KR20100015812A - Ｌｐｓ 글리코실트랜스퍼레이즈 돌연변이에 기초한 보르데텔라 페르투시스에 대한 개선된 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 변형된 LPS 분자를 갖는 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)의 돌연변이 또는 이로부터 획득가능한 LPS 분자가 사용되는 백일해에 대한 향상된 백신에 관한 것이다. 이러한 돌연변이 또는 이로부터 획득가능한 LPS 분자는 또한 보조제로서 사용될 수 있다.

백일해, 보르데텔라 페르투시스, LPS, 돌연변이, 백신

Description

ＬＰＳ 글리코실트랜스퍼레이즈 돌연변이에 기초한 보르데텔라 페르투시스에 대한 개선된 백신{Improved vaccines against Bordetella pertussis based on LPS glycosyltransferase mutants}

본 발명은 변형된 LPS 분자를 갖는 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)의 돌연변이 및/또는 이러한 돌연변이로부터 획득가능한 LPS 분자를 포함하는 백일해에 대한 개선된 백신에 관한 것이다. 이러한 돌연변이 및/또는 상기 획득가능한 LPS 분자는 또한 보조제로서 사용될 수 있다.

LPS는 그람 음성 박테리아의 외막의 외부 리플릿에 위치하는 양친매성 분자이다. LPS는 내독소 활성 및 보조제 활성 모두를 갖는다. 두 특성 모두 숙주 TLR4/MD-2 리셉터 복합체에 의한 인지에 기초한다(리뷰 Palsson-McDermott and O'Neill, 2004; O'Neill, 2006). LPS는 3개의 다른 구조 도메인, 리피드 A, 코어 및 O-항원으로 구성된다. 리피드 A는 소수성 막 앵커로서 작용하며 분자의 생활성 성분을 형성한다(Takada and Kotani, 1989). 복합체 올리고당으로 구성된 코어 리전은 O-항원에 비해 단지 제한된 구조 변이성을 나타낸다. 예를 들어, 엔테로박테 리아시아에(Enterobacteriaceae)와 같은 일부 박테리아에서 코어 올리고당(코어 OS)는 내부 코어 및 외부 코어로 나뉠 수 있다. 외부 코어는 주로 예를 들어, D-글루코즈, D-갈락토즈 및 D-글루코사민과 같은 피라노시딕 헥소스로 구성되며, 내부 코어는 주로 옥툴로소닉산 및 헵토피라노즈로 구성된다. 대다수의 그람 음성 박테리아에서, 코어 도메인은 특정 탄수화물, 2-케토-3-데옥시옥툴로소닉산(Kdo)에 의해 리피드 A 도메인에 연결된다(Raetz and Whitfield, 2002). O-항원은 LPA의 가장 가변적인 부분을 포함하며, 박테리아 혈청형 특이성을 제공한다. 1-8 당의 반복 당 서브유니트로 구성된다. 각 O-사슬은 이러한 서브유니트를 최대 50까지 함유할 수 있다. 상기 O-항원은 박테리아 면역 도피에 연루되며, 특히 혈청 보체-매개 라이시스의 도피에 연루된다(Raetz and Whitfield, 2002).

보르데텔라 브론치셉티카(Bordetella bronchiseptica) 및 보르데텔라 파라페르투시스(Bordetella parapertussis)의 LPS와 대조적으로, 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)의 LPS는 O-항원 도메인을 결코 함유하지 않는다(Peppler, 1984; Di Fabio et al., 1992). 따라서, B. 페르투시스 LPS는 종종 리포올리고당으로 칭하여진다. B. 페르투시스는 두가지 주요 LPS 형태, 밴드 A 및 밴드 B LPS를 생성한다(Peppler, 1984). 밴드 B LPS는 리피드 A 및 9 탄수화물로 구성된 코어 올리고당으로 구성된다(Caroff et al., 2000). 밴드 B LPS에 N-아세틸 글루코사민, 2,3-디아세트아미도-2,3-디데옥시-만누로닉산 및 2-아세트아미도-4-N-메틸-2,4-디데오시-퓨코즈로 구성된 말단 삼당류의 첨가는 밴드 A로 칭하여지는 LPS를 형성한다.

에스케리챠 콜라이(Escherichia coli) 및 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 혈청형 티피무리움에서, 코어 OS 생합성 유전자 클러스터는 gmhD, waaQ 및 WaaA 오페론으로 명명된 3개의 오페론으로 구성된다. gmhD 오페론은 4개의 유전자 gmhD 및 waaFCL로 구성되며, 이는 내부 코어의 합성에 관련된다(Schnaitman and Klena, 1993). gmhD, waaF, 및 waaC 유전자는 헵토스 I 및 II의 생합성 및 Kdo2-리피드 A로의 수송에 관련된 단백질을 코딩하며(Schnaitman and Klena, 1993), waaL 유전자 산물은 O-항원의 결합에 관련된 라이게이즈이다(MacLachlan et al., 1991). waaQ 오페론은 상기 3개의 오페론중에서 가장 크며 외부 코어의 생합성 및 코어 OS의 변형/데코레이션에 관련된 단백질을 코딩한다. waaQ 오페론내에 존재하는 유전자의 수와 타입은 스트레인마다 다르며, 이는 코어 구성의 스트레인-특이적 차이를 설명한다(Heinrichs et al., 1998). waaA 오페론은 종종 단지 하나의 단백질, KdtA를 코딩한다. 이. 콜라이(E. coli)에서만 추가의 논 LPS-관련 오픈 리딩 프래임(ORF)이 존재한다(Raetz and Whitfield, 2002). 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae)는 Kdo2-리피드 A 생합성시 두 Kdo 잔기를 부가하는 이작용성 Kdo 트랜스퍼레이즈를 코딩한다(Clementz and Raetz, 1991).

보르데텔라 및 이. 콜라이 코아 OS는 일부 유사점을 보이나, 잔기의 정확한 구성 및 형태는 현저한 차이를 나타낸다. 예를 들어, 보르데텔라 코어 OS는 이. 콜라이를 포함하는 대부분의 다른 그람 음성 박테리아에서 발견되는 2 또는 3개의 잔기 대신에 단지 하나의 Kdo 잔기를 함유한다. 최근에, 이는 이작용성 Kdo 트랜스퍼레이즈 보다는 단일작용성 Kdo 트랜스퍼레이즈로서 보르데텔라 KdtA의 기능에 기인 하는 것으로 나타났다(Isobe et al., 1999). 보르데텔라 코어 OS의 나머지 부분의 합성에 관여하는 효소는 현재 알려지지 않았으며 추가 확인중이다.

리피드 A 부분은 일반적으로 TLR4/MD-2 리셉터 복합체의 활성화를 통한 LPS의 생물학적 활성에 대한 주요 결정소로서 보여지나, 올리고당 리전은 또한 항원-제시 세포(APCs)와의 상호작용에 중요한 역할을 할 수 있다. 이러한 타입의 LPS 인지에 관련된 리셉터는 컴플리먼트 리셉터 CR3 및 스캐빈저 리셉터 SR-A를 포함한다(van Amersfoort et al., 2003; Pluddemann et al., 2006).

여러 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 백신이 이미 사용되었다. 1940년대 및 1950년대에 전세포 백일해(wP) 백신의 도입, 및 이후에 1980년대 및 1990년대에 무세포 백일해(aP) 백신의 도입은 백일해 발생의 점진적 감소를 이끌었으며, 그리고 질병의 감소된 이병률 및 사망률을 저수준으로 감소시켰다. 고백신 적용범위에도 불구하고, 백일해 질병은 풍토성을 유지하였으며, 매 2-5년마다 발생이 피크에 이르는 순환 패턴을 나타내는 것이 유지되었다. 지난 20년동안, 네덜란드를 포함하는 여러 국가는 보고된 백일해 케이스의 수가 증가되었다. 흥미롭게도, 일부 경우에 나이 분포에 있어 변화가 관찰되었다. 한편 프리백신 및 초기 백신 시대에서 백일해 케이스는 주로 어린 아이들에서 보고되었으며, 성인 및 청년은 최근에 있어 케이스의 비율이 증가되었다. 보고된 백일해의 재현에 대한 여러 이유가 다음과 같이 제시되었다: (1) 백신 효과를 감소시키는 순환 B. 페르투시스 스트레인의 유전적 변화, (2) 백일해 백신의 감소된 효과, (3) 면역성 감퇴, (4) 백일해 케이스의 증가된 보고, 및 (5) 백일해 질병의 개선된 진단.

따라서, 현존하는 보르데텔라 페르투시스 백신의 모든 결점을 나타내지 않는 보르데텔라 페르투시스에 대한 새로운 백신이 여전히 요구된다.

본 발명은 변환된 올리고당 사슬을 갖는 B. 페르투시스 돌연변이가 수지상 세포(DCs)와의 상호작용에 영향을 줄 수 있다는 가정에 기초한다. DCs와 같은 항원 제시 세포(APCs)에 대한 특이적 표적화는 생각할 수 있는 바로는 전-세포 백일해 백신에 대한 면역 반응의 결과에 영향을 줄 수 있다. 이러한 경로에 의한 전-세포 백신의 개선을 위한 제1 단계로서, 본 발명자들은 B. 페르투시스에서 LPS 올리고당 생합성에 관련되는 유전자 클러스터를 확인하였다. 특히 이러한 클러스터내에 있는 두 유전자는 불활성화되거나 과발현되는 경우에 DC와 상호작용하고 활성화시키는 개선된 효능을 갖는 돌연변이를 제공한다.

폴리펩타이드

제 1 견지로, 본 발명은 두 폴리펩타이드를 제공한다.

제 1 펩타이드는 폴리사카라이드 디아세틸라아제이며, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

제 2 폴리펩타이드는 글리코실트랜스퍼레이즈이며, SEQ ID NO:2의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

상기 글리코실트랜스퍼레이즈 폴리펩타이드의 각각의 폴리사카라이드 디아세틸라아제의 활성은 바람직하게, 이하 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 스트레인에서 각기 코딩된 유전자를 각각 불활성화시키는 과발현 및 획득가능한 LPS의 분석에 의해 평가된다. 형질변형된 보르데텔라 페르투시스 스트레인에 의해 생성된 LPS가 이하 본 명세서에서 정의된 바와 같이 적어도 검출가능한 양의 본 발명의 LPS를 포함하는 경우, 상기 글리코실트랜스퍼레이즈 폴리펩타이드의 각각의 폴리사카라이드 디아세틸라아제는 활성적이며 작용적인 것으로 볼 수 있다. 검출가능한 양의 LPS는 바람직하게 본 실시예에 기술된 바와 같이, 핫 페놀/물 추출을 이용한 분리후(Westphal and Jann, 1965), 마일드 가수분해에 의한 O-디아실화(Holst 2000) 및 음성 이온-모드로 ESI-MS(Electrospray-ionization Mass spectrometry)에 의한 분석을 통해 검출가능하다.

보다 바람직한 구현으로, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 92%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 가장 바람직한 구현으로, 상기 폴리사카라이드 디아세틸라아제는 SEQ ID NO:1을 갖는다. 이러한 폴리사카라이드 디아세틸라아제는 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)로부터 기원한다. SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:3에 주어진다.

다른 보다 바람직한 구현에 따르면, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 92%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 바람직한 구현으로, 상기 글리코실트랜스퍼레이즈는 SEQ ID NO:2를 갖는다. 이러한 글리코실트랜스퍼레이즈는 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)로부터 기원한다. SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:4에 주어진다.

동일성 퍼센트는 정렬된 서열 사이에 일치하는 아미노산 잔기의 수를 정렬된 서열의 길이에서 모든 갭의 길이를 뺀 수로 나눈 것으로 계산된다. 다중 서열 정렬은 DNAman 4.0 Optimal Alignment 프로그램을 이용하여 디폴트 설정으로 수행되었다. 정렬은 일반적으로 이들의 SEQ ID NO 또는 이의 일부에 의해 확인되는 서열들 사이에 수행된다. 바람직하게, 정렬은 이들의 SEQ ID NO에 의해 확인되는 서열을 이용하여 수행된다.

숙련자는 본 발명의 폴리펩타이드는 필수적인 활성 및 동일성을 갖는 한 보르데텔라 페르투시스와 다른 유기체로부터 획득될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 바람직한 구현으로, 상기 일치되는 각 폴리펩타이드는 페르투시스(pertussis), 브론티셉티카(bronchiseptica), 파라페르투시스(parapertussis)와 같은 보르데텔라 종으로부터 획득된다. 가장 바람직하게, 상기 일치되는 각 폴리펩타이드는 보르데텔라 페르투시스 스트레인으로부터 획득된다. 하나의 단일 보르데텔라 페르투시스 스트레인 또는 여러 다른 보르데텔라 페르투시스 스트레인은 본 발명에 따른 여러 동족체 폴리펩타이드를 가질 수 있다.

다른 바람직한 구현에 따르면, 본 발명의 폴리펩타이드는 앞서 정의된 바와 같은 폴리펩타이드 서열중 어느 하나의 변이체이다. 변이체 폴리펩타이드는 상기 폴리펩타이드의 비자연적으로 발생하는 형태일 수 있다. 폴리펩타이드 변이체는 이의 본래 공급원으로부터 분리된 폴리펩타이드에서 일부 합성적인 방식에서 다를 수 있다. 변이체는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3인 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열, 또는 SEQ ID NO:4인 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열로부터 출발하는 사이트-다이렉티드 돌연변이 유발에 의해 형성될 수 있다. 바람직하게, 상기 폴리펩타이드 변이체는 암호화된 폴리펩타이드의 생물학적 기능을 변화시키지 않는 돌연변이를 함유한다. 상기 폴리사카라이드 디아세틸라아제 또는 글리코실트랜스퍼레이즈의 생물학적 기능 또는 활성은 이미 본 명세서에 정의되어 있다.

본 발명의 다른 견지로, 앞서 정의된 바와 같은 폴리사카라이드 디아세틸라아제, 글리코실트랜스퍼레이즈 각각을 모두 의약 제조용으로 사용하는 용도가 제공된다. 바람직하게 상기 의약은 이하 본 명세서에 정의된 바와 같은 백신 또는 보조제이다.

핵산 서열

본 발명의 제 2 견지로, 두 핵산 서열이 제공된다.

제 1 서열은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 바람직하게 아미노산 서열 SEQ ID NO:1을 갖는 폴리사카라이드 디아세틸라아제를 코딩하며, 그리고/또는 보르데텔라 종, 바람직하게 보르데텔라 페르투시스로부터 기원한다.

제 1 핵산 서열은 바람직하게 SEQ ID NO:3의 핵산 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는 핵산 서열이다. 바람직하게, 동일성은 적어도 55%, 보다 바람직하게 적어도 60%, 보다 바람직하게 적어도 65%, 보다 바람직하게 적어도 70%, 보다 바람직하게 적어도 75%, 보다 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 보다 바람직하게 적어도 98%, 그리고 보다 바람직하게 적어도 99%이다. 가장 바람직하게, 상기 핵산 서열은 SEQ ID NO:3의 핵산 서열을 갖는다. SEQ ID NO:3는 NP_8809668에 상응한다.

제 2 핵산 서열은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 바람직하게 아미노산 서열 SEQ ID NO:2를 갖는 글리코실트랜스퍼레이즈를 코딩하며, 그리고/또는 보르데텔라 종, 바람직하게 보르데텔라 페르투시스로부터 기원한다.

제 2 핵산 서열은 바람직하게 SEQ ID NO:4의 핵산 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는 핵산 서열이다. 바람직하게, 동일성은 적어도 55%, 보다 바람직하게 적어도 60%, 보다 바람직하게 적어도 65%, 보다 바람직하게 적어도 70%, 보다 바람직하게 적어도 75%, 보다 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 보다 바람직하게 적어도 98%, 그리고 보다 바람직하게 적어도 99%이다. 가장 바람직하게, 상기 핵산 서열은 SEQ ID NO:4의 핵산 서열을 갖는다. SEQ ID NO:4는 NP_8809669에 상응한다.

동일성 퍼센트는 서열내 일치하는 뉴클레오타이드의 수를 총 뉴클레오타이드의 길이에서 어느 갭의 길이를 뺀 수로 나눈 비율을 계산하여 측정된다. DNA 다중 서열 정렬은 DNAman version 4.0으로 Optimal Alignment(Full Alignment) 프로그램을 이용하여 수행되었다. 50%이상의 동일성 수준을 나타내는 관련된 DNA 서열의 최소 길이는 40뉴클레오타이드이상이어야 한다. 정렬은 일반적으로 이들의 SEQ ID NO 또는 이의 일부에 의해 확인되는 서열들 사이에 수행된다. 바람직하게, 정렬은 이들의 SEQ ID NO에 의해 확인되는 서열을 이용하여 수행된다.

다른 바람직한 구현에 따르면, 본 발명의 핵산 서열은 상기 정의된 바와 같은 어느 핵산 서열의 변이체이다. 핵산 서열 변이체는 앞서 정의된 바와 같은 폴리펩타이드 변이체를 제조하는데 사용될 수 있다. 핵산 변이체는 상기 정의한 바와 같은 어느 핵산 서열의 프레그먼트일 수 있다. 핵산 변이체는 또한 유전 코드의 퇴화에 의해 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4와 다른 핵산 서열일 수 있다. 핵산 변이체는 또한 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4의 대립 변이체일 수 있다. 대립 변이체는 동일한 염색체 위치를 차지하는 유전자의 어느 둘 이상의 대체 형태를 나타낸다. 바람직한 핵산 변이체는 잠재성 돌연변이(silent mutation)들을 함유하는 핵산 서열이다. 택일적으로 또는 조합으로, 핵산 변이체는 또한 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩타이드의 다른 아미노산 서열을 일으키지 않으나, 본 발명의 폴리펩타이드의 제조로 의도된 숙주 유기체의 코돈 사용에 상응하는 뉴클레오타이드 치환의 도입에 의해 획득될 수 있다. 바람직한 구현에 따라, 상기 핵산 변이체는 본 명세서에 앞서 정의된 바와 같은 이의 생물학적 기능을 여전히 나타내는 폴리펩타이드를 암호한다. 보다 바람직하게, 상기 핵산 서열 변이체는 각각 폴리사카라이드 디아세틸라아제 또는 글리코실트랜스퍼레이즈 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 암호한다. 이러한 폴리펩타이드를 암호하는 핵산 서열은 어느 미생물로부터 분리될 수 있다.

이러한 모든 변이체는 핵산 서열 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4 또는 프로브를 디자인하는데 사용될 수 있는 이의 변이체에 대한 로 투 미디엄 투 하이 스트링전시 조건하에서 하이브리드화(서던 블롯팅 공정)에 의한 라이브러리의 스크리닝과 같이 숙련자에게 알려진 기술을 이용하여 획득될 수 있다. 로 투 미디엄 투 하이 스트링전시 조건은 각각, 로 투 미디엄 투 하이 스트링전시에 대해 5X SSPE, 0.3% SDS, 200pg/ml 전단 및 변성된 연어 정액 DNA 및 25%, 35% 또는 50% 포름아마이드에서 42℃에서의 프리하이브리드 및 하이브리드를 의미한다. 후속적으로, 하이브리드 반응은 로 투 미디엄 투 하이 스트링전시에 대해 2XSSC, 0.2%SDS 및 55℃, 65℃, 또는 75℃로 각 30분동안 3회 세척된다.

본 명세서에 제공되는 서열 정보는 잘못 확인된 염기의 포함을 요구하는 것과 같이 너무 좁게 해석되어서는 안된다. 숙련자는 이러한 잘못 확인된 염기를 확인할 수 있으며 이러한 오류에 대해 수정하는 방법을 알고 있다.

본 발명의 다른 견지로, 앞서 정의한 바와 같이 두 가지 모두 의약 제조에 사용되는 핵산인 각각의 폴리사카라이드 디아세틸라아제, 글리코실트랜스퍼레이즈를 코딩하는 핵산이 제공된다. 바람직하게 상기 의약은 본 명세서에 이하 정의된 바와 같은 백신 또는 보조제이다.

핵산 구조물

다른 견지로, 본 발명은 상기 단락에서 정의된 어느 핵산 서열을 포함하는 핵산 구조물에 관한 것이며, 상기 핵산 서열은

- 폴리사카라이드 활성을 나타내며, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 또는

- 글리코실트랜스퍼레이즈 활성을 나타내며, SEQ ID NO:2의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는

폴리펩타이드를 암호한다.

임의로, 상기 핵산 구조물내에 존재하는 핵산 서열은 적절한 발현 숙주내에서 상기 폴리펩타이드의 생성을 지시하는 하나 이상의 조절 서열에 실시 가능하게 연결된다.

실시 가능하게 연결된이란 본 명세서에서 조절 서열이 본 발명의 폴리펩타이드의 생성을 지시하도록 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열과 관련된 위치에 적절히 배치되는 형태로 정의된다.

발현은 이에 한정하는 것은 아니나, 전사, 전사후 변형, 번역, 번역후 변형 및 분비를 포함하는 상기 폴리펩타이드의 생성에 포함되는 어느 단계를 포함하는 것으로 이해될 것이다.

핵산 구조물은 자연적으로 발생하는 유전자로부터 분리되거나, 자연에 존재하는 것과 다르지 않은 방식으로 결합되거나 병치되는 핵산의 세그먼트를 함유하도록 변형된 핵산 분자로 정의된다.

조절 서열은 본 명세서에서 폴리펩타이드의 발현에 필요하거나 유리한 모든 성분을 포함하는 것으로 정의된다. 최소한, 상기 조절 서열은 프로모터 및 전사 및 번역 정지 신호를 포함한다.

발현 벡터

본 발명은 또한 앞선 단락에서 정의한 바와 같이 폴리사카라이드 디아세틸라아제 활성을 나타내며 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구조물을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 발현 벡터는 적절한 발현 숙주에서 상기 암호화된 폴리펩타이드의 생성을 지시하는 하나 이상의 조절 서열과 실시 가능하게 연결된 상기 핵산 서열을 포함한다. 최소한, 조절 서열은 프로모터 및 전사 및 번역 정지 신호를 포함한다. 상기 발현 벡터는 재조합 발현 벡터로 보여질 수 있다. 상기 발현 벡터는 재조합 DNA 공정에 편리하게 적용될 수 있으며 상기 폴리펩타이드를 암호하는 핵산 서열의 발현을 일으킬 수 있는 어느 벡터(예, 플라즈믹, 바이러스)일 수 있다. 이러한 발현 벡터가 도입되는 숙주의 본질에 따라 그리고 본 발명의 핵산 서열의 기원에 따라, 숙련자는 가장 적합한 발현 벡터 및 조절 서열을 선택하는 방법을 알 것이다. 가장 바람직한 숙주 세포는 숙주 세포라고 표제가 붙여진 단락에 있는 것들이다.

본 발명의 정황상, 숙주 세포내로 도입되는 경우에 발현 벡터는 세포에 발현 벡터에 존재하는 핵산 서열의 증가된 발현 수준 및/또는 발현 벡터에 존재하는 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 증가된 발현 수준 및/또는 발현 벡터에 존재하는 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 증가된 활성 수준을 갖도록 할 것이다. 이러한 정황에서, 증가는 상기 벡터를 포함하지 않는 숙주 세포 및/또는 SEQ ID NO:1과 적어도 50% 동일성을 갖는 내생 폴리펩타이드를 포함하지 않는 숙주 세포와 비교하여 평가된다.

본 발명의 다른 견지로, 앞서 정의한 바와 같은 발현 벡터를 의약 제조용으로서 사용하는 용도가 제공된다. 바람직하게 상기 의약은 본 명세서에 이하 정의된 바와 같은 백신 또는 보조제이다.

불활성화 벡터

본 발명은 또한 앞선 단락에서 정의된 바와 같이 글리코실트랜스퍼레이즈 활성을 나타내며 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구조물을 포함하는 불활성화 벡터에 관한 것이다. 불활성화 벡터는 주어진 숙주에서 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는 핵산 서열의 발현을 낮추거나 불활성화시키도록 디자인된다.

상기 불활성화 벡터는 재조합 발현 벡터로서 보여질 수 있다. 상기 불활성화 벡터는 재조합 DNA 공정에 편리하게 적용될 수 있으며 상기 정의된 바와 같은 핵산 서열의 발현을 불활성화시킬 수 있는 어느 벡터(예, 플라즈믹, 바이러스)일 수 있다. 이러한 불활성화 벡터가 도입되는 숙주의 본질에 따라 그리고 본 발명의 핵산 서열의 기원에 따라, 숙련자는 가장 적합한 불활성화 벡터를 선택하는 방법을 알 것이다. 가장 바람직한 숙주 세포는 숙주 세포라고 표제가 붙여진 단락에 있는 것들이다.

본 발명의 정황상, 숙주 세포내로 도입되는 경우에 불활성화 벡터는 세포에 발현 벡터내에 존재하는 핵산 서열의 감소된(또는 보다 낮아진) 발현 수준, 및/또는 발현 벡터내에 존재하는 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 감소된 발현 수준 및/또는 발현 벡터내에 존재하는 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 감소된 활성 수준을 이끌 것이다. 이러한 정황에서, 감소는 바람직하게 상기 불활성화 벡터를 포함하지 않는 숙주 세포와 비교하여 평가된다.

글리코실트랜스퍼레이즈 활성을 나타내며 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는 폴리펩타이드의 발현 수준의 감소 및/또는 이의 활성 수준의 저하는 숙주에서 상기 글리코실트랜스퍼레이즈를 암호하는 내생 핵산 서열의 발현을 불활성화 또는 하향 조절하는 것 과 같이 당 기술분야에 알려진 통상적인 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 불활성화 또는 하향 조절은 상기 폴리펩타이드를 암호하는 핵산 서열내의 하나 이상의 분자의 결실에 의해 달성될 수 있다. 다른 구현으로, 본 발명은 상기 글리코실트랜스퍼레이즈를 암호하는 핵산 서열내에 돌연변이를 갖는 숙주, 바람직하게는 보르데텔라에 관한 것이다. 글리코실트랜스퍼레이즈를 암호하는 불활성화된 핵산 서열을 갖는 숙주를 제작하기위해, 치환 또는 불활성화 벡터가 제조되며, 후속적으로 형질변형에 의해 숙주내로 도입된다. 숙련자는 이러한 벡터를 제조하는 방법을 알 것이다.

택일적으로 또는 상기 글리코실트랜스퍼레이즈를 암호하는 내생 핵산 서열의 불활성화와 함께, 상기 글리코실트랜스퍼레이즈를 암호하는 핵산 서열의 발현은 선택된 유기체에서 저 수준 단백질 발현에 적절한 약한 프로모터에 이를 융합시킴으로써 저하될 수 있다.

택일적으로 또는 상기 내생 글리코실트랜스퍼레이즈를 암호하는 핵산 서열의 불활성화와 함께, 상기 글리코실트랜스퍼레이즈를 암호하는 핵산 서열의 발현은 선택된 유기체에서 유도성 수준의 단백질 발현에 적절한 유도성 프로모터에 이를 융합시킴으로써 유도성이 제공될 수 있다.

택일적으로 또는 앞서 정의된 바람직한 구현과 함께, 상기 내생 글리코실트랜스퍼레이즈를 암호하는 핵산 서열의 불활성화는 바람직하게 자살 벡터를 이용하여 달성된다. 보다 바람직하게, 상기 자살 벡터는 pSS1129(Stibitz et al, 1994)이다.

본 발명의 다른 견지로, 앞서 정의된 바와 같은 불활성화 벡터를 의약 제조에 사용되는 용도가 제공된다. 바람직하게 상기 의약은 본 명세서에 이하 정의된 바와 같은 백신 또는 보조제이다.

숙주 세포

다른 견지로, 본 발명은 앞선 단락에서 두가지 모두 정의된 바와 같은 본 발명의 발현 벡터 및 본 발명의 불활성화 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포의 선택은 본 발명의 핵산 서열의 공급원에 따라 크게 달라질 것이다. 숙주 세포의 본질에 따라 숙련자는 본 발명의 구조물 또는 벡터로 이를 형질변형시키는 방법을 알 수 있을 것이다.

상기 숙주 세포는 본 발명의 LPS의 발현에 적절한 어느 미생물, 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 바람직한 구현으로, 상기 숙주 세포는 본 명세서에 앞서 언급된 바와 같은 보르데텔라 종이다. 가장 바람직하게, 상기 보르데텔라는 보르데텔라 페르투시스이다.

보르데텔라의 형질변형을 위한 적절한 방법은 숙련자에게 알려진 방법으로 컨쥬게이션을 포함하는 공정을 포함할 수 있다. 보르데텔라에 대한 적절한 형질변형 방법은 Stibitz et al, 1994에 기재되어 있다.

제 1 바람직한 구현에 따르면, 이에 따라 획득되는 숙주 세포는 상기 발현 벡터에 존재하는 핵산 서열의 증가된 발현 수준을 가지며, 그리고/또는 상기 발현 벡터에 존재하는 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 증가된 발현 수준을 가지며, 그리고/또는 상기 발현 벡터에 존재하는 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 증가된 활성 수준을 갖는다. 이러한 구현에서, 발현 구조물내에 존재하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:1과 적어도 50% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩한다. 이러한 정황에서, 증가는 모두 동일한 조건하에서 배양 및/또는 측정될 경우 상기 발현 벡터를 포함하지 않는 숙주 세포 및/또는 SEQ ID NO:1과 적어도 50% 동일성을 갖는 내생 폴리펩타이드를 포함하지 않는 숙주 세포와 비교하여 평가된다.

"폴리펩타이드의 발현 수준 증가"는 본 명세서에서 바람직하게 형질변형된 숙주 세포가

두 타입의 세포(모세포 및 형질변형 세포)가 동일한 조건하에서 배양될 경우 모 숙주 세포가 유도하는 앞서 정의된 바와 같은 폴리펩타이드보다 형질변형 숙주 세포가 유도하는 앞서 정의된 바와 같은 폴리펩타이드가 보다 많이 생성되는 것으로 정의된다. 바람직하게, 본 발명의 숙주 세포는 두 타입의 세포(모세포 및 형질변형 세포)가 동일한 조건하에서 배양될 경우 모 숙주 세포보다 형질변형된 숙주 세포가 이로부터 생성하게되는 SEQ ID NO:1과 적어도 50% 동일성을 갖는 본 발명의 폴리펩타이드를 적어도 3%, 6%, 10% 또는 15% 이상을 생성한다. 또한 모 세포보다 상기 폴리펩타이드를 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 150% 이상 생성하는 숙주가 바람직하다. 다른 바람직한 구현에 따르면, 본 발명의 숙주 세포의 이러한 폴리펩타이드의 생성 수준은 대조구로서 취해진 B213 보르데텔라 페르투시스 스트레인(Kasuga et al, 1953, 참조 표 1)의 생성 수준과 비교할만 하다. 보다 바람직한 구현에 따르면, 본 발명의 숙주 세포가 보르데텔라 페르투시스 스트레인인 경우, 본 발명의 숙주 세포의 폴리펩타이드의 생성 수준은 대조구로 취해진 상기 정의된 바와 같은 B213 스트레인의 생성 수준과 비교할만 하다.

상기 폴리펩타이드의 생성 수준의 평가는 노던 블롯 또는 어레이 분석을 수행함으로써 mRNA 수준에서 수행되거나 그리고/또는 웨스턴 블롯을 수행함으로써 폴리펩타이드 수준에서 수행될 수 있다. 이러한 모든 방법들은 숙련자에게 잘 알려져 있다.

"폴리펩타이드 활성의 증가"는 본 명세서에서 상기 활성에 대한 특정 평가를 이용하여 측정시 모 숙주 세포중 하나보다 형질 변형된 숙주 세포가 이로부터 더 높은 폴리사카라이드 디아세틸라아제 활성을 유도하는 것을 나타내는 것으로 정의된다. 바람직하게, 평가는 폴리펩타이드 단락에서 언급된 것이다. 바람직하게, 본 발명의 숙주 세포는 바람직하게 폴리펩타이드 단락에서 언급된 평가인 상기 활성에 대한 특정 평가를 이용하여 평가시 모 숙주 세포보다 형질변형된 숙주 세포가 이로부터 적어도 3%, 6%, 10% 또는 15% 더 높은 폴리사카라이드 디아세틸라아제 활성을 나타낸다. 모세포보다 상기 활성의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 150% 이상을 나타내는 숙주가 바람직하다. 다른 바람직한 구현에 따르면, 본 발명의 숙주 세포의 폴리사카라이드 디아세틸라아제 활성의 수준은 대조구로 취해진 앞서 정의한 바와 같은 B213 스트레인의 상응하는 활성과 비교할만 하다. 보다 바람직한 구현에 따르면, 본 발명의 숙주 세포가 보르데텔라 페르투시스 스트레인인 경우, 본 발명의 숙주 세포의 폴리사카라이드 디아세틸라아제 활성의 수준은 대조구로 취해진 앞서 정의한 바와 같은 B213 스트레인의 상응하는 활성과 비교할만 하다.

폴리펩타이드 발현 및/또는 활성의 증가는 상기 폴리사카라이드 디아세틸라아제를 암호하는 핵산의 보다 많은 카피를 자연적으로 존재하는 것보다 운반체상에 또는 염색체상에 숙주내로 도입하는 것과 같이 당 기술분야에 알려진 통상적인 방법에 의해 달성될 수 있다. 택일적으로, 상기 폴리사카라이드 디아세틸라아제를 암호하는 핵산 서열은 선택된 유기체에서 고 수준 단백질 발현에 적절한 고발현 또는 강력 프로모터에 이를 융합시킴으로써 또는 이러한 두 방식의 조합에 의해 과발현될 수 있다. 숙련자는 강력 프로모터는 숙주 세포의 본질에 따라 가장 적절한 것을 알 수 있을 것이다. 바람직하게 상기 숙주 세포가 보르데텔라 페르투시스 스트레인인 경우, 강력 프로모터는 벡터 pMMB67EH의 tac-프로모터이다(Methods for General and Molecular Bacteriology, Editors P. Gerhardt et al., American Society for Microbiology, Washington DC, 1994, p.409-410).

택일적으로 또는 제 1 바람직한 구현과 함께, 본 발명은 바람직하게 본 명세서에 앞서 정의된 바와 같은 본 발명의 불활성화 벡터의 사용을 통해 숙주 세포가 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호하는 핵산 서열의 감소된 발현 수준을 가지며 그리고/또는 상기 폴리펩타이드의 감소된 발현 수준을 가지며 그리고/또는 상기 폴리펩타이드의 증가된 활성을 갖는 제 2 바람직한 구현을 제공한다. 이러한 구현에서, 상기 불활성화 벡터에 존재하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:2와 적어도 50% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩한다. 이러한 정황에서, 감소는 모두 동일한 조건하에서 배양 및/또는 평가되는 경우 상기 불활성화 벡터를 포함하지 않는 숙주 세포와 비교함으로써 평가된다.

"폴리펩타이드의 발현 수준 감소"는 바람직하게 양쪽 타입의 세포(모세포 및 형질변형 세포)가 동일한 조건하에서 배양되는 경우에, 이로부터 생성하게될 앞서 정의한 바와 같은 폴리펩타이드를 모 숙주 세포보다 형질변형 숙주 세포가 덜 생성하는 것으로 정의된다. 바람직하게, 본 발명의 숙주 세포는 양쪽 타입의 세포(모세포 및 형질변형 세포)가 동일한 조건하에서 배양되는 경우에, 이로부터 생성하게될 SEQ ID NO:2와 적어도 50% 동일성을 갖는 본 발명의 폴리펩타이드를 모 숙주 세포보다 적어도 3%, 6%, 10% 또는 15% 덜 생성한다. 또한, 모 숙주 세포보다 상기 폴리펩타이드를 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 150% 덜 생성하는 숙주가 바람직하다. 다른 바람직한 구현에 따르면, 본 발명의 숙주 세포의 이러한 폴리펩타이드의 생성 수준은 대조구로서 취해진 앞서 정의한 바와 같은 B213 스트레인의 생성 수준과 비교할 만 하다. 보다 바람직한 구현에 따르면, 본 발명의 숙주 세포가 보르데텔라 페르투시스 스트레인인 경우, 본 발명의 숙주 세포의 폴리펩타이드의 생성 수준은 대조구로서 취해진 앞서 정의한 바와 같은 B213 스트레인의 생성 수준과 비교할 만 하다.

상기 폴리펩타이드의 생성 수준의 평가는 노던 블롯 또는 어레이 분석을 수행함으로써 mRNA 수준에서 수행되거나 그리고/또는 웨스턴 블롯을 수행함으로써 폴리펩타이드 수준에서 수행될 수 있다. 이러한 모든 방법들은 숙련자에게 잘 알려져 있다.

"폴리펩타이드 활성의 감소"는 본 명세서에서 상기 활성에 대한 특정 평가를 이용하여 측정시 모 숙주 세포중 하나보다 형질 변형된 숙주 세포가 이로부터 더 낮은 글리코실트랜스퍼레이즈 활성을 나타내는 것으로 정의된다. 바람직하게, 평가는 폴리펩타이드 단락에서 언급된 것이다. 바람직하게, 본 발명의 숙주 세포는 바람직하게 폴리펩타이드 단락에서 언급된 평가인 상기 활성에 대한 특정 평가를 이용하여 평가시 모 숙주 세포보다 형질변형된 숙주 세포가 이로부터 적어도 3%, 6%, 10% 또는 15% 더 낮은 글리코실트랜스퍼레이즈 활성을 나타낸다. 모 세포보다 상기 활성의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 150% 이하를 나타내는 숙주가 바람직하다. 다른 바람직한 구현에 따르면, 본 발명의 숙주 세포의 글리코실트랜스퍼레이즈 활성의 수준은 대조구로 취해진 앞서 정의한 바와 같은 B213 스트레인의 상응하는 활성과 비교할만 하다. 보다 바람직한 구현에 따르면, 본 발명의 숙주 세포가 보르데텔라 페르투시스 스트레인인 경우, 본 발명의 숙주 세포의 폴리사카라이드 디아세틸라아제 활성의 수준은 대조구로 취해진 앞서 정의한 바와 같은 B213 스트레인의 상응하는 활성과 비교할만 하다.

폴리펩타이드 발현 및/또는 활성의 감소는 상기 폴리사카라이드 디아세틸라아제를 암호하는 핵산의 보다 많은 카피를 자연적으로 존재하는 것보다 운반체상에 또는 염색체상에 숙주내로 도입하는 것과 같이 당 기술분야에 알려진 통상적인 방법에 의해 달성될 수 있다. 택일적으로, 상기 폴리사카라이드 디아세틸라아제를 암호하는 핵산 서열은 선택된 유기체에서 고 수준 단백질 발현에 적절한 고발현 또는 강력 프로모터에 이를 융합시킴으로써 또는 이러한 두 방식의 조합에 의해 과발현될 수 있다. 숙련자는 강력 프로모터는 숙주 세포의 본질에 따라 가장 적절한 것을 알 수 있을 것이다. 바람직하게 상기 숙주 세포가 보르데텔라 페르투시스 스트레인인 경우, 강력 프로모터는 벡터 앞서 정의한 바와 같은 벡터 pMMB67EH의 tac-프로모터이다.

보다 바람직한 구현에 따르면, 상기 숙주 세포는 어느 검출가능한 양의 본 발명의 글리코실트랜스퍼레이즈를 생성하지 않으며 그리고/또는 어느 검출가능한 글리코실트랜스퍼레이즈 활성을 나타내지 않는다. 바람직하게, 상기 숙주 세포는 글리코실트랜스퍼레이즈를 생성하지 않거나 실질적으로 생성하지 않는다.

택일적으로, 보다 바람직한 구현에 따르면, 상기 숙주 세포는 유도가능한 양의 본 발명의 글리코실트랜스퍼레이즈를 생성하거나 그리고/또는 유도가능한 글리코실트랜스퍼레이즈 활성을 나타낸다.

본 발명의 글리코실트랜스퍼레이즈의 발현 수준의 감소 및/또는 이의 활성 수준의 감소는 숙주의 상기 내생성 글리코실트랜스퍼레이즈를 암호하는 핵산 서열을 불활성화 또는 하향 조절하는 것과 같이 당 기술분야에 알려진 통상적인 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 불활성화 또는 하향 조절은 암호 유전자에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실에 의해 달성될 수 있다. 다른 구현으로, 본 발명은 상기 글리코실트랜스퍼레이즈를 암호하는 핵산 서열내에 돌연변이를 갖는 숙주, 바람직하게는 보르데텔라 페르투시스에 관한 것이다. 글리코실트랜스퍼레이즈를 암호하는 불활성화된 핵산 서열을 갖는 숙주를 제작하기위해, 치환 또는 불활성화 벡터가 제조되며, 후속적으로 형질변형에 의해 숙주내로 도입된다. 숙련자는 이러한 벡터를 제조하는 방법을 알 것이다.

택일적으로 또는 상기 글리코실트랜스퍼레이즈를 암호하는 내생 핵산 서열의 불활성화와 함께, 상기 글리코실트랜스퍼레이즈를 암호하는 핵산 서열의 발현은 선택된 유기체에서 저 수준 단백질 발현에 적절한 약한 프로모터에 이를 융합시킴으로써 저하될 수 있다.

택일적으로 또는 상기 내생 핵산 서열의 불활성화와 함께, 상기 글리코실트랜스퍼레이즈를 암호하는 핵산 서열의 발현은 선택된 유기체에서 유도성 수준의 단백질 발현에 적절한 유도성 프로모터에 이를 융합시킴으로써 유도성이 제공될 수 있다. 바람직하게 상기 숙주 세포가 보르데텔라 페르투시스 스트레인인 경우에, 유도성 프로모터는 앞서 정의한 바와 같은 벡터 pMMB67EH의 tac-프로모터이다.

예기치 않게, 본 발명의 숙주 세포는 그대로 백일해 백신으로 사용되거나 보조제로 사용되기에 매우 유용한 특성을 가지며; DC와 상호작용하는 향상된 잠재력을 가지며, 그리고 후속적으로 이들의 성숙을 유도하며 전염증성 사이토카인의 생성을 유도하는 유용한 특성을 갖는다. 택일적으로 또는 조합으로, 이러한 세포들로부터 획득가능한 LPS는 이하 나타낸 바와 같은 백신 또는 보조제로서 사용되기에 매우 적합하다.

따라서, 본 발명의 다른 견지로, 앞서 정의한 바와 같은 숙주 세포의 의약으로서 용도가 제공된다. 바람직하게, 상기 의약은 본 명세서에 이하 정의된 바와 같은 백신 또는 보조제이다.

숙주 세포에 의해 획득가능한 LPS

다른 견지로, 본 발명은 본 명세서에서 앞서 정의한 바와 같은 본 발명의 숙주 세포로부터 획득가능한 LPS에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 숙주 세포는 보르데텔라 종이며, 보다 바람직하게 보르데텔라 페르투시스이며, 보다 바람직하게 본 발명의 폴리사카라이드 디아세틸라아제의 과발현 및/또는 본 발명의 글리코실트랜스퍼레이즈의 불활성화를 운반하는 보르데텔라 페르투시스이다. 보다 바람직하게, 본 발명의 LPS는 실시예에서 제조된 바와 같은 돌연변이 2331로부터 획득가능하다.

보다 바람직하게, 핫 페놀/물 추출을 이용한 분리후(Westphal and Jann, 1965), 마일드 가수분해에 의한 O-디아실화(Holst 2000) 및 음성 이온-모드로 ESI-MS(Electrospray-ionization Mass spectrometry)에 의한 분석을 통해 분석되는 경우, 본 발명의 LPS의 ESI-MS 스펙트럼은 와일드 타입 LPS로 명명된 와일드 타입 보르데텔라 페르투시스로부터 유도되는 LPS의 이에 상응하는 ESI-MS 스펙트럼보다 많은 이온들을 제공하는 것으로 특징지어진다. 바람직하게 상기 와일드 타입 보르데텔라 페르투시스는 앞서 정의된 바와 같은 스트레인 B213이다. 어느 이론으로 한정지으려는 것은 아니나, 이러한 추가 이온들은 LPS의 리피드 A 파트의 1 또는 4' 포스페이트기의 헥소스아민 잔기로의 증가된 치환에 적어도 부분적으로 영향을 미칠 수 있다.

전형적으로, 와일드 타입 LPS의 ESI-MS 스펙트럼은 7 이온을 제공하는 것을 특징지어지며(참조 표 3), 한편 본 발명의 LPS의 ESI-MS 스펙트럼은 7이상의 이온, 적어도 8, 적어도 10, 적어도 12, 그리고 보다 바람직하게 14이상의 이온을 제공하는 것으로 특징지어진다.

택일적으로 또는 앞선 구현과의 조합으로, 바람직하게, 본 발명의 LPS의 ESI-MS 스펙트럼은 와일드 타입 LPS의 ESI-MS 스펙트럼보다 헥소스아민을 포함하는 보다 많은 이온을 포함한다. 전형적으로, 상기 와일드 타입 LPS의 ESI-MS 스펙트럼은 헥소스아민과 함께 두 이온을 제공하며(참조 표 3), 반면에 본 발명의 LPS의 ESI-MS 스펙트럼은 2개 이상의 이온, 적어도 4, 적어도 6, 그리고 보다 바람직하게 8이온을 제공하는 것으로 특징지어진다.

약학 조성물 및 의약 용도

본 발명은 본 명세서에 앞서 모두 정의된 바와 같은 본 발명의 숙주 세포 및/또는 LPS를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 약학 조성물은 백신 또는 보조제로서 사용될 수 있다. 상기 백신은 포유류의 면역화(면역반응 상승) 또는 백신화에 사용될 수 있다.

보조제는 본 명세서에서 항원과 함께 사용되는 경우에 포유류, 바람직하게는 사람에게 면역성을 주어 면역 시스템을 자극하고, 바람직하게는 상기 보조제 자체에 대해 특이적인 면역 반응을 생성하지 않고, 이에 따라 상기 항원에 대한 면역 반응을 일으키고, 증가시키거나 촉진하는 어느 물질 또는 화합물을 포함하는 것으로 정의된다. 바람직한 보조제는 상기 보조제가 없는 것을 제외하고 동일한 조건하에서 항원에 대해 생성되는 면역 반응과 비교하여 주어진 항원에 대해 면역 반응을 적어도 1.5, 2, 2.5, 5, 10 또는 20의 인자로 증가시킨다. 이에 상응하는 대조군에 비해 동물 또는 사람 그룹에서 보조제에 의해 생성되는 주어진 항원에 대한 면역 반응의 통계학적인 평균 증가율을 검출하는 시험은 당 기술분야에서 이용가능하다. 상기 보조제는 바람직하게 적어도 두개의 다른 항원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 보조제는 일반적으로 포유류에 외래적인 화합물일 것이며, 이에 따라 예를 들어, 인터루킨, 인터페론 및 다른 호르몬들과 같이 포유류에 내생적인 면역자극 화합물을 제외한다.

바람직한 구현으로, 상기 약학 조성물이 보조제로 사용되는 경우에, 상기 화합물은 또한 항원을 포함한다.

상기 조성물이 백신으로 사용되는 경우, 상기 항원은 본 발명의 숙주 세포의 표면에 존재하거나 그리고/또는 이러한 세포로부터 획득가능한 LPS내에 존재한다. 이러한 경우에, 상기 백신은 본 발명의 숙주에 대한 백신이며 그리고/또는 관련 LPS 분자를 발현할 수 있는 어느 숙주에 대한 백신이다.

상기 조성물이 보조제로서 사용되는 경우에, 바람직하게 항원이 존재한다. 상기 항원은 바람직하게 박테리아, 바이러스, 균류, 기생체, 암세포 또는 하기 정의된 바와 같은 알레르겐의 항원 또는 이로부터 생성되는 항원이다. 본 발명의 항원 및 숙주 세포 및/또는 이러한 세포에 의해 획득가능한 LPS는 바람직하게 박테리아, 바이러스, 균류 또는 기생체에 의해 야기되는 감염성 질병, 또는 암세포에 의해 야기되는 종양, 또는 알레르겐에 의해 야기되는 알레르기의 치료 및/또는 예방에 사용된다.

다른 바람직한 구현으로, 본 발명의 숙주 세포 및/또는 이로부터 획득가능한LPS, 및 임의로 또한 본 명세서에서 상기 정의한 바와 같은 항원을 포함하는 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 상기 약학 조성물은 또한 약학적으로 허용되는 안정화제, 삼투압제, 완충제, 분산제 등을 포함할 수 있다. 상기 약학 조성물의 바람직한 형태는 의도된 투여 방법 및 치료 적용 방법에 따라 달라진다. 상기 약학 담체는 활성 성분, 즉, 본 발명의 숙주 세포 및 이러한 숙주 세포로부터 획득가능한 LPS 및 임의로 상기 항원을 환자에게 운반하기에 적절한 어느 혼화가능한 무독성 물질일 수 있다. 비강내 운반을 위한 약학적으로 허용되는 담체는 물, 완충염용액, 글리세린, 폴리소르베이트 20, 크레모포어 EL 및 카프릴릭/카프릭 글리세라이드의 수성 혼합물로 예시되며, 중성 pH 환경을 제공하도록 완충될 수 있다. 비경구 운반을 위한 약학적으로 허용되는 담체는 멸균 완충된 0.9% NaCl 또는 임의로 20% 알부민이 보충된 5% 글루코즈로 예시된다. 비경구 투여용 제조물은 멸균되어야 한다. 활성 성분의 투여를 위한 비경구 경로는 예를 들어, 피하, 정맥내, 복막내, 근육내, 동맥내 또는 직접적 경로에 의한 주사 또는 주입과 같이 알려진 방법에 따른다. 본 발명의 조성물은 바람직하게 일시 주사에 의해 투여된다. 근육내 주사를 위한 전형적인 약학 조성물은 예를 들어, PBS 1-10ml 및 항원 1-100㎍, 바람직하게 항원 15-45㎍ 및 본 발명의 숙주 세포 및/또는 LPS 1-100㎍, 바람직하게 15-45㎍을 함유하도록 제조된다. 경구 투여를 위해, 상기 활성 성분은 엘릭시르, 시럽 및 서스펜션과 같은 액체 투여 형태로 투여될 수 있다. 경구 투여용 액체 투여 형태는 환자가 받아들이기 쉽게하기 위해 색소 및 향을 함유할 수 있다. 비경구, 경구 또는 비강 투여가능한 조성물을 제조하는 방법은 당 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Science(15th ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980)(그 전체가 모든 목적으로 참고문헌으로 편입됨)를 포함하는 다양한 공급처에 보다 상세히 기술되어 있다.

본 발명의 조성물에서 항원은 바람직하게 박테리아, 바이러스, 균류, 기생체, 암세포 또는 알레르겐으로부터 얻어진 항원이거나 이에 의해 생성된 항원이다. 본 발명의 숙주 세포 및/또는 LPS와 결합될 수 있는 바이러스 항원은 모든 종류의 바이러스로부터 유도될 수 있으며, 이러한 바이러스의 비-제한적인 예는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)와 같은 레트로바이러스과; 루벨라바이러스; 파라인플루엔자 바이러스, 홍역, 유행성이하선염, 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 인간 메타뉴모 바이러스(human metapneumovirus)와 같은 파라믹소바이러스과; 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, C형 간염바이러스(HCV), 일본뇌염바이러스(JEV), 틱본 엔세팔리티스, 세인트 루이스 엔세팔리티스 또는 웨스트 나일 바이러스와 같은 플라비바이러스과; 헤르페스 심플렉스 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 엡스테인바 바이러스와 같은 헤르페스바이러스과; 버냐바이러스과; 아레나바이러스과; 한탄과 같은 한타바이러스과; 코로나바이러스과; 인간 파필로마바이러스와 같은 파포바이러스과; 광견병 바이러스와 같은 랩도바이러스; 인간 코로나바이러스와 같은 코로나바이러스과; 알파바이러스과, 아테리바이러스과, 에볼라바이러스와 같은 필로바이러스과, 아레나바이러스과, 두창 바이러스와 같은 폭스바이러스과 및 아프리카 돼지 콜레라 바이러스이다. 본 발명의 숙주 세포 및/또는 LPS는 병원성 박테리아, 균류(이스트 포함) 또는 기생체로부터 유도된 항원과 결합될 수 있다. 이러한 항원은 예를 들어, H. 파일로리(H. pylori)와 같은 헬리코박터, N. 멩지티디스(N. mengitidis)와 같은 나이세리아, H. 인플루엔자(H. influenza)와 같은 헤모필러스, B. 페르투시스(B. pertussis)와 같은 보르데텔라, 클라미디아, 스트렙토코커스 종 혈청형 A과 같은 스트렙토코커스, V. 콜레라(V. cholera)와 같은 비브리오, 예를 들어, 살모넬라, 쉬겔라, 캄필로박터 및 에스케리치아를 포함하는 그람음성 장 병원체의 박테리아 항원 뿐만 아니라, 탄저병, 한센병, 결핵, 디프테리아, 라임병, 매독, 장티푸스 및 임질을 일으키는 박테리아의 항원을 포함한다. 기생체의 항원은 예를 들어, 바베오시스 보비스(Babeosis bovis), 플라스모디움, 리슈마니아 종, 톡소플라즈마 곤디 및 T. 크루지(T. cruzi)와 같은 트리파노소마와 같은 원생동물의 항원을 포함한다. 균류 항원은 아스퍼질러스 종, 칸디다 알비칸스, C. 네오포르만스(C. neoformans)와 같은 크립토코커스, 및 히스토플라즈마 캡설라텀(Histoplasma capsulatum)과 같은 균류의 항원을 포함할 수 있다.

백신화는 일반적으로 병원체에 대한 예방적 보호나 하기 병원성 감염의 질병의 치료를 위해 적용되나, 당 기술분야의 숙련자는 종양 치료를 위한 백신의 적용을 인지할 것이다. 다욱이, 증가된 수의 종양 특이 단백질은 인간 또는 인간화 항체에 의해 표적화될 수 있는 적절한 엔티티인 것으로 발견되었다. 이러한 종양 특이 단백질은 또한 본 발명의 범위내에 포함된다. 다수의 종양 특이 항원이 당 기술분야에 알려져 있다. 따라서, 바람직한 구현으로, 본 발명은 종양 특이 항원 및 상기 정의한 바와 같은 숙주 세포 및/또는 LPS를 포함하는 조성물을 제공한다. 적절한 종양 항원은 예를 들어, 태아성 암 항원, 전립선 특이 멤브레인 항원, 전립선 특이 항원, 단백질 MZ2-E, 다형성 상피 뮤신(PEM), 폴레이트 바인딩 단백질 LK26, (결절된) 상피 성장 인자 리셉터(EGRF), HER2, 톰슨-프리덴라이히(T) 항원, GM-2 및 GD-2 갱글리오사이드, Ep-CAM, 뮤신-1, 상피 글리코프로틴-2, 및 결장 특이 항원을 포함한다. 또한, 항원은 자가면역 질병의 예방시 내성을 유도하기위해 DC에 표적될 수 있다. 이러한 알레르겐이 또한 본 발명의 범위내에 포함된다.

이에 따라, 다른 견지로, 본 발명의 숙주 세포, 바람직하게, 보르데텔라 페르투시스 및/또는 이러한 세포로부터 획득가능한 LPS가 의약으로서 사용된다.

바람직하게, 상기 의약은 백일해에 대한 백신이다.

다른 바람직한 구현으로, 본 발명의 숙주 세포, 바람직하게 보르데텔라 페르투시스 및/또는 이러한 세포로부터 획득가능한 LPS가 보조제로서 사용된다. 보다 바람직하게, 본 발명의 숙주 세포, 바람직하게 보르데텔라 페르투시스 및/또는 이러한 세포로부터 획득가능한 LPS가 항원과 함께 사용된다.

이에 따라, 다른 견지로, 본 발명은 백일해의 예방 및/또는 치료용 의약 제조용으로서 사용되는 본 발명의 숙주 세포, 바람직하게 보르데텔라 페르투시스 및/또는 이러한 세포로부터 획득가능한 LPS의 용도에 관한 것이다. 바람직한 구현으로, 본 발명의 숙주 세포, 바람직하게 보르데텔라 페르투시스 및/또는 이러한 세포로부터 획득가능한 LPS는 항원에 대한 면역 반응을 상승시키기위한 의약 제조용 보조제로서 사용된다. 보다 바람직하게, 본 발명의 숙주 세포 및/또는 이러한 세포로부터 획득가능한 LPS는 상기 항원과 함께 보조제로서 사용된다.

이에 따라, 다른 견지로, 본 발명은 백일해의 예방 및/또는 치료용 의약 제조용으로서 사용되는 본 명세서에서 앞서 정의한 바와 같은 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 본 명세서에서 앞서 정의한 바와 같은 본 발명의 핵산 서열의 용도에 관한 것이다.

이에 따라, 다른 견지로, 본 발명은 보조제의 제조에 사용되는 본 명세서에서 앞서 정의한 바와 같은 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 본 명세서에서 앞서 정의한 바와 같은 본 발명의 핵산 서열의 용도에 관한 것이다. 바람직하게, 이러한 견지에서, 본 명세서에서 앞서 정의한 바와 같은 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 본 명세서에서 앞서 정의한 바와 같은 본 발명의 핵산 서열은 상기 항원에 대한 면역 반응을 상승시키기위한 의약 제조용 항원과 함께 사용된다.

본 발명의 방법 및 사용에 있어서, 포유류는 바람직하게 사람이다.

본 명세서 및 청구범위에 있어서, 동사 "포함하는" 및 이의 어형 변화는 비제한적인 관념으로 상기 단어에 후속하는 아이템이 포함되나, 특별히 언급되지 않은 아이템이 제외되지 않는 것을 의미하는 것으로 사용된다. 또한, 부정관사 "a" 또는 "an"에 의한 구성요소에 대한 언급은 문맥상 분명히 하나가 존재하고 구성요소의 하나만이 존재하는 것을 필요로 하지 않는 한, 하나 이상의 구성요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다.

도 1. (A) 확인된 글리코실트랜스퍼레이즈 오페론의 개요도. 진한 회색 화살표는 추정되는 글리코실트랜스퍼레이즈를 암호하는 유전자를 나타내며, 연한 회색 및 백색 화살표는 각각 추정되는 모노사카라이드 디아세틸라아제 및 플랭킹 ORFs를 암호하는 유전자를 나타낸다. (B) 트리신-SDS-PAGE를 이용한 와일드-타입 B. 페르투시스 스트레인(WT), 및 BP2329-, BP2328-, 및 BP2331-돌연변이 스트레인의 LPS 프로필의 분석.

도 2. 와일드-타입 B. 페르투시스(A) 및 B. 페르투시스 돌연변이 스트레인 BP2328(B), BP2329(C) 및 BP2331(D)의 O-디아실화 LPS의 음이온 ESI-MS.

도 3. BP2331-돌연변이 스트레인으로부터 얻어진 O-디아실화 LPS의 네가티브 모드 탠덤 질량 분석. (A) m/z 1108.3에서 이온의 추출된 MS/MS 스펙트럼, (B) m/z 1162.0에서 이온의 추출된 MS/MS 스펙트럼, (C) m/z 1112.6 내지 m/z 1162.0에서 이온의 추출된 MS³ 스펙트럼.

도 4. 와일드-타입 및 돌연변이 B. 페르투시스 세포로 자극후 DC 활성화. (A) PFA-고정된 와일드 타입 및 돌연변이 B. 페르투시스 세포로 10 MOI(검은 선) 또는 100 MOI(파선)로 24시간 자극후 인간 DCs에서 CD83, HLA-DR, CD86, 및 CD40 세포 표면 발현의 분석. 무자극 DCs는 대조구로 제공되었다(회색 막대 그래프). 카운트된 5,000 이벤트로부터 표시된 B. 페르투시스 스트레인에 대한 FACS 막대 그래프를 나타내었다. 수직축은 세포수를 나타내며, 수평축은 염색의 강도를 나타낸다. (B) PFA-고정된 와일드 타입 및 돌연변이 B. 페르투시스 세포로 10 MOI 또는 100 MOI로 자극후 배양된 인간 DCs에 의한 IL-10 및 IL-12p70 생성. 결과는 평균 사이토카인 농도(±SD)로 표기된다.

도 5. 정제된 와일드 타입 및 돌연변이 B. 페르투시스 LPS로 자극후 활성화. (A) 정제된 LPS 1㎍/ml로 24시간 자극후 인간 DCs에서 CD83, CD86 및 CD40 세포 표면 발현의 분석. 무자극된 DCs는 대조구로 제공되었다(회색 막대 그래프). 카운트 된 5,000 이벤트로부터 표시된 B. 페르투시스 스트레인의 LPS에 대한 FACS 막대 그래프를 나타내었다. 수직축은 세포수를 나타내며, 수평축은 염색의 강도를 나타낸다. (B) 정제된 LPS 1㎍/ml로 자극후 배양된 인간 DCs에 의한 IL-10 생성. 결과는 평균 사이토카인 농도로 표기된다.

도 6. 정제된 B. 페르투시스 LPS 및 전체 박테리아 세포에 의한 IL-6 유도. 인간 마크로파지 세포주 MM6에 의한 IL-6의 생성은 와일드-타입 B. 페르투시스 스트레인(WT), 및 BP2329-, BP2328-, 및 BP2331-돌연변이 스트레인으로부터 정제된 LPS(A) 또는 전체 박테리아 세포(B)의 스톡 용액의 연속 희석으로 자극되었다. 배양 상층액내 IL-6 농도는 인간 IL-6에 대한 ELISA로 정량되었다. 그 데이타는 3회의 각 실험의 평균을 나타낸다.

도 7. B. 페르투시스 LPS의 구조. 제시된 BP2328- 및 BP2329-돌연변이 스트레인의 결절 코어 OS 구조는 빨간 화살표로 표시된다. Caroff et al.(2000)로부터 적용되었다.

재료 및 방법

박테리아 스트레인 및 성장 조건

사용된 모든 박테리아 스트레인을 표 1에 기재하였다. 전형적으로, E. 콜라 이 스트레인을 Luria-Bertani 브로스에서 200rpm으로 교반하면서 배양하였다. 적절한 시기에 플라스미드 유지 또는 스트레인 선별을 위해 박테리아를 암피실린 100㎍/ml, 카나마이신 50㎍/ml 또는 젠타마이신 10㎍/ml의 존재하에서 배양하였다. B. 페르투시스는 15% 탈섬유소 양 혈액(Tritium)이 보충된 Bordet-Gengou(BG)상에서 35℃에서 배양되었다.

재조합 DNA 기술

사용된 모든 플라스미드를 표 1에 기재하였다. 플라스미드 DNA는 Promega Wizard^® Plus SV Minipreps 시스템을 이용하여 분리되었다. 제한효소는 제조자(Roche)의 지시에 따라 사용되었다. DNA 프레그먼트는 Promega Wizard^® Plus SV Gel 및 PCR Clean-Up 시스템을 이용하여 아가로즈겔로부터 분리되었다. 라이게이션은 rapid DNA 라이게이션 키트(Roche)를 이용하여 수행되었다.

사용된 모든 프라이머를 표 2에 기재하였다. PCR 반응을 위한 크로모조멀 주형 DNA는 증류수 50㎕에 ~10⁹ 박테리아를 리서스펜딩시키고, 이후 서스펜션을 95℃에서 15분간 가열하여 제조되었다. 그 다음 상기 서스펜션을 16,100 x g에서 1분간 원심분리한 후, 상층액을 주형 DNA로 사용하였다. B. 페르투시스 돌연변이 스트레인 B213ΔBP2328 및 ΔBP2329를 제작하기위해, 모두 BamHI 사이트를 가진 프라이머 BP2328_FWup, BP2329_FWup, 및 프라이머 BP2328_REVup 및 BP2329_REVup을 이용하여 이에 상응하는 ORFs의 5' 리전 및 업스트림 서열을 포함하는 DNA 세그먼트를 증폭 시켰다. 또한, 상기 ORFs의 3'리전 및 다운스트림 서열을 함유하는 DNA 프레그먼트는 모두 BamHI 사이트를 가진 프라이머 BP2328_FWdown, BP2329_FWdown, 및 프라이머 BP2328_REVdown and BP2329_REVdown을 이용한 PCR을 통해 획득되었다. B. 페르투시스 BP2331 돌연변이 스트레인을 제작하기위해, 이에 상응하는 ORF는 프라이머 BP2331_FW 및 BP2331_REV를 이용하여 증폭되었다. PCR은 각 프라이머 5pmol과 함께 총 반응 체적 25㎕에서 순수 Taq Ready-to-go PCR 비드(Amersham Biosciences)를 이용하여 수행되었다. 온도 프로그램은 다음과 같다: 95℃에서 3분, 95℃에서 15초 30싸이클, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 1분, 그 다음 72℃에서 7분 및 후속적인 4℃ 냉각. PCR 산물은 아가로즈 겔로부터 정제되고, 후속적으로 pGEM-T Easy내로 클로닝되어 그 결과 각각, 플라스미드 pGEM-BP2328up, pGEM-BP2328down, pGEM-BP2329up, pGEM-BP2329down 및 pGEM-BP2331이 생성되었다. pGEM-BP2328down 및 pGEM-BP2329down의 BamHI-SpeI 프레그먼트는 각각, BamHI-SpeI-제한된 pGEM-BP2328up 및 pGEM-BP2329up내로 라이게이션되었다. 그 결과 플라스미드 및 플라스미드 pGEM-BP2331은 각각, BamHI 및 HindIII 다이제션에 의해 획득되는 플라스미드 pBSL128의 카나마이신 내성 카세트의 삽입이 이루어지도록 각각, BamHI 및 EcoRV로 절단되었다. 최종적으로, 획득된 구조물의 EcoRI 프레그먼트는 EcoRI-제한된 자살 플라스미드 pSS1129내로 라이게이션되었다. 각각 pSS1129-BP2328_KO, pSS1129-BP2329_KO 및 pSS1129-BP2331_KO로 명명된 최종 구조물들은 상기 오페론의 전사 방향과 동일한 방향으로 카나마이신-내성 카세트를 함유하였다. pSS1129-계 플라스미드들 은 E. 콜라이 SM10(λpir)을 형질변형시키기위해 사용되었으며, 이는 대립 교환에 의한 상기 플라스미드들의 B. 페르투시스 및 B. 페르투시스 BP2328, BP2329 및 BP2331 돌연변이의 구조물로의 후속적인 이동을 가능케 하였다. 형질변형체들은 다양한 프라이머 세트를 이용한 PCR을 통해 스크리닝되었다.

LPS 분리 및 디-O-아세틸레이티드 LPS의 제조

LPS는 핫 페놀/물 추출법(Westphal and Jann, 1965)을 약간 변형하여(Geurtsen et al., 2006) 분리되었다. LPS의 디-O-아실화는 마일드 히드라지놀리시스(Holst, 2000)에 의해 이루어졌다. 간략히, LPS를 무수 히드라진(200㎕)에 용해하고, 지속적으로 교반하면서 37℃에서 50분간 배양하여 O-결합된 지방 아실 사슬을 방출시켰다. 그 혼합물을 냉각하고, 냉 아세톤 600㎕을 소 부분으로 첨가하여 히드라진을 아세톤 히드라존으로 전환시켰다. 디-O-아세틸레이티드 LPS의 침전물을 원심분리(4000 x g, 7℃에서 30분간)하여 수집하였다. 펠렛을 냉 아세톤 600㎕으로 2회 세척하고, 원심분리하고 물에 용해한 다음 동결건조하였다.

캐필러리 전기영동-전자스프레이 질량 분광학

Prince CE 시스템(Prince Technologies)을 4000 QTRAP 질량 분광계(Applied Biosystems/MDS Sciex)에 결합하였다. 시스 용액(이소프로판올-메탄올, 2:1)을 1.0㎕/min의 흐름 속도로 운반하였다. 분리는 탈이온수내 용해된 15mM 암모늄 아세테이트(pH 9.0)를 이용하여 ~90cm 길이 융합-실리카 캐필러리상에서 이루어졌다. 5kV 및 -5kV의 전자스프레이 이온화 전압이 각각 파지티브 및 네가티브 이온 모드 검출을 위해 사용되었다. 모든 질량 분광 실험에 있어서, 질소가 차단막 및 충돌 가스로 사용되었다. MS²(증강된 생성물 이온 스캔 또는 EPI) 및 MS³ 실험에서, 스캔 속도는 Q0 트래핑으로 4000Da/s로 설정되었으며, 트랩 충전 시간은 "동력적(dynamic)"으로 설정되었으며, 그리고 Q1의 레졸루션은 "유니트"로 설정되었다. MS³ 실험에 있어서, 여기 상수는 100ms로 설정된 여기 시간으로 단일 하전 전구체에 대해 제 1 동위 원소만을 여기하는 값으로 설정되었다.

트리신-SDS-PAGE의 LPS 분석

약 10⁹ 박테리아를 50㎕의 시료 버퍼(Laemmli, 1970)에 부유시키고 0.5mg/ml 프로테이나아제 K(최종 농도)를 첨가하였다. 시료를 55℃에서 60분간 배양한 다음 95℃에서 10분간 프로테이나아제 K를 불활성화하였다. 그 다음 시료 버퍼를 첨가하여 시료를 10배 희석한 후, 각 시료 2㎕를 트리신-SDS-PAGE 겔(Lesse et al., 1990)에 적용하였다. 브로모페놀 블루를 35V에서 상기 분리 겔에 런닝한 다음, 전압을 105V로 올렸다. 앞부분이 상기 겔의 바닥에 이른 후, 전기영동을 추가 45분간 계속하였다. 상기 겔을 물/에탄올/아세트산 11:8:1(v/v/v)에서 밤새 고정시킨 다음 설명된 바와 같이(Tsai and Frasch, 1982) 은으로 염색하였다.

박테리아 세포 서스펜션의 제조

박테리아를 PBS(phosphate buffered saline)내에 용해된 0.5% 파라포름알데히드(PFA)에서 30분간 불활성화시키고, 페놀 레드가 함유되지 않은 RPMI 1640 배지(Gibco)에 완전히 세척하였다. ~10⁹ 박테리아/ml에 해당되는 600nm(OD₆₀₀)에서 광학밀도 1을 갖는 박테리아 서스펜션이 페놀 레드가 함유되지 않은 RPMI 배지에 준비되었다.

휴먼 DC 생성 및 배양

미성숙 휴먼 DC를 소 변형으로 앞서 기재된 바와 같이(Sallusto and Lanzavecchia, 1994) 휴먼 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)로 부터 생성하였다. 간략히, PBMCs는 Ficoll 구배(Amersham Biosciences)에 걸친 밀도-구배 원심분리를 이용하여 건강한 지원자의 헤파린 처리된 혈액으로부터 분리되었다. 회수된 PBMC 분획은 10% 열-불활성화된 FCS(fetal calf serum)이 보충된 RPMI 1640 배지(Bodinco BV)에서 3회 세척되었다. 그 다음, 3층 Percoll 구배(GE Healthcare Bio-Sciences AB)(RPMI 1640(10% FCS)내에 용해된 60%, 47.5% 및 34% Percoll)에 걸친 원심분리에 의해 PBMCs로부터 모노사이트를 준비하였다. 상위 경계면으로부터 모노사이트를 거두고 RPMI 1640(10% FCS) 배지로 3회 세척하고 2.4mM L-글루타민(Sigma-Aldrich), 100U/ml 페니실린-스트렙토마이신(Gibco), 휴먼 재조합 GM-CSF(Peprotech) 100ng/ml 및 휴먼 재조합 IL-4(Strathmann-Biotec AG) 50ng/ml이 보충된 RPMI 1640(10% FCS)으로 6웰 플래이트(각 웰당 4ml, 0.5x10⁶ cells/ml)에서 배양하였다. 배양 6일후, 미성숙 DC(imDC)를 수거하였으며, 이는 CD14 및 CD83에 대해 음성이었으며, 플로우 사이토메트리로 측정시 저 수준의 CD86 및 HLA-DR을 발현하였으며, 그리고 고 수준의 CD40 및 CD11c를 발현하였다.

DC 자극

ImDC는 세척되고 RPMI 1640(10% FCS)으로 5x10⁵ cell/ml의 농도로 재부유되고, 10 또는 100 MOI(multiplicity of infection)로 PFA-고정된 B. 페르투시스 세포와 함께 10 또는 1000ng/ml의 농도로 정제된 LPS와 함께 공배양되었다. 자극되지 않은 imDC는 모든 실험에서 대조구로 제공되었다. DC는 24시간후 수거되고 세포 표면 마커의 발현에 대해 직접 염색되었으며; 상층액은 사이토카인 측정전에 -80℃에 보관되었다.

세포 표면 마커의 플로우 사이토메트릭 분석

DC 성숙 마커 및 보조자극 분자의 표면 발현이 플로우 사이토메트리에 의해 평가되었다. 미성숙 또는 자극된 DC는 수거되고, RPMI 1640(10% FCS)으로 세척되고, 0.1% BSA(bovine serum albumin)(FACS 버퍼)를 함유하는 필터-멸균된 PBS에 재부유되었다. 그 다음, 세포들은 하기 항체들중 하나와 함께 4℃에서 30분간 배양되었다: FITC-접합 항-휴먼 CD11c(mIgG1)과 CD83(mIgG1), 피코에리트린-접합 항-휴먼 CD86(mIgG1)과 CD40(mIgG1), 알로피코시아닌-접합 항-휴먼 CD14(mIgG1)과 HLA- DR(mIgG2b) 및 적절한 플루오로크롬-표지 아이소타입 대조구(CD11c, CD40 및 CD14(eBioscience); CD83, CD86 및 HLA-DR(BD Pharmingen). 세포들은 FACS 버퍼로 2회 세척되고 플로우 사이토메트리(FACScan, Becton Dickinson)를 이용하여 분석되었다.

사이토카인 측정

자극된 DCs의 상층액에서 휴먼 IL-10 및 IL-12p70 농도는 제조자의 지시에 따라(BD Biosciences Pharmingen) ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)를 이용하여 검출되었다.

내독성 활성 어세이

휴먼 마크로파지 세포주 MM6(Ziegler-Heitbrock et al., 1988)를 기술된 바와 같이(Geurten et al., 2006) 전체 박테리아 세포 서스펜션 또는 정제된 LPS의 연속 희석으로 자극하였다. 상기 박테리아 세포 서스펜션은 원심분리에 의해 배양물로부터 세포를 수집하여 준비되고, 이후 이들을 1.0의 OD₅₉₀에서 PBS에 재부유하고, 8mM 포름알데히드의 존재하에 10분간 열-불활성화하고, 4℃에 보관하였다. 자극후 배양 상층액내 IL-6 농도는 제조자의 지시에 따라(PeliKine Compact^TM) 휴먼 IL-6에 대하여 ELISA로 정량되었다.

결과

B. 페르투시스에서 새로운 LPS-바이오합성 오페론의 확인

본 발명자들은 4 유전자 집단을 발견하였으며(BP2328 내지 BP2331, GenBank Accssion Numbers NP_880966 내지 NP_880969), 이중 셋, 즉, BP2328, BP2329 및 BP2331은 다양한 박테리아의 LPS 글리코실트랜스퍼레이즈에 대해 고 서열 유사성을 보였다. BP2330은 자일렐라 파스티디오사(Xylella fastidiosa)의 폴리사카라이드 디아세틸라아제에 대해 가장 높은 유사성을 나타낸다. 4개의 ORFs는 서로 근접하며, 일부 경우에는 겹치며, 이는 이들이 하나의 오페론을 구성함을 제시한다(도 1A). 유전자 업스트림 및 반대 방향으로, 오페론의 다운스트림은 추정적으로 DNA 중합효소 III 서브유니트 알파 DnaE의 동족체 및 E. 콜라이의 추정되는 설파타아제 YhbX를 각각 암호한다. 추정되는 LPS 글리코실트랜스퍼레이즈의 역할을 연구하기위해, 대립 교환에 의한 삽입적 불활성화를 위한 카나마이신 내성 카세트에 의해 중단되는 각각의 BP2328, BP2329 및 BP2331 유전자를 운반하는 자살 플라스미드 pSS1129를 제작하였다. 이러한 접근으로 세가지 모든 유전자에 대한 녹아웃 돌연변이가 B. 페르투시스 스트레인 B213에서 쉽게 획득될 수 있다. 전세포 용해물의 트리신-SDS-PAGE에 의한 이들의 LPS 분석 결과, BP2328 및 BP2329 돌연변이에 대한 결절된 LPS인 것으로 명확히 나타났다(도 1B). 반대로, BP2331 돌연변이 스트레인의 LPS는 보다 이형적이며, 와일드 타입 길이를 포함하는 다중 밴드로 구성되었다.

LPS 구조 분석

이들의 구조를 조사하기위해, 와일드 타입 및 BP2328-, BP2329-, 및 BP2331-돌연변이 스트레인의 LPS를 분리하고, O-디아실화하고, 음이온 모드에서 ESI-MS에 의해 분석하였다(도 2). 제시된 LPS 구성은 표 3에 요약되었다. 와일드 타입 LPS의 스펙트럼은 m/z 1108.5에서 주된 3중-하전 이온을 나타내었으며, 이는 구성 GlcNAc

Man2NAc3NAcA

Fuc2NAc4NMe

GalNA

Glc

GlcN₂

GlcA

Hep₃

P

Kdo

리피드 A-OH를 갖는 전장 B. 페르투시스에 상응하는 것이었다. 부가적인 이온들은 m/z 770.1([M-3H]^3-), 811.1([M-4H]^4-), 831.4([M-4H]^4-), 888.3([M-3H]^3-), 951.8([M-H]^-), 987.1([M-2H]^2-), 1081.7([M-3H]^3-), 1121.1([M-3H+K]^3-), 1155.0([M-2H]^2-), 및 1162.1([M-3H]^3-)에 존재하였다. 이러한 이온의 대부분은 디포스포릴레이티드되거나 결정된 글리코폼에 상응하였으나, m/z 1162.1에서 삼중 하전 이온은 부가적인 헥소스아민부로 치환된 전장 B. 페르투시스 LPS에 상응하였다(표 3). BP2328-돌연변이 LPS의 ESI-MS 스펙트럼(도 2B)은 m/z 743.6, 770.0 및 823.7에서 삼중 하전 이온을 나타내었으며, m/z 1115.2, 1155.1 및 1235.7에서 이에 상응하는 이중 하전 이온을 함께 나타내었다. 부가적인 피크는 m/z 777.3([M-3H+Na]^3-), 952.1([M-H]^-), 1034.6([M-2H]^2-), 1074.6([M-2H]^2-) 및 1166.1([M-2H+Na]^2-)에 존재하였다. 상기 피크의 할당은 가장 완전한 코어 OS 구조가 m/z 823.7 및 1235.7에서의 이온으로 대표되며, 이는 구성 GalNA

Glc

GlcN₂

GlcA

Hep₂

P

Kdo

리피드 A-OH에 상응하는 것이었다. BP2329 돌연변이 LPS(도 2C)는 m/z 603.9 및 657.6d에서 삼중 하전 이온을 나타내었으며, m/z 906.0 및 986.6에서 이에 상응하는 이중 하전 이온을 함께 나타내었다. 또한, 이러한 이온의 소디움 및 포타슘 부가물이 m/z 917.4 및 997.6, 그리고 m/z 925.0 및 1005.6에서 각각 존재하였다. 부가적인 피크는 m/z 866.0([M-2H]^2-), 937.4([M-2H-H2O]^2-) 및 1067.1([M-2H]^2-)에 존재하였다. 이러한 경우에, 가장 완전한 코어 구조는 m/z 1067.1에서 이중 하전 이온으로 나타났으며, 이는 구성 GlcN2

GlcA

Hep2

P

Kdo

리피드 A-OH에 상응하는 것이었다. BP2331 돌연변이 LPS(도 2D)는 각각 부가적인 헥소스아민으로 치환된 전장 B. 페르투시스 LPS 및 전장 B. 페르투시스 LPS에 상응하는 m/z 1108.3 및 1162.0에서의 삼중 하전 이온을 포함하는 다수의 피크를 나타내었다.

와일드 타입 및 BP2331-돌연변이 LPS 모두에서 관찰된 부가적인 헥소스아민부의 위치를 분석하기위해, ESI-MS² 시험을 음이온 모드에서 수행하였다(도 3). m/z 1108.3(도 3A) 및 1162.0(도 3B)에서 이온의 MS/MS 스펙트럼은 모두 m/z 951.5에서 단일 하전 프레그먼트 이온을 나타내었으며, 이는 충돌-유도 해리하에서 Kdo-리피드 A 결합간의 분할로부터 발생된 리피드 A-OH가 N-아실레이티드 (3OH Cl4) 글루코사민 잔기의 β-(1→6)-결합 디사카라이드로 구성되며, 각 잔기는 포스페이트기로 치환된 것임을 보여주었다. m/z 1162.0에서 이온의 스펙트럼은 또한 m/z 1112.6에서 부가적인 이온을 나타내었으며, 이는 여분의 헥소스아민 잔기가 직접 리피드 A에 결합되었음을 보여준다. m/z 1112.6에서의 MS³는 또한 이러한 결론을 뒷받침해주 었다(도 3C).

B. 페르투시스 LPS 돌연변이에 의한 수지상 세포 활성화

DC 활성화시 LPS 돌연변이의 영향을 조사하기위해, 미성숙 DCs를 PFA-고정된 B. 페르투시스 와일드 타입 및 돌연변이 박테리아와 함께 10 및 100 MOI로 공배양하였다. DC 활성화는 플로우 사이토메트리를 통한 성숙 마커(CD83 및 HLA-DR) 및 보조자극 분자(CD86 및 CD40) 발현의 분석(도 4A)과 ELISA를 통한 IL-10 및 IL 12p70 유도의 분석(도 4B)으로 모니터되었다. 와일드 타입 및 모든 돌연변이 박테리아는 CD83, HLA-DR, CD86 및 CD40 발현을 유도하였으며, 이는 모든 스트레인이 DCs를 활성화시킬 수 있음을 입증한다. 그러나, BP2329- 및 BP2331-돌연변이 박테리아는 와일드 타입 박테리아에 비해 분명히 각각 덜 자극적이고, 보다 더 자극적이었다. 그러나, BP2328-돌연변이 스트레인은 와일드 타입과 유사한 정도의 효율을 나타내었다. BP2329-돌연변이 스트레인의 경우에서 관찰된 보다 낮은 DC 성숙은 IL-10 및 IL-12p70의 보다 낮은 유도가 수반되었다(도 4B). 마찬가지로, 증가된 DC-성숙 능을 보여준 BP2331 돌연변이는 보다 많은 양의 IL-10 및 IL-12p70을 유도하였다. 와일드 타입 스트레인 및 BP2328-돌연변이 스트레인은 상당한 수준의 IL-10을 유도하였으며, 이는 이러한 스트레인에 응하여 DCs에서의 보조자극 분자 및 성숙 마커의 동일한 발현과 일치하는 것이다. 그러나, 와일드 타입 스트레인은 분명히 IL-12p70 생성을 유도하였으며, 이러한 경우는 BP2328-돌연변이 스트레인에 대해서는 거의 일어나지 않는 것이며 IL-10 및 IL-12p70 발현이 다르게 조절될 수 있음을 제시하는 것이다.

와일드 타입과 돌연변이 스트레인간에 관찰된 DC 활성화 성능의 차이가 직접적으로 LPS 구성의 차이와 관련된 것인지 평가하기위해, DC 활성화 시험을 10 및 100ng/ml의 정제된 LPS를 이용하여 수행하였다. 와일드 타입, BP2328-, 및 BP2331-돌연변이 박테리아에 대해 DCs에서 성숙 마커 및 보조자극 분자의 발현의 높은 증가와 대조적으로, CD83, CD86 및 CD40 발현은 소 증가만을 나타내었으며(도 5A), HLA-DR 발현은 이러한 스트레인의 LPS 1000ng/ml에서도 증가가 발견되지 않았다(데이타로 나타내지 않음). 마찬가지로, IL-10 유도는 낮았으며(도 5B), IL-12p70은 LPS로 자극된 DCs의 상층액에서 검출되지 않았다(데이타로 나타내지 않음). 그럼에도 불구하고, 상호 비교(도 5A 및 5B)는 본래의 박테리아로 획득된 결과와 일치하여 최고 DC 활성화능이 BP2331-돌연변이 스트레인으로부터 분리된 LPS에 대해 관찰되었으며, 그 다음 BP2328-돌연변이 스트레인 및 와일드 타입 스트레인의 LPS가 후속하였으며, 한편 BP2329-돌연변이 스트레인의 LPS는 DCs를 성숙시킬 수 없었음을 입증하였다. 따라서, 돌연변이의 LPS 구조 변화는 DC 활성화 성능에 다르게 영향을 준다.

LPS 및 전 박테리아 세포의 내독성 활성

LPS의 내독성 활성에 미치는 LPS 돌연변이의 영향을 평가하기위해, IL-6 생성용 휴먼 마크로파지 세포주 MM6를 자극하는 정제된 LPS의 효능을 시험하였다. 와일드 타입 LPS에 비해, BP2331-돌연변이 스트레인으로부터 정제된 LPS는 상기 마크 로파지를 자극시키는데 매우 증가된 효능을 가졌다(도 6A). 이와 반대로, BP2329-돌연변이 스트레인의 LPS는 IL-6 생성을 자극시키는데 감소된 효능을 가졌으며, BP2328 돌연변이의 LPS는 와일드 타입 LPS와 유사한 활성을 나타내었다(도 6A). 시험된 단지 두개의 가장 높은 LPS 농도에서 후자의 LPS가 와일드 타입 LPS보다 더 활성적이었다. 정제된 LPS로 획득된 데이타와 일관되게, BP2331 돌연변이의 전 세포 서스펜션은 와일드 타입 세포에 비해 상기 마크로파지를 자극시키는데 분명히 증가된 효능을 나타내었다(도 6B). 그러나, 또한 BP2328-돌연변이 세포가 이러한 효과를 나타내었으며(도 6B), BP2329-돌연변이 세포는 활성적인 정제된 LPS가 보다 적음에도 불구하고 와일드 타입 세포와 유사한 활성을 가졌다(도 6A).

디스커션

본 연구의 목적은 B. 페르투시스 게놈에서 새로운 LPS 글리코실트랜스퍼레이즈를 확인하는 것이었다. 공지된 LPS 글리코실트랜스퍼레이즈의 서열을 이용하여 4-유전자 오페론을 확인할 수 있었다. 가금류 병원체 보르데텔라 아비움(Bordetella avium)의 게놈 서열을 다른 보르데텔라의 게놈 서열과 비교한 앞선 연구에서, 본 발명에서 확인된 것과 일치하는 유전자 집단은 LPS 생합성에 연루되는 것으로 기술되었다(Sebaihia et al., 2006). 그러나, 본 연구과제를 확인할 수 있는 기능적인 연구는 보고되지 않았다.

B. 페르투시스 LPS 생합성에서 이러한 오페론의 역할을 조사하기위해, 대립 교환에 의해 추정되는 글리코실트랜스퍼레이즈 유전자를 불활성화시키고, 와일드 타입과 돌연변이 스트레인의 LPS 프로필을 트리신-SDS-PAGE 및 ESI-MS를 이용하여 비교하였다. 예기치않게, 와일드 타입 스트레인은 전장 B. 페르투시스 LPS를 함유할 뿐만 아니라 본 명세서에 나타낸 바와 같이 리피드 A에 직접적으로 결합된 여분의 헥소스아민부로 치환된 숨은 전장 종까지 함유하는 것이 발견되었다. B. 페르투시스 리피드 A의 헥소스아민으로의 치환은 이전에 관찰되지 않았으며, 따라서 이는 B. 페르투시스 리피드 A의 새로운 변형을 나타낸다.

BP2328- 및 BP2329- 돌연변이 스트레인에 대해 제시된 결정 올리고사카라이드 구조를 도 7에 요약하였다. BP2328 돌연변이 스트레인중 가장 완전한 코어 OS 구조는 GalNA

Glc

GlcN₂

GlcA

Hep₂

P

Kdo

리피드 A-OH

HexN으로 구성되었으며, 이는 BP2328 돌연변이 스트레인이 말단 트리사카라이드, 헵토즈 잔기 및 GlcN 잔기중 하나가 결여된 것임을 나타낸다. 이러한 구성은 BP2328-암호화 단백질이 GlcN(1-4)의 Glc 트랜스퍼레이즈로서 작용함을 제시한다(도 7). BP2329-돌연변이 LPS의 분석 결과, 이러한 LPS는 더욱 결절되었으며, 이의 가장 완전한 구조는 GlcN

GlcA

Hep2

P

Kdo

리피드 A-OH

HexN으로 구성된 것으로 나타났다. 이러한 구조는 코어 OS의 제 2 GlcN이 연결되어야만 하는 Glc가 빠져있기때문에, 잔존 GlcN 잔기는 제 2 헵토즈에 결합되어야 한다. 따라서, 이러한 구성은 BP2329-암호화 단백질은 제 1 헵토즈 서브유니트에 결합하는 글리코실트랜스퍼레이즈로서 작용함을 제시한다(도 7). 이는 이러한 유전자 산물이 첫번째 장소에서 상기 유전자를 확인하는데 사용된 rfaK 및 lgtF/icsB와 같은 글루코즈(β1-4) 헵토즈 트랜스퍼레이즈와 고 상동성을 갖는 것과 일치한다. 상기 단백질은 다양한 LPS 글리코실트랜스퍼레이즈와 높은 서열 유사성을 보임에도 불구하고, 전장 B. 페르투시스 LPS는 여전히 돌연변이 스트레인에 존재하였다.

이러한 관찰은 BP2331 유전자가 활성 LPS 글리코실트랜스퍼레이즈를 암호하지 않거나, 암호화된 효소가 중복성을 나타냄을 제시한다. 이러한 최후 의견과 일치하게도, 본 발명자들은 B. 페르투시스의 게놈에서 BP2331-암호화 단백질에 대해 69% 동일성을 보이는 단백질을 암호하는 유전자, 즉, BP3671(GeneBank Accession Number CAE43928)을 확인하였다. 와일드 타입 및 BP2331-돌연변이 스트레인의 LPS 프로필이 보다 더 혹은 보다 덜 유사하였음에도 불구하고, 한가지 두드러진 관찰은 돌연변이 LPS가 보다 더 이형적이었다는 것이다. 이러한 현상에 대한 정확한 이유는 해명되어야 할 것으로 남아있으나, 한가지 가능한 설명은 BP2331 돌연변이가 이의 LPS의 증가된 화학량론적 치환, 아마도 헥소스아민으로의 치환을 다소 보인다는 것일 수 있다. 리피드 A의 아미노 당으로의 변형은 예를 들어, E. 콜라이 및 살모넬라에서 4-아미노아라비노즈로의 치환(Trent et al., 2001b) 및 프란시셀라 툴라렌시스에서 갈락토스아민으로의 치환(Phillips et al., 2004)과 같은 다양한 박테리아에서 기술되어 있다. 아미노아라비노즈 경로는 E. 콜라이에서 자세히 연구되었으며 리피드 A로의 전달전에 운데카프레닐 포스페이트 캐리어상에 당부의 어셈블리를 포함하는 것으로 나타났다(Trent et al., 2001a). BP2331에 카나마이신 내성 카세트의 삽입은 다운스트림 BP2330 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 사료되기때문에, 증가된 BP2330 발현은 리피드 A의 증가된 헥소스아민 변형을 이끌고, 결국 BP2331-돌연변이 세포에서 증가된 LPS 이형성을 이끌 수 있다는 것을 추측할 수 있다. 이러한 설명은 BP2331 돌연변이에서 헥소스아민 변형의 증가된 수준에 의해 뒷받침된다(참조 표 3).

LPS의 구조를 다룬 후, 정제된 LPS 및 전 박테리아 세포를 DCs의 성숙 유도능력 및 휴먼 마크로파지에 의한 전염증 사이토카인의 생성 자극 능력에 대해 시험하였다. 그 결과는 와일드 타입 스트레인과 비교하여, BP2331-돌연변이 스트레인은 증가된 DC 성숙 유도 능력 및 증가된 전염증 사이토카인 생성 유도 능력을 나타내었다. 유사한 결과가 정제된 LPS로 획득되었다. 이와 반대로, 전 박테리아 세포 및 BP2328- 및 BP2329- 돌연변이 스트레인으로부터 정제된 LPS는 DCs 성숙 및 마크로파지 자극에 대해 각각 유사 및 감소된 능력을 보였다. 이러한 결과는 LPS 코어 OS-구성의 변화는 B. 페르투시스 LPS의 생물학적 특성에 다르게 영향을 미침을 보여준다. 백신 개발의 관점으로, 이는 보다 효율적으로 면역 반응을 준비시키는 스트레인의 개발을 가능케하므로 이는 흥미로운 발견이다. 또한, BP2331-돌연변이 스트레인과 같은 증가된 LPS 이형성을 나타내는 돌연변이는 그 자체로 백신 효능에 호의적으로 영향을 줄 수 있는 보다 다양한 항-LPS 항체를 유도할 수 있다. 한편, DC의 수준과 마크로파지 활성화사이에 발견되는 우수한 상관관계, 및 다른 한편 리피드 A의 헥소스아민 변형의 정도는 BP2331 돌연변이에서 증가된 변형이 이와 관련하여 결정적인 것임을 강하게 제시한다.

[표 1]

[표 2]

[표 3]

와일드 타입 B. 페르투시스 및 B. 페르투시스 돌연변이 스트레인 BP2331, BP2328 및 BP2329의 O-디아실화 LPS에 대한 음이온 ESI-MS 데이타 및 제시된 구성. 평균 질량 유니트는 다음과 같이 제시된 구성에 기초하여 분자량 값의 계산에 사용되었다: 글루코즈(Glc), 162. 14; 헵토즈(Hep), 192. 17; 2-케토-3-데옥시옥툴로소닉산(Kdo), 220. 18; 포스페이트(P), 79.98; 글루코사민(GlcN), 161.17; 글루큐로닉산(GlcA), 176.13; N-아세틸-글루코사민(GlcNAc), 203.19; 2-아세트아미도-4-N-메틸-2,4-디데옥시-퓨코즈(fuc2NAc4NMe), 200.12; 2,3-아세트아미도-2,3-디데옥시-만누로닉산(Man2NAc3NAcA), 258.09; 갈락토스아미누로닉산(GalNA), 175.13 및 리피드 A-OH, 953.02. 표는 소디움 및 포타슘 부가물 및 단일 하전 리피드 A-OH 이 온(m/z 952([M-H)^-))을 포함하지 않는다.

<110> De Staat der Nederlanden, vert. door de minister van VWS <120> Improved vaccins against B. pertussis based on LPS glycosyltransferase mutants <150> PCT/EP 07104885.4 <151> 2007-03-26 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 283 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 1 Met Arg Asn Ala Pro Asn Val Pro Val Leu Met Tyr His His Val Thr 1 5 10 15 Pro Ala Gly Gly Met Ile Ala Ala Thr Pro Glu Val Phe Glu Arg Gln 20 25 30 Ile Ala Ala Leu Ala Arg Ala Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Thr Ala Glu 35 40 45 Phe Ala Ala Tyr Leu Asp Gly Ala Pro Val Pro Glu Lys Ser Val Leu 50 55 60 Ile Thr Phe Asp Asp Gly Tyr Leu Asn Asn Trp Val Tyr Ala His Pro 65 70 75 80 Ile Leu Gln Arg His Gly Met Lys Ala Val Leu Phe Leu Ile Thr Gly 85 90 95 Leu Leu Gly Asp Gly Pro Ala Arg Pro Cys Ala Gly Gln Asp Gly Pro 100 105 110 Leu Pro Pro Ala Pro Asp His Asp Glu Ser Lys Arg Leu Ile Ala Ala 115 120 125 Gly Arg Ala Asp Glu Val Met Leu Arg Trp Ser Glu Val Gln Ala Met 130 135 140 Leu Ala Ala Gly Thr Phe Glu Val His Ser His Thr His Thr His Thr 145 150 155 160 Arg Trp Asp Lys Gln Cys Gly Pro Asp Val Ala Ala Lys Arg Ala His 165 170 175 Ile Val Gln Glu Leu Ala Asp Ser Arg Arg Ala Leu Gln Ala Arg Leu 180 185 190 Gly Glu Val Ser Asp His Leu Cys Trp Pro Gln Gly Tyr Phe Asp Ala 195 200 205 Asp Tyr Val Gln Ala Ala Arg Asp Ala Gly Phe Arg His Leu Tyr Thr 210 215 220 Thr Asp Ala Leu Gly Gln Asn Val Pro Gly Gly Asp Pro Ala His Ile 225 230 235 240 Tyr Arg Phe Ala Val Arg Asn Arg Ala Gly Gly Trp Leu Asn Arg Arg 245 250 255 Ile Trp Leu Ala Arg His Pro Trp Ile Gly Pro Arg Tyr His Ala Trp 260 265 270 Lys Ala Trp Lys Lys Lys Leu Arg Arg Arg Ala 275 280 <210> 2 <211> 367 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <400> 2 Met Arg Pro Leu Arg Ile Val His Ser Glu Ala Ala Thr Ser Phe Gly 1 5 10 15 Gly Gln Glu Gly Arg Ile Phe Lys Glu Met Thr Ala Met Arg Glu Arg 20 25 30 Gly His His Met Glu Ala Ile Cys Gln Pro Gln Ala Gln Leu Ala Arg 35 40 45 Arg Leu Ala Glu Ala Ser Phe Thr Val His Thr Leu Glu Met Asp Gly 50 55 60 Pro Arg Asn Tyr Leu Arg Gly Val Leu Ser Leu Arg Arg Leu Leu Arg 65 70 75 80 Gln Gly Arg Tyr Asp Val Leu Asn Thr His Ser Arg Arg Asp Thr Val 85 90 95 Ile Ala Ala Ala Ala Gly Arg Leu Ala Gly Thr Pro Leu Ile Val Arg 100 105 110 Thr Arg His Leu Ser Asn Arg Val Gly Ser Leu Trp Ser Tyr Thr Gly 115 120 125 Leu Pro His Arg Val Thr Thr Val Ser Asp His Val Arg Gln His Leu 130 135 140 Ile Glu Arg Gly Val Pro Ala Gly His Ile Ala Thr Val Tyr Ser Pro 145 150 155 160 Ile Val Leu Pro Pro Pro Ile Glu His Ser Thr Leu Arg Gly Glu Leu 165 170 175 Gly Leu Ala Ala Asp Asp Ile Val Val Gly Cys Val Ala Val Met Arg 180 185 190 Ala Thr Lys Gly His Arg Glu Leu Ile Asp Ala Met Arg Pro Leu Met 195 200 205 Ala Glu Arg Ala Asn Leu His Leu Val Phe Val Gly Gly Gly Ser Pro 210 215 220 Met Phe Glu Gln Thr Gln Ala Tyr Val Ala Glu Leu Gly Leu Gln Ala 225 230 235 240 Arg Ile His Leu Met Gly Thr Arg Asn Asp Val Pro Asn Leu Leu Ala 245 250 255 Gly Phe Asp Leu Phe Ala Leu Ala Thr Arg Gln Glu Ala Ser Gly Thr 260 265 270 Val Tyr Val Glu Ala Glu Ala Cys Gly Leu Pro Val Val Gly Thr Asp 275 280 285 Val Gly Gly Val Ser Glu Met Met Arg Asp Gly Glu Thr Gly Ile Leu 290 295 300 Val Pro Val Asp Asp Pro Ala Ala Leu Gly Ala Ala Leu Arg Arg Leu 305 310 315 320 Ile Asp Asp Arg Ala Leu Arg Arg Arg Met Gly Glu Ala Gly Arg Arg 325 330 335 Met Val Arg Asp Glu Lys Val Phe Ala Pro Glu Arg Leu Ala Glu Arg 340 345 350 Thr Glu Ala Ile Tyr Arg Gln Trp Leu Ala Glu Arg Gly His Ala 355 360 365 <210> 3 <211> 852 <212> DNA <213> Bordetella pertussis <400> 3 atgcgtaacg cgcccaatgt cccggtgctg atgtaccacc acgtcacccc ggccggcggc 60 atgatcgccg ccacgcccga ggtgttcgaa cggcagatcg ccgcgctggc gcgggccggc 120 taccgctcgc tgggcacggc cgagttcgcc gcctacctgg acggcgcccc ggtgcccgag 180 aaatcggtgc tgatcacctt cgacgacgga tacctgaaca actgggtgta tgcccacccg 240 atcctgcagc gccacggcat gaaggccgtg ctgttcctga tcaccggcct gctgggcgat 300 ggtccggcgc ggccctgcgc cgggcaggac gggccgctgc cgcccgcgcc cgaccacgac 360 gaaagcaagc gcctgatcgc cgccggacgc gccgacgagg tcatgctgcg ctggagcgaa 420 gtgcaggcca tgctggcggc gggcaccttc gaggtgcatt cgcacaccca tacccatacg 480 cgctgggaca agcagtgcgg ccccgacgtc gccgccaagc gcgcccatat cgtccaggag 540 ctggccgatt cgcgccgggc gctgcaggcc cggctgggcg aggtcagcga ccacctgtgc 600 tggccccagg gctatttcga cgccgactat gtgcaggcgg cgcgcgacgc cggctttcgc 660 catctctaca ccaccgacgc cctgggccag aacgtcccgg gcggcgatcc cgcacacata 720 taccgcttcg cggtgcgcaa ccgcgccggc ggctggctca accgccgcat ctggctggcg 780 cgccatccct ggatcggccc gcgctatcac gcctggaagg cctggaagaa aaagctgagg 840 aggcgcgcat ga 852 <210> 4 <211> 1104 <212> DNA <213> Bordetella pertussis <400> 4 atgcggccat tgcgtatcgt gcattccgaa gccgccacca gtttcggcgg ccaggaaggg 60 cgcatcttca aggaaatgac ggccatgcgc gagcgcggcc atcacatgga ggcgatctgc 120 cagccgcagg cccagctggc gcgccgcctg gccgaggcca gcttcaccgt gcacacgctg 180 gaaatggacg ggccgcgcaa ttacctgcgc ggcgtgctga gcctgcgccg cctgctgcgc 240 cagggccgct acgacgtgct gaacacgcac agccggcgcg ataccgtgat cgccgcggcc 300 gccggccggc tggcgggcac gccgctgatc gtgcgtaccc gccacctgtc caacagggtc 360 ggctcgctct ggtcctatac cgggctgccg caccgcgtca ccacggtcag cgaccacgtg 420 cgccagcacc tcatcgaacg cggcgtaccc gccggccata tcgccacggt gtattcgccc 480 atcgtgctgc cgcctcccat cgaacactcg accctgcgcg gcgagctggg cctggcggcc 540 gacgatatcg tggtcggctg cgtggcggtg atgcgcgcca ccaaggggca ccgcgaactc 600 atcgacgcca tgcggccgct gatggccgag cgtgccaacc tgcacctggt gttcgtcggc 660 ggcggctcgc cgatgttcga gcagacccag gcctacgtgg ccgaactggg cctgcaggcg 720 cgcatccacc tgatgggcac gcgcaacgac gtccccaacc tgctggccgg tttcgacctg 780 ttcgccctgg ccacccgcca ggaggcttcg ggcaccgtct atgtcgaggc cgaagcctgt 840 ggcctgccgg tcgtcggcac cgacgtgggc ggcgtgtccg agatgatgcg cgatggcgag 900 accggcatcc tggtgccggt ggacgacccg atcgacgacc gcgcgttgcg gcgccgcatg 960 gaaaaggtct tcgcgcccga acggctggcc ctggcggagc gcggccatgc gtaagcggcg 1020 ctgggcgccg cgctgcgccg cctgggcgag gccggccggc gcatggtgcg cgacgagcgc 1080 accgaggcca tctaccggca gtgg 1104 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ttccgcactt actggctgag 20 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggatcctcgc ggtacgacag cacat 25 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggatcctgtt gcgcgagatg ctggag 26 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cctcatcgcc aaggtcaatc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tcaccttcga cgacggatac 20 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ggatccgtgc gcatctacct gatcc 25 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ggatccgaat cgaccacgat gaac 24 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gatccagctt ggcctggttg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gtgacgtggt ggtacatcag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tggtctaccg caggaacaat 20

Claims (27)

1. SEQ ID NO:2의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 글리코실트랜스퍼레이즈 폴리펩타이드.
2. SEQ ID NO:1의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리사카라이드 디아세틸라아제 폴리펩타이드.
3. 제 2항에 있어서, SEQ ID NO:1을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리사카라이드 디아세틸라아제.
4. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:2를 갖는 것을 특징으로 하는 글리코실트랜스퍼레이즈.
5. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 보르데텔라(Bordetella) 종, 바람직하게 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)로부터 획득되는 것 을 특징으로 하는 폴리사카라이드 디아세틸라아제.
6. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 보르데텔라(Bordetella) 종, 바람직하게 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)로부터 획득되는 것을 특징으로 하는 글리코실트랜스퍼레이즈.
7. 제 1항 및/또는 제 4항 및/또는 제 6항 중 어느 한 항에 정의된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열.
8. 제 2항 및/또는 제 3항 및/또는 제 5항 중 어느 한 항에 정의된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열.
9. 제 7항의 핵산 서열을 포함하는 핵산 구조물.
10. 제 8항의 핵산 서열을 포함하는 핵산 구조물.
11. 제 10항의 핵산 구조물을 포함하는 발현 벡터.
12. 제 9항의 핵산 구조물을 포함하는 불활성화 벡터.
13. 제 11항의 발현 벡터 및/또는 제 12항의 불활성화 벡터를 포함하는 숙주 세포.
14. 제 13항에 있어서, 상기 숙주 세포는 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 스트레인인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
15. 제 13항 또는 제 14항에 정의된 숙주 세포로부터 획득가능한 LPS.
16. 제 13항 또는 제 14항의 숙주 세포 및/또는 제 15항의 LPS를 포함하는 약학 조성물.
17. 제 16항에 있어서, 항원을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
18. 의약으로 사용되는 제 13항 또는 제 14항에 따른 숙주 세포 또는 제 15항에 따른 LPS.
19. 제 18항에 있어서, 백일해에 대한 백신으로 사용되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포 및/또는 LPS.
20. 제 18항에 있어서, 보조제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포 및/또는 LPS.
21. 제 20항에 있어서, 숙주 세포 및/또는 LPS는 항원과 함께 사용되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포 및/또는 LPS.
22. 백일해의 예방 및/또는 치료용 의약품의 제조에 사용되는 제 13항 또는 제 14항의 숙주 세포 및/또는 제 15항의 LPS의 용도.
23. 보조제로서 사용되는 제 13항 또는 제 14항의 숙주 세포 및/또는 제 15항의 LPS의 용도.
24. 제 23항에 있어서, 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 의약품의 제조를 위해 항원과 함께 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
25. 백일해의 예방 및/또는 치료용 의약품의 제조에 사용되는 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 정의된 폴리펩타이드 및/또는 제 7항 또는 제 8항 중 어느 한 항에 정의된 핵산 서열의 용도.
26. 보조제의 제조에 사용되는 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 정의된 폴리 펩타이드 및/또는 제 7항 또는 제 8항 중 어느 한 항에 정의된 핵산 서열의 용도.
27. 제 26항에 있어서, 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 의약품의 제조를 위해 항원과 함께 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.

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