кислоты является наиболее вероятной причиной видового барьера для птичьих вирусов и указывает на то, что уменьшение уровня рецепторной сиаловой кислоты, экспрессируемой в эпителии дыхательных путей, вероятно, будет снижать инфекционность вируса гриппа. Таким образом, сиалидазы, которые удаляют терминальные остатки сиаловых кислот из сиало-гликоконъюгатов, сами являются потенциальными терапевтическими агентами против вируса гриппа, функционирование которых приводит к снижению уровней рецепторных сиаловых кислот. Кроме этого сиалидазы могут действовать в качестве терапевтических агентов в отношении любого другого патогена, использующего сиаловые кислоты в процессе инфекции, включая, но не ограничиваясь этим, М. pneumoniae, М. catarrhalis, Н. pylori, Н. influenzae, S. pneumoniae, P. aeruginosa, вирусы парагриппа и некоторые коронавирусы и ротавирусы.

Сиалидазы имеют тенденцию к высокой субстратной специфичности. Они могут распознавать конкретные типы сложных молекул, таких как гликопротеины или гликолипиды; специфические связи между сахарами (например, 2-3, 2-6 или 2-8); или могут быть чувствительными к природе самого связанного сахара (например, D-галактозе, N-ацетил-0-галактозамину). Молекулы субстратов включают, но не ограничиваются этим, олигосахариды, полисахариды, гликопротеины, ганглиозиды и синтетические молекулы. Например, сиалидаза может расщеплять связи, имеющие α(2,3)-Gal, α(2,6)-Gal или α(2,8)-Gal связи между остатками сиаловой кислоты и остальной частью молекулы субстрата. Кроме того, сиалидаза может расщеплять любую связь или все связи между остатком сиаловой кислоты и остальной частью молекулы субстрата. Многие сиалидазные белки были очищены из микроорганизмов и высших эукариот, и для некоторых из них было показано, что они катализируют удаление терминальных остатков сиаловой кислоты, которые могут служить в качестве рецепторов для патогенных микроорганизмов. Например, среди большого числа бактериальных сиалидаз имеются такие, которые могут разрушать рецепторные для вируса гриппа сиаловые кислоты Neu5Ac α(2,6)-Gal и Neu5Ac α(2,3)-Gal, включая сиалидазы из Clostridium perfringens, Actinomyces viscosus, Arthrobacter ureafaciens и Micromonospora viridifaciens. Другие сиалидазы, которые могут служить в качестве терапевтических агентов, включают сиалидазы человека, например, кодируемые генами NEU2 и NEU4.

Слитые белки сиалидаза-GAG

Слитые белки сиалидаза-GAG представляют собой белки, которые созданы из белка сиалидазы, или его каталитически активной части, слитых с гликозаминогликан(GAG)-связывающей последовательностью. Как таковые, эти белки эффективно содержат якорный домен (GAG-связывающую последовательность) и терапевтический домен (белок сиалидазу или его каталитически активную часть). Слитые белки сиалидаза-GAG сконструированы для связывания с эпителием и удаления окружающих сиаловых кислот и поэтому могут быть использованы в качестве терапевтического агента против патогенов, использующих сиаловые кислоты в инфекционном процессе. Способность слитого белка связываться с эпителием увеличивает его удержание (retention) при введении слитого белка, например, в качестве ингаляционного средства для лечения гриппа. GAG-связывающая последовательность действует в качестве домена для заякоривания в эпителии, который "привязывает" сиалидазу к эпителию дыхательных путей и увеличивает ее удержание и эффективность.

Гепарансульфат, близкородственный гепарину, представляет собой тип гликозаминогликана (GAG), повсеместно присутствующий на клеточных мембранах, включая поверхность эпителия дыхательных путей. Многие белки специфически связываются с гепарин/гепарансульфатом, и в этих белках были идентифицированы GAG-связывающие последовательности. Например, было показано, что GAG-связывающие последовательности тромбоцитарного фактора 4 (PF4) человека (SEQ ID NO:3), интерлейкина 8 (IL8) человека (SEQ ID NO:4), антитромбина III человека (AT III) (SEQ ID NO:5), апопротеина E (ApoE) человека (SEQ ID NO:6), человеческого ангиогенез-ассоциированного белка, участвующего в миграции клеток (AAMP) (SEQ ID NO:7), или амфирегулина человека (SEQ ID NO:8) демонстрируют высокую аффинность в отношении гепарина (Lee et al. (1991) PNAS 88: 2768-2772; Goger et al. (2002) Biochem. 41: 1640-1646; Witt et al. (1994) Curr. Bio. 4: 394-400; Weisgraber et al. (1986) J. Bio. Chem. 261: 2068-2076). GAG-связывающие последовательности этих белков отличаются от их рецептор-связывающих последовательностей, поэтому они не индуцируют биологические активности, ассоциированные с полноразмерными белками или рецептор-связывающими доменами. Эти последовательности или другие последовательности, которые могут связывать гепарин/гепарансульфат, могут быть использованы в качестве доменов для заякоривания в эпителии в слитых белках сиалидаза-GAG.

В контексте слитого белка сиалидаза-GAG сиалидаза может включать весь белок сиалидазу или его каталитически активную часть. Например, слитый белок сиалидаза-GAG может содержать белок сиалидазу длиной 901 аминокислота из A. viscosus, приведенный в SEQ ID NO:1. В другом примере слитый белок сиалидаза-GAG может содержать состоящую из 394 аминокислот каталитически активную часть белка сиалидазы из A. viscosus, приведенную в SEQ ID NO:2. GAG-связывающую последовательность можно присоединить к сиалидазе с использованием рекомбинантных методов. В некоторых примерах слитый белок может включать аминокислотный линкер, такой как четыре остатка глицина. Кроме того, связь может осуществляться через N- или С-концы GAG-связывающей последовательности либо N- или С-концы сиалидазы. Типичные примеры слитых белков сиалидаза-GAG включают полипептиды, приведенные в SEQ ID NO: 9-13 и 17. В другом примере компоненты сиалидаза и GAG-связывающая последовательность могут быть соединены с использованием химических или пептидных линкеров любым известным в данной области способом.

Протеиназный ингибитор 8

Протеиназный ингибитор 8 (PI8), также известный как серпин В8, является ингибитором сериновых протеаз (серпин). Серпины представляют собой большое надсемейство структурно родственных белков, которые экспрессируются в вирусах, насекомых, растениях и высших организмах, но не в бактериях или дрожжах. Серпины регулируют активность протеаз, вовлеченных во многие биологические процессы, включая коагуляцию, фибринолиз, воспаление, клеточную миграцию и канцерогенез. Они содержат экспонированную на поверхности реакционноспособную сайт-петлю (RSL, reactive site loop), которая действует в качестве "приманки" для протеаз, имитируя последовательность субстрата для протеазы. После связывания протеазы-мишени с серпином, RSL расщепляется, после чего протеаза ковалентно связывается с серпином. Протеаза во вновь образованном серпин-протеазном комплексе не активна (Huntington et al. (2000) Nature 407: 923-926).

PI8 является членом подсемейства серпинов, прототипом которых является овальбумин цыпленка. Подобно другим принадлежащим к этому семейству серпинам PI8 лишен типичной отщепляемой N-концевой сигнальной последовательности, что дает в результате белок из 374 аминокислот (SEQ ID NO:14), который находится в основном внутри клетки. Другие члены этого подобного человеческому овальбумину подсемейства включают ингибитор активатора плазминогена 2 типа (PAI-2), ингибитор эластазы моноцитов и нейтрофилов (MNEI), антиген плоскоклеточной карциномы (SCCA)-1, лейпин (SCCA-2), маспин (PI5), протеазный ингибитор 6 (PI6), протеазный ингибитор (PI9) и бомапин (PI10). Внутри этого семейства серпины PI6, PI8 и PI9 демонстрируют наиболее высокую структурную гомологию (до 68% аминокислотной идентичности включительно) (Sprecher et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 29854-29861) Показано, что PI-8 ингибирует in vitro трипсин, тромбин, фактор Xa, субтилизин А, фурин, а также химотрипсин. Он выделяется тромбоцитами и, по-видимому, вовлечен в регуляцию активности фурина и, следовательно, агрегацию тромбоцитов (LeBlond et al. (2006) Thromb. Haemost. 95: 243-252).

В дополнение к их роли в регуляции эндогенных биологических процессов, таких как коагуляция, ингибиторы сериновых протеаз также могут функционировать в качестве ингибиторов биологической активности экзогенных микроорганизмов. Например, показано, что ряд ингибиторов сериновых протеаз уменьшает активацию вируса гриппа в культивируемых клетках, куриных эмбрионах и в легких инфицированных мышей. Серпины связываются с молекулами гемагглютинина (НА) на поверхности вируса гриппа и ингибируют его активность, снижая тем самым инфекционность вируса. Например, было показано, что ингибиторы трипсина, такие как: апротинин (Zhimov et al. (2002) J. Virol. 76: 8682-8689), лейпептин (Zhimov et al. (2002) J. Virol. 76: 8682-8689; Tashiro et al. (1987) J. Gen. Virol. 68: 2039-2043), соевый протеазный ингибитор (Barbey-Morel et al. (1987) J. Infect. Dis. 155: 667-672), Б-аминокапроновая кислота (Zhimov et al. 1982. Arch. Virol. 73: 263-272) и н-лара-тозил-L-лизинхлорметилкетон (TLCK) (Barbey-Morel et al. (1987) J. Infect. Dis. 155: 667-672), ингибируют инфицирование вирусом гриппа и являются кандидатами на применение в качестве терапевтических агентов в лечении гриппа. Таким образом, как и родственный ингибитор трипсина, PI8 также может быть использован в качестве терапевтического агента в лечении гриппа.

Поверхностно-активные агенты

Композиции, предложенные в данном изобретении, могут содержать один или более поверхностно-активных агентов, которые добавляют в количестве, достаточном для образования стабильной эмульсии. Соответствующее количество поверхностно-активного агента зависит от неденатурированного белка, возможных дополнительных активных агентов для доставки и других компонентов, присутствующих в эмульсии, так как некоторые агенты могут обладать самоэмульгирующими свойствами, а другие агенты и компоненты влияют на поверхностное натяжение.

Поверхностно-активные агенты для применения в данном изобретении представляют собой вещества, которые при растворении в водном растворе уменьшают поверхностное натяжение раствора или межфазное натяжение между водной фазой и масляной фазой с образованием стабильной эмульсии типа масло-в-воде или вода-в-масле. Молекулы поверхностно-активных веществ являются амфифильными и содержат гидрофильные головные группы и гидрофобные хвосты. В эмульсии молекулы поверхностно-активных веществ образуют разную макромолекулярную структуру, такую как мицеллы, обращенные мицеллы, бислойные липидные структуры (липосомы) и кубосомы. Точная макромолекулярная структура, которая образуется, зависит от относительных размеров гидрофильных и гидрофобных участков поверхности активной молекулы. В некоторых воплощениях поверхностно-активный агент выбран из лаурилсульфата натрия; сорбитанлаурата, сорбитанпальмитата, сорбитанстеарата (поставляемых под торговым названием Span® 20-40-60 и т.д.); полисорбатов, таких как полиоксиэтилена (20) сорбитанмонолаурат, полиоксиэтилена (20) сорбитанмонопальмитат, полиоксиэтилена (20) сорбитанмоностеарат (поставляемых под торговым названием TWEEN® 20-40-60 и т.д.); бензалкония хлорида, фосфолипидов, состоящих из смешанных цепей, катионных липидов, олиголипидов, фосфолипидов, карнитинов, сфингозинов, сфингомиелинов, церамидов, гликолипидов, липопротеинов, апопротеинов, амфифильных белков, амфифильных пептидов, амфифильных синтетических полимеров и их комбинаций. Другие типичные поверхностно-активные агенты для применения в данном изобретении включают, но не ограничиваются этим,

1) природные липиды, т.е. холестерин, сфингозин и производные, ганглиозиды, производные сфингозина (соевые бобы), фитосфингозин и производные (дрожжи), холин (фосфатидилхолин), этаноламин (фосфатидилэтаноламин), глицерин (фосфатидил-DL-глицерин), инозит (фосфатидилинозит), серии (фосфатидилсерин (натриевая соль)), кардиолипин, фосфатидную кислоту, эмбриональные лизо(моноацил)-производные (лизофосфатиды), гидрогенизированные фосфолипиды, экстракты жировой ткани,

2) синтетические липиды, т.е. асимметричную жирную кислоту, симметричную жирную кислоту - насыщенные виды, симметричную жирную кислоту - ненасыщенные виды, ацил-кофермент А (ацетоил-кофермент А, бутаноил-кофермент А, кротаноил-кофермент А, гексаноил-кофермент А, октаноил-кофермент А, деканоил-кофермент А, лауроил-кофермент А, миристоил-кофермент А, пальмитоил-кофермент А, стеароил-кофермент А, олеоил-кофермент А, арахидоил-кофермент А, арахидоноил-кофермент А, бегетоил-кофермент А, трикозаноил-кофермент А, лигноцероил-кофермент А, нервоноил-кофермент А, гексакозаноил-кофермент А),

3) сфинголипиды, т.е. D-эритро(С-18)-производные (сфингозин, такой как: D-эритросфингозин (синтетический), сфингозин-1-фосфат, N,N-диметилсфингозин, N,N,N-триметилсфингозин, сфингозилфосфорилхолин, сфингомиелин и гликозилированный сфингозин), производные церамидов (церамиды, D-эритро-церамид-1-фосфат, гликозилированные церамиды), сфинганин (дигидросфингозин) (сфинганин-1-фосфат, сфинганин (С20), D-эритро-сфинганин, N-ацил-сфинганин С2, N-ацил-сфинганин С8, N-ацил-сфинганин С16, N-ацил-сфинганин С18, N-ацил-сфинганин С24, N-ацил-сфинганин С24:1), гликозилированный (С18)-сфингозин и производные фосфолипидов (гликозилированный сфингозин) (сфингозин, β-D-глюкозил, сфингозин, β-D-галактозил, сфингозин, β-D-лактозил), гликозилированный церамид (D-глюкозил-β1-1'-церамид (С8), D-галактозил-β1-1'-церамид (С8), 0-лактозил-β1-1'-церамид (С8), D-глюкозил-β1-1'-церамид (С12), D-галактозил-β1-1'-церамид (С12), D-лактозил-β1-1'-церамид (С12)), гликозилированный фосфатидилэтаноламин (1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-лактоза), D-эритро(С17)-производные (D-эритро-сфингозин, D-эритро-сфингозин-1-фосфат), D-эритро(С20)-производные (D-эритро-сфингозин), 1-трео(С18)-производные (L-трео-сфингозин, сафингол (L-трео-дигидросфингозин)), производные сфингозина (яйца, головной мозг и молоко) (D-эритро-сфингозин, сфингомиелин, церамиды, цереброзиды, сульфатиды головного мозга), ганглиозиды (ганглиозидные структуры, ганглиозиды из головного мозга овцы, ганглиозиды из головного мозга свиньи), производные сфингозина (соевые бобы) (глюкозилцерамид), фитопроизводные сфингозина (дрожжи) (фитосфингозин, D-рибо-фитосфингозин-1-фосфат, N-ацил-фитосфингозин С2, N-ацил-фитосфингозин С8, N-ацил-фитосфингозин С18),

4) ацил-кофермент А, т.е. ацетоил-кофермент А (аммониевая соль), бутаноил-кофермент А (аммониевая соль), кротаноил-кофермент А (аммониевая соль), гексаноил-кофермент А (аммониевая соль), октаноил-кофермент А (аммониевая соль), деканоил-кофермент А (аммониевая соль), лауроил-кофермент А (аммониевая соль), миристоил-кофермент А (аммониевая соль), пальмитоил-кофермент А (аммониевая соль), стеароил-кофермент А (аммониевая соль), олеоил-кофермент А (аммониевая соль), арахидоил-кофермент А (аммониевая соль), арахидоноил-кофермент А (аммониевая соль), бегетоил-кофермент А (аммониевая соль), трикозаноил-кофермент А (аммониевая соль), лигноцероил-кофермент А (аммониевая соль), нервоноил-кофермент А (аммониевая соль), гексакозаноил-кофермент А (аммониевая соль), докозагексаеноил-кофермент А (аммониевая соль),

5) окисленные липиды, те. 1-пальмитоил-2-азелаоил-sn-глицеро-3-фосфохолин, 1-O-гексадецил-2-азелаоил-зп-глицеро-3-фосфохолин, 1-пальмитоил-2-глутароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (PGPC), 1-пальмитоил-2-(9'-оксо-нонаноил)-sn-глицеро-3-фосфохолин, 1-пальмитоил-2-(5'-оксо-валероил)-sn-глицеро-3-фосфохолин,

6) липиды с простой эфирной связью, т.е.: липиды с двумя простыми эфирными связями (диалкил-фосфатидилхолин, липиды с дифитаниловой простой эфирной связью), алкил-фосфохолин (додецилфосфохолин), О-алкил-диацилфосфатидилхолиний (1,2-диацил-5 л-глицеро-3-этилфосфохолин), синтетический PAF (фактор активации тромбоцитов) и производные (1-алкил-2-ацил-глицеро-3-фосфохолин и производные),

7) флуоресцентные липиды, т.е.: на основе глицерина (фосфатидилхолин (NBD (7-(4-нитро-2,1,3-(¹⁴С)бензоксадиазол)), фосфатидная кислота (NBD), фосфатидилэтаноламин (NBD), фосфатидилглицерин (NBD), фосфатидилсерин (NBD)), на основе сфингозина (церамид (NBD), сфингомиелин (NBD), фитосфингозин (NBD), галактозил-цереброзид (NBD)), меченные по головной группе липиды (на основе глицерина) (фосфатидилэтаноламин (NBD), фосфатидилэтаноламин (лиссамин, родамин В), диолеоил-фосфатидилэтаноламин (дансил, пирен, флуоресцеин), фосфатидилсерин (NBD), фосфатидилсерин (дансил)), 25-МВО-холестерин,

8) другие липиды, включая, но не ограничиваясь этим, лецитин, Ultralec-P (от ADM (Archer Daniels Midland)), соевый порошок,

9) поверхностно-активные вещества, включая, но не ограничиваясь этим, полиэтиленгликоль 400; лаурилсульфат натрия; сорбитанлаурат, сорбитанпальмитат, сорбитанстеарат (поставляемые под торговым названием Span® 20-40-60 и т.д.); полисорбаты, такие как полиоксиэтилена (20) сорбитанмонолаурат, полиоксиэтилена (20) сорбитанмонопальмитат, полиоксиэтилена (20) сорбитанмоностеарат (поставляемые под торговым названием TWEEN® 20-40-60 и т.д.); бензалкония хлорид.

В некоторых воплощениях фосфолипиды для применения представляют собой фосфатидилхолины, фосфатидилэтаноламины, фосфатидилсерины, фосфатидилглицерины, фосфатидилинозиты, фосфатидные кислоты, состоящие из разнородных цепей фосфолипиды, лизофосфолипиды, гидрогенизированные фосфолипиды, частично гидрогенизированные фосфолипиды и их смеси.

В некоторых воплощениях поверхностно-активный агент выбран из полисорбата-80, лецитина и фосфатидилхолина. Поверхностно-активные агенты представлены в количестве, достаточном для образования стабильной эмульсии.

Количество поверхностно-активного агента можно определить эмпирически, и оно зависит от выбранного агента и желаемой формы изготовленной композиции. Введенное количество может составлять от менее чем 0,1% по массе до 35% включительно или больше. В некоторых воплощениях поверхностно-активный агент присутствует в концентрации от примерно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% по массе до примерно 30% включительно по массе от общей массы композиции. В некоторых воплощениях поверхностно-активный агент присутствует в концентрации от примерно 1 масс.% до примерно 20 масс.% включительно от общей массы композиции. В некоторых воплощениях поверхностно-активный агент присутствует в концентрации от примерно 1 масс.% до примерно 15 масс.% включительно от общей массы композиции. В других воплощениях поверхностно-активный агент присутствует в концентрации от примерно 1 масс.% до примерно 10 масс.% включительно от общей массы композиции. В других воплощениях поверхностно-активный агент присутствует в концентрации от примерно 1 масс.% до примерно 8 масс.% включительно от общей массы композиции. В других воплощениях поверхностно-активный агент присутствует в концентрации от примерно 1 масс.% до примерно 6 масс.% включительно от общей массы композиции. В других воплощениях поверхностно-активный агент присутствует в концентрации от примерно 1 масс.% до примерно 4 масс.% включительно от общей массы композиции. В других воплощениях поверхностно-активный агент присутствует в концентрации примерно 20 масс.% от общей массы композиции. В других воплощениях поверхностно-активный агент присутствует в концентрации примерно 15 масс.% от общей массы композиции. В других воплощениях поверхностно-активный агент присутствует в концентрации примерно 13 масс.% от общей массы композиции. В других воплощениях поверхностно-активный агент присутствует в концентрации примерно 11 масс.% от общей массы композиции. Б других воплощениях поверхностно-активный агент присутствует в концентрации примерно 8 масс.% от общей массы композиции. В других воплощениях поверхностно-активный агент присутствует в концентрации примерно 6 масс.% от общей массы композиции. В других воплощениях поверхностно-активный агент присутствует в концентрации примерно 4 масс.% от общей массы композиции. В других воплощениях поверхностно-активный агент присутствует в концентрации примерно 2 масс.% от общей массы композиции. В других воплощениях поверхностно-активный агент присутствует в концентрации примерно 1 масс.% от общей массы композиции.

Стабильные эмульсии, предложенные в данном изобретении, могут содержать один или более разбавителей для доставки, выбранных из мицелл, липосом и кубосом и их смесей, или макромолекулярных ансамблей неденатурированных белков, таких как трубочки, спирали, сферы и тому подобное, которые могут инкапсулировать дополнительные питательные вещества или активные агенты. Разбавители для доставки, инкапсулирующие активный агент, затем всасываются в эпителий, куда доставляются неденатурированные белки и/или дополнительные питательные вещества/активные агенты.

Возможные дополнительные агенты

Композиции, предложенные в данном изобретении, в дополнение к неденатурированным белкам, возможно, могут содержать один или более чем один фармацевтический или нутрицевтический либо другой подобный агент для проглатывания субъектом. Обычно агентами являются такие, которые играют роль в организме реципиента, например в имунной регуляции, регуляции биохимических процессов или ферментативной активности. Любой агент, который может быть изготовлен, как описано в данном изобретении, можно вводить в композициях, предложенных в данном изобретении. Если агент является терапевтическим, композиции содержат терапевтически эффективное количество доставляемого агента. Конкретное количество активного агента в дозировке будет широко варьировать в соответствии с природой активного агента, природой состояния, которое лечат, возрастом и размером субъекта и другими параметрами.

Обычно количество дополнительного активного агента или питательного вещества, за исключением неденатурированных белков, в композиции будет варьировать от менее чем примерно 0,01% по массе до примерно 20% по массе композиции или более, и в типичном случае они изготавливаются для введения однократной дозировки. Однократная дозировка может варьировать от примерно 0,01 мкг до 10 мг агента на килограмм массы тела реципиента, причем обычно применяют дозировки от примерно 0,1 мкг до 1 мг/кг. Однако эти концентрации представляют собой только общие руководства, а конкретные количества и дозировки, которые могут быть выбраны на основе вводимого активного агента, состояния, которое лечат, и применяемого режима лечения, означают количество лекарственного средства или активного агента, достаточное для обеспечения желаемого местного или системного эффекта и действия с разумным соотношением польза/риск по отношении к субъекту при осуществлении какого-либо медицинского лечения.

Агенты могут быть выбраны из неорганических и органических лекарственных средств, включая, но не ограничиваясь этим, лекарственные средства, воздействующие на периферические нервы, адренергические рецепторы, холинергические рецепторы, нервную систему, скелетные мышцы, сердечно-сосудистую систему, гладкие мышцы, систему кровообращения, синаптические сайты, сайты нейроэффекторных соединений, эндокринную систему, гормональные системы, иммунологическую систему, репродуктивную систему, скелетную систему, аутакоидные системы, пищеварительную и выделительную системы, гистаминные системы и тому подобное. Активные агенты, которые могут быть доставлены с использованием композиций, предложенных в данном изобретении, включают, но не ограничиваются этим, противосудорожные средства, аналгетики, противопаркинсонические средства, противовоспалительные средства, антагонисты кальция, анестетики, противомикробные средства, противомалярийные средства, противопаразитарные средства, антигипертензивные средства, антигистамины, жаропонижающие средства, альфа-адренергические агонисты, альфа-блокаторы, биоциды, бактерицидные вещества, бронходилататоры, бета-адренергические блокирующие лекарственные средства, контрацептивы, сердечно-сосудистые лекарственные средства, ингибиторы кальциевых каналов, успокоительные средства, диагностические вещества, диуретики, электролиты, ферменты, снотворные средства, гормоны, гипогликемические средства, гипергликемические средства, средства, способствующие мышечному сокращению, миорелаксанты, противоопухолевые средства, гликопротеины, нуклеопротеины, липопротеины, офтальмические средства, транквилизаторы, седативные средства, стероиды, симпатомиметические средства, парасимпатомиметические средства, транквилизаторы, лекарственные средства для лечения мочевых путей, вакцины, вагинальные лекарственные средства, витамины, минералы, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, ангиотензин-превращающие ферменты, полинуклеотиды, полипептиды, полисахариды и пищевые добавки, включая добавки на основе трав.

Уровень доставляемого агента составляет от примерно 0,01% до примерно 50% включительно, от примерно 0,1% до примерно 40% включительно, от примерно 0,1% до примерно 30% включительно, от примерно 0,1% до примерно 20% включительно, от примерно 0,1% до примерно 10% включительно, от примерно 0,1% до примерно 9% включительно, от примерно 0,1% до примерно 8% включительно, от примерно 0,1% до примерно 7% включительно, от примерно 0,1% до примерно 6% включительно, от примерно 0,1% до примерно 5% включительно, от примерно 0,1% до примерно 4% включительно, от примерно 0,1% до примерно 3% включительно, от примерно 0,1% до примерно 2% включительно, от примерно 0,1% до примерно 1% включительно по массе композиции. Доставляемый агент может быть водорастворимым, слабо растворимым в воде или растворимым в масле. В некоторых воплощениях доставляемый агент выбран из противосудорожных средств, аналгетиков, противопаркинсонических средств, противовоспалительных средств, антагонистов кальция, анестетиков, противомикробных средств, противомалярийных средств, противопаразитарных средств, антигипертензивных средств, антигистаминов, жаропонижающих средств, альфа-адренергических агонистов, альфа-блокаторов, биоцидов, бактерицидных веществ, бронходилататоров, бета-адренергических блокирующих лекарственных средств, контрацептивов, сердечно-сосудистых лекарственных средств, ингибиторов кальциевых каналов, успокоительных средств, диагностических веществ, диуретиков, электролитов, ферментов, снотворных средств, гормонов, гипогликемических средств, гипергликемических средств, средств, способствующих мышечному сокращению, миорелаксантов, противоопухолевых средств, гликопротеинов, нуклеопротеинов, липопротеинов, неденатурированного сывороточного белка, офтальмических средств, транквилизаторов, седативных средств, стероидов, симпатомиметиков, парасимпатомиметиков, транквилизаторов, лекарственных средств для лечения мочевых путей, вакцин, вагинальных лекарственных средств, витаминов, минералов, нестероидных противовоспалительных лекарственных средств, ангиотензин-превращающих ферментов, полинуклеотидов, полипептидов, полисахаридов и пищевых добавок, включая добавки на основе трав.

В некоторых воплощениях активный агент выбран из следующего:

α-адренергических агонистов, таких как адрафинил, адренолон, амидефрин, апраклонидин, будралазин, клонидин, циклопентамин, детомидин, диметофрин, дипивефрин, эфедрин, эпинефрин, феноксазолин, гуанабенз, гуанфацин, гидроксиамфетамин, ибопамин, инданазолин, изометептен, мефентермин, метараминол, метоксамина гидрохлорид, метилгексанамин, метизолен, мидодрин, нафазолин, норэпинефрин, норфенефрин, октодрин, октопамин, оксиметазолин, фенилэфрина гидрохлорид, фенилпропаноламина гидрохлорид, фенилпропилметиламин, фоледрин, пропилгекседрин, псевдоэфедрин, рилменидин, синефрин, тетрагидрозолин, тиаменидин, трамазолин, туаминогептан, тимазолин, тирамин и ксилометазолин;

β-адренергических агонистов, таких как альбутерол, бамбутерол, битолтерол, карбутерол, кленбутерол, клорпреналин, денопамин, диоксетедрин, допексамин, эфедрин, эпинефрин, этафедрин, этилнорэпинефрин, фенотерол, формотерол, гексопреналин, ибопамин, изоэтарин, изопротеренал, мабутерол, метапротеренол, метоксифенамин, оксифедрин, пирбутерол, преналтерол, прокатерол, протокилол, репротерол, римитерол, ритодрин,сотеренол,тербутерол и ксамотерол;

α-адренергических блокаторов, таких как амосулалол, аротинолол, дапипразол, доксазозин, эрголоида мезилаты, фенспирид, индорамин, лабеталол, нисерголин, празозин, теразозин, толазолин, тримазозин и йохимбин;

β-адренергических блокаторов, таких как ацебутолол, алпренолол, амосулалол, аротинолол, атенолол, бефунолол, бетаксолол, бевантолол, бисопролол, бопиндолол, букумолол, бефетолол, буфуралол, бунитролол, бупранолол, бутидрина гидрохлорид, бутофилолол, каразопол, картеолол, карведилол, целипролол, цетамолол, клоранолол, дилевалол, эпанолол, эсмолол, инденолол, лабеталол, левобунолол, мепиндслол, метипраналол, метопролол, мопролол, надоксолол, нифеналол, нипрадилол, окспренолол, пенбутолол, пиндолол, практолол, пронеталол, пропранолол, соталол, сульфиналол, талинолол, тертатолол, тимолол, толипролол и ксибенолол;

средств, выводящих алкоголь, таких как цианамид кальция, подкисленный лимонной кислотой, дисульфирам, надид и нитрефазол;

ингибиторов альдозоредуктазы, таких как эпалрестат, поналрестат, сорбинил и толрестат;

анаболических веществ, таких как андроизоксазол, андростендиол, боландиол, боластерон, клостебол, этилэстренол; формилдиенолон, 4-гидрокси-19-нортестостерон, метандриол, метенолон, метилтриенолон, нандролон, нандролона деканоат, нандролона пара-гексилоксифенилпропионат, нандролона фенпропионат, норболетон, оксиместерон, пизотилин, хинболон, стенболон и тренболон;

аналгетиков (стоматологических), таких как хлорбутанол, клов и эугенол;

аналгетиков (наркотических), таких как алфентанил, аллилпродин, альфапродин, анилеридин, бензилморфин, безитрамид, бупренорфин, буторфанол, клонитазен, кодеин, кодеина метилбромид, кодеина фосфат, кодеина сульфат, дезоморфин, декстроморамид, дезоцин, диампромид, дигидрокодеин, дигидрокодеинона енолацетат, дигидроморфин, дименоксадол, димефептанол, диметилтиамбутен, диоксафетилбутират, дипипанон, эптазоцин, этогептазин, этилметилтиамбутен, этилморфин, этонитазен, фентанил, гидрокодон, гидрокодона битартрат, гидроморфон, гидроксипетидин, изометадон, кетобемидон, леворфанол, лофентанил, меперидин, мептазинол, метазоцин, метадона гидрохлорид, метопон, морфин, производные морфина, мирофин, налбуфин, нарцеин, никоморфин, норлеворфанол, норметадон, норморфин, норпипанон, опий, оксикодон, оксиморфон, папаверет, пентазоцин, фенадоксон, феназоцин, феоперидин, пиминодин, пиритрамид, прогептазин, промедол, проперидин, пропирам, пропоксифен, суфентанил и тилидин;

аналгетиков (ненаркотических), таких как ацетаминофен, ацетаминосалол, ацетанилид, ацетилсалициловая кислота, алклофенак, алминопрофен, алоксиприн, алюминия бис(ацетилсалицилат), аминохлортеноксазин, 2-амино-4-пиколин, аминопропилон, аминопирин, аммония салицилат, антипирин, антипирина салицилат, антрафенин, апазон, аспирин, бенорилат, беноксапрофен, бензпиперилон, бензидамин, пара-бромацетанилид, 5-бромсалициловой кислоты ацетат, буцетин, буфексамак, бумадизон, бутацетин, кальция ацетилсалицилат, карбамазепин, карбетидин, карбифен, карсалам, хлоралантипирин, хлортеноксазин, холина салицилат, синхофен, сирамадол, клометацин, кропропамид, кротетамид, дексоксадрол, дифенамизол, дифлунизал, дигидроксиалюминия ацетилсалицилат, дипироцетил, дипирон, эморфазон, энфенамовая кислота, эпиризол, этерсалат, этензамид, этоксазен, этодолак, фелбинак, фенопрофен, флоктафенин, флуфенамовая кислота, флуорезон, флупиртин, флупроквазон, флурбипрофен, фосфозал, гентизиновая кислота, глафенин, ибуфенак, имидазола салицилат, индометацин, индопрофен, изофезолак, изоладол, изониксин, кетопрофен, кеторолак, пара-лактофенетид, лефетамин, локсопрофен, лизина ацетилсалицилат, магния ацетилсалицилат, метотримепразин, метофолин, миропрофен, моразон, морфолина салицилат, напроксен, нефопам, нифеназон, 5'-нитро-2'-пропоксиацетанилид, парсалмид, перизоксал, фенацетин, феназопиридина гидрохлорид, феноколл, фенопиразон, фенил-ацетилсалицилат, фенил-салицилат, фенирамидол, пипебузон, пиперилон, продилидин, пропацетамол, пропифеназон, проксазол, хинина салицилат, рамифеназон, римазолия метилсульфат, салацетамид, салицин, салициламид, салициламида О-уксусная кислота, салицилсерная кислота, салсалат, салверин, симетрид, натрия салицилат, сульфамипирин, супрофен, талнифлумат, теноксикам, терофенамат, тетрадрин, тиноридин, толфенамовая кислота, толпронин, трамадол, виминол, ксенбуцин и зомепирак;

андрогенов, таких как андростерон, болденон, дегидроэпиандростерон, флуоксиместерон, местанолон, местеролон, метандростенолон, 17-метилтестостерон, 17α-метилтестостерона 3-циклопентил-еноловый простой эфир, норэтандролон, норметандрон, оксандролон, оксиместерон, оксиметолон, прастерон, станлолон, станозолол, тестостерон, тестостерона 17-хлораля гемиацеталь, тестостерона 17β-ципионат, тестостерона энантат, тестостерона никотинат, тестостерона фенилацетат, тестостерона пропионат и тиоместерон;

анестетиков, таких как ацетамидоэвгенол, альфадолона ацетат, альфаксалон, амукаин, амоланон, амилокаина гидрохлорид, беноксинат, бензокаин, бетоксикаин, бифенамин, бипивакаин, бутакаин, бутабен, бутаниликаин, буретамин, буталитал натрия, бутоксикаин, картикаин, 2-хлорпрокаина гидрохлорид, кокаэтилен, кокаин, циклометикаин, дибукаина гидрохлорид, диметизохин, диметокаин, диперадона гидрохлорид, диклонин, экгонидин, экгонин, этил-аминобензоат, этилхлорид, этидокаин, этоксадрол, β-эукаин, эупроцин, феналкомин, фомокаин, гексобарбитал, гексилкаина гидрохлорид, гидроксидион натрия, гидроксипрокаин, гидрокситетракаин, изобутил-пара-аминобензоат, кентамин, лейцинокаина мезилат, левоксадрол, лидокаин, мепивакаин, меприлкаина гидрохлорид, метабутоксикаина гидрохлорид, метогекситал натрия, метилхлорид, мидазолам, миртекаин, наепаин, октакаин, ортокаин, оксетазаин, парэтоксикаин, фенакаина гидрохлорид, фенциклидин, фенол, пиперокаин, пиридокаин, полидоканол, прамоксин, прилокаин, прокаин, пропанидид, пропанокаин, пропаракаин, пропипокаин, пропофол, пропоксикаина гидрохлорид, псевдококаин, пиррокаин, хинина мочевины гидрохлорид, ризокаин, салициловый спирт, тетракаина гидрохлорид, тиалбарбитал, тимилал, тиобутабарбитал, тиопентал натрия, толикаин, тримекаин и золамин;

понижающих аппетит средств, таких как аминорекс, амфеклорал, амфетамин, бензафетамин, хлорфентермин, клобензорекс, клофорекс, клортермин, циклекседрин, дестроамфетамина сульфат, диэтилпропион, дифеметоксидин, N-этиламфетамин, фенбутразат, фенфлурамин, фенпропорекс, фурфурилметиламфетамин, левофацетоперат, мазиндол, мефенорекс, метамфепроамон, метамфетамин, норпсевдоэфедрин, фендиметразин, фендиметразина тартрат, фенметразин, фенпентермин, фенилпропаноламина гидрохлорид и пицилорекс;

антигельминтных средств (против цестод), таких как ареколин, аспидин, аспидинол, дихлорфен, эмбелин, козин, нафталин, никлозамид, пеллертиерин, пеллертиерина таннат и хинакрин;

антигельминтных средств (против нематод), таких как алантолактон, амосканат, аскаридол, бефений, битосканат, четыреххлористый углерод, карвакрол, циклобендазол, диэтилкарбамазин, дифенан, дитиазанина йодид, димантин, гентиан фиолетовый, 4-гексилрезорцинол, каиновая кислота, мебендазол, 2-наптол, оксантел, папаин, пиперазин, пиперазина адипат, пиперазина цитрат, пиперазина кальция эдетат, пиперазина тартрат, пирантел, пирвиния памоат, α-сантонин, стилбазия йодид, тетрахлорэтилен, тетрамизол, тиабендазол, тимол, тимил-N-изоамилкарбамат, триклофенола пиперазин и мочевины стибамин;

антигельминтных средств (против онкоцеркоза), таких как ивермектин и сурамин натрия;

антигельминтных средств (против шистосомы), таких как амосканат, амфоталид, сурьмы калия тартрат, сурьмы натрия глюконат, сурьмы натрия тартрат, сурьмы натрия тиогликолат, сурьмы тиогликолламид, бекантон, гикантон, лукантона гидрохлорид, ниридазол, оксамнихин, празиквантел, стибокаптат, стибофен и мочевины стибамин;

антигельминтного средства (против трематод), такого как антиолимин и тетрахлорэтилен;

лекарственных средств против акне, таких как адапелен, алгестона ацетофенид, азелаиновая кислота, пероксид бензоила, циоктол, ципротерон, мотретинид, резорцинол, ретиноевая кислота, тетрохинон и третинонин;

антиаллергических средств, таких как амлексанокс, астемизол, азеластин, кромолин, фенпипран, гистамин, ибудиласт, недокромил, оксатомид, пентигетид, экстракт сумаха ядовитого, экстракт сумаха укореняющегося, экстракт сумаха лакового, репиринаст, траниласт, траксанокс и урушиол;

противоамебных средств, таких как арстинол, биаламикол, карбарзон, цефаелин, хлорбетамид, хлорохин, хлорфеноксамид, хлортетрациклин, дегидроэметин, дибромпропамидин, дилоксанид, дефетарзон, эметин, фумагиллин, глаукарубин, гликобиарзол, 8-гидрокси-7-йод-5-хинолинсульфоновая кислота, йодхлоргидроксихин, йодхинол, паромомицин, фанхинон, феарзона сульфоксилат, полибензарсол, пропамидин, хинфамид, секнидазол, сульфарсид, теклозан, тетрациклин, тиокарбамизин, тиокарбарзон и тинидазол;

антиандрогенов, таких как бифлуранол, циоктол, ципротерон, делмадинона ацетат, флутимид, нилутамид и оксендолон;

антиангинальных средств, таких как ацебутолол, алпренолол, амиодарон, амлодипин, аротинолол, атенолол, бепридил, бевантолол, букумолол, буфетолол, буфуралол, бунитролол, бупранолол, карозолол, картеолол, карведилол, целипролол, цинепазета малеат, дильтиазем, эпанолол, фелодипин, галлопамил, имоламин, инденолол, изосорбида динитрат, израдипин, лимапрост, мепиндолол, метопролол, молзидомин, надолол, никардипин, нифедипин, нифеналол, нилвадипин, нипрадилол, низолдипин, нитроглицерин, окспренолол, оксифедрин, озагрел, пенбутолол, пентаэритрита тетранитрат, пиндолол, пронеталол, пропранолол, соталол, теродилин, тимолол, толипролол и верапамил;

антиаритмических средств, таких как ацебутол, ацекаин, аденозин, аймалин, алпренолол, амиодарон, амопроксан, априндин, аротинолол, атенолол, бевантолол, бретилия тозилат, бубумолол, буфетолол, бунафтин, бунитролол, бупранолол, бутидрина гидрохлорид, бутобендин, капобеновая кислота, каразолол, картеолол, цифенлин, клоранолол, дизопирамид, энкаинид, эсмолол, флекаинид, галлопамил, гидрохинидин, индекаинид, инденолол, ипратропия бромид, лидокаин, лораймин, лоркаинид, меобентин, метипранолол, мексилетин, морисизин, надоксолол, нифеналол, окспренолол, пенбутолол, пиндолол, пирменол, практолол, праймалин, прокаинамида гидрохлорид, пронеталол, пропафенон, пропранолол, пиринолин, хинидина сульфат, хинидин, соталол, талинолол, тимолол, токаинид, верапамил, виквидил и ксибенолол;

антиартериосклеротических средств, таких как пиридинола карбамат;

противоартритных/противоревматических средств, таких как аллокупреид натрия, ауронафин, ауротиоглюкоза, ауротиогликанид, азатиоприн, кальция 3-ауротио-2-пропанол-1-сульфонат, целекоксиб, хлорохин, клобузарит, купроксолин, диацереин, глюкозамин, золота натрия тиомалат, золота натрия тиосульфат, гидроксихлорохин, кебузон, лобензарит, мелиттин, метотрексат, миорал и пеницилламин;

антибактериальных (антибиотических) лекарственных средств, включая: аминогликозиды, такие как амикацин, апрамицин, арбекацин, бамбермицины, бутирозин, дибекацин, дигидрострептомицин, фортимицин(ы), гентамицин, испамицин, канамицин, микрономицин, неомицин, неомицина ундециленат, нетилмицин, паромомицин, рибостамицин, сисомицин, спектиномицин, стрептомицин, стрептоникоцид и тобрамицин;

амфениколов, таких как азидамфеникол, хлорамфеникол, хлорамфеникола пальмитат, хлорамфеникола пантотенат, флорфеникол и тиамфеникол;

ансамицинов, таких как рифамид, рифампин, рифамицин и рифаксимин;

β-лактамов, включая: карбапенемы, такие как имипенем;

цефалоспоринов, таких как цефактор, цефадроксил, цефамандол, цефатризин, цефазедон, цефазолин, цефиксим, цефменоксим, цефодизим, цефоницид, цефоперазон, цефоранид, цефотаксим, цефотиам, цефпимизол, цефпиримид, цефподоксим проксетил, цефроксадин, цефсулодин, цефтазидим, цефтерам, цефтезол, цефтибутен, цефтизоксим, цефтриаксон, цефуроксим, цефузонам, цефасетрил натрия, цефапексин, цефалоглицин, цефалоридин, цефалоспорин, цефалотин, цефапирин натрия, цефрадин и пивцефалексин;

цефамицинов, таких как цефбуперазон, цефметазол, цефминокс, цефетан и цефокситин;

монобактамов, таких как азтреонам, карумонам и тигемонам;

оксацефемов, таких как фломоксеф и моксолактам;

пенициллинов, таких как амидиноциллин, амидиноциллин пивоксил, амоксициллин, ампициллан, апалциллин, аспоксициллин, азидоциллан, азлоциллан, бакампициллин, бекзилпенициллиновая кислота, бензилпенициллин натрия, карбенициллин, карфециллин натрия, кариндациллин, клометоцилл для инъекций, клоксацилл для инъекций, циклациллин, диклоксациллин, дифенициллин натрия, зпициллин, фенбенициллин, флоксициллин, гетациллин, ленампициллин, метампициллин, метициллин натрия, мезлоциллин, нафциллин натрия, оксациллин, пенамециллин, пенетамата гидройодид, пенициллина G бенетамин, пенициллина G бензатин, пенициллина G бензгидриламин, пенициллин G кальций, пенициллина G гидрабамин, пенициллин G калий, пенициллина G прокаин, пенициллин N, пенициллин О, пенициллин V, пенициллина V бензатин, пенициллина V гидрабамин, пенимепициклин, фентициллин калий, пиперациллин, пивапициллин, пропициллин, хинациллин, салбенициллин, талампициллин, темоциллин и тикарциллин;

линкозамидов, таких как клиндамицин и линкомицин;

макролидов, таких как азитроимицин, карбомицин, кларитромицин, эритромицин, эритромицина ацистрат, эритромицина эстолат, эритромицина глюкогептонат, эритромицина лактобионат, эритромицина пропионат, эритромицина стеарат, иозамицин, лейкомицины, мидекамицины, миокамицин, олеандомицин, примицин, рокитамицин, розарамицин, рокситромицин, спирамицин и тролеандомицин;

полипептидов, таких как амфомицин, бацитрацин, капреомицин, колистин, эндурацидин, энвиомицин, фузафунгин, грамицидин(ы), грамицидин S, микамицин, полимиксин, полимиксина В-метансульфоновая кислота, пристинамицин, ристоцетин, тейкопланин, тиострептон, туберактиномицин, тироцидин, тиротрицин, ванкомицин, биомицин, виомицина пантотенат, виргиниамицин и бацитрацин цинк;

тетрациклинов, таких как апициклин, хлортетрациклин, кломоциклин, демеклоциклин, доксициклин, гуамециклин, лимециклин, меклоциклин, метациклин, миноциклин, окситетрациклин, пенимепициклин, пипациклин, ролитетрациклин, санциклин, сеноциклин и тетрациклин; и

других антибиотиков, таких как циклосерин, мупироцин и туберин;

антибактериальных лекарственных средств (синтетических), включая: 2,4-диаминопиримидины, такие как бродимоприм, тетроксоприм и триметоприм;

нитрофуранов, таких как фуралтадон, фуразолия хлорид, нифураден, нифурател, нифурфолин, нифурпиринол, нифурпразин, нифуртоинол и нитрофурантоин;

хинолонов и аналогов, таких как амифлоксацин, циноксацин, ципрофлоксацин, дифлоксацин, эноксацин, флероксацин, флумехин, ломефлоксацин, милоксацин, налидиксиновая кислота, норфлоксацин, офлоксацин, оксолиновая кислота, пефлоксацин, пипемидиновая кислота, пиромидиновая кислота, розоксацин, темафлоксацин и тосуфлоксацин;

сульфамидов, таких как ацетил-сульфаметоксипиразин, ацетил-сульфизоксазол, азосульфамид, бензилсульфамид, хлорамин-В, хлорамин-Т, дихлорамин Т, формосульфатиазол, N₂-формилсульфизомидин, N²-β-D-глюкозилсульфаниламид, мафенид, 4'-(метилсульфамоил)сульфаниланилид, лара-нитросульфатиазол, ноприлсульфамид, фталилсульфацетамид, фталилсульфатиазол, салазосульфадимидин, сукцинилсульфатиазол, сульфабензамид, сульфацетамид, сульфахлорпиридазин, сульфахризоидин, сульфацитин, сульфадиазин, сульфадикрамид, сульфадиметоксин, сульфадоксин, сульфаэтидол, сульфагуанидин, сульфагуанол, сульфален, сульфалоксиновая кислота, сульфамеразин, сульфаметер, сульфаметазин, сульфаметизол, сульфаметомидин, сульфаметоксазол, сульфаметоксипиридазин, сульфаметрол, сульфамидокризоидин, сульфамоксол, сульфаниламид, сульфаниламидометансульфоновой кислоты триэтаноламиновая соль, 4-сульфаниламидосалициловая кислота, N-сульфанилилсульфаниламид, сульфанилилмочевина, N-сульфанилил-3,4-ксиламид, сульфанитран, сульфаперин, сульфафеназол, сульфапроксилин, сульфапиразин, сульфапиридин, сульфазомизол, сульфазимазин, сульфатиазол, сульфатиомочевина, сульфатоламид, сульфизомидин и сульфизоксазол;

сульфонов, таких как ацедапсон, ацедиасульфон, ацетосульфон натрия, дапсон, диатимосульфон, глюкосульфон натрия, соласульфон, сукцисульфон, сульфаниловая кислота, пара-сульфанилилбензиламин, п,п'-сульфонилдианилин-N,N'-дигалактозид, сульфоксон натрия и тиазолсульфон; и

других средств, таких как клофоктол, гекседин, метенамин, метенамина ангидрометилен-цитрат, метенамина гиппурат, метенамина манделат, метенамина субсалицилат, нитроксолин и ксиборнол;

антихолинергических средств, таких как адифенина гидрохлорид, алверин, амбутономия бромид, аминопентамид, амиксетрин, ампротропина фосфат, анизотропина метилбромид, апоатропин, атропин, атропина N-оксид, бенактизин, бенапризин, бензетимид, бензилония бромид, бензтропина мезилат, бевония метилсульфат, бипериден, бутропия бромид, N-бутилскопол-аммония бромид, бузепид, камилофин, карамифена гидрохлорид, хлорбензоксамин, хлорфеноксамин, циметропия бромид, клидиния бромид, циклодрин, циклония йодид, цикримина гидрохлорид, дептропин, дексетимид, дибутолина сульфат, дицикломина гидрохлорид, диэтазин, дифемерин, дигексиверин, дифеманил-метилсульфат, N-(1,2-дифенилэтил)-никотинамид, дипипроверин, дипония бромид, эмепрония бромид, эндобензилина бромид, этопропазин, этибензтропин, этилбензгидрамин, этомидолин, эукатропин, фенпивериния бромид, фентония бромид, флутропия бромид, гликопирролат, гетерония бромид, гексоциклия метилсульфат, гоматропин, гиосциамин, ипратропия бромид, изопропамид, левомепат, меклоксамин, мепензолата бромид, меткарафен, метантелина бромид, метиксен, метскополамина бромид, октамиламин, оксибутинина хлорид, оксифенциклимин, оксифенония бромид, пентапиперид, пентиената бромид, фенкарбамид, фенглутаримид, пипензолата бромид, пиперидолат, пиперилат, полдина метисульфат, придинол, прифиния бромид, проциклидин, пропантелина бромид, пропензолат, пропиромазин, скополамин, скополамина N-оксид, стилония йодид, страмоний, султропоний, тигексинол, тифенамил, тиемония йодид, тимепидия бромид, тихизия бромид, тридигексетилйодид, тригексифенидила гидрохлорид, тропацин, тропензил, тропикамид, троспия хлорид, валетамата бромид и ксенитропия бромид;

противосудорожных средств, таких как ацетилфенетурид, альбутоин, алоксидон, аминоглутетимид, 4-амино-3-гидроксимасляная кислота, атролактамид, бекламид, бурамат, кальция бромид, карбамазепин, цинромид, клометиазол, клоназепам, децимемид, диэтадион, диметадион, доксенитоин, этеробарб, этадион, этосукцимид, этотоин, флуорезон, гарбапентин, 5-гидрокситриптофан, ламотригин, ломактил, магния бромид, магния сульфат, мефенитоин, мефобарбитал, метарбитал, мететоин, метсукцимид, 5-метил-5-(3-фенантрил)гидантоин, 3-метил-5-фенилгидантоин, наркобарбитал, ниметазепам, нитразепам, параметадион, фенасемид, фенетарбитал, фенетурид, фенобарбитал, фенобарбитал натрия, фенсукцимид, фенилметилбарбитуровая кислота, фенитоин, фетенилат натрия, калия бромид, прегабатин, примидон, прогабид, натрия бромид, натрия валпроат, солан, стронция бромид, суклофенид, султиам, тетрантоин, тиагабин, триметадион, валпроевая кислота, валпромид, вигабатрин и зонисамид;

антидепрессантов, включая: бициклические соединения, такие как бинедалин, кароксазон, циталопрам, диметазан, индалпин, фенкамин, флувоксамина малеат, инделоксазина гидрохлорид, нефопам, номифензин, окситриптан, оксипертин, пароксетин, сертралин, тиазесим, тразодон, венлафаксин и зометапин;

гидразидов/гидразинов, таких как бенмоксин, ипроклозид, ипрониазид, изокарбоксазид, ниаламид, октамоксин и фенелзин;

пирролидонов, таких как котинин, роликиприн и ролипрам;

тетрациклических соединений, таких как мапротилин, метралиндол, миансерин и оксапротилин;

трициклических соединений, таких как адиназолам, амитриптилин, амитриптилиноксид, амоксапин, бутриптилин, кломипрамин, демексиптилин, дезипрамин, дибензепин, диметракрин, дотиепин, доксепин, флуацизин, имипрамин, имипрамина N-оксид, иприндол, лофепрамин, мелитрацен, метапрамин, нортриптилин, ноксиптилин, опипрамол, пизотилин, пропизепин, протриптилин, хинупрамин, тианептин и тримипрамин; и

других средств, таких как адрафинил, бенактизин, бупропион, бутацетин, деанол, деанола ацеглумат, деанола ацетамидобензоат, диоксадрол, этоперидон, фебарбамат, фемоксетин, фенпентадиол, флуоксетин, флувоксамин, гематопорфирин, гиперцинин, левофацетоперан, медифоксамин, минаприн, моклобемид, оксафлозан, пибералин, пролинтан, пирисукцидеанол, рубидия хлорид, сульпирид, сультоприд, тенилоксазин, тозалинон, тофенацин, толоксатон, транилципромин, L-триптофан, вилоксазин и зимелдин;

противодиабетических средств, включая: бигуаниды, такие как буформин, метформин и фенформин;

гормонов, таких как глюкагон, инсулин, инсулин для инъекций, инсулин-цинковая суспензия, изофан-инсулиновая суспензия, протамин-цинк-инсулиновая суспензия и кристаллы цинк-инсулина;

производных сульфонилмочевины, таких как ацетогексамид, 1-бутил-3-метанилилмочевина, карбутамид, хлорпропамид, глиборнурид, гликлазид, глипизид, глихидон, глизоксепид, глибурид, глибутиазол, глибузол, глигексамид, глимидин, глипинамид, фенбутамид, толазамид, толбутамид и толцикламид; и

других средств, таких как акарбоза, кальция мезоксалат и миглитол;

лекарственных средств против диареи, таких как ацетилдубильная кислота, альбумина таннат, алкофанон, алюминия салицилаты основные, катехин, дифеноксин, дифеноксилат, лидамидин, лоперамид, мебихин, триллий и узарин;

антидиуретиков, таких как десмопрессин, фелипрессин, липрессин, орнипрессин, оксицинхофен, средство, воздействующее на заднюю долю гипофиза, терлипрессин и вазопрессин;

антиэстрогенов, таких как делмадинона ацетат, этамокситрифетол, тамоксифен и торемифен;

противогрибковых лекарственных средств (антибиотиков), включая: полиены, такие как амфотерицин-В, кандицидин, дермостатин, филипин, фунгихромин, хачимицин, хамицин, люценсомицин, мепартрицин, натамицин, нистатин, пецилоцин и перимицин; и другие, такие как азасерин, гризеофульвин, олигомицины, неомицина ундециленат, пирролнитрин, сикканин, туберцидин и виридин;

противогрибковых лекарственных средств (синтетических), включая: аллиламины, такие как налтифин и тербинафин;

имидазолов, таких как бифоназол, бутоконазол, хлордантоин, хлормидазол, клоконазол, клотримазол, эконазол, энилконазол, фентиконазол, изоконазол, кетоконазол, миконазол, омоконазол, оксиконазола нитрат, сулконазол и тиоконазол;

триазолов, таких как флуконазол, итраконазол и терконазол; и

других средств, таких как акризорцин, аморолфин, бифенамин, бромсалицилхлоранилид, буклозамид, кальция пропионат, хлофенезин, циклопирокс, клоксихин, копараффинат, диамтазола дигидрохлорид, эксаламид, флуцитозин, галетазол, гексетидин, лофлукарбан, нифурател, калия йодид, пропионовая кислота, пиритион, салициланилид, натрия пропионат, сулбентин, тенонитрозол, толциклат, толиндат, толнафтат, трицетин, уджотион (ujothion), ундециленовая кислота и цинка пропионат;

лекарственных средств против глаукомы, таких как ацетазоламид, бефунолол, бетаксолол, бупранолол, картеолол, дапипразол, дихлорфенамид, дипивефрин, эпинефрин, певобунолол, метазоламид, метипранолол, пилокарпин, пиндолол и тимолол;

антигонадотропинов, таких как даназол, гестринон и пароксипропион;

лекарственных средств против подагры, таких как аллопуринол, карпрофен, колхицин, пробенецид и сульфинпиразон;

антигистаминов, включая: производные алкиламинов, такие как акривастин, бамипин, бромфенирамин, хлорфенирамин, диметинден, метрон S, фенирамин, пирробутамин, теналдин, толпропамин и трипролидин;

аминоалкиловых простых эфиров, таких как биетанаутин, бромдифенгидрамин, карбиноксамин, клемастин, дифенилпиралин, доксиламин, эмбраммин, медриламин, мефенгидрамин,

пара-метилдифенгидрамин, орфенадрин, фенилтолоксамин, пипрингидринат и сетазин;

производных этилендиаминов, таких как аллокламид, пара-бромтрипеленнамин, хлорпирамин, хлоротен, гистапирродин, метафурилен, метафенилен, метапирилен, фенбензамин, пириламин, таластин, тенилдиамин, тонзиламина гидрохлорид, трипеленнамин и золамин;

пиперазинов, таких как цетиризин, хлорциклизин, циннаризин, клоцинизин и гидроксизин;

трициклических соединений, включая: фенотиазины, такие как агистан, этимемазин, фенетазин, N-гидроксиэтилпрометазина хлорид, изопрометазин, мехитазин, прометазин, пиратиазин и тиазинамия метилсульфат; и

других средств, таких как азатадин, клобензепам, ципрогептадин, дептропин, изотипендил, лоратадин и протипендил; и

других антигистаминов, таких как антазолин, астемизол, азеластин, цетоксим, клемизол, клобензтропин, дифеназолин, дифенгидрамин, флутиказона пропионат, мебгидролин, фениндамин, терфенадин и тритоквалин;

антигиперлипопротеинемических средств, включая: производные арилоксиалкановой кислоты, такие как беклорбат, базафибрат, бинифибрат, ципрофибрат, клинофибрат, клофибрат, клофибриновую кислоту, этонфибрат, фенофибрат, гемфиброзил, никофибрат, пирифибрат, ронифибрат, симфибрат и теофибрат;

секвестрантов желчных кислот, таких как холестираминовый полимер, колестипол и полидексид;

ингибиторов НМС-СоА(3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермент А)-редуктазы, таких как флувастатин, ловастатин, правастатин натрий и симвастатин;

производных никотиновой кислоты - алюминия никотината, аципимокса, ницеритрола, никоклоната, никомола и оксиникотиновой кислоты;

тиреоидных гормонов и аналогов, таких как этироксат, тиропропиновая кислота и тироксин; и

других средств, таких как ацифран, азакостерол, бенфлуорекс, β-бензальбутирамид, карнитин, хондроитина сульфат, кломестон, детакстран, декстрансульфат натрия, 5,8,11,14,17-эйкозапентаеновая кислота, эритаденин, фуразбол, меглутол, мелинамид, митатриендиол, орнитин, γ-оризанол, пантетин, пенатаэритрита тетраацетат, α-фенилбутирамид, пирозадил, пробукол, α-ситостерол, сультосиловая кислота, соль пиперазина, тиаденол, трипаранол и ксенбуцин;

антигипертензивных лекарственных средств, включая: производные арилэтаноламинов, такие как амосулалол, буфуралол, дилевалол, лабеталол, пронеталол, соталол и сульфиналол;

производных арилоксипропаноламинов, таких как ацебутолол, алпренолол, аротинолол, атенолол, бетаксолол, бевантолол, бисопролол, бопиндолол, бунитролол, бупранолол, бутофилолол, каразолол, картезолол, карведилол, целипролол, цетамолол, эпанолол, инденолол, мепиндолол, метипранолол, метопролол, мопролол, надолол, нипрадилол, окспренолол, пенбутолол, пиндолол, пропранолол, талинолол, тетраолол, тимолол и толипролол;

производных бензотиадиазинов, таких как алтиазид, бендрофлуметиазид, бензтиазид, бензилгидрохлортиазид, бутиазид, хлортиазид, хлорталидон, циклопентиазид, циклотиазид, диазоксид, эпитиазид, этиазид, фенхизон, гидрохлортиазид, гидрофлуметиазид, метиклотиазид, метикран, метолазон, парафлутизид, политиазид, тетрахлорметиазид и трихлорметиазид;

N-карбоксиалкиловых (пептид/лактам) производных, таких как аласеприл, каптоприл, силазаприл, делаприл, эналаприл, эналаприлат, фозиноприл, лизиноприл, мовелтиприл, периндоприл, хинаприл и рамиприл;

производных дигидропиридинов, таких как амлодипин, фелодипин, израдипин, никардипин, нифедипин, нилвадипин, низолдипин и нитрендипин;

производных гуанидина, таких как бетанидин, дебризохин, гуанабенз, гуанаклин, гуанадрел, гуаназодин, гуанетидин, гуанфацин, гуанохлор, гуаноксабенз и гуаноксан;

гидразинов и фталазинов, таких как будралазин, кадралазин, дигидралазин, эндралазин, гидракарбазин, гидралазин, фенипразин, пилдралазин и тодралазин;

производных имидазола, таких как клонидин, лофексидин, фентоламин, фентоламина мезилат, тиаменидин и толонидин;

соединений четвертичного аммония - азаметония бромида, хлоризондамина хлорида, гексаметония, пентациния бис(метилсульфата), пентаметония бромида, пентолиния тартрата, фенактопиния хлорида и триметидиния метосульфата;

производных хиназолина, таких как алфузозин, буназозин, доксазозин, празозин, теразозин и тримазозин;

производных резерпина, таких как биэтасерпин, десерпидин, ресциннамин, резерпин и сиросингопин;

сульфамидных производных, таких как амбузид, клопамид, фуросемид, индапамид, хинетазон, трипамид и ксипамид; и

других средств, таких как аймалин, γ-аминомасляная кислота, буфениод, кандесартан, хлорталидон, цикпетаин, сиклозидомин, криптенамина таннаты, эпросартан, фенолдопам, флосексинан, индорамин, ирбесартан, кетансерин, лосартан, метбутамат, мекамиламин, метилдопа, метил-4-пиридил-кетон тиосемикарбарзон, метолазон, миноксидил, музолимин, паргилин, пемпидин, панасидил, пипероксан, примаперон, протовератрины, раубазин, ресциметол, рилмениден, саралазин, натрия нитропруссид, тикринафен, триметафана камзилат, тирозиназа, урапидил и валсартан;

средств против гипертиреоза, таких как 2-амино-4-метилтиазол, 2-аминотиазол, карбимазол, 3,5-дибром-L-тирозин, 3,5-дийодтирозин, гиндерин, йод, иотиоурацил, метимазол, метилтиоурацил, пропилтиоурацил, натрия перхлорат, тибензазолин, тиобарбитал и 2-тиоурацил;

антигипотензивных лекарственных средств, таких как амезиний-метилсульфат, ангиотензина амид, диметофрин, дофамин, этифелмин, этилефрин, гепефрин, метарамииол, мидодрин, норэпинефрин, фоледринид и синефрин;

лекарственных средств против гипотиреоза, таких как левотироксин натрия, лиотиронин, тиреоид, тиреоидин, тироксин, тиратрикол и TSH (тиреотропный гормон);

противовоспалительных (нестероидных) лекарственных средств, включая: производные аминоарилкарбоновой кислоты, такие как энфенамовая кислота, этофенамат, флуфенамовая кислота, изониксин, меклофенамовая кислота, мефенамовая кислота, нифлумовая кислота, талнифлумат, терофенамат и толфенамовая кислота;

производных арилуксусной кислоты, таких как ацеметацин, алклофенак, амфенак, буфексамак, цинметацин, клопирак, диклофенак натрия, этодолак, фелбинак, фенклофенак, фенклорак, фенклозовая кислота, фентиазак, глюкаметацин, ибуфенак, индометацин, изофезолак, изоксепак, лоназолак, метиазиновая кислота, оксаметацин, проглуметацин, сулиндак, тиарамид, толметин и зомепирак;

производных арилмасляной кислоты, таких как бумадизон, бутибуфен, фенбуфен и ксенбуцин;

арилкарбоновых кислот, таких как клиданак, кеторолак и тиноридин;

производных арилпропионовой кислоты, таких как алминопрофен, беноксапрофен, буклоксовая кислота, карпрофен, фенопрофен, флуноксапрофен, флурбипрофен, ибупрофен, ибупроксам, индопрофен, кетопрофен, локсопрофен, миропрофен, напроксен, оксапрозин, пикетопрофен, пирпрофен, пранопрофен, протизиновая кислота, супрофен и тиапрофеновая кислота;

пиразолов, таких как дифенамизол и эпиризол;

пиразолонов, таких как алазон, бензпиперилон, фепразон, мофебутазон, моразон, оксифенбутазон, фенибутазон, пипебузон, пропифеназон, рамифеназок, суксибузон и тиазолинобутазон;

производных салициловой кислоты, таких как ацетаминосалол, аспирин, бенорилат, бромсалигенин, кальция ацетилсалицилат, дифлунизал, этерсалат, фендосал, гентизиновая кислота, гликоля салицилат, имидазола салицилат, лизина ацетилсалицилат, мезиламин, морфолина салицилат, 1-нафтил-салицилат, олсалазин, парсалмид, фенил-ацетилсалицилат, фенилсалицилат, салацетамид, салициламина О-уксусная кислота, салицилсерная кислота, салсалат и сульфасалазин;

тиазинкарбоксамидов, таких как дроксикам, изоксикам, пироксикам и теноксикам; и

других средств, таких как s-ацетамидокапроновая кислота, S-аденозилметионин, 3-амино-4-гидроксимасляная кислота, амиксетрин, бендазак, бензидамин, буколом, дифенпирамид, дитазол, эморфазон, гвайазулен, набуметон, нимесулид, орготеин, оксасепрол, паранилин, перизоксал, пифоксим, проквазон, проксазол и тенидап;

противомалярийных лекарственных средств, таких как ацедапсон, амодиахин, артеэтер, артеметер, артемисинин, артесунат, бебеэрин, берберин, хирата, хлоргуанид, хлорохин, хлорпрогуанил, синхона, синхонидин, синхонин, циклогуанил, гентиопикрин, галофантрин, гидроксихлорохин, мефлохина гидрохлорид, 3-метиларсацетин, памахин, плазмоцид, примахин, пириметамин, хинакрин, хинин, хинина бисульфат, хинина карбонат, хинина дигидробромид, хинина дигидрохлорид, хинина этилкарбонат, хинина формиат, хинина глюконат, хинина гидройодид, хинина гидрохлорид, хинина салицилат, хинина сульфат, хинина таннат, хинин-мочевины гидрохлорид, хиноцид, хинолин и натрия арсенат двуосновный;

лекарственных средств против мигрени, таких как алпироприд, дигидроэрготамин, элетриптан, эргокорнин, эргокорнинин, эргокриптин, эргот, эрготамин, флумедроксона ацетат, фоназин, лисурид, метисергид, наратриптан, оксеторон, пизотилин, ризатриптан и суматриптан;

противорвотных лекарственных средств, таких как ацетиллейцина моноэтаноламин, ализаприд, бензхинамид, биетанаутин, бромоприд, буклизин, хлорпромазин, клебоприд, циклизин, дименгидринат, дифениодол, домперидон, гранисетрон, меклизин, металлтал, метоклопрамид, метопимазин, набилон, онданстерон, оксипендил, пипамазин, пипрингидринат, прохлорперазин, скополамин, тетрагидроканнабинолы, триэтилперазин, тиопроперазин и триметобензамид;

противоопухолевых лекарственных средств, включая: алкилирующие агенты, такие как алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан;

азиридинов, таких как бензодепа, карбоквон, метуредепа и уредепа;

этилениминов и метилмеламинов, таких как алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин;

азотистых аналогов иприта, таких как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтамина оксида гидрохлорид, мельфалан, новембихин, фенстерин, преднимустин, трофосфамид и урациловый аналог иприта;

нитрозомочевин, таких как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимустин; и

других средств, таких как камптотецин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол и пипоброман;

антибиотиков, таких как аклациномицины, актиномицин F₁, антрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карубицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, митомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, пликамицин, порфиромицин, пуромицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин и зорубицин;

антиметаболитов, включая: аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин и триметрексат;

пуриновых аналогов, таких как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн и тиогуанаин; и

пиримидиновых аналогов, таких как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, фторурацил и тегафур;

ферментов, таких как L-аспарагиназа; и

других средств, таких как ацеглатон, амсакрин, бестрабуцил, бисантрен, бриостатин 1, карбоплатин, цисплатин, дефофамид, демеколцин, диазихон, элфорнитин, эллиптиния ацетат, этоглуцид, этопозид, галлия нитрат, гидроксимочевина, интерферон-α, интерферон-β, интерферон-γ, интерлейкин-2, лентинан, летрозол, лонидамин, митогуазон, митоксантрон, мопидамол, нитракрин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, подофиллиновая кислота, 2-этитгидразид, полинитрокубаны, прокарбазин, PSK7, разоксан, сизофиран, спирогерманий, таксол, тенипозид, тенуазоновая кислота, триазихон, 2,2’,2’’-трихлортриэтиламин, уретан, винбластин, винкристин, виндезин и винорелбин;

противоопухолевых (гормональных) лекарственных средств, включая: андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан и тестолактон;

средств против клеток надпочечников, таких как аминоглутетимид, митотан и трилостан;

антиандрогенов, таких как флутамид и нилутамид; и

антиэстрогенов, таких как тамоксифен и торемифен;

противоопухолевых вспомогательных средств, включая компенсаторы фолиевой кислоты, такие как фролиновая кислота;

лекарственных противопаркинсонических средств, таких как амантадин, бенсеразид, биетанаутин, бипериден, бромкриптин, будипин, кабэрголин, карбидопа, депренил (известный также как L-депренил, L-депреналин и селегилин), дексетимид, диэтазин, дифенгидрамин, дроксидопа, этопропазин, этилбензгидрамин, леводопа, наксаголид, перголид, пирогептин, прамипексол, придинол, продипин, хинпирол, ремацемид, ропинирол, тергурид, тиглоидин и тригексифенидила гидрохлорид;

лекарственных средств против феохромоцитомы, таких как метирозин, феноксибензамин и фентоламин;

лекарственных средств против пневмоцистоза, таких как эффорнитин, пентамидин и сульфаметоксазол;

лекарственных средств против гипертрофии предстательной железы, таких как гестонорона капроат, мепартрицин, оксендолон и проскар7;

антипротозойных лекарственных средств (против лейшманиоза), таких как сурьмы натриы глюконат, этилстибамин, гидроксистильбамидин, N-метилглюкамин, пентамидин, стильбамидин и мочевины стибамин;

антипротозойных лекарственных средств (против трихомоноза), таких как ацетарсон, аминитрозол, анизомицин, азанидазол, форминитразол, фуразолидон, хачимицин, лаурогуадин, мепартрицин, метронидазол, нифурател, нифуроксим, ниморазол, секнидазол, серебра пикрат, тенонитрозол и тинидазол;

антипротозойных лекарственных средств (против трипаносомы), таких как бензнидазол, эфлорнитин, меларсопрол, нифуртимокс, оксофенарзина гидрохлорид, пентамидин, пропамидин, пуромицин, хинапирамин, стильбамидин, сурамин натрия, трипановый красный и трипарасмид;

противозудных средств, таких как камфора, ципрогептадин, дихлоризон, глицин, галометазон, 3-гидроксикамфора, ментол, месульфен, метдилазин, фенол, полидоканол, ризокаин, камфарный спирт, теналдин, толпропамин и тримепразин;

антипсориатических лекарственных средств, таких как ацитретин, аммония салицилат, антралин, 6-азауридин, бергаптен, хризаробин, этретинат и пирогаллол;

антипсихотических лекарственных средств, включая: бутирофеноны, такие как бенперидол, бромперидол, дроперидол, флуанизон, галоперидол, мелперон, моперон, пипамперон, сниперон, тимиперон и трифлуперидол;

фенотиазинов, таких как ацетофеназин, бутаперазин, карфеназин, хлорпроэтазин, хлорпромазин, клоспиразин, циамемазин, диксиразин, флуфеназин, имиклопазин, мепазин, мезоридазин, метоксипромазин, метофеназат, оксафлумазин, перазин, перициазин, периметазин, перфеназин, пиперацетазин, пипотиазин, прохлорперазин, промазин, сульфоридазин, тиопропазат, тиоридазин, трифлуоперазин и трифлупромазин;

тиоксантенов, таких как хлорпротиксен, клопентиксол, флупентиксол и тиотиксен;

других трициклических соединений, таких как бензхинамид, карпипрамин, клокапрамин, кломакран, клотиапин, клозапин, опипрамол, протипендил, тетрабеназин и зотепин; и

других средств, таких как ализаприд, амисулприд, бурамат, флуспирилен, молиндон, пенфлуридол, пимозид, спирилен и сульпирид;

жаропонижающих средств, таких как ацетаминофен, ацетаминосалол, ацетанилид, аконин, аконит, аконитин, алклофенак, алюминия бис(ацетилсалицилат), аминохлортеноксазин, аминопирин, аспирин, бенорилат, бензидамин, берберин, пара-бромацетанилид, буфексамак, бумадизон, кальция ацетилсалицилат, хлортеноксазин, холина салицилат, клиданак, дигидроксиалюминия ацетилсалицилат, дипироцетил, дипирон, эпиризол, этерсалат, имидазола салицилат, индометацин, изофезолак, пара-лактофенетид, лизина ацетилсалицилат, магния ацетилсалицилат, меклофенамовая кислота, моразон, морфолина салицилат, напроксен, нифеназон, 51-нитро-2'-пропоксиацетанилид, фенацетин, феникарбазид, феноколл, фенопиразон, фенил-ацетилсалицилат, фенилсалицилат, пипебузон, пропацетамол, пропифеназон, рамифеназон, салацетамид, салициламида О-уксусная кислота, натрия салицилат, сульфамипирин, тетрандрин и тиноридин;

антириккетсиозных лекарственных средств, таких как пара-аминобензойная кислота, хлорамфеникол, хлорамфеникола пальмитат, хлорамфеникола пантотенат и тетрациклин;

антисеборрейных лекарственных средств, таких как хлорксин, 3-O-лауроилпиридоксола диацетат, пироктон, пиритион, резорцинол, селена сульфиды и тиоксолон;

антисептических средств, включая: гуанидины, такие как алексидин, амбазон, хлоргексидин и пиклоксидин;

галогенов и галогеновых соединений, такие как висмута йодида оксид, висмута йодсубгаллат, висмута трибромфенат, борнилхлорид, кальция йодат, хлорная известь, клофлукарбан, фторсалан, йодноватая кислота, йод, йода монохлорид, йода трихлорид, йодоформ, метенамина тетрайод, оксихлорозен, повидон-йод, натрия гипохлорит, натрия йодат, симклозен, тимола йодид, триклокарбан, триклозан и троклозен калия;

соединений ртути, таких как гидрагафен, мералеин натрия, мербромин, хлорид ртути (II), хлорид ртути (II), содержащий аммиак, натрий пара-фенолсульфонат ртути (II), сукцинимид ртути (II), сульфид ртути (II), красный, меркурофен, ацетат ртути (I), хлорид ртути (I), йодид ртути (I), нитромерсол, калия тетрайодмеркурат (II), раствор калия трийодмеркурата (II), тримерфонат натрия и тримерозал;

нитрофуранов, таких как фуразолидон, 2-(метоксиметил)-5-нитрофуран, кидроксизон, нифуроксим, нифурзид и нитрофуразон;

фенолов, таких как ацетомероктол, битионол, кадмия салицилат, карвакрол, хлорксиленол, клорофен, крезот, крезол(ы), пара-крезол, фентиклор, гексахлорофен, 1-нафтилсалицилат, 2-нафтилсалицилат, 2,4,6-трибром-м-крезол и 3',4',5'-трихлорсалициланилид;

хинолинов, таких как аминохинурид, бензоксихин, броксихинолин, хлороксин, хлорхиналдол, клоксихин, этилгидрокупреин, эупроцин, галхинол, гидрастин, 8-гидроксхинолин, 8-гидроксхинолина сульфат и йодхлоргидроксихин; и

других средств, таких как раствор алюминия ацетата, раствор алюминия субацетата, алюминия сульфат, 3-амино-4-гидроксимасляная кислота, борная кислота, хлоргексидин, хлоразодин, м-крезилацетат, сульфат меди (II), дибромпропамидин, ихтаммол, негатол7, нокситиолин, орнидазол, β-пропиолактон, α-терпинеол;

спазмолитических лекарственных средств, таких как алибендол, амбуцетамид, аминопромазин, апоатропин, бевония метилсульфат, биетамиверин, бутаверин, бутропия бромид, N-бутилскополаммония бромид, кароверин, циметропия бромид, циннамедрин, клебоприд, кониина гидробромид, кониина гидрохлорид, циклония йодид, дифемерин, диизопромин, диоксафетил-бутират, дипония бромид, дрофенин, эмепрония бромид, этаверин, феклемин, феналамид, феноверин, фенпипран, фенпивериния бромид, фентония бромид, флавоксат, флопропион, глюконовая кислота, гваяктамин, гидрамитразин, гимекромон, лейопиррол, мебеверин, моксаверин, нафиверин, октамиламин, октаверин, пентапиперид, фенамацида гидрохлорид, флороглюцинол, пинаверия бромид, пиперилат, пироксолана гидрохлорид, прамиверин, прифиния бромид, проперидин, пропивай, пропиромазин, прозапин, рацефемин, росиверин, спазмолитол, стилония йодид, султропоний, тиемония йодид, тихизия бромид, тиропрамид, трепибутон, трикромил, трифолий, тримебутин, N,N-триметил-3,3-дифенил-пропиламин, тропензил, троспия хлорид и ксенитропия бромид;

антитромботических лекарственных средств, таких как анагрепид, аргатробан, силостазол, крисоптин, далтробан, дефибротид, эноксапарин, фраксипарин7, индобуфен, ламопаран, озагрел, пикотамид, плафибрид, ревипарин, теделпарин, тиклопидин, трифлузал и варфарин;

противокашлевых лекарственных средств, таких как аллокамид, амицибон, бенпроперин, бензонатат, бибензония бромид, бромоформ, бутамират, бутетамат, карамифена этандисульфонат, карбетапентан, хлофедианол, клобутинол, клоперастин, кодеин, кодеина метилбромид, кодеина N-оксид, кодеина фосфат, кодеина сульфат, циклексанон, декстрометорфан, дибунат натрия, дигидрокодеин, дигидрокодеинона енолацетат, димеморфан, диметоксанат, α,α-дифенил-2-пиперидинпропанол, дропропизин, дротебанол, эпразинон, этилдибунат, этилморфин, фоминобен, гвиайапат, гидрокодон, изоаминил, левопропоксифен, морклофон, нарцеин, норметадон, носкапин, окселадин, оксоламин, фолкодин, пикоперин, пипазетат, пиперидион, преноксдиазина гидрохлорид, рацеметорфан, тазипринона гидрохлорид,типепидин и зипепрол;

противоязвенных лекарственных средств, таких как ацеглутамид-алюминиевый комплекс, ε-ацетамидокапроновой кислоты цинковая соль, ацетоксолон, арбапростил, бенексата гидрохлорид, раствор висмута субцитрата (высушенный), карбеноксолон, цетраксат, циметидин, энпростил, эсапразол, фамотидин, фтаксилид, гефарнат, гвайазулен, ирсогладин, мисопростол, низатидин, омепразол, орнопростил, γ-оризанол, пифарнин, пирензепин, плаунотол, ранитидин, риопростил, розапростол, ротраксат, роксатидина ацетат, софалкон, спизофурон, сукралфат, тепренон, тримопростил, тритиозин, троксипид и золимидин;

антиуролитических лекарственных средств, таких как ацетогидроксамовая кислота, аллопуринол, калия цитрат и сукцинимид;

лекарственных средств на основе антитоксической иммунной сыворотки, таких как антитоксическая иммунная сыворотка лиовак7;

противовирусных лекарственных средств, включая: пурины и пиримидиноны, такие как ацикловир, цитарабин, дидезоксиаденозин, дидезоксицитидин, дидезоксиинозин, эдоксудин, флоксуридин, ганцикловир, идоксуридин, инозин пранобекс, MADU (5-метиламино-2'-дезоксиуридин), пенцикловир, трифлуридин, видрарбин и зидовудиин; и

других средств, таких как ацетиллейцина моноэтаноламин, амантадин, амидиномицин, косалан, куминальдегид тиосемикарбазон, фоскарнет натрия, имихимод, интерферон-α, интерферон-β, интерферон-γ, кетоксал, лизоцим, метисазон, мороксидин, подофиллотоксин, рибавирин, римантадин, сталлимицин, статолон, тромантадин и ксеназоевая кислота;

анксиолитических лекарственных средств, включая: арилпиперазины, такие как буспирон, гепирон, ипсапирон и тондоспирон;

производных бензодиазепинов, таких как алпразолам, бромазепам, камазепам, хлордиазепоксид, клобазам, кпоразепат, хотиазепам, клоксазолам, диазепам, этиллофлазепат, этизолам, флуидазепам, флутазолам, флутопразепам, галазепам, кетазолам, лоразепам, локсапин, медазепам, метаклазепам, мексазолам, нордазепам, оксазепам, оксазолам, пиназепам, празепам и тофизопам;

карбаматов, таких как цикларбамат, эмилкамат, гидроксифенамат, мепробамат, фенпробамат и тибамат; и

других средств, таких как алпидем, бензоктамин, каптодиамин, хлормезанон, этифоксин, фелсиноксан, флуорезон, глутаминовая кислота, гидроксизин, лесопитрон, меклоралмочевина, мефеноксалон, миртазепин, оксанамид, фенагликодол, суриклон и затосетрон;

антагонистов бензодиазепинов, таких как флумазенил;

бронходилататоров, включая: производные эфедрина, такие как альбутерол, бамбутерол, битолтерол, карбутерол, кленбутерол, клорпреналин, диоксетедрин, эфедрин, эпинифрин, эпрозинол, этафедрин, этилнорэпинефрин, фенотерол, гексопреналин, изоэтарин, изопротеренол, мабутерол, метапротеренол, N-метилэфедрин, пирбутерол, прокатерол, протокилол, репротерол, римитерол, сальметерол, сотеренол, тербуталин и тулобутерол;

соединений четвертичного аммония, таких как бевония метилсульфат, клутропия бромид, ипратропия бромид и окситропия бромид;

ксантиновых производных, таких как ацефиллин, ацефиллин-пиперазин, амбуфиллин, аминофиллин, бамифиллин, холина теофиллинат, доксофиллин, дифиллин, энпрофиллин, этамифиллин, этофиллин, гваятиллин, проксифиллин, теобром, 1-теобромуксусная кислота и теофиллин; и

других средств, таких как фенспирид, медибазин, монтелукаст, метоксифенамин, третохинол и зафирлукаст;

блокаторов кальциевых каналов, включая: арилалкиламины, такие как бепридил, дитиазем, фендилин, галлопанил, прениламин, теродилин и верапамил;

производных дигидропиридинов, таких как фелодипин, израдипин, никардипин, нифедипин, нилвадипин, нимодипин, низолдипин и нитрендипин;

производных пиперазина, таких как циннаризин, флунаризин и лидофлазин; и

других средств, таких как бенциклан, этафенон и пергексилин;

регуляторов кальция, таких как кальцифедиол, кальцитонин, кальцитриол, клодроновая кислота, дигидротахистерол, элкатонин, этидроновая кислота, иприфлавон, памидроновая кислота, паратиреоидный гормон и терипаратида ацетат;

кардиотонических средств, таких как ацефиллин, ацетилдигититоксины, 2-амино-4-пиколин, амринон, бенфуродила гемисукцинат, букласдезин, церберозид, камфотамид, конваллатоксин, цимарин, денопамин, десланозид, диталин, дигиталис, дигитоксин, дигоксин, добутамин, дофамин, допексамин, эноксимон, эритрофлеин, феналкомин, гиталин, гитоксин, гликоциамин, гептаминол, гидрастинин, ибопамин, ланотодизы, метамивам, милринон, нериифолин, олеандрин, уабаин, оксифедрин, преналтерол, просцилларидин, резибуфогенин, сцилларен, сцилларенин, строфантин, сулмазол, теобромин и ксамотерол;

хелатирующих агентов, таких как деферозмин, дитиокарб натрия, кальция динатрия эдетат, динатрия эдетат, натрия эдеат, тринатрия эдетат, пеницилламин, кальция тринатрия пентетат, пентектиновая кислота, сукцимер и триентин;

антагонистов холецистокинина, таких как проглумид;

холелитолитических агентов, таких как хенодиол, метил-трет-бутиловый простой эфир, монооктаноин и урсодиол;

желчегонных средств, таких как алибендол, анетол тритион, азинтамид, холевая кислота, цикротоевая кислота, кланобутин, циклобутирол, цикловалон, цинарин, дегидрохолевая кислота, дезоксихолевая кислота, димекротовая кислота, а-этилбензиловый спирт, эксипробен, фегупрол, фенцибутирол, фенипентол, флорантирон, гимекромон, менбутон, 3-(о-метоксифенил)-2-фенилакриловая кислота, метохалкон, мохизон, озалмид, экстракт бычьей желчи, 4,4'-оксиди-2-бутанол, пипрозолин, прозапин, 4-салицилоилморфолин, синкалид, таурохолевая кислота, тимонацик, токамфил, трепибутон и ванитиолид;

холинергических агентов, таких как ацеклидин, ацетилхолина бромид, ацетилхолида хлорид, аклатония нападизилат, бензпириния бромид, бетанехола хлорид, карбахол, карпрония хлорид, демекария бромид, декспантенол, диизопропилпараоксон, эхотиофата йодид, эдрофомия хлорид, эсеридин, фуртретоний, изофторфат, метахолина хлорид, мускарин, неостигмин, оксапропания йодид, физостигмин и пиридостигмина бромид;

ингибиторов холинэстеразы, таких как амбенония хлорид, дистигмина бромид и галантамин;

реактиваторов холинэстеразы, таких как обидоксимина хлорид и пралидоксима хлорид;

стимуляторов и агентов центральной нервной системы, таких как аминептин, амфетимин, амфетаминил, бемегрид, бензфетамин, бруцин, кофеин, хлорфентермин, клофенциклан, клортермин, кокаин, деманила фосфат, дексоксадрол, декстроамфетамина сульфат, диэтилпропион, N-этиламфетамин, этамиван, этифелмин, этриптамин, фенкамфамин, фенетиллин, фенозолон, фтортил, галантамин, гексациклонат натрия, гомокамфин, мазиндол, мегексамид, метамфетамин, метилфенидат, никетамид, пемолин, пентилентетразол, фенидиметразин, фенметразин, фентермин, пикротоксин, пипрадрол, пролинтан и пировалерон;

противоотечных средств, таких как амидефрин, кафаминол, циклопентамин, эфедрин, эпинефрин, феноксазолин, инданазолин, метизолин,

нафазолин, нордефрина гидрохлорид, октодрин, оксиметазолин, фенилэфрина гидрохлорид, фенилпропаноламина гидрохлорид, фенилпропилметиламин, пропилгекседрин, псевдоэфедрин, тетрагидрозолин, тимазолин и ксилометазолин;

стоматологических агентов, включая: бисфосфонаты (средства против периодонтального заболевания и резорпции кости), такие как алендронат, клодронат, этидронат, памидронат и тилудронат; профилактические агенты против кариеса, такие как аргинин и натрия фторид;

десенсибилизирующих агентов, таких как калия нитрат и цитрат оксалат;

депигментирующих веществ, таких как гидрохинин, гидрохинон и монобензон;

диуретиков, включая: органортутные препараты, такие как хлормеродрин, мераллурид, меркамфамид, меркаптомерин натрия, меркумаллиловая кислота, меркуматилин натрия, хлорид ртути (одновалентной) и мерсалил;

птеридинов, таких как фуртерен и триамтерен;

пуринов, таких как ацефиллин, 7-морфолинометилтеофиллин, памабром, протеобром и теобром;

стероидов, таких как канренон, олеандрин и спиронолактон;

сульфамидных производных, таких как ацетазолмид, амбузид, азосемид, буметанид, бутазоламид, хлораминофенамид, клофенамид, клопамид, клорексолен, дифенилметан-4,4'-дисульфамид, дисульфамид, этоксзоламид, фуросемид, индапамид, мефрузид, метазоламид, пиретанид, хинетазон, торасемид, трипамид и ксипамид;

урацилов, таких как аминометрадин и амисометрадин;

других средств, таких как аманозин, амилорид, арбутин, хлоразанил, этакриновая кислота, этозолин, гидракарбазин, изосорбид, маннит, метохалкон, музолимин, пергексилин, тикринафен и мочевина;

агонистов дофаминового рецептора, таких как бромкриптин, допексамин, фенолдопам, ибопамин, лизурид, наксаголид и перголид;

средств против эктопаразитов, таких как амитраз, бензилбензоат, карбарил, кротамитон, DDT (дихлордифенилтрихлорэтан), диксантоген, изоборнил-тиоцианоацетат технический, раствор сульфурированной извести, линдан, малатион, олеат ртути (двухвалентной), месульфен и сера фармацевтическая;

ферментов, включая: ферменты пищеварительной системы, такие как α-амилаза (из поджелудочной железы свиньи), липаза, панкрелипаза, пепсин и химозин;

муколитических ферментов, таких как лизоцим;

пенициллин-инактивирующих ферментов, таких как пенициллиназа; и

протеолитических ферментов, таких как коллагеназа, химопапаин, химотрипсины, папаин и трипсин;

ферментных индукторов (печеночных), таких как флумецинол;

эстрогенов, включая: нестероидные эстрогены, такие как бензэстрол, бропароэстрол, хлоротрианизен, диенэстрол, диэтилстилбэстрол, диэтилстилбэстрола дипропионат, димэстрол, фосфэстрол, гексэстрол, металленэстрил и метэстрол; и

стероидных эстрогенов, таких как колпормон, конъюгированные эстрогенные гормоны, эквиленин, эквилин, эстрадиол, эстрадиола бензоат, эстрадиола 17β-ципионат, эстриол, эстрон, этинилэстрадиол, местранол, моксэстрол, митатриендиол, хинэстрадиол и хинэстрол;

ингибиторов желудочной секреции, таких как энтерогастрон и октреотид;

глюкокортикоидов, таких как 21-ацетоксипрефненолон, алклометазон, алгестон, амицинонид, беклометазон, бетаметазон, будесонид, хлорпреднизон, клобетазол, бловетазон, клокортолон, клопреднол, кортикостерон, кортизон, кортивазол, дефлазакорт, десонид, дезоксиметазон, дексаметазон, дифлоразон, дифлукортолон, дифлупреднат, эноксолон, флуазакорт, флуклоронид, флуметазон, флунизолид, флуоцинолона ацетонид, флуоцинонид, флуокортина бутил, флуокортолон, фторметолон, флуперолона ацетат, флупреднидена ацетат, флупреднизолон, флурандренолид, формокортал, галцинонид, галометазон, галопредона ацетат, гидрокортамат, гидрокортизон, гидрокортизона ацетат, гидрокортизона фосфат, гидрокортизона 21-натрия сукцинат, гидрокортизона тебутат, мазипредон, медризон, мепреднизон, метиолпреднизолон, мометазона фуроат, параметазон, предникарбат, преднизолон, преднизолона 21-диэтиламиноацетат, преднизона натрия фосфат, преднизолона натрия сукцинат, преднизолона натрия 21-м- сульфобензоат, преднизолона 21-стеароилгликолят, преднизолона тебутат, преднизолона 21-триметилацетат, преднизон, преднивал, преднилиден, преднилидена 21-диэтиламиноацетат, тиксокортал, триамцинолон, триамцинолона ацетонид, триамцинолона бенетонид и триамцинолона гексацетонид;

гонадостимулирующих веществ, таких как бусерелин, кломифен, циклофенил, эпимэстрол, FSH (фолликулостимулирующий гормон), HCG (хорионический гонадотропин человека) и LH-RH;

гонадотропных гормонов, таких как LH и PMSG (гонадотропин сыворотки жеребой кобылы);

ингибиторов гормона роста, таких как октреотид и соматостатин;

высвобождающих факторов ростового гормона, таких как семорелин;

стимуляторов роста, таких как соматотропин;

гемолитических агентов, таких как фенилгидразин и фенилгидразина гидрохлорид;

антагонистов гепарина, таких как гексадиметрина бромид и протамины;

гепатопротекторов, таких как S-аденозилметионин, бетаин, катехин, цитолон, малотилат, оразамид, фосфорилхолин, протопорфирин IX, группа силимаринов, тиоктовая кислота и тиопронин;

иммуномодуляторов, таких как амиприлоза, буцилламин, дитиокарб натрия, инозин пранобекс, иитерферон-γ, интерлейкин-2, лентинан, муроктазин, платонин, прокодазол, тетрамисол, тимомодулин, тимопентин и убенимекс;

иммуносупрессантов, таких как азатиоприн, циклоспорины и мизорибин;

ионообменных полимеров, таких как карбакриловые полимеры, полимер на основе холестираминэ, колестипол, полидексид, резодек и полистиролсульфонат натрия;

стимулирующего лактацию гормона, такого как пролактин;

агонистов LH-RH, таких как бусерелин, госерелин, лейпролид, нафарелин и трипторелин;

липотропных агентов, таких как N-ацетилметионин, холина хлорид, холина дегидрохолат, холина дигидроцитрат, инозит, лецитин и метионин;

супрессоров красной волчанки, таких как висмута натрия тригликольламат, висмута субсалицилат, хлорохин и гидроксихлорохин;

минералокортикоидов, таких как альдостерон, дезоксикортикостерон, дезоксикортикостерона ацетат и флудрокортизон;

мистических лекарственных средств, таких как карбахол, физостигмин, пилокарпин и пилокарпус;

ингибиторов моноаминоксидазы, таких как депренил, ипроклозид, ипрониазид, изокарбоксазид, моклобемид, октомоксин, паргилин, фенелзин, феноксипропазин, пивалилбензгидразин, продипин, толоксатон и транилципромин;

муколитических агентов, таких как ацетилцистеин, бромгексин, карбоцистеин, домиодол, летостеин, лизоцим_г мецистеина гидрохлорид, месна, собрерол,степронин,тиопронин и тилоксапол;

миорелаксантов (скелетных), таких как афлохиалон, алкуроний, атракурия безилат, баклофен, бензоктамин, бензохинония хлорид, С-калебассин, каризопродол, хлормезанон, хлорфенезина карбамат, хлорпроэтазин, хлозоксазон, кураре, цикларбамат, циклобензаприн, дантролен, декаметония бромид, диазепам, эперизон, фазадиния бромид, флуметрамид, галламина триэтиодид, гексакарбахолина бромид, гексафлуорения бромид, идросиламид, лаудексия метилсульфат, лептодактилин, мемантин, мефенезин, мефеноксалон, метаксалон, метокарбамол, метокурина йодид, ниметазепам, орфенадрин, панкурония бромид, фенпробамат, фенирамидол, пипекурия бромид, промоксолан, хинина сульфат, стирамат, сукцинилхолина бромид, сукцинилхолина хлорид, сукцинилхолина йодид, суксетония бромид, тетразепам, тиоколхикозид, тизанидин, толперизон, тубокурарина хлорид, векурония бромид и зоксоламин;

антагонистов наркотиков, таких как амифеназол, циклазоцин, леваллорфан, надид, налмфен, налорфин, налорфина диникотинат, налоксон и налтрексон;

нейропротекторных агентов, таких как дизоцилпин;

ноотропных агентов, таких как ацеглутамид, ацетил карнитин, анирацетам, бифематлан, эксифон, фипексид, идебенон, инделоксазуна гидрохлорид, низофенон, оксирацетам, пирацетам, пропентофиллин, пиритинол и такрин;

офтальмических агентов, таких как 15-кетопростагландины;

овариальных гормонов, таких как релаксин;

лекарственных средств, стимулирующих родовую деятельность, таких как карбопрост, каргутоцин, деаминоокситоцин, эргоновин, гемепрост, метилэргоновин, окситоцин, средство, воздействующее на гипофиз (заднюю долю), простагландин Е₂, простагландин F_2a и спартеин;

пепсиновых ингибиторов, таких как натрия амилосульфат;

стимуляторов перистальтики, таких как цизаприд;

прогестогенов, таких как аллилэстренол, анагестон, хлормадинона ацетат, делмадинона ацетат, демегестон, дезогестрел, диметистерон, дидрогестерон, этистерон, этинодиол, флурогестона ацетат, гестоден, гестонорона капроат, галопрогестерон, 17-гидрокси-16-метилен-прогестерон, 17α-гидроксипрогестерон, 17α-гидроксигестерона капроат, линэстренол, медрогестон, медроксипрогестерон, мегестрола ацетат, меленгестрол, норэтиндрон, норэтинодрел, норгестерон, норгестимат, норгестрел, норгестриенон, норвинистерон, пентагестрон, прогестерон, промегестон, хингестрон и тренгестон;

ингибиторов пролактина, таких как метэрголин;

простагландинов и аналогов простагландинов, таких как арбапростил, карбопрост, энпростил, бемепрост, лимапрост, мисопростол, орнопростил, простациклин, простагландин E₁, простагландин Е₂, простагландин F_2a, риопростил, розапростол, сулпростон и тримопростил;

протеазных ингибиторов, таких как апротинин, камостат, габексат и нафамостат;

респираторных стимуляторов, таких как алмитрин, бемегрид, двуокись углерода, кропропамид, кротетамид, димефлин, диморфоламин, доксапрам, этамиван, фоминобен, лобелии, мепиксанокс, метамивам, никетамид, пикротоксин, пимеклон, пиридофиллин, натрия сукцинат и такрин;

склерозирующих агентов, таких как этаноламин, этиламин, 2-гексилдекановая кислота, полидоканол, хинина бисульфат, хинин-мочевины гидрохлорид, натрия рицинолеат, натрия тетрадецилсульфат и трибенозид;

седативных средств и снотворных средств, включая: ациклические уреиды, такие как ацекарбромал, апроналид, бомизовал, капурид, карбромол и эктилмочевина;

спиртов, таких как хлоргексадол, этхлорвинол, мепарфинол, 4-метил-5-триазолэтанол, трет-пентиловый спирт и 2,2,2-трихлорэтанол;

амидов, таких как бутоктамид, диэтилбромацетамид, ибротамид, изовалерил-диэтиламид, ниапразин, трицетамид, триметозин, золпидем и зопиклон;

производных барбитуровой кислоты, таких как аллобарбитал, амобарбитал, апробарбитал, барбитал, браллабарбитал, бутабарбитал натрия, буталбитал, буталлилонал, бутетал, карбубарб, циклобарбитал, циклопентобарбитал, эналлилпропимал, 5-этил-5-(1-пиперидил)барбитуровая кислота, 5-фурфурил-5-изопропилбарбитуровая кислота, гептабарбитал, гексетал натрия, гексобарбитал, мефобарбитал, метитурал, наркобарбитал, неалбарбитал, пентобарбитал натрия, феналлимал, фенобарбитал, фенобарбитал натрия, фенилметилбарбитуровая кислота, пробарбитал, пропаллилонал, проксибарбал, репозал, секобарбитал натрия, талбутал, тетрабарбитал, винбарбитал натрий и винилбитал;

производных бензодиазепинов, таких как бротизолам, доксефазепам, эстазолам, флунитразепам, флуразепам, галоксазолам, лопразолам, лорметазепам, нитразепам, хиазепам, темазепам и триазолам;

бромидов, таких как аммония бромид, кальция бромид, кальция бромлактобионат, лития бромид, магния бромид, калия бромид и натрия бромид;

карбаматов, таких как амилкарбамат - третичный, этинамат, гексапропимат, мепарфинола карбамат, новонал и трихолороуретан;

хлораль-производных, таких как карбохлораль, хлорал ьбетаин, хлоральформамид, хлораль гидрат, хлоральантипирин, дихлоральфеназон, пентаэритрит-хлораль и триклофос;

пиперидиндионов, таких как глутетимид, метиприлон, пиперидион, пиритилдион, таглутимид и талидомид;

производных хиназолонов, таких как этаквалон, меклоквалон и метаквалон; и

других средств, таких как ацеталь, ацетофенон, альдол, аммония валерат, амфенидон, d-борнил-α-бромизовалерат, d-борнил-изовалерат, бромоформ, кальция 2-этилбутаноат, карфинат, α-хлоролоза, клометиазол, циприпедий, доксиламин, этодроксизин, этомидат, фенадиазол, гомофеназин, бромистоводородная кислота, меклоксамин, ментилвалерат, опий, паральдегид, перлапин, пропиомазин, рилмазафон, натрия оксибат, сульфонэтилметан и сульфонметан;

тромболитических агентов, таких как APSAC (анизоилированный плазминоген-стрептокиназа-активаторный комплекс), плазмин, проурокиназа, стрептокиназа, тканевой плазминогенный активатор и урокиназа;

тиреотропных гормонов, таких как TRH (тиреотропин-высвобождающий фактор) и TSH;

средств, способствующих выделению мочевой кислоты, таких как бензбромарон, этебенецид, оротовая кислота, оксицинхофен, пробенецид, сульфинпиразон, тикринафен и зоксазоламин;

вазодилататоров (церебральных), таких как бенциклан, циннаризин, ситиколин, цикланделат, сиклоникат, диизопропиламина дихлорацетат, эбурнаморин, фенокседил, флунаризин, ибудиласт, ифенпродил, нафронил, никаметат, нисерголин, нимодипин, папаверин, пентифиллин, тинофедрин, винкамин, винпоцетин и вихидил;

вазодилататоров (коронарных), таких как амотрифен, бендазол, бенфуродила гемисукцинат, бензиодарон, хлоацизин, хромонар, клобенфурол, клонитрат, диазеп, дипиридамол, дропрениламин, эфлоксат, эритрит, эритритилтетранитрат, этафенон, фендилин, флоредил, ганглефен, гексестрола бис(β-диэтиламиноэтиловый простой эфир), гексобендин, итрамина тозилат, кхеллин, лидофлазин, маннита гексанитрат, медибазин, никорандил, нитроглицерин, пентаэритрита тетранитрат, пентринитрол, пергексилин, пимефиллин, прениламин, пропатилнитрат, пиридофиллин, трапидил, трикромил, триметазидин, тролнитрата фосфат и виснадин;

вазодилататоров (периферических), таких как алюминия никотинат, баметан, бенциклан, бетагистин, брадикинин, бровинкамин, буфониод, буфломедил, буталамин, цетиедил, сиклоникат, синепазид, циннаризин, цикланделат, диизопропиламина дихлорацетат, эледоизин, феноксидил, флунаризин, героникат, ифенпродил, инозита ниацинат, изокссуприн, каллидин, калликреин, моксисилит, нафронил, никаметат, нисерголин, никофураноза, никотиниловый спирт, нилидрин, пентифиллин, пентоксифиллин, пирибедил, простагландин E₁, сулоктидил и ксантинала ниацинат;

вазопротекторов, таких как бензарон, биофлавоноиды, хромокарб, клобеозид, диосмин, добезилат кальция, эсцин, ролескутол, лейкоцианидин, метескуфиллин, кверцетин, рутин и троксерутин;

витаминов, источников витаминов и витаминных экстрактов, таких как витамины А, В, С, D, Е и К и их производные, кальциферолы, солодковый корень и мекобаламин;

агентов, способствующих заживлению раны, таких как ацетилцистеин, аллантоин, азиатикозид, кадексомер йод, хитин, декстраномер и оксацепрол;

антикоагулянтов, таких как гепарин:

средства смешанного действия, такого как эритропоэтин (повышающего количество гемоглобина в крови), филграстим, финастерид (против доброкачественной гипертрофии предстательной железы) и интерферон β 1α (против множественного склероза).

В некоторых воплощениях доставляемый агент представляет собой один или более белков, гормонов, витаминов или минералов. В некоторых воплощениях доставляемый агент выбран из инсулина, IGF-1 (инсулиноподобный ростовой фактор 1), тестостерона, винпоцетина, гексарелина, GHRP-6 (высвобождающий пептид 6 ростового гормона) или кальция. В некоторых воплощениях композиции содержат два или более агентов.

Приведенный выше перечень активных агентов основан на категориях и видах лекарственных средств, приведенных на страницах от THER-1 до THER-28 Merck Index, 12-е издание, Merck & Co. Rahway, N.J. (1996). Эта ссылка включена в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки.

Г. Применения композиций

Терапевтические и диагностические применения микросфер включают лекарственную доставку, вакцинацию, генотерапию и визуализацию in vivo тканей или опухолей. Способы введения включают пероральное или парентеральное введение; введение через слизитые; офтальмическое введение; внутривенную, подкожную, внутрисуставную или внутримышечную инъекцию; ингаляционное введение; и местное введение.

Заболевания и расстройства могут включать, но не ограничиваются этим, нервные расстройства, респираторные расстройства, расстройства иммунной системы, мышечные расстройства, репродуктивные расстройства, желудочно-кишечные расстройства, легочные расстройства, пищеварительные расстройства, метаболические расстройства, сердечно-сосудистые расстройства, почечные нарушения, пролиферативные расстройства, злокачественные заболевания и воспаление.

Микрочастицы, предложенные в данном изобретении, могут быть использованы для лечения инфекционных заболеваний, таких как зооноз: арбовирусные инфекции, ботулизм, бруцеллез, кандидоз, кампилобактериоз, ветряная оспа, хламидиоз, холера, короновирусные инфекции, стафилококковые инфекции, инфекции вирусом Коксаки, болезнь Крейцфельдта-Якоба, криптоспоридиоз, инфекция циклоспорами, цитомегаловирусные инфекции, инфекция вирусом Эпштейна-Барра, лихорадка денге, дифтерия, ушные инфекции, энцефалит, гриппозные инфекции, парагриппозные инфекции, лямблиоз, гонорея, инфекции Haemophilus influenzae, гантавирусные инфекции, вирусный гепатит, инфекции, вызванные вирусом простого герпеса, ВИЧ/СПИД, инфекция видами Helicobacter, папилломавирусные инфекции человека (HPV), инфекционный мононуклеоз, болезнь "легионеров", лепра, лептоспироз, листериоз, болезнь Лима, лимфоцитарный хориоменингит, малярия, корь, церкопитековая геморрагическая лихорадка, менингит, обезьянья оспа, эпидемический паротит, микобактериальная инфекция, микоплазменная инфекция, инфекция вирусом Норвалк, коклюш, энтеробиоз, пневмококковое заболевание, инфекция Streptococcus pneumoniae, инфекция Mycoplasma pneumoniae, инфекция Moraxella catarrhalis, инфекция Pseudomonas aeruginosa, ротавирусная инфекция, орнитоз, бешенство, инфекция респираторно-синтициальным вирусом (RSV), дерматомикоз, пятнистая лихорадка Скалистых гор, краснуха, сальмонеллез, SARS (атипичная пневмония (severe acute respiratory syndrome)), чесотка, венерические болезни, шигеллез, опоясывающий герпес, споротрихоз, стрептококковые инфекции, сифилис, столбняк, трихинеллез, туберкулез, туляремия, брюшной тиф, вирусный менингит, бактериальный менингит, вирусная инфекция западного Нила, желтая лихорадка, иерсиниоз и любые другие инфекционные заболевания дыхательных, легочных, дерматологических, желудочно-кишечных и мочевых путей.

Другие заболевания и состояния включают артрит, астму, аллергические состояния, болезнь Альцгеймера, виды рака, сердечно-сосудистое заболевание, множественный склероз (MS), болезнь Паркинсона, муковисцидоз (CF), диабет, невирусный гепатит, гемофилию, нарушения кровотечения, болезни крови, генетические нарушения, гормональные расстройства, заболевание почек, заболевание печени, неврологические расстройства, метаболические заболевания, кожные состояния, заболевание щитовидной железы, остеопороз, ожирение, инсульт, анемию, воспалительные заболевания и аутоиммунные заболевания.

Д. Комбинации, наборы, изделия

Предложены комбинации и наборы, содержащие комбинации, предложенные в данном изобретении, включающие микрочастицы или ингредиенты для образования микрочастиц, такие как белок или другая макромолекула, противоионы, растворители, буферы или соли, и возможно включающие инструкции для введения. Комбинации включают, например композиции, предложенные в данном изобретении, и реагенты или растворы для разведения композиции до желаемой концентрации для введения реципиенту-субъекту, в том числе людям. Комбинации также могут включать композиции, предложенные в данном изобретении, и дополнительные пищевые и/или терапевтические агенты, в том числе лекарственные средства, предложенные в данном изобретении.

В данном изобретении дополнительно предложены наборы, содержащие описанные выше комбинации и возможно инструкции для введения пероральным, подкожным, трансдермальным, внутривенным, внутримышечным, офтальмическим или другими путями, в зависимости от белка, и возможный дополнительный агент(ы), которые должны быть доставлены.

Композиции, предложенные в данном изобретении, могут быть упакованы в виде изделий, содержащих упаковочный материал, предложенную в данном изобретении композицию и этикетку, на которой указано, что композиция, например, DAS181-композиция, изготовлена для пероральной, легочной или другой доставки.

Изделия, предложенные в данном изобретении, могут содержать упаковочные материалы. Упаковочные материалы для применения в упаковывании фармацевтических продуктов хорошо известны специалистам в данной области техники. См., например, патенты США №№5323907, 5052558 и 5033252. Примеры фармацевтических упаковочных материалов включают, но не ограничиваются этим, блистерные упаковки, бутылки, пробирки, ингаляторы, насосы, мешки, флаконы, контейнеры, бутылки и любой упаковочный материал, подходящий для выбранной композиции и предполагаемого способа введения и лечения.

Следующие далее примеры включены только для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема изобретения.

ПРИМЕР 1

Изготовление микросфер сиалидазного слитого белка DAS181

А. Очистка DAS181

DAS181 представляет собой слитый белок, содержащий гепарин(гликозаминогликан или GAG)-связывающий домен амфирегулина человека, слитый через его N-конец с С-концом каталитического домена Actinomyces viscosus (последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO:17). Белок DAS181 очищали, как описано в работе Malakhov et al., Antimicrob. Agents Chemother., 1470-1479, 2006, включенной в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки. Кратко, фрагмент ДНК, кодирующий DAS181, клонировали в плазмидный вектор pTrc99a (Pharmacia; SEQ ID NO:16) под контролем IPTG(изопропил-β-D-тиогалактопиранозид)-индуцибельного промотора. Полученную конструкцию экспрессировали в штамме BL21 Escherichia coli (Е. coli).

Клетки Е. coli, содержащие экспрессируемую конструкцию, лизировали ультразвуком в 50 мМ фосфатном буфере, pH 8,0; 0,3 М NaCl и 10%-ном глицерине. Осветленный лизат пропускали через колонку с SP-Сефарозой. Белки элюировали из колонки лизирующим буфером, который содержал 0,8 М NaCl. В элюируемую с SP-Сефарозы фракцию добавляли сульфат аммония ((NH₄)₂SO₄) до 1,9 М, осветляли центрифугированием и наносили на колонку с бутил-сефарозой. Колонку промывали двумя объемами 1,3 М (NH₄)₂SO₄) и слитый белок DAS181 элюировали 0,65 М (NH₄)₂SO₄).

В качестве заключительной стадии проводили гель-фильтрацию на Сефакрил S-200, уравновешенном фосфат-забуференным физиологическим раствором (PBS). Определено, что чистота белка составляла более 98% по оценкам с использованием гель-электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS), обращенно-фазовой жидкостной хроматографии высокого давления и иммуноферментного твердофазного анализа с антителами против клеточных белков Е. соli. Очищенный DAS181, молекулярная масса 44800 Да, диализовали против 2 мМ натрий-ацетатного буфера, pH 5,0.

Б. Активность DAS181

Сиалидазную активность DAS181 измеряли, используя флуорогенный субстрат 4-метилумбеллиферил-N-ацетил-α-D-нейраминовую кислоту (4-MU-NANA; Sigma). Одну единицу сиалидазы определяют как количество фермента, которое высвобождает 10 нмоль MU из 4-MU-NANA за 10 минут при 37°C (50 мМ CH₃COOH-NaOH буфер, pH 5,5) в реакционной смеси, содержащей 20 нмоль 4-MU-NANA в объеме 0,2 мл (Potier et al., Anal. Biochem., 94: 287-296, 1979). Было определено, что удельная активность DAS181 составляла 1300 ед./мг белка (0,77 мкг белка DAS181 на одну единицу активности).

В. Изготовление микросфер с использованием очищенного DAS181

DAS181 (10 мг/мл), очищенный и полученный как описано выше в разделе А, использовали для образования коктейлей объемом 200 мкл, показанных ниже. Коктейли содержали или глицин, или цитрат в качестве противоионов и изопропанол в качестве органического растворителя, как изложено ниже:

1) DAS181+5 мМ глицин, pH 5,0;

2) Das 181+5 мМ глицин, pH 5,0,+10% изопропанола;

3) DAS181+5 мМ цитрат натрия, pH 5,0;

4) DAS181+5 мМ цитрат натрия, pH 5,0, +10% изопропанола.

Пластмассовые микроцентрифужные пробирки, содержащие коктейли с ингредиентами, описанными выше в 1)-4), постепенно охлаждали от:

(а) температуры окружающей среды (примерно 25°C) до 4°C, помещая коктейли в холодильник, с последующим:

(б) охлаждением до -20°C, помещая полученный коктейль со стадии (а) в морозильную камеру, с последующим:

(в) замораживанием до -80°C, помещая полученный коктейль со стадии (б) в морозильную камеру.

Ожидается, что в оптимальных условиях микросферы будут образовываться при температурах от примерно 4°C до примерно -20°C (обычно в диапазоне от примерно -2°C до примерно -15°C). Замораживание до -80°C осуществляют для удаления из коктейля ингредиентов, отличных от микросфер (например, растворителя и т.д.), сублимационной сушкой. Коктейль 4) готовили в трех повторностях с двумя аликвотами в пластмассовых пробирках и одной в стеклянной пробирке. Одну аликвоту (в пластмассовой пробирке) охлаждали, как описано выше, в то время как две другие аликвоты (одну в пластмассовой пробирке, а другую в стеклянной пробирке) подвергали мгновенному охлаждению/замораживанию, погружая пробирки в жидкий азот.

После замораживания все пробирки помещали в лиофилизатор и летучие вещества (воду и изопропанол) удаляли посредством сублимации, получая сухие гранулы.

Результаты: сухие гранулы, полученные из коктейлей, обработанных, как описано выше, тестировали на наличие микросфер. Среди вышеупомянутых образцов микросферы с хорошими характеристиками дисперсности, примерно 2 микрона (мкм) в размере, наблюдали только для коктейля 4), содержащего цитрат в качестве противоиона и изопропанол и подвергнутого постепенному охлаждению. Применение противоиона глицина не было оптимальным для белка DAS181 (коктейль 2)), что было продемонстрировано наличием смеси стеклоподобных кристаллов и агломератов и лишь небольшого количества микросфер. В отсутствие какого-либо органического растворителя была получена стеклоподобная масса лиофилизированного белка DAS181 и никаких микросфер обнаружено не было (коктейли 1) и 3)). Мгновенное замораживание коктейля 4) в стеклянной пробирке приводило к образованию стеклоподобных кристаллов и отсутствию микросфер, тогда как мгновенное замораживание коктейля 4) в пластмассовой пробирке (скорость охлаждения немного меньше ввиду более медленной передачи тепла через пластмассу по сравнению со стеклом) приводило к образованию агломерированных микросфер.

Этот пример демонстрирует, что микросферы с узким распределением по размерам и хорошей дисперсностью (минимальной агломерацией) могут быть изготовлены посредством комбинирования соответствующего белка, противоиона, органического растворителя и постепенного охлаждения с использованием способов, предложенных в данном изобретении.

ПРИМЕР 2

Размер микросфер DAS181 в зависимости от концентрации органического растворителя

DAS181 очищали и использовали для изготовления микросфер, как описано выше в Примере 1 (см. коктейль 4)), используя комбинацию белка DAS181 (10 мг/мл), цитрата в качестве противоиона (цитрат натрия, 5 мМ) и органического растворителя изопропанола (10%, 20% или 30%). Изготовленные коктейль-растворы охлаждали от температуры окружающей среды (примерно 25°C) до 4°C, с последующим охлаждением до -20°C, с последующим замораживанием до -80°C, как описано в Примере 1. После замораживания до -80°C пробирки помещали в лиофилизатор, и летучие вещества (воду и изопропанол) удаляли посредством сублимации с получением сухого порошка, содержащего микросферы.

Результаты: образование микросфер наблюдали при всех трех концентрациях: 10%, 20% или 30% органического растворителя изопропанола. Однако размеры микросфер менялись в зависимости от концентрации органического растворителя. Размеры микросфер, как определено путем сравнения частиц на решетке на гемоцитометре, составляли 2 микрона при использовании 10% изопропанола, 4 микрона при использовании 20% изопропанола и 5-6 микрон при использовании 30% изопропанола. Эти результаты демонстрируют, что микрочастицы желаемого размера могут быть созданы с использованием соответствующей концентрации органического растворителя.

ПРИМЕР 3

Размер микросфер DAS181 в зависимости от концентрации белка

DAS181 очищали и использовали для изготовления микросфер, как описано выше в Примере 1 (см. коктейль 4)), используя комбинацию белка DAS181 (5 мг/мл или 10 мг/мл), цитрата в качестве противоиона (цитрат натрия, 5 мМ) и изопропанола (5% или 20%). Изготовленные коктейль-растворы охлаждали от температуры окружающей среды (примерно 25°C) до 4°C, с последующим охлаждением до -20°C, с последующим замораживанием до -80°C, как описано в Примере 1. После замораживания до -80°C пробирки помещали в лиофилизатор, и летучие вещества (воду и изопропанол) удаляли посредством сублимации с получением сухого порошка, содержащего микросферы.

Результаты: образование микросфер наблюдали с обеими концентрациями белка (5 мг/мл и 10 мг/мл) и обеими концентрациями органического растворителя (5% или 20%). Однако размеры микросфер менялись. Из коктейлей, содержащих 5 мг/мл или 10 мг/мл белка и 5% изопропанола, получали микросферы, оцененные как примерно 1,5 микрона в размере. Из коктейля, содержащего 5 мг/мл белка и 20% изопропанола, получали микросферы, оцененные как примерно 3 микрона в размере, в то время как из коктейля, содержащего 10 мг/мл белка и 20% изопропанола, получали микросферы, оцененные как примерно 4 микрона в размере. Эти результаты демонстрируют, что микрочастицы желаемого размера могут быть созданы с использованием соответствующей концентрации белка или с использованием соответствующей комбинации концентрации органического растворителя и концентрации белка.

ПРИМЕР 4

Размер микросфер DAS181 в зависимости от концентрации противоиона

DAS181 очищали и использовали для изготовления микросфер, как описано выше в Примере 1 (см. коктейль 4)), используя комбинацию белка DAS181 (10 мг/мл), цитрата в качестве противоиона (цитрат натрия; 2 мМ, 3 мМ или 6 мМ) и изопропанола (20%). Коктейль-растворы перемешивали в стеклянных флаконах и охлаждали от +20°C до -40°C при линейном изменении температур замораживания 1°C в минуту в лиофилизаторе Millrock Lab Series. Летучие вещества (воду и изопропанол) удаляли посредством сублимации при 100 мторр (13,3 Па) с первичной сушкой при -30°C в течение 12 часов и вторичной сушкой при 30°C в течение 3 часов с получением сухого порошка, содержащего микросферы.

Результаты: образование микросфер наблюдали при всех трех тестируемых концентрациях цитрата в качестве противоиона. Размер микросфер увеличивался от 1 микрона при 2 мМ цитрате, до 3 микрон при 3 мМ цитрате, до 5 микрон при 6 мМ цитрате. Добавление 1 мМ ацетата натрия или 1 мМ хлорида натрия к коктейлю, содержащему 2 мМ цитрат, не влияло на образование микросфер, инициируемое цитратом в качестве противоиона. Эти результаты демонстрируют, что микрочастицы желаемого размера могут быть созданы с использованием соответствующей концентрации противоиона.

ПРИМЕР 5

DAS181 - микросферы, образованные в присутствии поверхностно-активных веществ

Добавление поверхностно-активных веществ к микросферам макромолекул (например, белка) часто может улучшать характеристики микросфер, делающие их подходящими для введения субъекту, такие как текучесть, дисперсность и предрасположенность к конкретному пути введения, такому как интраназальная или пероральная ингаляция. Чтобы протестировать возможность включения поверхностно-активных веществ в способы изготовления микросфер, предложенные в данном изобретении, было предпринято получение DAS181-микросфер, как описано в Примере 1 выше, за исключением того, что дополнительно к раствору было добавлено поверхностно-активное вещество. К коктейль-раствору, содержащему 5 мг/мл DAS181, 5 мМ цитрат натрия и 20% изопропанола, добавляли поверхностно-активное вещество (3,5% (масс./масс.) лецитина, 0,7% (масс./масс.) Span-85® (сорбитантриолеат) или 3,5% (масс./масс.) олеиновой кислоты). Микросферы образовывались посредством охлаждения растворов до 4°C, с последующим охлаждением до -20°C, с последующим замораживанием до -80°C для лиофилизации, как описано выше в Примере 1. После замораживания пробирки помещали в лиофилизатор, и летучие вещества (воду и изопропанол) удаляли посредством сублимации с получением сухого порошка, содержащего микросферы.

Результаты: микросферы, полученные в результате описанной выше обработки каждого из указанных выше коктейлей, наносили в качестве покрытия на предметные стекла, используя растирание круговыми движениями скользящей крышкой. Во всех случаях наблюдали эффективное образование микросфер. Когда образцы, содержащие поверхностно-активное вещество, сравнивали с образцом, содержащим все оставшиеся ингредиенты, но без добавленного поверхностно-активного вещества, было отмечено, что микросферы, образованные в присутствии поверхностно-активного вещества, обладают улучшенной дисперсностью (меньшей агломерацией или агрегацией).

ПРИМЕР 6

Изготовление микросфер бычьего сывороточного альбумина (БСА) посредством выбора подходящих типов и концентраций органических растворителей и противоионов

Как изложено в данном описании, способы, предложенные в данном изобретении, могут быть эмпирически оптимизированы в высокопроизводительном формате для получения микросфер, имеющих желаемые характеристики, включая размер, текучесть и дисперсность. Цель этого эксперимента состояла в том, чтобы продемонстрировать, что посредством варьирования типов и концентраций органических растворителей и противоионов, а также pH коктейля, можно регулировать размер и качество микросфер представляющего интерес белка, в данном случае бычьего сывороточного альбумина (БСА).

Коктейль-растворы, содержащие 5 мг/мл БСА и различные органические растворители и противоионы с указанными значениями pH и концентрациями (см. Таблицу 1), помещали в титрационный микропланшет (конечный объем на лунку 0,1 мл). Коктейли охлаждали от +20°C до -40°C при линейном изменении температур замораживания 1°C в минуту в лиофилизаторе Millrock Lab Series. Летучие вещества удаляли посредством сублимации при 100 мторр (13,33 Па) с первичной сушкой при -30°C в течение 12 часов и вторичной сушкой при 30°C в течение 3 часов

Результаты: результаты приведены ниже в Таблице 1. Для белка БСА комбинации (противоиона и органического растворителя, соответственно), которые дают наиболее однородные микросферы с минимальной кристаллизацией или агрегацией, включают:

(1) цитрат+изопропанол,

(2) цитрат+ацетон,

(3) итаконовая кислота+1-пропанол,

(4) глицин+диоксан,

(5) глицин+1-пропанол,

(6) рубидий+1-пропанол,

(7) перхлорат+1-пропанол.

Таблица 1
Высокопроизводительный скрининг микросфер БСА, образованных в разных условиях
Противоион	pH	Органический растворитель	Описание продукта
5 мМ пивалиновая кислота	4,0	5% циклогексанола	Микросферы 0,5-1 микрон с редкими кристаллами
5 мМ пивалиновая кислота	4,0	5% 1-пропансла	Микросферы 0,5-1 микрон с некоторым количеством агрегатов
5 мМ пивалиновая кислота	4,0	5% бутилового спирта	Агрегированные микросферы
5 мМ пивалиновая кислота	4,0	5% лара-диоксана	Агрегированные микросферы
5 мМ хлорид рубидия	9,0	5% циклогексанола	Микросферы 0,5-1 микрон. Агрегаты и редкие кристаллы
5 мМ хлорид рубидия	9,0	5% 1-пропанола	Микросферы 0,5-1 микрон
5 мМ хлорид рубидия	9,0	5% бутилового спирта	Редкие микросферы (0,5-1 микрон). В основном агрегаты и кристаллы
5 мМ хлорид рубидия	9,0	5% лара-диоксана	Микросферы 1-2 микрона с некоторым количеством агрегатов
5 мМ бромид натрия	4,0	5% циклогексанола	Микросферы 1-2 микрона с некоторым количеством агрегатов
5 мМ бромид натрия	4,0	5% 1-пропанола	Редкие микросферы (0,5-2 микрона). В основном агрегаты и кристаллы
5 мМ бромид натрия	4,0	5% бутилового спирта	Редкие микросферы (0,5-1 микрон). В основном агрегаты и кристаллы

Противоион	pH	Органический растворитель	Описание продукта
5 мМ бромид натрия	4,0	5% пара-диоксана	Микросферы 1-2 микрона с некоторым количеством агрегатов
5 мМ перхлорат натрия	4,0	5% циклогексанола	Микросферы 0,5-2 микрона с некоторым количеством кристаллов и агрегатов
5 мМ перхлорат натрия	4,0	5% 1-пропанола	Микросферы 0,5-1 микрон
5 мМ перхлорат натрия	4,0	5% бутилового спирта	Редкие микросферы 1-2 микрона. В основном кристаллы и агрегаты
5 мМ перхлорат натрия	4,0	5% пара-диоксана	Агрегированные микросферы
5 мМ фосфат кальция	4,0	5% циклогексанола	Редкие микросферы 1-2 микрона. В основном агрегаты
5 мМ фосфат кальция	4,0	5% 1-пропанола	Микросферы 1-2 микрона с некоторым количеством агрегатов
5 мМ фосфат кальция	4,0	5% бутилового спирта	Редкие микросферы 1-2 микрона. В основном кристаллы и агрегаты
5 мМ фосфат кальция	4,0	5% пара-диоксана	Агрегированные микросферы
5 мМ триэтиламин	9,0	5% циклогексанола	Микросферы 0,5-1 микрон с некоторым количеством кристаллов и агрегатов
5 мМ триэтиламин	9,0	5% 1-пропанола	Микросферы 1-2 микрона с некоторым количеством агрегатов
5 мМ триэтиламин	9,0	5% бутилового спирта	Редкие микросферы 1-2 микрона. В основном кристаллы и агрегаты
5 мМ триэтиламин	9,0	5% лара-диоксана	Агрегированные микросферы
5 мМ глицин	9,0	5% циклогексанола	Микросферы 0,5-1 микрон с некоторым количеством кристаллов и агрегатов
5 мМ глицин	9,0	5% 1-пропанола	Микросферы 0,5-2 микрона с редкими агрегатами
5 мМ глицин	9,0	5% бутилового спирта	Редкие микросферы 1-2 микрона. В основном кристаллы и агрегаты
5 мМ глицин	9,0	5% пара-диоксана	Микросферы 1-2 микрона
5 мМ цитрат натрия	4,0	15% изопропанола	Микросферы 1-2 микрона
5 мМ цитрат натрия	4,0	15% ацетона	Микросферы 0,5-1 микрон

Противоион	pH	Органический растворитель	Описание продукта
5 мМ итаконовая кислота	4,0	15% 1-пропанола	Микросферы 1-2 микрона

Эти результаты демонстрируют, что для каждого белка в рамках высокопроизводительного формата можно легко провести скрининг многочисленных композиций на предмет образования наилучших микросфер (желаемые размеры, однородность, дисперсность, минимальные агрегация и образование кристаллов и т.д.). Комбинации реагентов и условий (противоион, органический растворитель, рН, концентрации), выбранные для начального скрининга, затем можно дополнительно точно отрегулировать, по желанию.

ПРИМЕР 7

Изготовление микросфер с использованием разнообразных белков

Способы, предложенные в данном изобретении, могут быть использованы для изготовления микросфер с использованием разнообразных белков. В дополнение к приведенным выше в качестве примеров DAS181 и БСА данные способы использовали для изготовления микросфер из трипсина, гемоглобина, ДНКазы I, лизоцима, овальбумина, РНКазы А, протеиназного ингибитора 8 человека с гексагистидиновой меткой (PI8, имеющего последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO:15), красного флуоресцентного белка (RFP) и зеленого флуоресцентного белка (GFP).

ДНКазу I, трипсин и гемоглобин получали от Worthington. Лизоцим, овальбумин и РНКазу А получали от Sigma. Очистка 6xHis-меченных PI8, GFP и RFP: 6хHis-меченные PI8, GFP и RFP экспрессировали и очищали по существу, как описано для DAS181 в Примере 1 выше, с приведенными далее модификациями.

Очистка 6хHis-меченного GFP и 6xHis-меченного RFP: конструкции, кодирующие красный флуоресцентный белок и зеленый флуоресцентный белок с N-концевыми метками His₆, экспрессировали в Е. coli в виде exHis-меченных белков. Экспрессию красного флуоресцентного белка осуществляли в течение ночи в среде LB (бульон Луриа) с 1 мМ IPTG. Зеленый флуоресцентный белок индуцировали в течение 3 часов в среде ТВ (Terrific Broth) с 1 мМ IPTG. Клеточные лизаты из 4 литров индуцированных культур осветляли центрифугированием и белки очищали металл-хелатирующей аффинной хроматографией на хелатирующей смоле Fast-Flow (GE Healthcare), заряженной никелем и упакованной в С-10 колонки (GE Healthcare).

Затем белки очищали гель-фильтрацией на колонке с Сефакрилом 200 (0,5 см×70 см), уравновешенной забуференным фосфатом физиологическим раствором. Белки диализовали против 2 мМ натрий-ацетатного буфера, pH 5,0, и концентрировали на Centriprep (Amicon).

Очистка 6хHis-меченного PI8: конструкцию, кодирующую PI8 с N-концевой меткой HiS₆, экспрессировали в Е. coli в виде 6×His-меченного PI8. Очистку проводили, как описано выше для 6xHis-RFP и 6xHis-GFP, за исключением того, что все буферы, используемые на различных стадиях хроматографической очистки, содержали 1 мМ ТСЕР (трис(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорид).

Изготовление микросфер: коктейль-растворы, содержащие 5 мг/мл белка и различные противоионы, органические растворители и pH, которые перечислены ниже, готовили в титрационном микропланшете, как описано выше в Примере 6.

Таблица 2
Комбинации, используемые для изготовления микросфер различных белков
Белок	Противоион	pH	Органический растворитель	Размер микросфер (микроны)
Трипсин	5 мМ аргинин	8,0	5% изопропанола	0,5-1
Лизоцим	5 мМ цитрат	8,0	5% изопропанола	4-5
PIN 168 (PI8)	5 мМ цитрат	5,0	7% изопропанола	2-5
ДНКаза I	5 мМ цитрат	4,0	5% изопропанола	0,4-1
РНКазаА	5 мМ цитрат	4,0	5% изопропанола	0,4-1
Гемоглобин	5 мМ глицин	5,0	10% изопропанола	0,4-0,7
Овальбумин	5 мМ пиваловая кислота	4,0	10% изопропанола	0,5-1
Красный флуоресцентный белок	5 мМ пиваловая кислота	7,0	10% 1-пропанола	1-4 (редкие агрегаты)
Зеленый флуоресцентный белок	5 мМ пиваловая кислота	7,0	10% 1-пропанола	0,5-1,5

Титрационный микропланшет охлаждали от +20°C до -40°C при линейном изменении температур замораживания 1°C в минуту в лиофилизаторе Millrock Lab Series. Летучие вещества (воду и изопропанол) удаляли посредством сублимации при 100 мторр (13,33 Па) с первичной сушкой при -30°C в течение 12 часов и вторичной сушкой при 30°C в течение 3 часов с получением сухого порошка, содержащего микросферы.

Сухие порошки наносили в виде покрытия на предметные стекла и, используя объектив 32х или 100х, осуществляли микрофотографирование. Все комбинации, перечисленные выше в Таблице 2, давали микросферы хорошего качества (однородное распределение по размерам, дисперсность, с небольшим количеством агрегатов и/или кристаллов). Размер микросфер изменялся от примерно 0,4-1 микрон (РНКаза А, ДНКаза I) до примерно 2-5 микрон (6xHis-PI8, лизоцим) в зависимости от белка. Этот пример демонстрирует, что способы, предложенные в данном изобретении, могут быть использованы для изготовления микросфер из большого разнообразия белков.

ПРИМЕР 8

Распределение частиц DAS181-микросфер для ингаляции по их аэродинамическим размерам: сравнение способов, предложенных в данном изобретении, с распылительной сушкой

Как изложено в данном описании, способы, предложенные в данном изобретении, могут быть использованы для изготовления микросфер в любом желаемом диапазоне размеров, включая диапазон от примерно 0,5 микрона до примерно 6-8 микрон, для доставки посредством ингаляции.

А. Изготовление микросфер

Для тестирования распределения частиц сухого порошка DAS181 (микросфер), изготовленного для доставки посредством ингаляции, по их аэродинамическим размерам изготавливали DAS181-микросферы, используя два способа, которые изложены ниже:

(а) водный раствор DAS181, содержащий 14 мг/мл DAS181, 5 мМ цитрат натрия, pH 5,0, сушили распылением в воздушном потоке при 55°C для изготовления микросфер;

(б) альтернативно, микросферы DAS181 изготавливали в соответствии со способами, предложенными в данном изобретении. К водному раствору DAS181, содержащему 14 мг/мл DAS181, 5 мМ цитрат натрия, pH 5,0, добавляли 5% изопропанола в качестве органического растворителя. Приготовленный раствор охлаждали от +20°C до -40°C при линейном изменении замораживания 1°C в минуту в лиофилизаторе Millrock Lab Series. Летучие вещества (воду и изопропанол) удаляли посредством сублимации при 100 мторр (13,33 Па) с первичной сушкой при -30°C в течение 12 часов и вторичной сушкой при 30°C в течение 3 часов с получением сухого порошка, содержащего микросферы.

Б. Распределение частиц микросфер по их аэродинамическим размерам

Микросферы, изготовленные, как описано в Примере 8А, тестировали методом каскадного столкновения по Андерсену (Andersen cascade impaction). Осаждение фармацевтических средств в дыхательных путях можно предсказать по аэродинамическому поведению частиц (микросфер) на ступенях/приемных пластинах каскадного импактора. Эксперимент с каскадным столкновением проводили, используя DAS181-микросферы, изготовленные одним из двух альтернативных способов, описанных выше в разделе А, т.е. либо с использованием распылительной сушки, либо способов, предложенных в данном изобретении. Микросферы (10 мг) загружали в желатиновые капсулы. Желатиновые капсулы помещали в сухой порошковый ингалятор CycloHaler (PharmaChemie) и подвергали каскадному столкновению. Использовали 8-ступенчатый каскадный импактор Андерсена (ACI) для неживых частиц (Thermo Electron, Boston), модифицированный для подачи потока воздуха 90 литров в минуту, оборудованный трубкой по стандарту USP (Фармакопея США), впускным конусом (induction cone) и не содержащий предсепаратора. На приемные пластины импактора, соответствующие различным областям/ступеням осаждения после ингаляции (трахея, первичные и вторичные бронхи, конечные бронхи, альвеолы и т.д.), наносили покрытие силиконового напыления для предупреждения отскакивания микросфер. Микросферы со ступеней и приемных пластин переводили в забуференный фосфатом физиологический раствор, содержащий 0,1% Твина, и количество осажденного DAS181, собранного с каждой ступени и каждой приемной пластины, определяли посредством измерения поглощения при 280 нм.

Результаты: геометрический размер микросфер, изготовленных двумя способами, оценивали по световой микроскопии, и было обнаружено, что он по существу идентичен (диапазон 1,5-3,0 микрона) для обоих способов. Однако, как показано ниже в Таблице 3, распределение частиц двух данных композиций по их аэродинамическим размерам существенно различается в двух способах. Микросферы, изготовленные в соответствии со способом, предложенным в данном изобретении (т.е. способом (б), приведенным выше в разделе А) менее чем на 25% оставались уловленными во рту (горловине/конусе системы импактора), в то время как более 70% микросфер доставлялись в трахею и легкие (из них более 40% в конечные бронхи и альвеолы). В сравнение с этим, менее 50% DAS181-микросфер, образованных распылительной сушкой (способ (а), приведенный выше в разделе А), доставлялись в трахею и легкие (менее 20% в конечные бронхи и альвеолы). Результаты демонстрируют, что при применении способов, предложенных в данном изобретении, можно изготавливать микросферы для доставки глубоко в легкие, и что микросферы, изготовленные способами, предложенными в данном изобретении, обладают превосходными свойствами дезагломерации и текучести (обеспечивая более высокую доставляемую дозу) по сравнению с микросферами, изготовленными способом распылительной сушки.

Таблица 3
Результаты анализов каскадного соударения DAS181-микросфер
				Процентное осаждение DAS181
Компонент каскадного импактора Андерсена		Соответств. отсечение по размерам (микроны)	Ожидаемое осаждение в дыхательных путях	Микросферы, изготовленные способом (а) (т.е. распылительной сушкой)	Микросферы, изготовленные способом (б)
Горловина+конус		>10	Ротовая полость	42,9	16,6
-2 (S+Р)		8,0-10	Ротовая полость	3,7	4,9
-1 (S+Р)		6,5-8,0	Ротоглотка	5,9	5,5
-0		5,2-6,5	Глотка	5,8	4,0
1		3,5-5,2	Трахеи/бронхи	12,5	9,3
2		2,6-3,5	Вторичные бронхи	11,6	12,6
3		1,7-2,6	Конечные бронхи	11,0	24,0
4	1,0-1,7		Альвеолы	4,5		19,2
5	0,43-1,0		Альвеолы	1,4		3,5
S=ступень. P=пластина.

ПРИМЕР 9

Крупномасштабное производство микросфер

Этот пример демонстрирует, что способы, предложенные в данном изобретении, могут быть масштабированы для изготовления больших количеств DAS181. Периодический (с перерывами) способ, описанный в данном изобретении, подходит для изготовления высококачественного сухого порошка микросфер в количестве от, например, миллиграммов до примерно килограмма и лимитируется емкостью резервуара для смешивания и/или площадью полок лиофилизатора. Альтернативный "непрерывный" процесс, описанный в данном изобретении, может быть использован для изготовления количеств от, например, одной сотни граммов до одной сотни или более килограммов (от 100 граммов до 100 кг и выше). Дополнительное преимущество непрерывного процесса заключается в лучшем регулировании охлаждения коктейля.

Крупномасштабное производство с использованием периодического способа или непрерывного способа может протекать, например, в одну или более чем одну стадию, описанную ниже, в любой комбинации стадий или с использованием особых альтернативных способов.

- Осаждение белка в микросферы. Эта стадия может быть осуществлена в периодическом режиме путем помещения коктейль-раствора, содержащего желаемую концентрацию белка, органический растворитель и противоион, в поддон(ы) для лиофилизации и помещения поддона(ов) на полки аппарата для лиофилизации. Альтернативно, поддоны могут быть охлаждены и заморожены на охлаждающей платформе или с использованием другого типа оборудования (например, морозильной камеры) и могут храниться замороженными в течение некоторого периода времени и лиофилизированы позже. Альтернативно, микросферы могут быть образованы путем осаждения в сосуде с перемешиванием, при этом сосуд помещают на холодную поверхность или в жидкость вводят охлаждающую спираль, или когда коктейль подвергают рециркуляции через теплообменник с использованием перистальтического насоса. Альтернативно, микросферы могут быть образованы путем осаждения в непрерывном режиме в результате однократного пропускания коктейль-раствора через теплообменник(и) с использованием перистальтического насоса.

- Удаление жидкости из объема. Суспензию микросфер можно сконцентрировать, используя стандартное центрифугирование, непрерывное проточное центрифугирование (например, CARR ViaFuge Pilot) или фильтрацию (например, на стеклянных фильтрах, агломерированном стекле, полимерных фильтрах, картриджах с полыми волокнами (например, выпускаемых GE Healthcare) или на фильтрационных кассетах с тангенциальным потоком (кассетах TFF, выпускаемых Millipore или Sartorius)). Удаление жидкости из объема (на 50% или более) может ускорить цикл сушки, повысить эффективность и производительность.

- Сушка микросфер. Извлеченные микросферы, образованные любым способом, можно сушить с применением традиционной лиофилизации. Альтернативно, микросферы можно сушить при температуре окружающей среды и атмосферном давлении, что позволяет исключить применение лиофилизатора.

Результаты: белок DAS181 был успешно переведен в сухой порошок (микросферы) в непрерывном режиме, как описано в данном изобретении. Коктейль, содержащий 10 мг/мл DAS181, 20% изопропанола, 2 мМ сульфат натрия, пропускали через теплообменник 35 SERIES (Exergy, Garden City, NY), соединенный с циркулирующим криостатом NESLAB, используя перистальтический насос таким образом, чтобы во время пропускания коктейль охлаждался от примерно 25°C до примерно -12°C. Приготовленную суспензию микросфер, выходящую из теплообменника, подавали с использованием насоса в предварительно охлажденный поддон (-40°C) для лиофилизации, замораживали и лиофилизировали или, альтернативно, подавали с использованием насоса непосредственно в жидкий азот и затем лиофилизировали. Изготовленные микросферы, которые анализировали с использованием микроскопии и каскадного соударения, представляли собой однородные микросферы с минимальной агрегацией и хорошей дисперсностью и были аналогичны по размерам и распределению частиц по их аэродинамическим размерам микросферам, изготовленным периодическим способом. Когда приготовленный коктейль-раствор DAS181 не подвергали охлаждению (не пропускали через теплообменник, тем самым не индуцируя никакого осаждения микросфер) и выливали непосредственно в жидкий азот, то не наблюдали никакого образования микросфер, а вместо этого после лиофилизации наблюдали образование стеклоподобных кристаллов.

ПРИМЕР 10

Способ в периодическом режиме и композиция DAS181 -микросфер для доставки в верхние и центральные дыхательные пути

В этом примере описываются композиция и способ изготовления ОА8181-микросфер. Содержимое коктейль-раствора DAS181 и относительные количества компонентов показаны в Таблице 4 ниже.

Таблица 4
Пропись для изготовления партии микросфер DAS181
Ингредиент	Количество на одну партию⁽¹⁾		Конечная концентрация в приготовлен. коктейле	Функция
Ингредиент	Концентрация исходного раствора	Добавленное количество	Конечная концентрация в приготовлен. коктейле	Функция
Белок DAS181	19,55 г/л	3,306 л, раствор API	12 г/л	Активный ингредиент
Ацетат натрия⁽²⁾	1,12 мМ		0,688 мМ	pH буфера
Уксусная кислота⁽²⁾	0,63 мМ		0,0387 мМ	pH буфера
Сульфат натрия	500 мМ	0,0215 л	2 мМ	Агент для образования микрочастиц (противоион)
Изопропанол	100% об./об.	0,269 л	5% об./об.	Агент для образования микрочастиц
Хлорид кальция	500 мМ	0,0028 л	0,268 мМ	Повышающий стабильность агент
Вода для растворения	чистая	1,79 л	NA	Растворитель
⁽¹⁾ Размер партии: конечный объем приготовленного коктейля 5,38 л. Теоретический выход 74 г нерасфасованного порошка DAS181
⁽²⁾ Компоненты исходного раствора белка DAS181 (API (активный фармацевтический ингредиент))
NA=не анализировали

А. Изготовление нерасфасованного лекарственного вещества

Термины лекарственное вещество, активный фармацевтический ингредиент и API в этом Примере использованы взаимозаменяемо и относятся к белку DAS181. Получение белка DAS181 в нерасфасованной (bulk) форме осуществляли следующим образом. Сначала большое количество DAS181 экспрессировали в Е. coli (штамм BL21), по существу как описано в Примере 1. Клетки Е. coli, экспрессирующие белок DAS181, промывали диафильтрацией на стадии промывки сбора ферментации, используя Toyopearl буфер 1, картридж на полых волокнах UFP-500-E55 (GE Healthcare) и перистальтический насос Watson-Marlow.

Затем рекомбинантный белок DAS181 очищали в большом количестве от клеток. Подробные описания компонентов и буферов, используемых очистке большого количества DAS181, представлены в Таблицах 5 и 6 ниже. Собранные и промытые клетки лизировали на стадии гомогенизации путем двукратного пропускания клеток через клеточный дезинтегратор Niro-Soave Panda. Изготовленный таким образом гомогенат осветляли микрофильтрацией с использованием Toyopearl буфера 1, TFF-кассеты 0,2 микрона (Hydrosart) и насоса Watson Marlow. Осветленный гомогенат далее концентрировали, проводя рециркуляцию лизата без подачи свежего буфера. Затем белок DAS181 адсорбировали из осветленного гомогената на смолу Toyopearl SP-550С, которую промывали серией буферов (см. Таблицу 5), после чего белок DAS181 элюировали со смолы. Концентрацию хлорида натрия в элюате подводили до 1,0 М в конечном 50 мМ фосфатном буфере рН 8,0. Затем DAS181 -содержащий элюат пропускали через смолу Toyopearl Hexyl-650C для дальнейшей очистки, используя Toyopearl буфер 4. Затем буфер в элюате со смолы, содержащем белок DAS181, заменяли на 5 мМ ацетат натрия на стадии диафильтрации (см. стадию 8 в Таблице 5). Концентрированный белок далее пропускали через фильтр Sartorius Q SingleSep для удаления ДНК в режиме проходящего потока, к фильтрату с Q SingleSep добавляли изопропанол до конечной концентрации 20% (об./об.). Белок DAS181 в буфере пропускали через смолу Amberchrome CG300M, уравновешенную Amberchrom буфером (см. стадию 11 в Таблице 5). Затем для очищенного в большом количестве белка DAS181 далее проводили замену буфера на буфер для композиции и концентрировали диафильтрацией (см. стадию 12 Таблицы 5).

Таблица 5
Очистка нерасфасованного лекарственного вещества DAS181
1	Задача	Промывка сбора ферментации	Описание
	Картридж	GE UFP-500-E55
	Процесс	Название буфера	Входное давление, ф/кв.дюйм (кПа)
	Диафильтрация	Toyopearl буфер 1	25-35 (172-243)

2	Задача	Гомогенизация
	Процесс	Стадия	Название буфера
	Уравновешивание	Уравновешивание	Буфер для сбора
	Гомогенизация 1-й прогон		Загрузка образца
	Гомогенизация 2-й прогон		Загрузка образца

3	Задача	Осветление гомогената (диафильтрация)	Описание
	TFF Картридж	HydroSart 10К 0,6 м²
	Процесс	Название буфера	Входное давление, ф/кв. дюйм (кПа)
	Рециркуляция	Загрузка образца	40 (276)
	Диафильтрация	Toyopearl буфер 1	<50 (<345)

4	Задача	Концентрирование пермеата	Описание
	TFF Картридж	HydroSart 10К 0,6 м²
	Процесс	Название буфера	Входное давление, ф/кв. дюйм (кПа)
	Рециркуляция	Загрузка образца	NS
	Концентрирование	Загрузка образца	<50 (<345)

5	Задача	Захват DAS181, осуществленный в режиме связывания и элюирования
	Смола	Toyopearl SP-550C
	Процесс	Стадия	Название буфера
	Загрузка	Загрузка образца	Осветл. гомогенат
	Промывка	SP-промывка 1	Toyopearl буфер 1
		SP-промывка 2	Toyopearl буфер 2
		SP-промывка 3	Toyopearl буфер 3
		SP-промывка 4	Toyopearl буфер 2
		SP-промывкз 5	Toyopearl буфер 1
	Элюирование	Элюирование	Toyopearl буфер 4

6	Задача	Подведение концентрации NaCl
	Метод	Добавить NaCl до 1,0 М
	Конечный буфер	50 мМ фосфат, 1,0 М NaCl, pH 8,0

7	Задача	Очистка DAS181 в режиме проходящего потока
	Смола	Toyopearl Hexyl-650C
	Процесс	Стадия	Название буфера
	Загрузка	Загрузка образца	В условиях загрузки на Hexyl-смолу

8	Задача	Концентрирование и диафильтрация	Описание
	TFF Картридж	HydroSart 10К 0,6 м²
	Процесс	Название буфера	Рециркул., л/мин*
	Рециркуляция	Toyopearl буфер 6	15-16
	Концентрирование	Пул продуктов после Hexyl-смолы	15-16
	Диафильтрация	Toyopearl буфер 6	15-16
	Рециркуляция	Toyopearl буфер 6	NS

9	Задача	Удаление ДНК в режиме проходящего потока
	Смола	Фильтр Sartorius Q SingleSep
	Процесс	Стадия	Название буфера
	Загрузка	Загрузка образца

10	Задача	Регулирование состава буфера
	Метод	Добавить изопропанол до 20%
	Конечный буфер	50 мМ ацетат, 20% изопропанола, pH 5,0

11	Задача	Окончательная очистка DAS181 в режиме проходящего потока
	Смола	Amberchrome CG300M
	Процесс	Стадия		Название буфера
	Загрузка	Загрузка образца		Загрузочный Amberchrome буфер

12	Задача	Концентрирование и диафильтрация		Описание
	TFF Картридж	HydroSart 10К 0,6 м²
	Процесс	Название буфера		Рециркул., л/мин*
	Рециркуляция	Буфер для композиции		15-16
	Концентрирование	Пул продуктов после Amberchrome		15-16
	Диафильтрация	Буфер для композиции		15-16
*Объемы в литрах, за исключением 4х, означающего кратности объема ретентата
CV=объемы колонки
NR=не регистрировали
NS=не уточняли

Таблица 6
Буферы, используемые в процессе очистки DAS181
Название буфера	Состав буфера
Toyopearl буфер 1	50 мМ фосфат калия, 0,3 М NaCl, pH 8,0
Toyopearl буфер 2	1,1 мМ фосфат калия, 2,9 мМ фосфат натрия, 154 мМ NaCl, pH 7,4
Toyopearl буфер 3	1,1 мМ фосфат калия, 2,9 мМ фосфат натрия, 154 мМ NaCl, 1% Тритона Х-100, 0,1% SDS, 0,5% дезоксихолата натрия, pH 7,4
Toyopearl буфер 4	50 мМ фосфат калия, 1,0 М NaCl, pH 8,0
Toyopearl буфер 5	50 мМ форсфат калия, 0 5 М NaCl pH 8,0
Toyopearl буфер 6	5 мМ ацетат натрия, pH 5,0
Toyopearl буфер 7	5 мМ ацетат натрия, 60% изопропанола, pH 5,0
Буфер для композиции	1,75 мМ ацетат натрия, pH 5,0
3% изопропилового спирта	3% изопропанола
Amberchrome буфер	5 мМ ацетат натрия, 20% изопропанола, pH 5,0, подведенный уксусной кислотой
1,0 н. NaOH 3% изопропанола	1,0 н. NaOH, 3% изопропанола
1,0 н. NaOH	1,0 н. NaOH
0,5 н. NaOH	0,5 н. NaOH
0,1 н. NaOH	0,1 н. NaOH
70% изопропилового спирта	70% изопропанола
20% ЕtOН	20% этилового спирта

Б. Периодический способ изготовления

Ингредиенты, приведенные в Таблице 4, выше, объединяли для образования DAS181-микросфер в крупномасштабном периодическом способе, как описано ниже.

Стадия I: размораживание нерасфасованного лекарственного вещества

Замороженное, профильтрованное через фильтр 0,2 мкм нерасфасованное лекарственное вещество в пластмассовых бутылках размораживали в течение ночи при температуре окружающей среды (25±3°C).

Стадия II: взвешивание эксципиентов и приготовление растворов

Взвешивали 35,51 г безводного порошка сульфата натрия и добавляли воду для растворения в количестве необходимом до 500 мл, затем перемешивали до получения прозрачного раствора. Взвешивали 18,38 г порошка хлорида кальция дигидрата и добавляли воду для растворения в количестве необходимом до 250 мл, затем перемешивали до получения прозрачного раствора.

Стадия III: получение коктейль-раствора DAS181

К 3,3 л концентрированного лекарственного вещества (19,55 г/л) медленно с перемешиванием добавляли 1,79 л воды для растворения с последующим добавлением 0,0215 л раствора сульфата натрия, 0,0028 л раствора хлорида кальция и 0,269 л изопропанола. Раствор перемешивали до полного смешивания компонентов.

Стадия IV: фильтрация приготовленного коктейль-раствора через фильтр 0,2 мкм

Для контроля частиц и обсемененности приготовленный коктейль-раствор со Стадии III фильтровали через фильтр 0,2 мкм в стерильные емкости для сред.

Стадия V: заполнение в поддоны для лиофилизации

Приготовленный отфильтрованный раствор распределяли в автоклавированные поддоны для лиофилизации Lyoguard. Для обеспечения равномерного охлаждения раствора и образования высококачественных микросфер в каждый из 6 поддонов вливали по 0,9 л или меньше коктейль-раствора.

Стадия VI: замораживание и лиофилизация

Поддоны помещали на полки лиофилизатора (Hull 120FSX200), предварительно охлажденные до -45±5°C, и раствор оставляли охлаждаться и замерзать. Образование микросфер происходило по мере замораживания раствора. Замораживание проводили в течение 1-2 ч для обеспечения полного затвердевания. Температуру продукта контролировали, следя за показаниями термопар, присоединенных к двум из шести поддонов.

Осуществляли следующие стадии цикла лиофилизации:

а) установка вакуума до 160 микрон и вакуумирование до 100-200 микрон;

б) линейное изменение температуры полок до +10°C в течение 3 ч;

в) поддержание температуры полок при +10°C в течение 36 ч (первичная сушка);

г) проверка записи показаний термопары, чтобы убедиться в завершении первичной фазы и стабилизации температуры продукта при +10°C±5°C в течение 15-30 ч;

д) линейное изменение температуры полок до +30°C в течение 1 ч и поддержание в течение 3-5 ч (вторичная сушка).

Стадия VII: перенесение нерасдзасованных микросфер DAS181 в контейнер и смешивание

Секцию пленки на дне каждого поддона для лиофилизации Lyoguard очищали, используя санирующие протирания, и скальпелем проделывали отверстие 3×3 см. Высушенные микросферы переносили в пластмассовую бутылку. Бутылку закрывали крышкой и переворачивали сорок раз, изменяя направления при каждом переворачивании. Переворачивания осуществляли для обеспечения однородности содержимого бутылки. Отбирали образцы для аналитического тестирования и бутылку повторно закрывали крышкой и герметично запечатывали в пластмассовые мешочки для хранения.

Было показано, что в способе изготовления нерасфасованных DAS181-микросфер, который описан выше, сульфат является безопасным веществом для использования в качестве противоиона и воспроизводимо дает микросферы с узким распределением по размерам. Далее, органический растворитель изопропанол являлся хорошим выбором для растворителя, потому что (1) он является растворителем класса 3, (2) с его помощью можно получать микросферы в широком диапазоне (2-30% (об./об.)) концентраций и (3) он обладает относительно высокой точкой замерзания, так что его пары могут эффективно улавливаться во время лиофилизации.

Концентрацию белка в конечной композиции можно варьировать (10-14 мг/мл), как и концентрацию противоиона (1-5 мМ) и изопропанола (2-30% (об./об.)) без существенного влияния на физические свойства микросфер или активность белка DAS181 в микросферах. При более высоких концентрациях изопропанола (15-30%) микросферы образовывались, пока коктейль оставался полностью жидким. При более низких концентрациях (2-15%) первыми начинали образовываться кристаллы льда с последующим осаждением с образованием микросфер.

В. Выход DAS181 в микросферах

Теоретический выход DAS181 в сухих микросферах рассчитывают в соответствии со следующей формулой:

Теоретический выход=белок DAS181, г/доля белка в сухом порошке (в микросферах).

Величину белковой фракции (0,866) устанавливали эмпирически, анализируя различные произведенные партии DAS181-микросфер. Теоретический выход для количеств, приведенных в Таблице 2, составляет 64,56 г/0,866=74,55 г. Было обнаружено, что реальный выход сухого порошка DAS181 составляет 64 г.

Результаты. Стабильность микросфер, изготовленных, как описано выше в разделе Б, для ведения посредством пероральной ингаляции, тестировали методом каскадного столкновения по Андерсену. Результаты суммированы в Таблице 7, ниже. Осаждение фармацевтических средств в дыхательных путях может быть предсказано, исходя из осаждения частиц (микросфер) на ступенях/приемных пластинах каскадного импактора. Для фармацевтического средства, например DAS181-микросфер, которое вводят для предупреждения или лечения вирусных инфекций, начинающихся в дыхательных путях, таких как грипп, желательно доставлять фармацевтическое средство в горло, трахеи и бронхи (верхние и центральные дыхательные пути). Слитый белок DAS181, доставляемый в верхние и центральные дыхательные пути, расщепляет рецепторные сиаловые кислоты мембран слизистой оболочки, предупреждая тем самым связывание вируса и инфекцию в этих сайтах. Для оптимальной доставки DAS181-микросфер в места, где может быть инициирована респираторная вирусная инфекция, т.е. в горло, трахеи или бронхи, микросферы не должны быть (а) слишком большими, чтобы они захватывались на переднем краю ротовой полости (т.е. достаточно большими микросферами, примерно 8 микрон или больше); или (б) слишком маленькими, чтобы они осаждались глубоко в легких и всасывались системно в кровоток (т.е. 0,5 микрона или меньше). Для доставки DAS181 -микросфер в горло, трахеи и бронхи обычно подходит диапазон размеров от примерно 1 микрона до примерно 5,5-6 микрон.

DAS181-микросферы, изготовленные, как описано выше, были охарактеризованы методом каскадного столкновения по Андерсену и было установлено, что они подходят для доставки в верхние и центральные дыхательные пути со сравнительно низким процентом (<5%) осаждения в альвеолах.

Таблица 7
Распределение частиц сухого порошка DAS181 по аэродинамическим размерам при 60 литрах в минуту
Компонент каскадного импактора Андерсена	Соответств. разделение по размерам, микроны	Ожидаемое осаждение в дыхательных путях	Осажденный белок DAS181 (в мг)	Процент от общего извлеченного белка DAS181
Ингалятор (Cyclohaler)			1,57±0,11	20,13%
Трубка/конус	>10	Ротовая полость	0,93±0,19	11,92%
-1 (ступень+пласт.)	8,6-10	Ротовая полость	0,50±0,10	6,41%
-0 (ступень+пласт.)	6,5-8,6	Ротоглотка	0,40±0,03	5,13%
1 (ступень+пласт.)	4,4-6,5	Глотка	0,58±0,03	7,44%
2 (ступень+пласт.)	3,3-4,4	Трахеи/бронхи	0,83±0,07	10,64%
3 (ступень+пласт.)	2,0-3,3	Вторичные бронхи	1,80±0,09	23,08%
4 (ступень+пласт.)	1,1-2,0	Конечные бронхи	0,82±0,08	10,51%
5 (ступень+пласт.)	0,54-1,1	Альвеолы	0,23±0,03	2,95%
6 (ступень+пласт.)	0,25-0,54	Альвеолы	0,14±0,03	1,79%
ΣACl (эмиттирован.)			6,24±0,10	80,00%
По 10±1,0 мг сухого порошка DAS181 (8,5 мг±10% белка DAS181) вносили в капсулу из НРМС (гидроксипропилметилцеллюлоза).
ΣACl (эмиттированная) фракция представляет собой сумму всего вещества, извлеченного из трубки по стандарту USP, впускного конуса и ступеней от -1 до 6

DAS181-микросферы далее характеризовали с использованием лазерной дифракции, которая продемонстрировала согласующиеся с методом каскадного столкновения результаты, заключающиеся в том, что размер большей части микросфер, изготовленных способом, описанным в этом Примере, лежит в диапазоне от 1 микрона до 5 микрон. С использованием сканирующей электронной микроскопии (FEI Quanta 200 Scanning Electron Microscope, детектор Everhart Thornley (ET)) для анализа DAS181-микросфер, изготовленных в соответствии с описанным в Примере способом, подтверждено, что микросферы присутствуют в виде агломератов сотен и тысяч индивидуальных частиц размером примерно 0,5-3 микрона. Однако данные агломераты легко распадаются под действием турбулентности воздуха, производимой в процессе приведения в действие сухого порошкового ингалятора (как продемонстрировано методом каскадного столкновения по Андерсену или лазерной диффракцией). С использованием световой микроскопии для микросфер, диспергированных в жидком поверхностно-активном веществе (например, Тритоне Х-100 или Твине 20) или неполярном растворителе (например, спирте, ацетоне или ацетонитриле), в которых микросферы не растворяются, было подтверждено, что данные агрегаты легко распадаются до отдельных однородных микросфер.

ПРИМЕР 11

Изготовление DAS181-микросфер с использованием сульфатов, а не натриевой соли

Исследования показали, что в некоторых случаях, например у некоторых больных астмой, присутствие натрия в композиции для легочного введения может приводить к риску индуцирования гиперчувствительности дыхательных путей (Agrawal et al., Lung, 183: 375-387 (2005)). Ввиду этого в данном Примере тестировали альтернативные соли, например соли других металлов, таких как калий, магний и кальций.

DAS181-микросферы изготавливали, как описано выше в Примере 1. Коктейль-растворы, содержащие 12 мг/мл DAS181 и 5% ((об./об.)) изопропанола, содержали в качестве противоионов указанные сульфаты в концентрации 2 мМ, pH 4,5-5,0. Микросферы образовывались в результате охлаждения растворов от +25°C до -45°C. После замораживания летучие вещества (воду и изопропанол) удаляли посредством сублимации с получением сухого порошка, содержащего микросферы.

Распределение частиц в сухом порошке по их аэродинамическим размерам оценивали с использованием метода каскадного столкновения по Андерсену, а количество DAS181 на каждой ступени определяли, измеряя УФ-поглощение при 226 нм (А₂₂₆). Результаты приведены ниже в Таблице 8. Данные результаты демонстрируют, что соли сульфатов, кроме натриевой соли, могут быть использованы в качестве противоионов для изготовления DAS181-микросфер в таком диапазоне размеров, что основная часть будет доставляться в горло, трахею и бронхи в количестве, сравнимом с количеством, доставляемым, когда в качестве противоиона использовали сульфат натрия.

Таблица 8
Распределение частиц DAS181-микросфер, изготовленных с натрием и без него, по их аэродинамическим размерам
			Процент	DAS181 на уровне импактора
	Соответств. разделение по размерам, микроны	Ожидаемое осаждение в дыхательных путях	Сульфат натрия	Сульфат калия	Сульфат магния	Сульфат кальция
Ингалятор			19,86%	28,58%	21,41%	16,71%
Капсула			2,07%	2,30%	1,88%	0,00%
Трубка+конус	>10	Ротовая полость	11,67%	9,00%	12,91%	16,79%
-1 (S+P)	8,6-10	Ротовая полость	10,00%	3,43%	7,86%	14,87%
-0 (S+P)	6,5-8,6	Ротоглотка	5,30%	3,08%	4,71%	7,77%
1 (S+P)	4,4-6,5	Глотка	6,97%	5,86%	6,58%	7,54%
2 (S+P)	3,3-4,4	Трахеи/бронхи	7,55%	8,24%	6,90%	6,43%
3 (S+P)	2,0-3,3	Вторичные бронхи	19,57%	20,21%	17,01%	12,65%
4 (S+P)	1,1-2,0	Конечные бронхи	12,39%	14,00%	13,00%	10,39%
5 (S+P)	0,54-1,1	Альвеолы	2,80%	2,99%	4,31%	4,69%
6 (S+P)	0,25-0,54	Альвеолы	1,82%	2,31%	3,44%	2,16%

Кроме того, сухие порошки инкубировали при +37°C или +53°C с продолжительностью, указанной в Таблице 9, и тестировали на сиалидазную активность с использованием 4-MU-NANA в анализе, описанном в Примере 1 и включенном в данное описание посредством ссылки. Относительная активность по сравнению с нелиофилизированными DASISI-микросферами, хранимыми при -80°C, представлена в Таблице 9. Данные результаты показывают, что стабильность микросфер, изготовленных с использованием сульфатов различных металлов в качестве противоионов, была сравнима с таковой для сульфата натрия, с почти полным или полным сохранением активности в течение более 2 месяцев при 37°C и сохранением почти всей (сульфаты натрия и калия) или более 85% (сульфаты магния и цинка) активности в течение более 10 суток при 53°C Результаты этого эксперимента демонстрируют, что различные ненатриевые противоионы могут давать микросферы с желаемыми характеристиками.

Таблица 9
Сиалидазная активность композиций DAS181-микросфер: ускоренные исследования стабильности
	Процент оставшейся активности
Температура	37°C	53°C
Инкубация, сутки	42 суток 69 суток	11 суток 39 суток
2 мМ сульфат натрия+0,268 мМ CaCl₂	107,14% 105,62%	110,66% 23,66%
2 мМ сульфат калия+0,268 мМ CaCl₂	97,37% 104,00%	101,54% 52,76%
2 мМ сульфат магния+0,268 мМ CaCl₂	123,81% 107,29%	85,93% 60,00%
13,34 мМ кальций/2 мМ сульфат	116,67% 93,20%	87,12% 40,48%

ПРИМЕР 12

Стабильность DAS181-микросфер

Стабильность белка DAS181 в микросферах оценивали, измеряя сиалидазную активность во времени с использованием 4-MU-NANA в анализе на активность, как описано выше в Примере 1, включенном в данное описание посредством ссылки. Изготовление сухих DAS181-микросфер было предпринято из коктейль-раствора, содержащего 10 мг/мл DAS181, 2 мМ сульфат натрия, 5% (об./об.) изопропанола. К некоторым растворам добавляли 0,01% масс/об. сахара (сорбита, маннита, трегалозы или сахарозы). Микросферы образовывались в результате охлаждения растворов от +25°C до -45°C. После замораживания летучие вещества (воду и изопропанол) удаляли посредством сублимации с получением сухих порошков, содержащих микросферы.

А. Стабильность DAS181-микросфер без сахаров

Сухой порошок ОА8181-микросфер, изготовленных без сахаров, хранили при комнатной температуре (25°C) в контейнере с осушителем Drierite (Hammond Drierite, Xenia, ОН). Сухой порошок сохранял свою исходную эффективность (по измерениям сиалидазной активности с использованием 4-MU-NANA в соответствии с Примером 1 и как включено в данное описание посредством ссылки; результаты представлены в Таблице 10) и распределение частиц по их аэродинамическим размерам (по измерениям с использованием каскадного столкновения по Андерсену; Таблица 11) по меньшей мере в течение 8 месяцев.

Таблица 10
Удельная активность сухого порошка DAS181
Тест	Время 0	3 месяца	8 месяцев
Сиалидазная активность, отнесенная ко времени 0	100%	102,0%	99,9%

Таблица 11
Распределение частиц сухого порошка DAS181 по их аэродинамическим размерам
Компонент ACI	Соответств. разделение по размерам, микроны	Ожидаемое осаждение в дыхательных путях	Время 0	3 месяца	8 месяцев
Трубка+конус	>10	Ротовая полость	19,57±2,43	26,00±0,30	18,57±4,14
Ступень - 1	8,6-10	Ротовая полость	17,87±0,51	12,87±1,56	15,13±2,41
Ступень - 0	6,5-8,6	Ротоглотка	10,27±0,93	7,07±0,32	9,80±1,80
Ступень 1	4,4-6,5	Глотка	8,57±0,49	8,80±0,26	7,73±0,57
Ступень 2	3,3-4,4	Трахеи/бронхи	10,67±0,23	10,70±0,35	9,30±0,82
Ступень 3	2,0-3,3	Вторичные бронхи	21,10±0,75	21,80±0,52	21,90±0,87
Ступень 4	1,1-2,0	Конечные бронхи	10,10±0,75	10,63±0,80	14,50±3,22
Ступень 5	0,54-1,1	Альвеолы	1,47±0,23	1,73±0,06	2,37±0,06
Ступень 6	0,25-0,54	Альвеолы	0,33±0,06	0,40±0,10	0,73±0,06

Таблица 11: распределение частиц по их аэродинамическим размерам оценивали с использованием метода каскадного столкновения по Андерсену и выражали как % от общего извлекаемого белка DAS181. Капсулы заполняли 10 мг сухого порошка DAS181, на который воздействовали, используя сухой порошковый ингалятор Cyclohaler в качестве устройства для доставки. Скорость потока воздуха составляла 60 литров в минуту. Анализы проводили в трех повторностях, показаны среднее значение и стандартное отклонение.

Б. Стабильность DAS181-микросфер, изготовленных с сахарами

Сиалидазную активность DAS181 в сухих порошковых композициях микросфер, содержащих сахара, и в нелиофилизированных композициях микросфер, хранимых при -80°C, измеряли, используя флуорогенный субстрат 4-MU-NANA, как описано в Примере 1 и как включено в данное описание посредством ссылки. Сухие порошковые композиции, не содержащие сахара или содержащие различные сахара, указанные ниже в Таблице 12, хранили при +42°C в течение 4 недель (усиленная деградация). Результаты представлены в Таблице 12. По сравнению с нелиофилизированными композициями, которые хранили при -80°C, композиция, не содержащая сахара, сохраняла почти 80% своей активности. Добавление различных Сахаров повышает стабильность, так что сохраняется примерно 88-98% активности в зависимости от сахара.

Таблица 12
Сахар	Процент сиалидазной активности, сохраняющейся после 4 недель при 42°C
Без сахара	79,82
Сорбит	91,23
Маннит	89,47
Трегалоза	97,37
Сахароза	88,60

Так как модификации будут очевидны специалистам в данной области техники, предполагается, что данное изобретение будет ограничено только объемом прилагаемой формулы изобретения.

Claims

1. Композиция микрочастиц, содержащих:

(а) сиалидазный слитый белок, содержащий последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 17, где микрочастицы имеют средний диаметр от примерно 0,5 мкм до примерно 10 мкм; и

(б) сульфат магния или сульфат натрия.

2. Композиция по п. 1, где микрочастицы имеют средний диаметр от примерно 1 мкм до примерно 6 мкм.

3. Композиция по п. 1, где микрочастицы имеют средний диаметр от примерно 4 мкм до примерно 8 мкм.

4. Композиция по п. 1, где микрочастицы имеют средний диаметр от примерно 6 мкм до примерно 8 мкм.

5. Композиция по п. 1, где микрочастицы дополнительно содержат сахар, выбранный из сорбита, маннита, трегалозы и сахарозы.

6. Композиция по п. 5, где микрочастицы сохраняют более 50% сиалидазной активности после 4 недель хранения при 42°С.

7. Композиция по п. 5, где микрочастицы сохраняют более 50% сиалидазной активности после восьми месяцев хранения при 25°С.

8. Композиция по п. 5, где микрочастицы сохраняют более 90% сиалидазной активности после восьми месяцев хранения при 25°С.

9. Композиция по п. 5, где микрочастицы сохраняют более 50% сиалидазной активности после 1 года хранения при 25°С.

10. Композиция по п. 1, полученная из раствора, приготовленного путем добавления противоиона, выбранного из сульфата натрия и сульфата магния, к раствору, содержащему слитый белок, и кроме того, добавления органического растворителя, выбранного из метанола, этанола, 1-пропанола, изопропанола, трет-бутилового спирта и бутанола.

11. Композиция по п. 1, где содержание влаги композиции составляет от примерно 1% до примерно 15%.

12. Композиция по п. 1, где содержание влаги композиции составляет от примерно 5% до примерно 12%.

13. Композиция по п. 1, где количество слитого белка в микрочастицах составляет от 50% до 99% масс./масс.

14. Композиция по п. 1, где количество слитого белка в микрочастицах составляет от 60% до 90% масс./масс.

15. Композиция по п. 1, где количество слитого белка в микрочастицах составляет от 70% до 85% масс./масс.

16. Композиция по п. 1, где количество слитого белка в микрочастицах составляет от 90% до 99% масс./масс.

17. Композиция микрочастиц, содержащих сиалидазный слитый белок, содержащий последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 17, полученная способом, включающим:

а) добавление противоиона, выбранного из цитрата натрия, сульфата натрия, сульфата кальция, сульфата калия и сульфата магния, к водному раствору, содержащему слитый белок;

б) добавление органического растворителя, выбранного из метанола, этанола, 1-пропанола, изопропанола, трет-бутилового спирта и бутанола, к данному раствору; и

в) постепенное охлаждение раствора до температуры ниже 25°С, в результате чего образуется композиция микрочастиц, содержащих слитый белок.

18. Композиция по п. 17, где противоион представляет собой сульфат натрия или сульфат магния.

19. Композиция по п. 18, где органический растворитель представляет собой изопропанол.

20. Композиция по п. 19, где стадия (б) включает добавление изопропанола до примерно 10% об./об.

21. Композиция по п. 19, где стадия (б) включает добавление изопропанола до примерно 20% об./об.

22. Композиция по п. 19, где стадия (б) включает добавление изопропанола до примерно 30% об./об.

23. Композиция по любому из пп. 17-22, где стадию (в) осуществляют при скорости охлаждения от примерно 0,1°С в минуту до примерно 10°С в минуту.

24. Композиция по любому из пп. 17-22, где стадию (в) осуществляют при скорости охлаждения от примерно 0,5°С в минуту до примерно 2°С в минуту.

25. Композиция по любому из пп. 17-22, где стадию (в) осуществляют при скорости охлаждения от примерно 0,5°С в минуту до примерно 1°С в минуту.

26. Композиция по любому из пп. 17-22, где стадию (в) осуществляют при скорости охлаждения менее чем примерно 1°С в минуту.

27. Композиция по любому из пп. 17-22, где стадия (в) включает охлаждение раствора до температуры от примерно 4°С до примерно -45°С.

28. Композиция по любому из пп. 17-22, где стадия (в) включает охлаждение раствора до температуры от примерно 2°С до примерно -20°С.

29. Композиция по любому из пп. 17-22, где стадия (в) включает охлаждение раствора до температуры от примерно 2°С до примерно -15°С.

30. Композиция по п. 17, где микрочастицы имеют средний диаметр от примерно 1 мкм до примерно 6 мкм.

31. Композиция по п. 17, где микрочастицы имеют средний диаметр от примерно 4 мкм до примерно 8 мкм.

32. Композиция по п. 17, где микрочастицы имеют средний диаметр от примерно 6 мкм до примерно 8 мкм.

33. Композиция по п. 17, где общее количество полипептида в конце стадии (в) составляет по меньшей мере примерно 80% общего количества полипептида в композиции микрочастиц.

34. Способ лечения гриппа или парагриппа, включающий введение пациенту композиции по п. 1 или 17.

35. Способ по п. 34, где композицию вводят посредством ингаляции.