RU2542667C2 - УЛУЧШЕННЫЕ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ Bordetella pertussis НА ОСНОВЕ МУТАНТНЫХ ГЛИКОЗИЛТРАНСФЕРАЗ LPS - Google Patents
УЛУЧШЕННЫЕ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ Bordetella pertussis НА ОСНОВЕ МУТАНТНЫХ ГЛИКОЗИЛТРАНСФЕРАЗ LPS Download PDFInfo
- Publication number
- RU2542667C2 RU2542667C2 RU2009139262/10A RU2009139262A RU2542667C2 RU 2542667 C2 RU2542667 C2 RU 2542667C2 RU 2009139262/10 A RU2009139262/10 A RU 2009139262/10A RU 2009139262 A RU2009139262 A RU 2009139262A RU 2542667 C2 RU2542667 C2 RU 2542667C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lps
- host cell
- acid sequence
- nucleic acid
- bordetella
- Prior art date
Links
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 title claims abstract description 73
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 title claims abstract description 60
- 229940066827 pertussis vaccine Drugs 0.000 title description 8
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 title description 6
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 title description 4
- 102000045442 glycosyltransferase activity proteins Human genes 0.000 title 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 100
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 52
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 52
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims abstract description 39
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 36
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 32
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 2-Amino-2-Deoxy-Hexose Chemical compound NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 26
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 claims abstract description 23
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 17
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 12
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000000119 electrospray ionisation mass spectrum Methods 0.000 claims abstract description 5
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims abstract description 5
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 claims abstract description 4
- 241000588780 Bordetella parapertussis Species 0.000 claims abstract description 4
- 208000018150 Bordetella infection Diseases 0.000 claims abstract 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 77
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 47
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 42
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 42
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 30
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 21
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 9
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 5
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 19
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 abstract description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 139
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 136
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 136
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 78
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 78
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 78
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 30
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 25
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 108010045801 polysaccharide deacetylase Proteins 0.000 description 19
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 13
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 13
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 13
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 11
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 9
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 8
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 8
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 8
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 8
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- FZHXIRIBWMQPQF-UHFFFAOYSA-N Glc-NH2 Natural products O=CC(N)C(O)C(O)C(O)CO FZHXIRIBWMQPQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 7
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 7
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 7
- -1 respectively Proteins 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactopyranuronic acid Natural products OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 5
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 5
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 5
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 101100284517 Aneurinibacillus thermoaerophilus hddC gene Proteins 0.000 description 4
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 4
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 4
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 4
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- 150000008273 hexosamines Chemical group 0.000 description 4
- 101150039741 hldD gene Proteins 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 3
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 3
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 description 3
- 102000007298 Mucin-1 Human genes 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 3
- 230000002346 endotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 101150012219 rfaQ gene Proteins 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- 101710187837 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid transferase Proteins 0.000 description 2
- 241000712891 Arenavirus Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 150000002386 heptoses Chemical class 0.000 description 2
- 102000052611 human IL6 Human genes 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000017306 interleukin-6 production Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 150000004043 trisaccharides Chemical group 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- NFFPKRVXIPSSQR-JJYYJPOSSA-N (2s,3r,4r)-2,3,4,5-tetrahydroxypentanamide Chemical compound NC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO NFFPKRVXIPSSQR-JJYYJPOSSA-N 0.000 description 1
- NTPBCPFMSISLCR-MROZADKFSA-N (2s,3s,4r)-4-amino-2,3,4,5-tetrahydroxypentanal Chemical group OC[C@](O)(N)[C@@H](O)[C@H](O)C=O NTPBCPFMSISLCR-MROZADKFSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 206010001935 American trypanosomiasis Diseases 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 101710099705 Anti-lipopolysaccharide factor Proteins 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 241000588851 Bordetella avium Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000221204 Cryptococcus neoformans Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- BGWQRWREUZVRGI-UHFFFAOYSA-N D-altro-D-manno-Heptose Chemical compound OCC(O)C1OC(O)C(O)C(O)C1O BGWQRWREUZVRGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 1
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 1
- 102100031940 Epithelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 101100540702 Escherichia coli (strain K12) waaU gene Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 241000589602 Francisella tularensis Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 1
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 1
- 241000228404 Histoplasma capsulatum Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000822604 Homo sapiens Methanethiol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000904196 Homo sapiens Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2 Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000946850 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD86 Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000342334 Human metapneumovirus Species 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 1
- 206010024229 Leprosy Diseases 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102100022465 Methanethiol oxidase Human genes 0.000 description 1
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 1
- 101100532633 Mus musculus Selenbp1 gene Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 102100024019 Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2 Human genes 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091007643 Phosphate carriers Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 1
- 229920002685 Polyoxyl 35CastorOil Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000007066 Prostate-Specific Antigen Human genes 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 101710107606 Putative glycosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101710119363 Putative glycosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 1
- 101001039269 Rattus norvegicus Glycine N-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 1
- 101100540701 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) waaK gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 206010041896 St. Louis Encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 241000710888 St. Louis encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 241000194022 Streptococcus sp. Species 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 102000005262 Sulfatase Human genes 0.000 description 1
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 241000223997 Toxoplasma gondii Species 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 241000223104 Trypanosoma Species 0.000 description 1
- 241000223109 Trypanosoma cruzi Species 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 241001672648 Vieira Species 0.000 description 1
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 description 1
- 241000204362 Xylella fastidiosa Species 0.000 description 1
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 1
- 108010013829 alpha subunit DNA polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical compound N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 238000000738 capillary electrophoresis-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000001360 collision-induced dissociation Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 108010047295 complement receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006834 complement receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150106284 deoR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- UFPHFKCTOZIAFY-NTDVEAECSA-N ditrans,polycis-undecaprenyl phosphate Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C/CC\C(C)=C/CC\C(C)=C/CC\C(C)=C/CC\C(C)=C/CC\C(C)=C/CC\C(C)=C/CC\C(C)=C/COP(O)(O)=O UFPHFKCTOZIAFY-NTDVEAECSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 230000007689 endotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002190 fatty acyls Chemical group 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 229940118764 francisella tularensis Drugs 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 101150045500 galK gene Proteins 0.000 description 1
- 101150041954 galU gene Proteins 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 1
- 208000001786 gonorrhea Diseases 0.000 description 1
- 101150096208 gtaB gene Proteins 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 102000046699 human CD14 Human genes 0.000 description 1
- 102000049849 human CD86 Human genes 0.000 description 1
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 description 1
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 1
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 101150063484 icsB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 244000000074 intestinal pathogen Species 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 101150080180 kdtA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 101150023497 mcrA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- DGEYTDCFMQMLTH-UHFFFAOYSA-N methanol;propan-2-ol Chemical compound OC.CC(C)O DGEYTDCFMQMLTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 1
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 1
- QCQYVCMYGCHVMR-AAZUGDAUSA-N n-[(2r,3r,4s,5r)-4,5,6-trihydroxy-1-oxo-3-[(2r,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyhexan-2-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O QCQYVCMYGCHVMR-AAZUGDAUSA-N 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 101150012154 nupG gene Proteins 0.000 description 1
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002357 osmotic agent Substances 0.000 description 1
- QUANRIQJNFHVEU-UHFFFAOYSA-N oxirane;propane-1,2,3-triol Chemical compound C1CO1.OCC(O)CO QUANRIQJNFHVEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008389 polyethoxylated castor oil Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 150000003109 potassium Chemical class 0.000 description 1
- 238000009021 pre-vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003214 pyranose derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 101150092659 rfaC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150041296 rfaF gene Proteins 0.000 description 1
- 101150057996 rfaL gene Proteins 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 108060007951 sulfatase Proteins 0.000 description 1
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000007181 unidentified human coronavirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 101150040194 waaA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 1
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/14—Antitussive agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K2039/10—Brucella; Bordetella, e.g. Bordetella pertussis; Not used, see subgroups
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/099—Bordetella
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Представлена клетка-хозяин Bordetella pertussis, Bordetella bronchiseptica или Bordetella parapertussis, которая используется в качестве адъюванта или для профилактики или лечения коклюша, имеющая сниженную активность эндогенной гликозилтрансферазы с по меньшей мере 98% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 по сравнению с активностью гликозилтрансферазы соответствующего родительского штамма, где сниженная активность достигается применением инактивирующего вектора, который вызывает инактивацию экспрессии последовательности эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, или приводит к сниженному уровню экспрессии последовательности эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, слиянием последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, со слабым или индуцибельным промотором. Раскрыт препарат, состоящий из LPS из указанной клетки-хозяина с увеличенной заменой гексозамином 1' или 4' фосфатных групп части LPS, относящейся к липиду А, по сравнению с препаратом LPS из соответствующего родительского штамма, и посредством чего LPS характеризуется получением по меньшей мере 8 ионов в ESI-MS спектре, где препарат используется в качестве адъюванта или для профилактики или лечения коклюша. Предложено применение указанных клетки-хозяина или препарата LPS для получения лекарственного средства для профилактики и/или лечения коклюша, или получения лекарственного средства для иммунизации млекопитающего, где клетка-хозяин или LPS используются в качестве адъюванта. Описана фармацевтическая композиция, используемая в качестве адъюванта или для профилактики или лечения инфекции Bordetella, содержащая указанную клетку-хозяина или указанный препарат LPS в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель. Изобретение позволяет получить фармацевтический препарат клеток Bordetella или LPS, обладающий повышенной иммуногенностью по сравнению с препаратом из соответствующего родительского штамма Bordetella. 9 н. и 3 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл., 1 пр.
Description
Область, к которой относится изобретение
Изобретение относится к улучшенной вакцине против коклюша, содержащей мутантные штаммы Bordetella pertussis с модифицированной молекулой LPS и/или молекулами LPS, полученными из этих мутантных штаммов. Эти мутантные штаммы и/или получаемые молекулы LPS могут быть дополнительно использованы в качестве адъюванта.
Предпосылки к созданию изобретения
LPS представляет собой амфифильную молекулу, расположенную на внешней стороне наружной мембраны грамотрицательных бактерий. LPS обладает как эндотоксической активностью, так и адъювантной активностью. Оба свойства основаны на распознавании его рецепторным комплексом TLR4/MD-2 хозяина (обзор представлен у Pålsson-McDermott и O'Neill, 2004; O'Neill, 2006). LPS состоит из трех различных структурных доменов: липида A, ядра и O-антигена. Липид A функционирует как гидрофобный мембранный якорь и образует биологически активный компонент молекулы (Takada and Kotani, 1989). Область ядра состоит из сложного олигосахарида, который, по сравнению с О-антигеном, демонстрирует только ограниченную структурную вариабельность. В некоторых бактериях, например Enterobacteriaceae, олигосахарид ядра (ядерный OS) можно разделить на внутреннее ядро и внешнее ядро. Внешнее ядро главным образом состоит из гексоз в пиранозной форме, например D-глюкозы, D-галактозы и D-глюкозамина, тогда как внутреннее ядро главным образом состоит из октулозоновых кислот и гептопираноз. У подавляющего большинства грамотрицательных бактерий ядерный домен соединен с доменом липида А особым углеводом, 2-кето-3-дезоксиоктулоновой кислотой (Kdo) (Raetz и Whitfield, 2002). O-антиген содержит наиболее вариабельную часть LPS и придает бактериям специфичность серотипа. О-антиген состоит из повторяющихся сахарных субъединиц одного-восьми сахаров. Каждая О-цепь может содержать вплоть до 50 таких субъединиц. О-антиген участвует в ускользании бактерий от иммунологического надзора, особенно ускользании от сывороточного комплемент-опосредованного лизиса (Raetz and Whitfield, 2002).
В отличие от LPS Bordetella bronchiseptica и Bordetella parapertussis, LPS Bordetella pertussis никогда не содержит О-антигенный домен (Peppler, 1984; Di Fabio et al., 1992). Следовательно, LPS B. pertussis зачастую называют липоолигосахаридом. B. pertussis продуцирует две доминантные формы LPS, LPS группы А и группы В (Peppler, 1984). LPS группы В состоит из липида А и олигосахарида ядра, состоящего из 9 углеводов (Caroff et al., 2000). Добавление концевого трисахарида, состоящего из N-ацетилглюкозамина, 2,3-диацетамидо-2,3-дидезоксиманнуроновой кислоты и 2-ацетамидо-4-N-метил-2,4-дидезоксифукозы к LPS группы В образует LPS, называемый группой А.
У Escherichia coli и Salmonella enterica серовар Typhimurium, генный кластер биосинтеза ядерного OS состоит из трех оперонов, обозначенных gmhD, waaQ, и WaaA опероны. Оперон gmhD состоит из четырех генов, gmhD и waaFCL, которые вовлечены в синтез внутреннего ядра (Schnaitman и Klena, 1993). Гены gmhD, waaF, и waaC кодируют белки, вовлеченные в биосинтез и трансфер гептоз I и II к Kdo2-липид A (Schnaitman и Klena, 1993), тогда как продукт гена waaL представляет собой лигазу, которая вовлечена в присоединение O-антигена (MacLachlan et al., 1991). Оперон waaQ является самым большим из трех оперонов и кодирует белки, которые вовлечены в биосинтез наружного ядра и в модификацию/декорацию ядерного OS. Количество и типы генов, находящихся в опероне waaQ, отличаются в штаммах, что объясняет штамм-специфичные различия в структуре ядра (Heinrichs et al., 1998). Оперон waaA зачастую кодирует только один белок, KdtA. Только в E. coli K-12 присутствует дополнительная, не относящаяся к LPS открытая рамка считывания (ORF) (Raetz и Whitfield, 2002). Ген kdtA Enterobacteriaceae кодирует бифункциональную Kdo трансферазу, которая добавляет два остатка Kdo в биосинтез Kdo2-липид A (Clementz and Raetz, 1991).
Хотя ядерный OS Bordetella и E. coli демонстрирует некоторое сходство, точный состав и конфигурация остатков проявляют заметные отличия. Например, ядерный OS Bordetella содержит только остаток Kdo, вместо двух или трех остатков, которые обнаруживаются у большинства других грамотрицательных бактерий, в том числе E. coli. Недавно это было показано благодаря функционированию Bordetella KdtA как монофункциональной, а не бифункциональной Kdo трансферазы (Isobe et al., 1999). Ферменты, ответственные за синтез оставшейся части ядерного OS Bordetella, в настоящее время неизвестны, и ожидается их дальнейшая идентификация.
Хотя липид A в основном рассматривается в качестве основной детерминанты для биологической активности LPS через активацию рецепторного комплекса TLR4/MD-2, область олигосахарида также может играть важную роль во взаимодействии с антиген-презентирующими клетками (APC). Рецепторы, вовлеченные в этот тип распознавания LPS, включают рецептор комплемента CR3 и фагоцитарный рецептор SR-A (van Amersfoort et al., 2003; Plüddemann et al., 2006).
Некоторые вакцины Bordetella pertussis уже применялись. Введение цельноклеточных коклюшных вакцин (wP) в 1940-х и 1950-х годах и позднее бесклеточных коклюшных вакцин (aP) в 1980-х и 1990-х, привело к постепенному снижению заболеваемости коклюшем и снижению распространения этого заболевания и смертности от этого заболевания до низких уровней. Несмотря на обширную зону вакцинации, заболевание коклюшем остается эндемическим и продолжает демонстрировать циклический характер с пиками заболеваемости каждые 2-5 лет. За последние два десятилетия некоторые страны, в том числе Нидерланды, испытали повышение числа сообщенных случаев коклюша. Интересно то, что в некоторых областях также наблюдалось изменение в распределении по возрасту. Тогда как в эру пре-вакцинации и ранней вакцинации о случаях коклюша преимущественно сообщалось у маленьких детей, в последние годы увеличивающуюся долю случаев составляли взрослые и подростки. Было предложено несколько причин возрождения описанных случаев коклюша, в том числе: (1) генетические изменения циркулирующих штаммов B. Pertussis, которые снижают эффективность вакцин, (2) сниженная эффективность коклюшевых вакцин, (3) снижение иммунитета, (4) увеличение сообщений о случаях коклюша, и (5) улучшение диагностики заболевания коклюшем.
Таким образом, все еще остается необходимость в новых вакцинах против Bordetella pertussis, у которых отсутствуют недостатки существующих вакцин.
Описание изобретения
Настоящее изобретение основано на гипотезе, что мутантные штаммы B. pertussis с измененной олигосахаридной цепью могут затрагиваться в их взаимодействии с дендритными клетками (DC). Специфическое нацеливание на антиген-презентирующие клетки (APC), такие как DC, могло бы предположительно повлиять на исход иммунной реакции против цельноклеточной коклюшной вакцины. В качестве первого шага в сторону улучшения цельноклеточных вакцин таким путем, авторы изобретения в настоящий момент идентифицировали генный кластер, вовлеченный в биосинтез олигосахарида LPS в B. pertussis. В особенности два гена в этом кластере при инактивации или гиперэкспрессии дают мутантные штаммы, обладающие улучшенными потенциальными возможностями взаимодействовать с DC и активировать их.
Полипептиды
В первом аспекте изобретение относится к двум полипептидам.
Первый полипептид представляет собой деацетилазу полисахаридов и имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1.
Второй полипептид представляет собой гликозилтрансферазу и имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
Активность деацетилазы полисахаридов относительно полипептида гликозилтрансферазы предпочтительно определяется гиперэкспрессией относительно инактивации соответствующего кодируемого гена в штамме Bordetella pertussis, определенного далее в настоящей заявке, и анализом получаемого LPS. В тех случаях, когда LPS, продуцированный трансформированным штаммом Bordetella pertussis, содержит по меньшей мере детектируемые количества LPS по изобретению, как определено далее в настоящей заявке, говорят, что деацетилаза полисахарида, соответственно полипептиды гликозилтрансферазы являлись активными и функциональными. Детектируемые количества LPS предпочтительно определяются, как описано в примерах: после выделения с помощью экстракции горячим фенолом/водой (Westphal and Jann, 1965), O-дезацетилированием мягким гидролизом (Holst 2000) и анализом с помощью ESI-MS (масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением) в режиме определения отрицательных ионов.
В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления, полипептид по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% или 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 92%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. В наиболее предпочтительном варианте осуществления деацетилаза полисахарида имеет последовательность SEQ ID NO:1. Эта деацетилаза полисахарида происходит из Bordetella pertussis. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, представлена в SEQ ID NO:3.
В соответствии с другим еще более предпочтительным вариантом осуществления, полипептид по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% или 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 92%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
В предпочтительном варианте осуществления гликозилтрансфераза имеет SEQ ID NO:2. Эта гликозилтрансфераза происходит из Bordetella pertussis. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, представлена в SEQ ID NO:4.
Процент идентичности вычисляют как число идентичных аминокислотных остатков между выровненными последовательностями, разделенное на длину выровненных последовательностей минус длина всех разрывов. Выравнивание множества последовательностей проводили с помощью программы оптимального выравнивания DNAman 4.0, используя настройки по умолчанию. Выравнивание обычно проводят между последовательностями, определяемыми их SEQ ID NO или их частями. Предпочтительно, выравнивание проводят, используя последовательности, определяемые их SEQ ID NO.
Специалисту в данной области будет понятно, что полипептиды по настоящему изобретению могли быть получены из других организмов, отличных от Bordetella pertussis, при условии, что они обладают требуемой активностью и идентичностью. В предпочтительном варианте осуществления, каждый полипептид, как определено выше, получен из видов Bordetella, таких как pertussis, bronchiseptica, parapertussis. Наиболее предпочтительно, каждый полипептид, определенный выше, получают из Bordetella pertussis. Один отдельный штамм Bordetella pertussis или несколько различных штаммов Bordetella pertussis могут иметь несколько гомологичных полипептидов в соответствии с настоящим изобретением.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления, полипептид по изобретению представляет собой вариант любой из полипептидных последовательностей, определенных ранее. Вариант полипептида может представлять собой неприродную форму полипептида. Вариант полипептида может отличаться вследствие использованных методов генной инженерии от полипептида, выделенного из природного источника. Вариант может быть создан с помощью сайт-направленного мутагенеза, начиная с аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 или с SEQ ID NO:2 или с последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, которая представляет собой SEQ ID NO:3, или из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, которая представляет собой SEQ ID NO:4. Предпочтительно, вариант полипептида содержит мутации, которые не изменяют биологическую функцию кодируемого полипептида. Биологическая функция или активность либо деацетилазы полисахарида, либо гликозилтрансферазы уже была определена в настоящем описании.
В другом аспекте настоящего изобретения представлена деацетилаза полисахарида, соответственно гликозилтрансфераза, как определено ранее, обе для применения для производства лекарственного средства. Предпочтительно, указанное лекарственное средство представляет собой вакцину или адъювант, как определено далее в настоящем описании.
Последовательности нуклеиновой кислоты
Во втором аспекте настоящего изобретения представлены две последовательности нуклеиновой кислоты.
Первая последовательность кодирует деацетилазу полисахарида, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, предпочтительно имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и/или происходящую из видов Bordetella, предпочтительно Bordetella pertussis.
Первая последовательность нуклеиновой кислоты предпочтительно представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 50% идентичную последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:3. Предпочтительно, идентичность составляет по меньшей мере 55%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере 98% и еще более предпочтительно по меньшей мере 99%. Наиболее предпочтительно, последовательность нуклеиновой кислоты имеет последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:3. SEQ ID NO:3 соответствует NP_8809668.
Вторая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует гликозилтрансферазу, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, предпочтительно имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 и/или происходящую из видов Bordetella, предпочтительно Bordetella pertussis.
Вторая последовательность нуклеиновой кислоты предпочтительно представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 50% идентичную последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:4. Предпочтительно, идентичность составляет по меньшей мере 55%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере 98% и еще более предпочтительно по меньшей мере 99%. Наиболее предпочтительно, последовательность нуклеиновой кислоты имеет последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:4. SEQ ID NO:4 соответствует NP_8809669.
Процент идентичности определяли путем вычисления отношения числа идентичных нуклеотидов в последовательности, разделенного на длину всех нуклеотидов минус длина всех разрывов. Выравнивание множественных последовательностей ДНК проводили, с помощью DNAman version 4.0, используя программу Optimal Alignment (Full Alignment). Минимальная длина релевантной последовательности ДНК, демонстрирующей 50% или более высокий уровень идентичности, должна быть 40 нуклеотидов или длиннее. Выравнивание обычно проводят между последовательностями, определяемыми их SEQ ID NO или их частей. Предпочтительно, выравнивание проводят, используя последовательности, определяемые их SEQ ID NO.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению представляет собой вариант любой из последовательностей нуклеиновой кислоты, определенной выше. Варианты последовательности нуклеиновой кислоты могут быть использованы для получения вариантов полипептида, определенных ранее. Вариант нуклеиновой кислоты может представлять собой фрагмент любой из последовательностей нуклеиновой кислоты, определенных выше. Вариант нуклеиновой кислоты также может представлять собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая отличается от SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 вследствие вырожденности генетического кода. Вариант нуклеиновой кислоты также может представлять собой аллельный вариант SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4. Аллельный вариант означает любую из двух или более альтернативных форм гена, занимающего один и тот же хромосомный локус. Предпочтительный вариант нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит молчащую мутацию (мутации). Альтернативно или в сочетании, вариант нуклеиновой кислоты также может быть получен путем введения нуклеотидных замен, которые не дают начало другой аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, но которая соответствует частоте использования кодона организмом-хозяином, предназначенным для получения полипептида по настоящему изобретению. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, вариант нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, все еще проявляющий свою биологическую функцию, определенную ранее в настоящем описании. Более предпочтительно, вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, проявляющий активность деацетилазы полисахарида или гликозилтрансферазы соответственно. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие такой полипептид, могут быть выделены из любого микроорганизма.
Все эти варианты могут быть получены, используя методики, известные специалисту, такие как скрининг библиотеки гибридизацией (методики саузерн-блоттинга) в условиях гибридизации от низких к средним и к высоким в отношении последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 или ее варианта, которая может быть использована для создания зонда. Условия строгости от низким к средним и к высоким означают прегибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 пг/мл расщепленной и денатурированной ДНК спермы лосося, и либо 25%, 35% или 50% формамида для низкой-средней-высокой строгости соответственно. Затем, реакцию гибридизации промывают три раза в течение 30 минут каждый, используя 2XSSC, 0,2% SDS и либо 55°C, 65°C или 75°C для низкой-средней-высокой строгости.
Информация о последовательностях, представленная в настоящем описании, не должна быть настолько узко интерпретирована, чтобы требовалось включение ошибочно идентифицированных оснований. Специалист может идентифицировать такие ошибочно идентифицированные основания и знает, как скорректировать такие ошибки.
В другом аспекте настоящего изобретения представлена нуклеиновая кислота, кодирующая деацетилазу полисахарида, соответственно гликозилтрансферазу, как определено ранее, обе нуклеиновые кислоты предназначены для применения для получения лекарственного средства. Предпочтительно указанное лекарственное средство представляет собой вакцину или адъювант, как определено далее в настоящем описании.
Конструкция нуклеиновой кислоты
Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей любую из последовательностей нуклеиновой кислоты, определенных в предыдущем разделе, указанная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, демонстрирующий:
- Активность в отношении полисахарида и имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 или
- Активность в отношении гликозилтрансферазы и имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
Необязательно, последовательность нуклеиновой кислоты, присутствующая в конструкции нуклеиновой кислоты, оперативно связана с одной или несколькими контрольными последовательностями, которые направляют продукцию полипептида в подходящем экспрессионном хозяине.
В настоящем описании «оперативно связана» определяется как конфигурация, в которой контрольная последовательность соответствующим образом расположена в положении, по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по изобретению таким образом, что контрольная последовательность направляет продукцию полипептида по изобретению.
Будет понятно, что экспрессия включает любую стадию, вовлеченную в продукцию полипептида, в том числе, но не только, транскрипцию, пост-транскрипционную модификацию, трансляцию, пост-трансляционную модификацию и секрецию.
Конструкция нуклеиновой кислоты определяется как молекула нуклеиновой кислоты, которая выделена из природного гена или которая была модифицирована таким образом, чтобы содержать сегменты нуклеиновой кислоты, которые объединены или соединены способом, который в ином случае не существовал бы в природе.
Определенная в настоящем описании контрольная последовательность включает все компоненты, которые являются обязательными или предпочтительными для экспрессии полипептида. Как минимум, контрольные последовательности включают промотор и стоп-сигналы траскрипции и трансляции.
Вектор экспрессии
Настоящее изобретение дополнительно относится к вектору экспрессии, содержащему конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, проявляющий деацетилазную активность в отношении полисахарида и имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, определенной в предыдущем разделе. Предпочтительно, вектор экспрессии содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая оперативно связана с одной или несколькими контрольными последовательностями, которые направляют продукцию кодируемого полипептида в подходящем для экспрессии хозяине. Как минимум, контрольные последовательности включают промотор и стоп-сигналы транскрипции и трансляции. Вектор экспрессии может рассматриваться как рекомбинантный вектор экспрессии. Вектором экспрессии может быть любой вектор (например, плазмида, вирус), который удобно подвергать методикам рекомбинантных ДНК и который может осуществлять экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей этот полипептид. В зависимости от вида хозяина, в который будет введен вектор экспрессии и происхождения последовательности нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, специалист будет знать, как выбрать наиболее подходящий вектор экспрессии и контрольные последовательности. Наиболее предпочтительные клетки-хозяева представлены в разделе под названием клетки-хозяева.
В контексте настоящего изобретения вектор экспрессии при введении в клетку-хозяина приведет к тому, что в клетке повысится уровень экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, находящейся в векторе экспрессии, и/или повысится уровень экспрессии полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, находящейся в векторе экспрессии, и/или повысится уровень активности полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, находящейся в векторе экспрессии. В этом контексте, повышение оценивается в сравнении с клеткой-хозяином, которая не содержит указанный вектор экспрессии, и/или с клеткой-хозяином, которая не содержит эндогенный полипептид, по меньшей мере на 50% идентичный SEQ ID NO:1.
В другом аспекте настоящего изобретения представлен вектор экспрессии, охарактеризованный ранее, для использования, для получения лекарственного средства. Предпочтительно указанное лекарственное средство представляет собой вакцину или адъювант, как определено далее.
Инактивирующий вектор
Настоящее изобретение дополнительно относится к инактивирующему вектору, содержащему конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, проявляющий гликозилтрансферазную активность и имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, охарактеризованной в предыдущем разделе. Инактивирующий вектор создают для снижения или инактивации экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 50% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 в заданном хозяине.
Вектор инактивации можно рассматривать как рекомбинантный вектор экспрессии. Инактивирующим вектором может быть любой вектор (например, плазмида, вирус), который удобно подвергать методикам рекомбинантных ДНК и который может осуществлять инактивацию экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, как определено выше. В зависимости от вида хозяина, в который будет введен инактивирующий вектор, и происхождения последовательности нуклеиновой кислоты по изобретения, специалисту будет известно, как выбрать наиболее подходящий инактивирующий вектор. Наиболее предпочтительные клетки-хозяева представлены в разделе под названием клетки-хозяева.
В контексте настоящего изобретения, инактивирующий вектор при введении в клетку-хозяина будет приводить к тому, что в этой клетке будет уменьшенный (сниженный) уровень экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, находящейся в векторе экспрессии, и/или сниженный уровень экспрессии полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, находящейся в векторе экспрессии и/или сниженный уровень активности полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, находящейся в векторе экспрессии. В этом контексте, снижение предпочтительно оценивается сравнением с клеткой-хозяином, которая не содержит указанный инактивирующий вектор.
Снижение уровня экспрессии полипептида, проявляющего гликозилтрансферазную активность и имеющего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и/или снижение уровня его активности достигалось традиционными способами, известными из уровня техники, например, инактивацией или отрицательной регуляцией экспрессии последовательности эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную гликозилтрансферазу у хозяина. Такая инактивация или отрицательная регуляция может достигаться делецией одного или нескольких нуклеотидов в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный полипептид. В другом варианте осуществления изобретение относится к хозяину, предпочтительно Bordetella, который имеет мутацию в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную гликозилтрансферазу. Предпочтительно для получения хозяина, имеющего инактивированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, получают вектор замещения или инактивирующий вектор, и впоследствии вводят хозяину путем трансформации. Специалисту известно, как получить такой вектор.
Альтернативно или в сочетании с инактивацией последовательности эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, экспрессия последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, может быть снижена путем слияния ее со слабым промотором, подходящим для экспрессии белка на низком уровне в выбранном организме.
Альтернативно или в сочетании с инактивацией последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей эндогенную гликозилтрансферазу, экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, можно сделать индуцибельной путем слияния ее с индуцибельным промотором, подходящим для индуцибельного уровня экспрессии белка в выбранном организме.
Альтернативно или в сочетании с изложенным ранее предпочтительным вариантом осуществления, инактивация последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей эндогенную гликозилтрансферазу предпочтительно достигается с помощью использования суицидного вектора. Более предпочтительно, суицидный вектор представляет собой pSS1129 (Stibitz et al., 1994).
В другом аспекте настоящего изобретения представлен инактивирующий вектор, охарактеризованный ранее, для применения для получения лекарственного средства. Предпочтительно указанное лекарственное средство представляет собой вакцину или адъювант, как определено далее в настоящем описании.
Клетка-хозяин
Еще в одном аспекте, изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей вектор экспрессии по настоящему изобретению и/или инактивирующий вектор по настоящему изобретению, оба вектора охарактеризованы в предыдущих разделах. Выбор клетки-хозяина будет в большой степени зависеть от источника последовательности нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. В зависимости от типа клетки-хозяина, специалист знает, как трансформировать эту клетку конструкцией или вектором по настоящему изобретению.
Клеткой-хозяином может быть любая микробная, прокариотическая или эукариотическая клетка, которая подходит для экспрессии LPS по изобретению. В предпочтительном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой виды Bordetella, как упомянуто ранее в настоящем описании. Наиболее предпочтительно, Bordetella представляет собой Bordetella pertussis.
Методики, подходящие для трансформации Bordetella, могут включать способ, предусматривающий конъюгирование, в известной степени знакомый специалисту. Методики, подходящие для трансформации Bordetella, описаны у Stibitz et al., 1994.
В соответствии с первым предпочтительным вариантом осуществления, полученная таким образом клетка-хозяин имеет повышенный уровень экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, находящейся в векторе экспрессии, и/или имеет повышенный уровень экспрессии полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, находящейся в векторе экспрессии, и/или имеет повышенный уровень активности полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, находящейся в векторе экспрессии. В этом варианте осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты, находящейся в экспрессирующей конструкции, кодирует полипептид, по меньшей мере на 50% идентичный SEQ ID NO:1. В этом контексте повышение оценивается сравнением с клеткой-хозяином, которая не содержит указанный вектор экспрессии и/или с клеткой-хозяином, которая не содержит эндогенный полипептид, по меньшей мере на 50% идентичный SEQ ID NO:1 при культивировании обеих клеток и/или анализе в одинаковых условиях.
«Повышенный уровень экспрессии полипептида» в настоящем описании предпочтительно определяется как продукция большего количества полипептида, как определено ранее, чем то количество, которое будет продуцировать родительская клетка-хозяин, из которой происходит трансформированная клетка при культивировании обоих типов клеток (родительской и трансформированных клеток) в одинаковых условиях. Предпочтительно, клетка-хозяин по настоящему изобретению продуцирует по меньшей мере на 3%, 6%, 10% или 15% больше полипептида по изобретению, по меньшей мере на 50% идентичного SEQ ID NO:1, чем будет продуцировать родительская клетка-хозяин, из которой происходит трансформированная клетка-хозяин при культивировании обоих типов клеток (родительской и трансформированных клеток) в одинаковых условиях. Также предпочтительными являются хозяева, которые продуцируют по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или 150% больше указанного полипептида, чем родительская клетка. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления уровень продукции этого полипептида клеткой-хозяином по настоящему изобретению сравнивают с уровнем продукции штаммом B213 Bordetella pertussis (Kasuga et al., 1953, см. также Таблицу 1), который взят в качестве контроля. В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления, в тех случаях, когда клетка-хозяин по изобретению представляет собой штамм Bordetella pertussis, уровень продукции полипептида клетки-хозяина по изобретению сравнивают с уровнем продукции штамма B213, как определено выше, который взят в качестве контроля.
Оценку уровня продукции полипептида можно проводить на уровне мРНК, путем проведения Нозерн-блоттинга или матричного анализа, и/или на уровне полипептида, проводя Вестерн-блоттинг. Все эти способы хорошо известны специалисту.
«Повышение активности полипептида» в настоящем описании определяется как проявление более высокой активности деацетилазы полисахарида, чем активность родительской клетки-хозяина, из которой происходит трансформированная клетка, используя анализ, специфичный для указанной активности. Предпочтительно, анализ представляет собой анализ, упомянутый в разделе полипептиды. Предпочтительно, клетка-хозяин по изобретению демонстрирует по меньшей мере на 3%, 6%, 10% или 15% более высокую активность деацетилазы полисахарида, чем будет демонстрировать родительская клетка-хозяин, из которой происходит трансформированная клетка, исследованную с помощью специфического для указанной активности анализа, который предпочтительно представляет собой анализ, упомянутый в разделе полипептиды. Также предпочтительным является хозяин, который демонстрирует по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или 150% больше указанной активности, чем родительская клетка. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления, уровень активности деацетилазы полисахарида клетки-хозяина по настоящему изобретению сравнивают с соответствующей активностью штамма B213, как определено выше, который взят в качестве контроля. В соответствии с более предпочтительным вариантом осуществления, в тех случаях, когда клетка-хозяин по изобретению представляет собой штамм Bordetella pertussis, уровень активности деацетилазы полисахарида клетки-хозяина по изобретению сравнивают с соответствующей активностью штамма B213, как определено ранее, который взят в качестве контроля.
Повышение экспрессии полипептида и/или активности может достигаться традиционными способами, известными из уровня техники, например введением в хозяина большего количества копий последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей деацетилазу полисахарида, будь то на носителе или в хромосоме, чем имеется в природе. Альтернативно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая деацетилазу полисахарида, может гиперэкспрессироваться посредством слияния ее с высоко экспрессируемым или сильным промотором, подходящим для высокого уровня экспрессии белка в выбранном организме, или сочетанием двух подходов. Специалисту будет понятно, какой сильный промотор является наиболее подходящим, в зависимости от типа клетки-хозяина. Предпочтительно, в тех случаях, когда клетка-хозяин представляет собой штамм Bordetella pertussis, сильным промотором является tac-промотор вектора pMMB67EH (Methods for General and Molecular Bacteriology, Editors P. Gerhardt et al., American Society for Microbiology, Washington DC, 1994, p.409-410).
Альтернативно или в сочетании с первым предпочтительным вариантом осуществления, настоящее изобретение относится ко второму предпочтительному варианту осуществления, в котором клетка-хозяин имеет сниженный уровень экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, по меньшей мере на 50% идентичный аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и/или имеет сниженный уровень экспрессии указанного полипептида и/или имеет повышенный уровень активности указанного полипептида, предпочтительно посредством применения инактивирующего вектора по изобретению, охарактеризованного ранее в настоящем описании. В этом варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, находящейся в инактивирующем векторе, кодирует полипептид, по меньшей мере на 50% идентичный SEQ ID NO:2. В этом контексте снижение оценивают путем сравнения с клеткой-хозяином, которая не содержит такой инактивирующий вектор, при культивировании обеих клеток и анализе их в одинаковых условиях.
«Снижение уровня экспрессии полипептида» в настоящем описании предпочтительно определяется как продукция меньшего количества полипептида, охарактеризованного ранее, чем будет продуцировать родительская клетка, из которой происходит трансформированная клетка-хозяин, при культивировании обеих клеток (родительской и трансформированных клеток) в одинаковых условиях. Предпочтительно, клетка-хозяин по настоящему изобретению продуцирует по меньшей мере на 3%, 6%, 10% или 15% меньше полипептида по изобретению, по меньшей мере на 50% идентичного SEQ ID NO:2, чем будет продуцировать родительская клетка-хозяин, из которой происходит трансформированная клетка-хозяин при культивировании обеих типов клеток (родительской и трансформированных клеток) в одинаковых условиях. Также предпочтительными являются хозяева, которые продуцируют по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или 150% меньше указанного полипептида, чем родительская клетка. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления, уровень продукции этого полипептида клетки-хозяина по изобретению сравнивают с уровнем продукции штамма B213, охарактеризованного ранее, который взят в качестве контроля. В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления, в тех случаях, когда клетка-хозяин по изобретению представляет собой штамм Bordetella pertussis, уровень продукции полипептида клетки-хозяина по изобретению сравнивают с уровнем продукции штамма B213, охарактеризованного выше, который взят в качестве контроля.
Оценку уровня продукции полипептида можно проводить на уровне мРНК, путем проведения Нозерн-блоттинга или матричного анализа и/или на уровне полипептида, проводя Вестерн-блоттинг. Все эти способы хорошо известны специалисту.
«Снижение полипептидной активности» в настоящем описании определяется как проявление более низкой активности гликозилтрансферазы, чем активность родительской клетки-хозяина, из которой происходит трансформированная клетка, используя анализ, специфичный для указанной активности. Предпочтительно, анализ представляет собой анализ, уже описанный в настоящем описании в разделе полипептиды. Предпочтительно, клетка-хозяин по изобретению проявляет по меньшей мере на 3%, 6%, 10% или 15% ниже активность гликозилтрансферазы, чем будет проявлять родительская клетка-хозяин, из которой происходит трансформированная клетка-хозяин, которая исследована с помощью специфического анализа для указанной активности, который предпочтительно представляет собой анализ, описанный в разделе полипептиды. Также предпочтительным является хозяин, который проявляет по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или 150% больше указанной активности, чем родительская клетка. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления уровень активности гликозилтрансферазы клетки-хозяина по изобретению сравнивают с соответствующей активностью штамма B213, охарактеризованного ранее, который взят в качестве контроля. В соответствии с более предпочтительным вариантом осуществления, в тех случаях, когда клетка-хозяин по изобретению представляет собой штамм Bordetella pertussis, уровень активности деацетилазы полисахарида клетки-хозяина по изобретению сравнивают с соответствующей активностью штамма B213, охарактеризованного выше, который взят в качестве контроля.
Снижение экспрессии полипептида и/или активности может достигаться с помощью традиционных способов, известных из уровня техники, например путем введения в клетку-хозяина большего числа копий последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей деацетилазу полисахарида, будь то на носителе или в хромосоме, чем находится в природе. Альтернативно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей деацетилазу полисахарида, может быть гиперэкспрессирована путем слияния ее с высоко экспрессируемым или сильным промотором, подходящим для высокого уровня экспрессии белка в выбранном организме, или сочетанием этих двух подходов. Специалисту будет понятно, какой сильный промотор является наиболее подходящим, в зависимости от типа клетки-хозяина. Предпочтительно, в тех случаях, когда клетка-хозяин представляет собой штамм Bordetella pertussis, сильным промотором является tac-промотор вектора pMMB67EH, охарактеризованного выше.
В соответствии с более предпочтительным вариантом осуществления, клетка-хозяин не продуцирует никаких детектируемых количеств гликозилтрансферазы по изобретению и/или не проявляет никакой детектируемой гликозилтрансферазной активности. Предпочтительно, клетка-хозяин не продуцирует или по существу не продуцирует гликозилтрансферазу.
Альтернативно, в соответствии с другим более предпочтительным вариантом осуществления, клетка-хозяин продуцирует индуцибельное количество гликозилтрансферазы по изобретению и/или проявляет индуцибельную гликозилтрансферазную активность.
Снижение уровня экспрессии гликозилтрансферазы по изобретению и/или снижение уровня активности может достигаться традиционными способами, известными из уровня техники, например, инактивацией или отрицательной регуляцией последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей эндогенную гликозилтрансферазу хозяина. Инактивация или отрицательная регуляция может достигаться делецией одного или нескольких нуклеотидов в кодирующем гене. В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к хозяину, предпочтительно Bordetella pertussis, имеющему мутацию в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу. Предпочтительно, для получения хозяина, имеющего инактивированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, получают вектор замещения или инактивирующий вектор, и впоследствии вводят хозяину путем трансформации. Специалисту будет понятно, как получить такой вектор.
Альтернативно или в сочетании с инактивацией последовательности эндогенной нуклеиновой кислоты, экспрессия последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, может быть снижена, путем слияния ее со слабым промотором, подходящим для низкого уровня экспрессии белка в выбранном организме.
Альтернативно или в сочетании с инактивацией последовательности эндогенной нуклеиновой кислоты, экспрессия последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, может стать индуцибельной, путем слияния ее с индуцибельным промотором, подходящим для индуцибельного уровня экспрессии белка в выбранном хозяине. Предпочтительно, в тех случаях, когда клетка-хозяин представляет собой штамм Bordetella pertussis, индуцибельным промотором является tac-промотор вектора pMMB67EH, охарактеризованного ранее.
Неожиданно, клетка-хозяин по настоящему изобретению обладает привлекательными свойствами, которые делают ее очень привлекательной для применения в качестве цельной коклюшевой вакцины или в качестве адъюванта: улучшенная потенциальная способность взаимодействовать с DC, и для последующей индукции их созревания, и чтобы индуцировать продукцию провоспалительных цитокинов. Альтернативно или в сочетании, LPS, получаемый из этих клеток также является очень подходящим для использования в качестве вакцины или в качестве адъюванта, как представлено ниже.
В соответствии с этим, в другом аспекте настоящего изобретения представлена клетка-хозяин, охарактеризованная ранее, для применения в качестве лекарственного средства. Предпочтительно, указанное лекарственное средство представляет собой вакцину или адъювант, определенный далее в настоящем описании.
LPS, получаемый с помощью клетки-хозяина
Еще в одном аспекте, настоящее изобретение относится к LPS, получаемому из клетки-хозяина по изобретению, как определено ранее в настоящем описании. Предпочтительно, клеткой-хозяином являются виды Bordetella, более предпочтительно Bordetella pertussis, еще более предпочтительно Bordetella pertussis с гиперэкспрессией деацетилазы полисахарида по настоящему изобретению и/или инактивацией гликозилтрансферазы по изобретению. Более предпочтительно, LPS по изобретению получают из мутантного штамма 2331, как получено в примерах.
Еще более предпочтительно, при анализе после выделения с помощью экстракции горячим фенолом/водой (Westphal and Jann, 1965), O-дезацетилированием мягким гидролизом (Holst 2000) и анализе с помощью ESI-MS в режиме определения отрицательных ионов, спектр ESI-MS LPS по настоящему изобретению характеризуется тем, что дает больше ионов, чем соответствующий спектр ESI-MS LPS, полученного из дикого типа Bordetella pertussis, называемым LPS дикого типа. Предпочтительно диким типом Bordetella pertussis является штамм B213, охарактеризованный выше. Не желая привязываться к какой-либо теории, эти дополнительные ионы могут отражать по меньшей мере частичное увеличение замены 1 или 4' фосфатных групп части LPS, относящейся к липиду А остатками гексозамина.
Обычно спектр ESI-MS LPS дикого типа характеризуется тем, что дает 7 ионов (см. таблицу 3), тогда как спектр ESI-MS LPS по настоящему изобретению характеризуется тем, что дает более чем 7 ионов, по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, и более предпочтительно 14 ионов.
Альтернативно или в сочетании с предыдущим вариантом осуществления, предпочтительно спектр ESI-MS LPS по настоящему изобретению содержит больше ионов, содержащих гексозамин, чем ESI-MS спектр LPS дикого типа. Обычно ESI-MS спектр LPS дикого типа дает два иона с гексозамином (см. таблицу 3), тогда как ESI-MS спектр LPS по настоящему изобретению характеризуется тем, что дает более двух ионов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 6 и более предпочтительно 8 ионов.
Фармацевтические композиции и применения в медицине
Изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, содержащей клетку-хозяин по изобретению и/или LPS по изобретению, и то, и другое охарактеризовано ранее в настоящем описании. Фармацевтическая композиция может быть использована в качестве вакцины или в качестве адъюванта. Вакцина может быть использована для иммунизации (вызывания иммунного ответа) или вакцинации млекопитающего.
В настоящем описании определено, что адъюванты включают любое вещество или соединение, которое, при использовании в сочетании с антигеном, для иммунизации млекопитающего, предпочтительно человека, стимулирует иммунную систему, тем самым вызывая, усиливая или облегчая иммунный ответ на антиген, предпочтительно не вызывая специфической иммунной реакции на сам адъювант. Предпочтительные адъюванты усиливают иммунный ответ на заданный антиген, по меньшей мере в 1,5, 2, 2,5, 5, 10 или 20 раз, по сравнению с иммунным ответом, генерированным на антиген в тех же условиях, но в отсутствии адъюванта. Тесты для определения статистического среднего усиления иммунного ответа на заданный антиген, продуцируемого адъювантом в группе животных или людей по сравнению с соответствующей контрольной группой, доступны из уровня техники. Адъювант предпочтительно способен усиливать иммунный ответ по меньшей мере на два различных антигена. Адъювант по настоящему изобретению обычно будет представлять собой соединение, которое является чужеродным для млекопитающего, тем самым исключая иммуностимулирующие соединения, которые являются эндогенными для млекопитающих, например, такие как интерлейкины, интерфероны и другие гормоны.
В предпочтительном варианте осуществления, в тех случаях, когда фармацевтическую композицию используют в качестве адъюванта, композиция дополнительно содержит антиген.
В тех случаях, когда композицию используют в качестве вакцины, антиген представлен на поверхности клетки-хозяина по настоящему изобретению и/или находится в LPS, получаемом из таких клеток. В этом случае вакцина предпочтительно представляет собой вакцину против хозяина по настоящему изобретению и/или против любого хозяина, способного экспрессировать соответствующую молекулу LPS.
В тех случаях, когда композицию используют в качестве адъюванта, предпочтительно присутствует антиген. Антигеном предпочтительно является антиген из бактерий, вирусов, грибов, паразитов, злокачественных клеток или аллергена, как определено дополнительно ниже, или продуцируется этими организмами. Антиген и клетка-хозяин по изобретению и/или LPS, получаемый с помощью таких клеток, предпочтительно используются при лечении и/или профилактике инфекционного заболевания, вызываемого бактериями, вирусами, грибами или паразитами, или опухоли, вызываемой злокачественными клетками, или аллергической реакции, вызванной аллергеном.
Еще в одном предпочтительном варианте осуществления, фармацевтическая композиция, содержащая клетку-хозяина по настоящему изобретению и/или LPS, получаемый из нее, и необязательно антиген, как определено выше в настоящем описании, дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции дополнительно могут содержать фармацевтически приемлемые стабилизирующие агенты, осмотические агенты, буферные агенты, диспергирующие агенты и подобное. Предпочтительная форма фармацевтической композиции зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Фармацевтический носитель может представлять собой любое совместимое нетоксическое вещество, подходящее для доставки в организм пациента активных ингредиентов, т.е. клетки-хозяина по изобретению и/или LPS, получаемого из такой клетки-хозяина и необязательно антигена. Для фармацевтически приемлемых носителей для интраназальной доставки примерами служат вода, забуференные солевые растворы, глицерин, полисорбат 20, кремофор EL, и водная смесь каприлового/каприкового глицерида, и могут быть забуферены для обеспечения нейтрального рН окружения. Примерами фармацевтически приемлемых носителей для парентеральной доставки служат стерильный забуференный 0,9% NaCl или 5% глюкоза необязательно дополненная 20% альбумином. Препараты для парентерального введения должны быть стерильными. Парентеральный путь для введения активных ингредиентов соответствует известным способам, например, инъекции или инфузии подкожным, внутривенным, внутрибрюшинным, внутримышечным, внутриартериальным путем или введением внутрь пораженных тканей. Композиции по настоящему изобретению предпочтительно вводят болюсной инъекцией. Характерная фармацевтическая композиция для внутримышечного введения содержала бы, например, 1-10 мл фосфатного буферного солевого раствора и от 1 до 100 мкг, предпочтительно 15-45 мкг антигена и от 1 до 100 мкг, предпочтительно 15-45 мкг клетки-хозяина и/или LPS по изобретению. Для перорального введения активный ингредиент может быть введен в жидких лекарственных формах, таких как эликсиры, сиропы и суспензии. Жидкие лекарственные формы для перорального введения могут содержать красители и ароматизаторы для повышения приемлемости для пациента. Способы получения композиций, вводимых парентерально, перорально или интраназально хорошо известны из уровня техники и описаны более подробно в различных источниках, в том числе, например, в Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980) (включено в качестве ссылки в полном объеме для всех целей).
Антиген в композиции по изобретению предпочтительно представляет собой антиген из бактерий, вирусов, грибов, паразитов, злокачественных клеток или аллергена, или продуцируется ими. Вирусные антигены, которые могут быть объединены с клеткой-хозяином и/или LPS по настоящему изобретению, могут происходить из всех типов вирусов, неограничивающими примерами таких вирусов являются: ретровирусы, такие как вирус иммунодефицита человека (HIV); вирус краснухи; парамиксовирусы, такие как вирусы парагриппа, кори, инфекционного паротита, респираторный синцитиальный вирус, метапневмовирус человека; флавивирусы, такие как вирус желтой лихорадки, вирус денге, вирус гепатита С (HCV), вирус японского энцефалита (JEV), клещевого энцефалита, энцефалита Сент-Луис, или вирус Западного Нила; герпесвирусы, такие как вирус простого герпеса, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр; Буньянвирусы; Аренавирусы; Гантавирусы, такие как гантаан; коронавирусы; Паповавирусы такие как вирус папилломы человека; рабдовирусы, такие как вирус бешенства. Коронавирусы, такие как коронавирус человека; Альфавирусы, Артеривирусы, филовирусы, такие как Эболавирус, Аренавирусы, поксвирусы, такие как вирус натуральной оспы, и вирус африканской лихорадки свиней. Аналогичным образом клетка-хозяин и/или LPS по изобретению можно объединить с антигенами, происходящими из патогенных бактерий, грибов (в том числе дрожжей) или паразитических организмов. Такие антигены включают бактериальные антигены, например, Helicobacter, таких как H. pylori, Neisseria, таких как N. mengitidis, Haemophilus, таких как H. influenza, Bordetella, таких как B. pertussis, Chlamydia, Streptococcus, таких как Streptococcus sp. серотип A, Vibrio, таких как V. cholera, грамотрицательных кишечных патогенов, например, Salmonella, Shigella, Campylobacter и Escherichia, а также антиген из бактерий, вызывающих сибирскую язву, лепру, туберкулез, дифтерию, болезнь Лайма, сифилис, брюшной тиф и гонорею. Антигены из паразитических организмов, например, включают антигены из простейших, таких, как Babeosis bovis, Plasmodium, Leishmania spp. Toxoplasma gondii, и Trypanosoma, таких как T. cruzi. Антигены грибов могут включать антигены из таких грибов, как Aspergillus sp., Candida albicans, Cryptococcus, таких как, например, C. neoformans, и Histoplasma capsulatum.
Хотя вакцинацию обычно применяют для профилактической защиты от патогенов или для лечения заболеваний, следующих после инфицирования патогеном, специалист в данной области осведомлен о применении вакцин для лечения опухолей. Более того, обнаружено возрастающее число опухоль-специфичных белков, являющихся подходящими объектами, на которые могут быть нацелены антитела человека или гуманизированные антитела. Такие опухоль-специфичные белки также входят в объем настоящего изобретения. Многие опухоль-специфичные антигены известны из уровня техники. Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к композициям, содержащим опухоль-специфичный антиген и клетку-хозяина и/или LPS, как определено выше. Подходящие опухолевые антигены включают, например, эмбриональный опухолевый антиген, простат-специфичный мембранный антиген, простат-специфичный антиген, белок MZ2-E, полиморфный эпителиальный муцин (PEM), фолатсвязывающий белок LK26, (усеченный) рецептор эпидермального фактора роста (EGRF), HER2, антиген Томсона-Фриденрайха (T), ганглиозиды GM-2 и GD-2, Ep-CAM, муцин-1, эпителиальный гликопротеин-2, и специфичный антиген толстой кишки.
Кроме того, антигены могут быть нацелены на DC для индукции толерантности при профилактике аутоиммунного заболевания. Такие аллергены также входят в объем настоящего изобретения.
В соответствии с этим, в еще в одном аспекте клетка-хозяин по изобретению, предпочтительно Bordetella pertussis и/или LPS, получаемый из такой клетки, используют в качестве лекарственного средства. Предпочтительно, лекарственное средство представляет собой вакцину против коклюша.
В другом предпочтительном варианте осуществления клетка-хозяин по изобретению, предпочтительно Bordetella pertussis и/или LPS, получаемый из такой клетки, применяют в качестве адъюванта. Более предпочтительно, клетка-хозяин по изобретению, предпочтительно Bordetella pertussis и/или LPS, получаемый из такой клетки, применяют в сочетании с антигеном.
В соответствии с еще одним аспектом, настоящее изобретение относится к применению клетки-хозяина по изобретению, предпочтительно Bordetella pertussis и/или LPS, получаемого из такой клетки, для получения лекарственного средства для профилактики и/или лечения коклюша. В предпочтительном варианте осуществления клетку-хозяина по изобретению, предпочтительно Bordetella pertussis и/или LPS, получаемый из такой клетки, применяют в качестве адъюванта для получения лекарственного средства для вызывания иммунного ответа на антиген. Более предпочтительно, клетка-хозяин по изобретению и/или LPS, получаемый из такой клетки, применяются в качестве адъюванта в сочетании с указанным антигеном.
В соответствии с еще одним аспектом, настоящее изобретение относится к применению полипептида по изобретению, охарактеризованного ранее в настоящем описании, и/или последовательности нуклеиновой кислоты по изобретению, охарактеризованной в настоящем описании, для профилактики и/или лечения коклюша.
В соответствии с еще одним аспектом, изобретение относится к применению полипептида по изобретению, охарактеризованного ранее в настоящем описании, и/или последовательности нуклеиновой кислоты по изобретению, охарактеризованной ранее в настоящем описании, для получения адъюванта. Предпочтительно, в этом аспекте, полипептид по изобретению, охарактеризованный ранее в настоящем описании и/или последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению, охарактеризованная ранее в настоящем описании, применяют в сочетании с антигеном для получения лекарственного средства для вызывания иммунного ответа на этот антиген.
В способах и применениях по изобретению млекопитающим предпочтительно является человек.
В этом документе и в формуле изобретения глагол «содержать» и его спряжения используется в неограничивающем смысле для обозначения того, что понятия, следующие за этим словом, включены, но понятия, которые специально не указаны, не исключены. Кроме того, ссылка на элемент в единственном числе не исключает возможности того, что присутствует более одного такого элемента, если контекст явным образом не требует наличия одного и только одного такого элемента. Единственное число, таким образом, обычно означает «по меньшей мере один».
Описание фигур
Фиг. 1. (A) Схематическое представление идентифицированного гликозилтрансферазного оперона. Темно-серые стрелки показывают гены, которые кодируют предполагаемые гликозилтрансферазы, а светло-серые и белые стрелки показывают ген, кодирующий предполагаемую деацетилазу моносахарида и фланкирующие ORF, соответственно. (B) Анализ профиля LPS из штамма B. pertussis дикого типа (WT), и BP2329-, BP2328-, и BP2331-мутантных штаммов с помощью трицин-SDS-PAGE.
Фиг. 2. ESI-MS в режиме отрицательных ионов O-дезацетилированного LPS B. pertussis дикого типа (A) и мутантных штаммов BP2328 (B), BP2329 (C) и BP2331 (D) B. pertussis.
Фиг. 3. Тандемная масс-спектрометрия с анализом отрицательных ионов O-дезацетилированного LPS из мутантного штамма BP2331. (A) полученный спектр MS/MS иона с m/z 1108,3, (B) полученный спектр MS/MS иона с m/z 1162,0, (C) полученный спектр MS3 иона с m/z 1112,6 от иона с m/z 1162,0.
Фиг. 4. Активация DC после стимуляции клетками дикого типа и мутантными B. pertussis. (A) Анализ экспрессии CD83, HLA-DR, CD86, и CD40 на клеточной поверхности DC человека после 24 ч стимуляции PFA-фиксированными клетками B. pertussis дикого типа и мутантными клетками при MOI 10 (черная линия) или 100 (пунктирная линия). Нестимулированные DC служили в качестве контроля (серая гистограмма). Показаны FACS гистограммы для указанных штаммов B. pertussis из 5000 подсчитанных случаев. Вертикальная ось представляет число клеток, а горизонтальная ось представляет интенсивность окрашивания. (B) Продукция IL-10 и IL-12p70 культивированными DC человека после стимуляции PFA-фиксированными клетками B. pertussis дикого типа и мутантными клетками при MOI 10 или 100. Результаты выражены в виде средних концентраций цитокинов (± SD).
Фиг. 5. Активация DC после стимуляции очищенным LPS B. pertussis дикого типа и мутантного штамма. (A) Анализ экспрессии CD83, CD86, и CD40 на поверхности клеток DC человека после 24 ч стимуляции 1 мкг/мл очищенного LPS. Нестимулированные DC служили в качестве контроля (серая гистограмма). Показаны гистограммы FACS для LPS указанных штаммов B. pertussis из 5000 подсчитанных случаев. Вертикальная ось представляет число клеток, а горизонтальная ось представляет интенсивность окрашивания. (B) Продукция IL-10 культивированными DC человека после стимуляции 1 мкг/мл очищенного LPS. Результаты выражены в виде средних концентраций цитокина.
Фиг. 6. Индукция IL-6 под действием очищенного LPS B. pertussis и целых бактериальных клеток. Продукцию IL-6 клеточной линией MM6 макрофагов человека стимулировали серийными разведениями маточных растворов очищенного LPS (A) или цельных бактериальных клеток (B) из штамма B. pertussis дикого типа (WT), или BP2328-, BP2329-, и BP2331-мутантных штаммов. Концентрации IL-6 в культуральных супернатантах количественно анализировали в ELISA в сравнении с IL-6 человека. Данные представляют средние значения трех отдельных экспериментов.
Фиг. 7. Структура LPS B. pertussis. Представленные усеченные структуры OS ядра BP2328- и BP2329-мутантных штаммов указаны красными стрелками. Заимствовано у Caroff et al. (2000).
Примеры
Материалы и методы
Бактериальные штаммы и условия роста
Все использованные бактериальные штаммы описаны в Таблице 1. Обычно штаммы E. coli выращивали при 37°C в бульоне Луриа-Бертани при встряхивании 200 об/мин. При целесообразности бактерии выращивали в присутствии 100 мкг/мл ампициллина, 50 мкг/мл канамицина или 10 мкг/мл гентамицина, для поддержания плазмиды или селекции штамма. B. pertussis выращивали при 35°C на агаре Борде-Жангу (BG), дополненном 15% дефибринированной кровью овцы (Tritium).
Методики рекомбинантных ДНК
Все используемые плазмиды описаны в Таблице 1. Плазмидную ДНК выделяли, используя систему Promega Wizard® Plus SV Minipreps. Эндонуклеазы рестрикции использовали в соответствии с инструкциями производителя (Roche). Фрагменты ДНК выделяли из агарозных гелей, используя Promega Wizard® SV Gel и систему PCR Clean-Up. Лигирования проводили, используя набор rapid DNA ligation kit (Roche).
Все используемые праймеры описаны в Таблице 2. Хромосомную матричную ДНК для ПЦР реакций получали ресуспендированием ~109 бактерий в 50 мкл дистиллированной воды, после чего суспензию нагревали в течение 15 мин при 95°C. Затем суспензию центрифугировали в течение 1 мин при 16100 × g, после чего супернатант использовали в качестве матричной ДНК. Для конструирования мутантных штаммов B. pertussis B213ΔBP2328 и ΔBP2329, авторы изобретения амплифицировали сегменты ДНК, охватывающие 5' область и вышележащие последовательности соответствующих ORF, используя праймеры BP2328_FWup, BP2329_FWup, и праймеры BP2328_REVup, и BP2329_REVup, оба содержали сайт BamHI. Кроме того, фрагменты ДНК, содержащие 3' области и нижележащие последовательности ORF, получали с помощью ПЦР с праймерами BP2328_FWdown, BP2329_FWdown, оба содержащие сайт BamHI, и праймерами BP2328_REVdown, и BP2329_REVdown. Для конструирования мутантного штамма B. pertussis BP2331, соответствующую ORF амплифицировали, используя праймеры BP2331_FW и BP2331_REV. ПЦР проводили, используя чистые бусы для ПЦР Taq Ready-to-go (Amersham Biosciences) в суммарном объеме реакционной смеси 25 мкл с 5 пмоль каждого праймера. Температурный режим был следующим: 95°C на 3 мин, 30 циклов по 15 с при 95°C, 30 с при 55°C и 1 мин при 72°C, после этого 7 мин при 72°C и с последующим охлаждением до 4°C. Продукты ПЦР очищали от агарозного геля и после этого клонировали в pGEM-T Easy, получая в результате плазмиды pGEM-BP2328up, pGEM-BP2328down, pGEM-BP2329up, pGEM-BP2329down и pGEM-BP2331, соответственно. BamHI-SpeI фрагменты pGEM-BP2328down и pGEM-BP2329down лигировали в pGEM-BP2328up и pGEM-BP2329up, рестриктированные BamHI-SpeI, соответственно. Полученные в результате плазмиды и плазмиду pGEM-BP2331 резали с использованием BamHI и EcoRV, соответственно, для возможности осуществления вставки кассеты устойчивости к канамицину из плазмиды pBSL128, полученной путем расщепления под действием BamHI и HindIII, соответственно. Наконец, EcoRI фрагменты полученных конструкций лигировали в рестриктированную EcoRI суицидную плазмиду pSS1129. Окончательные конструкции, обозначенные pSS1129-BP2328KO, pSS1129-BP2329KO и pSS1129-BP2331KO, соответственно, содержали кассету устойчивости к канамицину в той же ориентации, что и направление транскрипции оперона. Плазмиды на основе pSS1129 использовали для трансформации E. coli SM10(λpir), что в дальнейшем позволяло осуществлять перенос плазмид в B. pertussis и конструировать мутантные штаммы B. pertussis BP2328, BP2329 и BP2331 посредством замены аллелей. Трансформанты подвергали скринингу с помощью ПЦР, используя различные пары праймеров.
Выделение LPS и получение де-O-ацетилированного LPS
LPS выделяли, используя способ экстракции горячим фенолом/водой (Westphal и Jann, 1965) с небольшими модификациями (Geurtsen et al., 2006). Де-O-ацетилирование LPS достигалось мягким гидролизом (Holst, 2000). Вкратце, LPS растворяли в безводном гидразине (200 мкл) и инкубировали при 37°C в течение 50 мин при постоянном перемешивании для высвобождения O-связанных жирных ацильных цепей. Смесь охлаждали и добавляли 600 мкл холодного ацетона небольшими порциями для превращения гидразина в гидразон ацетона. Преципитат де-O-ацилированного LPS собирали центрифугированием (4000 × g, при 7°C в течение 30 мин). Осадок промывали дважды 600 мкл холодного ацетона, центрифугировали и растворяли в воде перед лиофилизацией.
Капиллярный электорофорез-масс спектрометрия с электрораспылением
Систему Prince CE (Prince Technologies) соединяли с масс-спектрометром 4000 QTRAP (Applied Biosystems/MDS Sciex). Анодный раствор (изопропанол-метанол, 2:1) поступал со скоростью потока 1,0 мкл/мин. Разделения получали на неизолированном капилляре из кварцевого стекла длиной ~90 см, используя 15 мМ ацетат аммония в деионизированной воде, pH 9,0. 5 кВ и -5 кВ напряжение ионизации электрораспылением использовали для режима разделений положительного и отрицательного иона, соответственно. Для всех масс-спектрометрических экспериментов азот использовали в качестве газа для отражения и столкновения. В MS2 (усиленный продукт ион сканирования или EPI) и MS3 экспериментах, скорость сканирования устанавливали до 4000 Да/с с улавливанием Q0, разностное время улавливания устанавливали как «динамичное» и разрешение Q1 устанавливали как «единицу». Для MS3 экспериментов, коэффициент экстинкции был установлен на величине для возбуждения только первого изотопа для однозарядного предшественника со временем возбуждения, установленном на 100 мс.
Анализ LPS с помощью трипсин-SDS-PAGE
Приблизительно 109 бактерий суспендировали в 50 мкл буфера для образца (Laemmli, 1970), и добавляли 0,5 мг/мл протеиназы K (конечная концентрация). Образцы инкубировали в течение 60 мин при 55°C, затем 10 мин при 95°C для инактивации протеиназы K. Затем образцы разбавляли в 10 раз добавлением буфера для образца, после чего 2 мкл каждого образца наносили на гель в трипсин-SDS-PAGE (Lesse et al., 1990). Бромфеноловый синий прогоняли в разделяющем геле при 35 В, после чего напряжение повышали до 105 В. После достижения фронтом нижней части геля электрофорез продолжали в течение еще 45 мин. Гели фиксировали в течение ночи в воде/этаноле/уксусной кислоте 11:8:1 (об/об/об) и впоследствии окрашивали серебром, как описано (Tsai and Frasch, 1982).
Получение суспензий бактериальных клеток
Бактерии инактивировали в 0,5% параформальдегиде (PFA) в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) в течение 30 мин и тщательно промывали в среде RPMI 1640 без фенола красного (Gibco). Бактериальные суспензии с оптической плотностью при 600 нм (OD600), равной 1, соответствующие ~109 бактерий/мл, получали в среде RPMI 1640 без фенола красного.
Получение и культивирование DC человека
Незрелые DC человека получали из мононуклеарных клеток периферической крови человека (PBMC), как описано ранее с незначительными модификациями (Sallusto and Lanzavecchia, 1994). Вкратце, PBMC выделяли из гепаринизированной крови от здоровых добровольцев, используя центрифугирование в градиенте плотности по градиенту Фиколла (Amersham Biosciences). Извлеченные фракции PBMC промывали три раза в среде RPMI 1640, дополненной 10% инактивированной нагреванием эмбриональной сывороткой теленка (FCS) (Bodinco BV). Далее моноциты из PBMC получали центрифугированием через трехслойный Percoll градиент (GE Healthcare Bio-Sciences AB) (60%, 47,5%, и 34% Percoll в RPMI 1640, 10% FCS). Моноциты собирали с верхней поверхности раздела и промывали три раза, используя RPMI 1640, 10% среду FCS и инкубировали в шести луночном планшете (4 мл на лунку, 0,5×106 клеток/мл) в RPMI 1640, 10% FCS, дополненной 2,4 мМ L-глутамина (Sigma-Aldrich), 100 Ед/мл пенициллина-стрептомицина (Gibco), 100 нг/мл рекомбинантного GM-CSF человека (Peprotech), и 50 нг/мл рекомбинантного IL-4 человека (Strathmann-Biotec AG). После шести дней культивирования собирали незрелые DC (imDC), которые были негативными по CD14 и CD83, экспрессировали низкие уровни CD86 и HLA-DR, и экспрессировали высокие уровни CD40 и CD11c, по данным проточной цитометрии.
Стимуляция DC
ImDC промывали и ресуспендировали в концентрации 5×105 клеток/мл в RPMI 1640 10% FCS и совместно инкубировали либо с PFA-фиксированными клетками B. pertussis с множественностью заражения (MOI) 10 или 100, либо с LPS в концентрации 10 или 1000 нг/мл. Нестимулированные imDC служили в качестве контроля во всех экспериментах. DC собирали через 24 часа и напрямую окрашивали на экспрессию маркеров клеточной поверхности, супернатанты хранили при -80°C до измерения цитокинов.
Проточный цитометрический анализ маркеров клеточной поверхности
Поверхностную экспрессию маркеров созревания DC и молекул ко-стимуляции оценивали с помощью проточной цитометрии. Незрелые или стимулированные DC собирали, промывали в RPMI 1640, 10% FCS и ресуспендировали в стерилизованном фильтрацией PBS, содержащем 0,1% бычий сывороточный альбумин (FACS буфер). Далее, клетки инкубировали в течение 30 мин при 4°C с одним из следующих антител: FITC-конъюгированным против CD11c человека (mIgG1) и CD83 (mIgG1), конъюгированным с фикоэритрином против CD86 человека (mIgG1) и CD40 (mIgG1), конъюгированным с аллофикоцианином против CD14 человека (mIgG1) и HLA-DR (mIgG2b) и соответствующими изотипными контролями, меченными флуорохромом (CD11c, CD40 и CD14 от eBioscience; CD83, CD86 и HLA-DR от BD Pharmingen). Клетки промывали дважды буфером FACS и анализировали, с помощью проточной цитометрии (FACScan, Becton Dickinson).
Измерения цитокинов
Концентрации IL-10 и IL-12p70 в супернатантах, стимулированных DC определяли, используя твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) в соответствии с инструкциями производителя (BD Biosciences Pharmingen).
Исследования эндотоксической активности
Клеточную линию макрофагов человека MM6 (Ziegler-Heitbrock et al., 1988) стимулировали серийными разведениями суспензий цельных бактериальных клеток или очищенного LPS, как описано (Geurtsen et al., 2006). Суспензии бактериальных клеток получали, собирая клетки из культур центрифугированием, после чего их ресуспендировали в PBS с OD590 1,0, инактивировали нагреванием в течение 10 мин в присутствии 8 мМ формальдегида и хранили при 4°C. После стимуляции, концентрации IL-6 в культуральных супернатантах количественно анализировали с помощью ELISA в отношении IL-6 человека в соответствии с инструкциями производителя (PeliKine Compact™).
Результаты
Идентификация нового оперона биосинтеза LPS в B. pertussis
Авторы изобретения обнаружили кластер из четырех генов (BP2328-BP2331, GenBank Accession Numbers NP_880966-NP_880969), три из которых демонстрировали высокое сходство последовательностей с гликозилтрасферазами LPS из различных бактерий, т.е. BP2328, BP2329 и BP2331. BP2330 демонстрирует самое высокое сходство с деацетилазой полисахаридов из Xylella fastidiosa. Четыре ORF расположены близко друг к другу и в некоторых случаях даже перекрываются, давая возможность предположить, что они составляют оперон (Фиг. 1A). Гены выше, и в обратной ориентации, ниже оперона, предположительно кодируют гомологи ДНК полимеразы III субъединицы альфа DnaE и предполагаемой сульфатазы YhbX E. coli, соответственно. Для изучения роли предполагаемых гликозилтрансфераз LPS, авторы изобретения изготовили конструкции в суицидной плазмиде pSS1129, несущей отдельные гены BP2328, BP2329 и BP2331, которые прерываются кассетой устойчивости к канамицину для вставочной инактивации посредством аллельного обмена. Используя этот подход, нокаут-мутанты для всех трех генов можно легко получить в штамме B. pertussis B213. Анализ их LPS с помощью трипсин-SDS-PAGE лизатов цельных клеток, показал отчетливо усеченный LPS для мутантных штаммов BP2328 и BP2329 (Фиг. 1B). В отличие от этого, LPS мутантного штамма BP2331 был более гетерогенным и состоял из множества полос, в том числе длины дикого типа.
Структурный анализ LPS
Для определения их структуры, LPS из штаммов дикого типа и мутантных штаммов BP2328-, BP2329-, и BP2331- выделяли, O-дезацетилировали и анализировали с помощью ESI-MS в режиме определения отрицательных ионов (Фиг. 2). Предложенные составы LPS суммированы в Таблице 3. Спектр LPS дикого типа (Фиг. 2A) показал основной трехзарядный ион с m/z 1108,5, соответствующий полноразмерному LPS B. pertussis с составом GlcNAc·Man2NAc3NAcA·Fuc2NAc4NMe·GalNA·Glc·GlcN2·GlcA·Hep3·P·Kdo· липид A-OH. Дополнительные ионы присутствовали при m/z 770,1 ([M-3H]3-), 811,1 ([M-4H]4-), 831,4 ([M-4H]4-), 888,3 ([M-3H]3-), 951,8 ([M-H]-), 987,1 ([M-2H]2-), 1081,7 ([M-3H]3-), 1121,1 ([M-3H+K]3-), 1155,0 ([M-2H]2-), и 1162,1 ([M-3H]3-). Большинство этих ионов соответствовали дефосфорилированным или усеченным гликоформам; однако, трехзарядный ион с m/z 1162,1 соответствовал полноразмерному LPS B. Pertussis, замещенному дополнительной гексозаминной частью (Таблица 3). ESI-MS спектр LPS мутантного штамма BP2328 (Фиг. 2B) показал трехзарядные ионы с m/z 743,6, 770,0, и 823,7, вместе с их соответствующими двухзарядными ионами с m/z 1115,2, 1155,1, и 1235,7. Дополнительные пики находились при m/z 777,3 ([M-3H+Na]3-), 952,1 ([M-H]-), 1034,6 ([M-2H]2-), 1074,6 ([M-2H]2-), и 1166,1 ([M-2H+Na]2-). Распределение пиков показало, что наиболее полная структура ядерного OS была представлена ионами с m/z 823,7 и 1235,7, соответствующими составу GalNA·Glc·GlcN2·GlcA·Hep2·P·Kdo·липид A-OH. Мутантный LPS BP2329 (Фиг. 2C) показал трехзарядные ионы с m/z 603,9 и 657,6, вместе с соответствующими им двухзарядными ионами с m/z 906,0 и 986,6. Кроме того, натриевые и калиевые аддукты этих ионов находились при m/z 917,4 и 997,6, и m/z 925,0 и 1005,6, соответственно. Дополнительные пики находились на m/z 866,0 ([M-2H]2-), 937,4 ([M-2H-H2O]2-), и 1067,1 ([M-2H]2-). В этом случае, наиболее полная структура ядра была представлена двухзарядным ионом с m/z 1067,1, соответствующим составу GlcN2·GlcA·Hep2·P·Kdo·липид A-OH. Мутантный LPS BP2331 (Фиг. 2D) показал большое число пиков, в том числе трехзарядные ионы с m/z 1108,3 и 1162,0, соответствующие полноразмерному LPS B. pertussis и полноразмерному LPS B. Pertussis, замещенному дополнительным гексозамином, соответственно.
Для определения локализации дополнительной гексозаминной части, которая наблюдалась в LPS как дикого типа, так и в мутантном LPS BP2331, проводили исследования ESI-MS2 в режиме отрицательного иона (Фиг. 3). MS/MS спектры ионов с m/z 1108,3 (Фиг. 3A) и 1162,0 (Фиг. 3B) оба показали однозарядный фрагментный ион с m/z 951,5, который показал, что A-OH, полученный в результате расщепления между связью Kdo-липид A в условиях диссоциации, индуцированной столкновением, состоял из β-(1→>6)-связанного дисахарида N-ацилированных (3OH C14) глюкозаминных остатков, каждый остаток замещен фосфатной группой. Спектр иона с m/z 1162,0 также показал дополнительный ион с m/z 1112,6, который указывает на то, что дополнительный гексозаминный остаток был напрямую присоединен к липиду A. MS3 на m/z 1112,6 дополнительно поддержал это заключение (Фиг. 3C).
Активация дендритных клеток под действием мутантных LPS B. pertussis
Для определения влияния мутаций LPS на активацию DC, незрелые DC совместно культивировали с PFA-фиксированными B. pertussis дикого типа и мутантными бактериями с MOI 10 и 100. Активацию DC контролировали анализом маркеров созревания (CD83 и HLA-DR), а экспрессию молекул ко-стимулирования (CD86 и CD40) с помощью проточной цитометрии (Фиг. 4A) и индукцию IL-10 и IL12p70 с помощью ELISA (Фиг. 4B). Бактери дикого типа и все мутантные бактерии индуцировали экспрессию CD83, HLA-DR, CD86, и CD40, демонстрируя, что все штаммы были способны активировать DC. Однако BP2329- и BP2331-мутантные бактерии были явно менее и более стимулирующими соответственно, чем бактерии дикого типа, тогда как мутантный штамм BP2328 был также эффективен, как и штамм дикого типа. Меньшее созревание DC наблюдалось в случае мутантного штамма BP2329 сопровождалось более низкой индукцией IL-10 и IL-12p70 (Фиг. 4B). Аналогично, мутантный штамм BP2331, который демонстрировал повышенную способность DC к созреванию, индуцировал более высокие количества IL-10 и IL-12p70. Штамм дикого типа и мутантный штамм BP2328 индуцировали сравнимые уровни IL-10, что согласуется с равной экспрессией молекул ко-стимуляции и маркеров созревания на DC в ответ на эти штаммы. Однако тогда как штамм дикого типа отчетливо индуцировал продукцию IL-12p70, это было мало вероятно в случае мутантного штамма BP2328 (Фиг. 4B), что дает возможность предположить, что экспрессия IL-10 и IL-12p70 может регулироваться дифференциально.
Чтобы оценить связаны ли наблюдаемые отличия в способности активировать DC между штаммами дикого типа и мутантными штаммами непосредственно с различиями в составе LPS, исследования активации DC проводили с 10 и 1000 нг/мл очищенного LPS. В отличие от большого повышения в экспрессии маркеров созревания и молекул ко-стимуляции на DC в ответ на бактерии дикого типа, BP2328-, и BP2331-мутантные бактерии, только незначительные повышения в экспрессии CD83, CD86, и CD40 (Фиг. 5A) и отсутствие повышения в экспрессии HLA-DR (данные не показаны) были обнаружены даже с 1000 нг/мл LPS этих штаммов. Аналогично, индукция IL-10 была низкой (Фиг. 5B) и IL-12p70 не мог быть детектирован в супернатантах DC, стимулированных LPS (данные не показаны). Тем не менее взаимное сличение (Фиг. 5A и 5B) показало, что в соответствии с результатами, полученными с интактными бактериями, наибольшая способность активировать DC была обнаружена для LPS, выделенного из мутантного штамма BP2331, за ним следовали LPS мутантного штамма BP2328 и штамма дикого типа, тогда как LPS мутантного штамма BP2329 был неспособен вызывать созревание DC. Таким образом, изменения в структуре LPS мутантных штаммов дифференцильно влияет на способность активировать DC.
Эндотоксическая активность LPS и цельных бактериальных клеток
Чтобы оценить последствия мутаций LPS для эндотоксической активности LPS, была протестирована эффективность очищенного LPS в отношении стимуляции клеточной линии макрофагов человека MM6 к продукции IL-6. По сравнению с LPS дикого типа, LPS, очищенный из мутантного штамма BP2331, обладал гораздо более высокой эффективностью в отношении стимуляции макрофагов (Фиг. 6A). В отличие от этого, LPS из мутантного штамма BP2329 обладал сниженной эффективность в отношении стимуляции продукции IL-6, тогда как активность LPS из мутантного штамма BP2328 была сходна с активностью LPS дикого типа (Фиг. 6A). Только в двух самых высоких тестируемых концентрациях LPS, последний LPS был более активным, чем LPS дикого типа. Согласуясь с данными, полученными с очищенным LPS, суспензии цельных клеток мутантного штамма BP2331 показали, по сравнению с клетками дикого типа, отчетливо повышенную эффективность в отношении стимуляции макрофагов (Фиг. 6B). Однако также мутантные клетки BP2328 показали тот же эффект (Фиг. 6B), хотя мутантные клетки BP2329 имели аналогичную активность, что и клетки дикого типа, несмотря на их менее активный очищенный LPS (Фиг. 6A).
Обсуждение
Целью настоящего исследование было идентифицировать новые гликозилтрансферазы LPS в геноме B. pertussis. Используя последовательности известных гликозилтрансфераз LPS в качестве лидеров, авторам изобретения удалось идентифицировать четыре генных оперона. В предыдущем исследовании, в котором геномную последовательность птичьего патогена Bordetella avium сравнивали с геномными последовательностями других Bordetellae, было описано, что генный кластер, гомологичный одному из идентифицированных в настоящем исследовании, вовлечен в биосинтез LPS (Sebaihia et al., 2006). Однако о каких-либо функциональных исследованиях, которые могли бы подтвердить это распределение, не сообщалось.
Для изучения роли этого оперона в биосинтезе LPS B. pertussis, авторы изобретения инактивировали предполагаемые гены гликозилтрансферазы посредством аллельного обмена и сравнили профили LPS штаммов дикого типа и мутантных штаммов, используя трицин-SDS-PAGE и ESI-MS. Неожиданно, авторы изобретения обнаружили, что штамм дикого типа не только содержал полноразмерный LPS B. pertussis, а также содержал полноразмерные виды, замещенные еще одной гексозаминной частью, которая, как было показано авторами изобретения, была непосредственно присоединена к липиду А. Замещение липида А B. pertussis гексозамином ранее не наблюдалось и, следовательно, представляет новую модификацию липида А B. pertussis.
Предложенные усеченные олигосахаридные структуры для мутантных штаммов BP2328- и BP2329- суммированы на Фиг. 7. Наиболее полная структура ядерного OS в мутантном штамме BP2328 состояла из GalNA·Glc·GlcN2·GlcA·Hep2·P·Kdo·липид A-OH·HexN, указывая на то, что мутантный штамм BP2328 лишен терминального трисахарида, остатка гепрозы и одного из остатков GlcN. Этот состав позволяет предположить, что BP2328-кодируемый белок функционирует как GlcN (1-4) в отношении Glc трансферазы (Фиг. 7). Анализ LPS мутантного штамма BP2329 показал, что этот LPS был дополнительно усечен, и что его наиболее полная структура состояла из GlcN·GlcA·Hep2·P·Kdo·липид A-OH·HexN. Поскольку эта структура лишена Glc, к которому должен быть присоединен второй GlcN ядерного OS, оставшийся присутствующий остаток GlcN должен быть присоединен ко второй гептозе. Таким образом, этот состав позволяет предположить, что BP2329-кодируемый белок функционирует в качестве гликозилтрансферазы, которая присоединяет Glc к первой гептозной субъединице (Фиг. 7). Это согласовывалось бы с высокой гомологией этого генного продукта с глюкозой (β1-4) гептозтрансферазами, такими как rfaK и lgtF/icsB, которые были использованы для идентификации гена в первом положении. Наиболее сложный фенотип наблюдался в случае мутантного штамма BP2331. Хотя этот белок демонстрирует высокое сходство последовательностей с различными гликозилтрансферазами LPS, полноразмерный LPS B. pertussis все же присутствовал в мутантном штамме. Это наблюдение позволяет предположить, что либо этот ген BP2331 не кодирует активную гликозилтрансферазу LPS, либо что кодируемый фермент демонстрирует дублирование. Согласно этому последнему мнению, авторы изобретения идентифицировали ген, т.е. BP3671 с регистрационным номером GenBank CAE43928, в геноме B. Pertussis, который кодирует белок, который на 69% идентичен белку, кодируемому BP2331. Хотя профили LPS штамма дикого типа и мутантного BP2331 были более или менее сравнимыми, одним поразительным наблюдением было то, что мутантный LPS был более гетерогенным. Хотя точную причину этого феномена остается объяснить, одним возможным объяснением может быть то, что BP2331 мутант так или иначе проявляет повышенную нестехиометрическую замену его LPS, возможно, гексозамином. Модификация липида А аминосахарами была описана у различных бактерий, например, замещение 4-аминоарабинозой в E. coli и Salmonella (Trent et al., 2001b), и галактозамином в Francisella tularensis (Phillips et al., 2004). Аминоарабинозный путь был изучен подробно у E. coli и было показано, что он вовлечен в сборку сахарной части на отдельном ундекапренилфосфатном носителе до переноса в липид A (Trent et al., 2001a). Поскольку возможно, что вставка кассеты устойчивости к канамицину в BP2331 повысила экспрессию нижележащего гена BP2330, можно было сделать предположение, что повышенная экспрессия BP2330 может привести к повышенной гексозаминной модификации липида А и, следовательно, к повышенной гетерогенности LPS в BP2331-мутантных клетках. Основанием для такой интерпретации является повышенный уровень гексозаминной модификации в мутантном ВР2331, см. Таблицу 3.
Обратившись к структуре LPS, очищенный LPS и цельные бактериальные клетки были протестированы на их способность индуцировать созревание DC и стимулировать продукцию провоспалительных цитокинов макрофагами человека. Результаты показали, что по сравнению со штаммом дикого типа, ВР2331-мутантный штамм демонстрировал повышенную способность индуцировать созревание DC и продукцию провоспалительных цитокинов. Аналогичные результаты были получены с очищенным LPS. В отличие от этого, цельные бактериальные клетки и очищенный LPS из мутантных штаммов ВР2328 и ВР2329 демонстрировали сходную и сниженную способность вызывать созревание DC и стимулировать макрофаги, соответственно. Эти результаты показывают, что изменения в LPS ядерного OS-состава дифференциально влияют на биологические свойства LPS В. pertussis. Исходя из перспективы создания вакцин это является интересным открытием, поскольку это может давать возможность получать штаммы, которые более эффективно примируют иммунные ответы. Более того, мутантные штаммы, которые демонстрируют повышенную гетерогенность LPS, например мутантный штамм ВР2331, могут вызывать образование большого разнообразия антител против LPS, что само по себе может положительно влиять на эффективность вакцины. Найдена хорошая корреляция между уровнем активации DC и макрофагов с одной стороны и степенью гексозаминной модификации липида A с другой (см. Таблицу 3), убедительно указывает на то, что повышенная модификация в мутантном штамме ВР2331 является решающей в этом отношении.
Таблица 1 Бактериальные штаммы и плазмиды |
||
Штамм или плазмида | Генотип или описание | Источник или ссылка |
Штаммы B. pertussis |
||
B213 | Устойчивый к стрептомицину производный штамм B. pertussis Tohama | Kasuga et al., 1953 |
B213 ΔBP2328 | BP2328 мутант штамма B213, StrR, KmR | Это исследование |
B213 ΔBP2329 | BP2329 мутант штамма B213, StrR, KmR | Это исследование |
B213 ΔBP2331 | BP2331 мутант штамма B213, StrR, KmR | Это исследование |
E. coli | ||
TOP10F' |
F´{lacI
q
Tn10 (Tet
R
)} mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74
deoR recA1 araD139 Δ (ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG |
Invitrogen |
DH5α |
F
-
Δ(lacZYA-algF)U169 thi-1 hsdR17 gyrA96 recA1 endA1 supE44 relA1
phoA Φ80 dlacZΔM15 |
Hanahan, 1983 |
SM10(λpir) | thi thr leu fhyA lacY supE recA::RP4-2-Tc::Mu λ pir R6K KmR | N.V.I.a |
Плазмиды | ||
pGEM-T Easy | E. coli клонирующий вектор AmpR | Promega |
pUC4K | E. coli вектор, содержащий кассету устойчивости к канамицину, AmpR KmR | Vieira and Messing, 1982 |
pSS1129 | Вектор аллельной замены, bla gen rpsL oriVColE1 oriT λ cos | Stibitz, 1994 |
pGEM-BP2328up | производное pGEM-T Easy, содержащее последовательность BP2328, расположенную перед сайтом инициации транскрипции |
Это исследование |
pGEM-BP2328down | производное pGEM-T Easy содержащее последовательность BP2328, расположенную по ходу транскрипции |
Это исследование |
pGEM-BP2329up | производное pGEM-T Easy, содержащее последовательность BP2329, расположенную перед сайтом инициации транскрипции |
Это исследование |
pGEM-BP2329down | производное pGEM-T Easy, содержащее последовательность BP2329, расположенную по ходу транскрипции |
Это исследование |
pGEM-BP2331 | производное pGEM-T Easy, содержащее последовательность BP2331 | Это исследование |
pSS1129-BP2328KO | производное pSS1129, содержащее нокаут конструкцию BP2328, KmR | Это исследование |
pSS1129-BP2329KO | производное pSS1129, содержащее нокаут конструкцию BP2329, KmR | Это исследование |
pSS1129-BP2331KO) | производное pSS1129, содержащее нокаут конструкцию BP2331, KmR | Это исследование |
a Netherlands Vaccine Institute, Bilthoven, Нидерланды |
Таблица 2 Праймеры |
|
Название | Последовательность (5'-3')a |
BP2328_FW up | TTCCGCACTTACTGGCTGAG |
BP2328_FW down | GGATCCTCGCGGTACGACAGCACAT |
BP2328_REV up | GGATCCTGTTGCGCGAGATGCTGGAG |
BP2328_REV down | CCTCATCGCCAAGGTCAATC |
BP2329_FW up | TCACCTTCGACGACGGATAC |
BP2329_FW down | GGATCCGTGCGCATCTACCTGATCC |
BP2329_REV up | GGATCCGAATCGACCACGATGAAC |
BP2329_REV down | GATCCAGCTTGGCCTGGTTG |
BP2331_FW | GTGACGTGGTGGTACATCAG |
BP2331_REV | TGGTCTACCGCAGGAACAAT |
a BamHI сайты рестрикции подчеркнуты |
Ссылки
Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N., and Croughan, T. P. (1995) Improved antibiotic-resistance gene cassettes and omega elements for Escherichia coli vector construction and in vitro deletion/insertion mutagenesis. Gene 160: 63-67.
Allen, A. G., Isobe, T., and Maskell, D. J. (1998a) Identification and cloning of waaF (rfaF) from Bordetella pertussis and use to generate mutants of Bordetella spp. with deep rough lipopolysaccharide. J. Bacteriol. 180: 35-40.
Allen, A. G., Thomas, R. M., Cadisch, J. T., and Maskell, D. J. (1998b) Molecular and functional analysis of the lipopolysaccharide biosynthesis locus wlb from Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis and Bordetella bronchiseptica. Mol. Microbiol. 29: 27-38.
Allen, A., and Maskell, D. (1996) The identification, cloning and mutagenesis of a genetic locus required for lipopolysaccharide biosynthesis in Bordetella pertussis. Mol. Microbiol. 19: 37-52.
Caroff, M., Brisson, J., Martin, A., and Karibian, D. (2000) Structure of the Bordetella pertussis 1414 endotoxin. FEBS Lett. 477: 8-14.
Clementz, T., and Raetz, C. R. H. (1991) A gene coding for 3-deoxy-D-manno-octulosonic-acid transferase in Escherichia coli. Identification, mapping, cloning, and sequencing. J. Biol. Chem. 266: 9687-9696.
Di Fabio, J. L., Caroff, M., Karibian, D., Richards, J. C., and Perry, M. B. (1992) Characterisation of the common antigenic lipopolysaccharide O-chains produced by Bordetella bronchiseptica and Bordetella parapertussis. FEMS Microbiol. Lett. 76: 275-281.
Geurtsen, J., Steeghs, L., Hamstra, H-J., ten Hove, J., de Haan, A., Kuipers, B., Tommassen, J., and van der Ley, P. (2006) Expression of the lipopolysaccharide-modifying enzymes PagP and PagL modulates the endotoxic activity of Bordetella pertussis. Infect. Immun. 74: 5574-5585.
Hanahan, D. (1983) Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166: 557-580.
Holst, O. (2000) Deacylation of lipopolysaccharides and isolation of oligosaccharides phosphates. in Methods in Molecular Biology, Bacterial Toxins: Methods and Protocols (Holst, O., Ed.) pp 345-353, Humana Press, Totowa, NJ.
Heinrichs, D. E., Yethon, J. A., and Whitfield, C. (1998) Molecular basis for structural diversity in the core regions of the lipopolysaccharides of Escherichia coli and Salmonella enterica. Mol. Microbiol. 30: 221-232.
Isobe, T., White, K. A., Allen, A. G., Peacock, M., Raetz, C. R. H., and Maskell, D. J. (1999) Bordetella pertussis waaA encodes a monofunctional 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid transferase that can complement an Escherichia coli waaA mutation. J. Bacteriol. 181: 2648-2651.
Kasuga, B., Nakase, Y., Ukishima, K., and Takatsu, K. (1953) Studies on Haemophilus pertussis. Kitasato Arch. Exp. Med. 27: 21-28.
Kurzai, O., Schmitt, C., Claus, H., Vogel, U, Frosch, M, and Kolb-Maurer, A. (2005) Carbohydrate composition of meningococcal lipopolysaccharide modulates the interaction of Neisseria meningitidis with human dendritic cells. Cell. Microbiol. 7: 1319-1334.
Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.
Lesse, A. J., Campagnari, A. A., Bittner, W. E., and Apicella, M. A. (1990) Increased resolution of lipopolysaccharides and lipooligosaccharides utilizing tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. J. Immunol. Methods 126: 109-117.
MacLachlan, P. R., Kadam, S. K., and Sanderson, K. E. (1991) Cloning, characterization, and DNA sequence of the rfaLK region for lipopolysaccharide synthesis in Salmonella typhimurium LT2. J. Bacteriol. 173: 7151-7163.
O'Neill, L. A. J. (2006) How Toll-like receptors signal: what we know and what we don't know. Curr. Opin. Immunol. 18: 3-9.
Pålsson-McDermott, E. M., and O'Neill, L. A. J. (2004) Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor, Toll-like receptor-4. Immunology 113: 153-162.
Peppler, M. S. (1984) Two physically and serologically distinct lipopolysaccharide profiles in strains of Bordetella pertussis and their phenotype variants. Infect. Immun. 43: 224-232.
Phillips, N. J., Schilling, B., McLendon, M. K., Apicella, M. A., and Gibson, B. W. (2004) Novel modification of lipid A of Francisella tularensis. Infect. Immun. 72: 5340-5348.
Plüddeman, A., Mukhopadhyay, S., and Gordon, S. (2006) The interaction of macrophage receptors with bacterial ligands. Exp. Rev. Mol. Med. 8: 1-25.
Raetz, C. R. H., and Whitfield, C. (2002) Lipopolysaccharide endotoxins. Annu. Rev. Biochem. 71: 635-700.
Sallusto, F., and Lanzavecchia, A. (1994) Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor α. J. Exp. Med. 179: 1109-1118.
Schnaitman, C. A., and Klena, J. D. (1993) Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in enteric bacteria. Microbiol. Rev. 57: 655-682.
Sisti, F., Fernández, J., Rodríguez, M. E., Lagares, A., Guiso, N., and Hozbor, D. F. (2002) In vitro and in vivo characterization of a Bordetella bronchiseptica mutant strain with a deep rough lipopolysaccharide structure. Infect. Immun. 70: 1791-1798.
Steeghs, L., van Vliet, S. J., Uronen-Hansson, H., van Mourik, A., Engering, A., Sanchez-Hernandez, M., Klein, N., Callard, R., van Putten, J. P. M., van der Ley, P., van Kooyk, Y., and van de Winkel, J. G. J. (2006) Neisseria meningitidis expressing lgtB lipopolysaccharide targets DC-SIGN and modulates dendritic cell function. Cell. Microbiol. 8: 316-325.
Stibitz, S. (1994) Use of conditionally counterselectable suicide vectors for allelic exchange.
Methods Enzymol. 235: 458-465.
Methods Enzymol. 235: 458-465.
Takada H, and Kotani S. (1989) Structural requirements of lipid A for endotoxicity and other biological activities. Crit. Rev. Microbiol. 16: 477-523.
Trent, M. S., Ribeiro, A. A., Doerrler, W. T., Lin, S., Cotter, R. J., and Raetz, C. R. H. (2001a) Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm. J. Biol. Chem. 276: 43132-43144.
Trent, M. S., Ribeiro, A. A., Lin, S., Cotter, R. J., and Raetz, C. R. H. (2001b) An inner membrane enzyme in Salmonella and Escherichia coli that transfers 4-amino-4-deoxy-L-arabinose to lipid A: induction on polymyxin-resistant mutants and role of a novel lipid-linked donor. J. Biol. Chem. 276: 43122-43131.
Tsai, C. M., and Frasch, C. E. (1982) A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 119: 115-119.
Uronen-Hansson, H., Steeghs, L., Allen, J., Dixon, G.L.J., Osman, M., van der Ley, P., Wong, S.Y.C., Callard, R., and Klein, N. (2004) Human dendritic cell activation by Neisseria meningitidis: phagocytosis depends on expression of lipooligosaccharide (LOS) by the bacteria and is required for optimal cytokine production. Cell. Microbiol. 6: 625-637.
van Amersfoort, E. S., Van Berkel, T. J., and Kuiper, J. (2003) Receptors, mediators, and mechanisms involved in bacterial sepsis and septic shock. Clin. Microbiol. Rev. 16: 379-414.
Westphal, O., and Jann, J. K. (1965) Bacterial lipopolysaccharides, extraction with phenol-water and further applications of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5: 83-91.
Ziegler-Heitbrock, H. W. L., Thiel, E., Futterer, A., Herzog, V., Wirtz, A., and Riethmüller, G. (1988) Establishment of a human cell line (Mono Mac 6) with characteristics of mature monocytes. Int. J. Cancer 41: 456-461.
Claims (12)
1. Клетка-хозяин Bordetella pertussis, Bordetella bronchiseptica или Bordetella parapertussis для применения в качестве адъюванта, имеющая сниженную активность эндогенной гликозилтрансферазы с по меньшей мере 98% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 по сравнению с активностью гликозилтрансферазы соответствующего родительского штамма, где сниженная активность достигается применением инактивирующего вектора, который вызывает инактивацию экспрессии последовательности эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, или приводит к сниженному уровню экспрессии последовательности эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, слиянием последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, со слабым или индуцибельным промотором.
2. Клетка-хозяин Bordetella pertussis, Bordetella bronchiseptica или Bordetella parapertussis для применения для профилактики или лечения коклюша, имеющая сниженную активность эндогенной гликозилтрансферазы с по меньшей мере 98% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 по сравнению с активностью гликозилтрансферазы соответствующего родительского штамма, где сниженная активность достигается применением инактивирующего вектора, который вызывает инактивацию экспрессии последовательности эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, или приводит к сниженному уровню экспрессии последовательности эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, слиянием последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, со слабым или индуцибельным промотором.
3. Клетка-хозяин по п.1 или п.2, где инактивирующий вектор, который вызывает инактивацию экспрессии последовательности эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, представляет собой суицидный вектор.
4. Препарат для применения в качестве адъюванта, состоящий из LPS, полученного из клетки-хозяина по п.1, где препарат состоит из LPS с увеличенной заменой гексозамином 1' или 4' фосфатных групп части LPS, относящейся к липиду А, по сравнению с препаратом LPS из соответствующего родительского штамма, и посредством чего LPS характеризуется получением по меньшей мере 8 ионов в ESI-MS спектре.
5. Препарат для применения в качестве лекарственного средства для профилактики или лечения коклюша, состоящий из LPS, полученного из клетки-хозяина по п.2, где препарат состоит из LPS с увеличенной заменой гексозамином 1' или 4' фосфатных групп части LPS, относящейся к липиду А, по сравнению с препаратом LPS из соответствующего родительского штамма, и посредством чего LPS характеризуется получением по меньшей мере 8 ионов в ESI-MS спектре.
6. Фармацевтическая композиция для применения в качестве адъюванта, содержащая клетку-хозяина по п.1 или препарат по п.4 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.
7. Фармацевтическая композиция для применения в качестве вакцины для профилактики и/или лечения инфекции Bordetella, содержащая клетку-хозяина по п.1 или препарат по п.4 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель и дополнительно содержащая антиген в эффективном количестве.
8. Фармацевтическая композиция для применения в качестве вакцины для профилактики и/или лечения инфекции Bordetella, содержащая клетку-хозяина по п.2 или препарат по п.5 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.
9. Применение клетки-хозяина по п.2 или препарата по п.5 для получения лекарственного средства для профилактики и/или лечения коклюша.
10. Применение клетки-хозяина по п.1 или препарата по п.4 для получения лекарственного средства для иммунизации млекопитающего, где клетка-хозяин или LPS используются в качестве адъюванта.
11. Применение по п.10, где клетку-хозяина или препарат применяют в сочетании с антигеном.
12. Применение по п.11, где адъювант дополнительно объединен с антигеном для получения лекарственного средства для вызывания иммунного ответа на антиген.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP07104885 | 2007-03-26 | ||
EP07104885.4 | 2007-03-26 | ||
PCT/NL2008/050169 WO2008118015A2 (en) | 2007-03-26 | 2008-03-25 | Improved vaccines against bordetella pertussis based on lps glycosyltransferase mutants |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2009139262A RU2009139262A (ru) | 2011-05-10 |
RU2542667C2 true RU2542667C2 (ru) | 2015-02-20 |
Family
ID=38134330
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2009139262/10A RU2542667C2 (ru) | 2007-03-26 | 2008-03-25 | УЛУЧШЕННЫЕ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ Bordetella pertussis НА ОСНОВЕ МУТАНТНЫХ ГЛИКОЗИЛТРАНСФЕРАЗ LPS |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9296995B2 (ru) |
EP (1) | EP2134743B1 (ru) |
JP (1) | JP5683260B2 (ru) |
KR (1) | KR101667551B1 (ru) |
CN (1) | CN101801997B (ru) |
AU (1) | AU2008230238B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0809321A2 (ru) |
CA (1) | CA2681924C (ru) |
ES (1) | ES2393682T3 (ru) |
IL (1) | IL201241A (ru) |
MX (1) | MX2009010347A (ru) |
NZ (1) | NZ579940A (ru) |
PL (1) | PL2134743T3 (ru) |
PT (1) | PT2134743E (ru) |
RU (1) | RU2542667C2 (ru) |
SI (1) | SI2134743T1 (ru) |
WO (1) | WO2008118015A2 (ru) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11078257B2 (en) | 2016-07-29 | 2021-08-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Recombinant gram negative bacteria and methods of generating and utilizing same |
CN110461865A (zh) * | 2017-03-13 | 2019-11-15 | 由卫生福利和体育大臣代表的荷兰王国 | 包含具有降低的反应原性的lps的博德特氏菌疫苗 |
US10398094B2 (en) * | 2017-05-16 | 2019-09-03 | Martin W. Taylor | Impermeable sectional apparatus for soil moisture retention |
CN110373438B (zh) * | 2019-07-31 | 2021-05-04 | 江南大学 | 一种提高γ-氨基丁酸产量的方法 |
CN117947054B (zh) * | 2024-03-25 | 2024-06-21 | 上海羽冠生物技术有限公司 | 一种百日咳鲍特菌无缝基因编辑的方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2258739C2 (ru) * | 1998-02-27 | 2005-08-20 | Новозимс А/С | ВАРИАНТ МАЛЬТОГЕННОЙ α-АМИЛАЗЫ |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU762369B2 (en) * | 1998-11-03 | 2003-06-26 | De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezonheid En Cultuur | LPS with reduced toxicity from genetically modified gram negative bacteria |
US20040029129A1 (en) * | 2001-10-25 | 2004-02-12 | Liangsu Wang | Identification of essential genes in microorganisms |
JP5378685B2 (ja) | 2004-12-17 | 2013-12-25 | デ スタート デール ネーダーランデン, フェルテヘンウォールディヒィト ドール デ ミニステール ファン フォルクスヘーゾンドハイド, フェルザイン アン スポルト | グラム陰性菌におけるlpsの脱アシル化 |
-
2008
- 2008-03-25 CN CN200880017600.1A patent/CN101801997B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-03-25 SI SI200830829T patent/SI2134743T1/sl unknown
- 2008-03-25 RU RU2009139262/10A patent/RU2542667C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-03-25 NZ NZ579940A patent/NZ579940A/en not_active IP Right Cessation
- 2008-03-25 US US12/593,346 patent/US9296995B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-03-25 WO PCT/NL2008/050169 patent/WO2008118015A2/en active Application Filing
- 2008-03-25 PT PT87239208T patent/PT2134743E/pt unknown
- 2008-03-25 KR KR1020097022125A patent/KR101667551B1/ko active IP Right Grant
- 2008-03-25 BR BRPI0809321-0A patent/BRPI0809321A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2008-03-25 AU AU2008230238A patent/AU2008230238B2/en not_active Ceased
- 2008-03-25 EP EP08723920A patent/EP2134743B1/en not_active Not-in-force
- 2008-03-25 MX MX2009010347A patent/MX2009010347A/es active IP Right Grant
- 2008-03-25 CA CA2681924A patent/CA2681924C/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-03-25 ES ES08723920T patent/ES2393682T3/es active Active
- 2008-03-25 PL PL08723920T patent/PL2134743T3/pl unknown
- 2008-03-25 JP JP2010500860A patent/JP5683260B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-09-29 IL IL201241A patent/IL201241A/en active IP Right Grant
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2258739C2 (ru) * | 1998-02-27 | 2005-08-20 | Новозимс А/С | ВАРИАНТ МАЛЬТОГЕННОЙ α-АМИЛАЗЫ |
Non-Patent Citations (1)
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL201241A (en) | 2015-02-26 |
CA2681924C (en) | 2019-12-31 |
KR20100015812A (ko) | 2010-02-12 |
CN101801997B (zh) | 2016-06-01 |
CA2681924A1 (en) | 2008-10-02 |
SI2134743T1 (sl) | 2013-01-31 |
EP2134743A2 (en) | 2009-12-23 |
US20100291153A1 (en) | 2010-11-18 |
MX2009010347A (es) | 2009-12-10 |
CN101801997A (zh) | 2010-08-11 |
NZ579940A (en) | 2012-03-30 |
BRPI0809321A2 (pt) | 2014-09-23 |
WO2008118015A3 (en) | 2009-06-25 |
RU2009139262A (ru) | 2011-05-10 |
ES2393682T3 (es) | 2012-12-27 |
KR101667551B1 (ko) | 2016-10-19 |
IL201241A0 (en) | 2010-05-31 |
EP2134743B1 (en) | 2012-09-05 |
AU2008230238B2 (en) | 2013-06-06 |
PL2134743T3 (pl) | 2013-01-31 |
AU2008230238A1 (en) | 2008-10-02 |
WO2008118015A2 (en) | 2008-10-02 |
PT2134743E (pt) | 2012-12-21 |
JP5683260B2 (ja) | 2015-03-11 |
JP2010522557A (ja) | 2010-07-08 |
US9296995B2 (en) | 2016-03-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2652416T3 (es) | Métodos y sistemas para la O-glicosilación de proteínas | |
US9764021B2 (en) | Methods of using Salmonella enterica presenting C. jejuni N-glycan or derivatives thereof | |
RU2542667C2 (ru) | УЛУЧШЕННЫЕ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ Bordetella pertussis НА ОСНОВЕ МУТАНТНЫХ ГЛИКОЗИЛТРАНСФЕРАЗ LPS | |
WO2001025254A2 (en) | Novel adjuvant comprising a lipopolysaccharide antagonist | |
KR20190128056A (ko) | 감소된 반응원성을 갖는 lps 함유 보르데텔라 백신 | |
Geurtsen et al. | Identification of a novel lipopolysaccharide core biosynthesis gene cluster in Bordetella pertussis, and influence of core structure and lipid A glucosamine substitution on endotoxic activity | |
EP1747262B1 (en) | Conserved inner core lipopolysaccharide epitopes as multi-species vaccine candidates | |
AU2003239125A1 (en) | Neisseria mutants, lipooligosaccharides and immunogenic compositions | |
JP2022536703A (ja) | ラムノース-多糖 | |
Geurtsen et al. | Gene cluster involved in lipopolysaccharide-core biosynthesis and identification of a novel lipid A modification in Bordetella | |
JP2022541911A (ja) | バイオコンジュゲートグリコシル化の定量化 | |
Chen | Glycoengineered vesicle vaccines against bacterial pathogens | |
TW202304504A (zh) | 大腸桿菌o18生物軛合物之生產 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200326 |