BRPI0809321A2 - Polipeptídeo, sequência de ácido nucleico, construção de ácido nucleico, vetor de expressão, vetor de inativação, célula hospedeira, lipopolissacarídeo, composição farmacêutica, e, usos da célula hospedeira e/ou do lipopolissacarídeo, e do polipeptídeo e/ou da sequência de ácido nucleico - Google Patents

Description

“POLIPEPTÍDEO, SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, VETOR DE INATIV AÇÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, LIPOPOLISSACARÍDEO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USOS DA CÉLULA HOSPEDEIRA E/OU DO LIPOPOLISSACARÍDEO, E DO POLIPEPTÍDEO E/OU DA SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO”

Campo da invenção

A invenção diz respeito a uma vacina melhorada contra coqueluche que compreende mutantes de Bordetella pertussis tendo uma molécula de LPS modificada e/ou as moléculas de LPS obteníveis destes mutantes. Estes mutantes e/ou as molécula de LPS obteníveis podem ser usadas ainda como um adjuvante.

Fundamentos da invenção

LPS é uma molécula anfifílica localizada no folíolo externo da membrana externa de bactérias Gram negativas. LPS possui tanto atividade endotóxica quanto atividade adjuvante. Ambas as propriedades são fundamentadas no seu reconhecimento pelo complexo de receptor TLR4/MD

2 hospedeiro (revisado em Palsson-McDermott e O5Neill, 2004; 0’Neill, 2006). LPS consiste de três domínios estruturais distintos: Lipídeo A, o núcleo, e o antígeno O. O Lipídeo A funciona como uma âncora de membrana hidrofóbica e forma o componente bioativo da molécula (Takada e Kotani, 1989). A região de núcleo consiste de um oligossacarídeo complexo, que, quando comparado com o antígeno O, mostra apenas variabilidade estrutural limitada. Em algumas bactérias, por exemplo, Enterobacteriaceae, o oligossacarídeo de núcleo (OS de núcleo) pode ser dividido em um núcleo interno e um núcleo externo. O núcleo externo primariamente consiste de hexoses piranosídicas, por exemplo, D-glicose, D-galactose, e D-glicosamina, ao passo que o núcleo interno primariamente consiste de ácidos octulosônicos e heptopiranoses. Na vasta maioria das bactérias Gram-negativas, o domínio de núcleo é conectado ao domínio do lipídeo A por um carboidrato específico, o ácido 2-ceto-3-desoxioctulosônico (Kdo) (Raetz e Whitfield, 2002). O antígeno O compreende a parte mais variável do LPS e confere especificidade sorotípica às bactérias. Este é composto de subunidades de repetição de 5 açúcar de um a oito açúcares. Cada cadeia O pode conter até 50 destas subunidades. O antígeno O foi implicado na fuga imune bacteriana, especialmente a fuga da Iise mediada por complemento sérico (Raetz e Whitfield, 2002).

Ao contrário dos LPS de Bordetella bronchiseptica e 10 Bordetella parapertussis, o LPS de Bordetella pertussis nunca contém um domínio do antígeno O (Peppler, 1984; Di Fabio et al., 1992). Portanto, o LPS da B. pertussis é frequentemente aludido como lipooligossacarídeo. A B. pertussis produz duas formas de LPS dominantes, LPS de faixa A e faixa B (Peppler, 1984). O LPS de faixa B é composta de lipídeo A e um 15 oligossacarídeo de núcleo consistindo de 9 carboidratos (Caroff et al., 2000). A adição de um trissacarídeo terminal, consistindo de N-acetil glicosamina, ácido 2,3-diacetamido-2,3-didesóxi-manurônico e 2-acetamido-4-N-metil-2,4- didesóxi-fucose, ao LPS da faixa B forma o LPS aludido como faixa A.

Na Escherichia coli e Salmonella enterica sorovar 20 Typhimurium, o grupo de gene da biossíntese de OS de núcleo consiste de três operons, designados os operons gmhD, waaQ e WaaA. O operon gmhD consiste de quatro genes, gmhD e waaFCL, que estão envolvidos na síntese do núcleo interno (Schnaitman e Klena, 1993). Os genes gmhD, waaF e waaC codificam proteínas envolvidas na biossíntese e transferência de Heptoses I e 25 II para Kdo2-Iipideo A (Schnaitman e Klena, 1993), ao passo que o produto do gene waaL é uma ligase que está envolvida na ligação do antígeno O (MacLachlan et al., 1991). O operon waaQ é o maior dos três operons e codifica proteínas que estão envolvidas na biossíntese do núcleo externo e na modificação/decoração do núcleo OS. O número e tipos de genes presentes dentro no operon waaQ diferem por cepa, o que explica as diferenças específicas de cepa na composição do núcleo (Heinrichs et al., 1998). O operon WaaA frequentemente codifica apenas uma proteína, KdtA. Apenas na K-12 da E. coli, uma matriz de leitura aberta (ORF) não relacionada com o 5 LPS adicional está presente (Raetz e Whitfield, 2002). O gene kdtA de Enterobacteriaceae codifica a Kdo transferase bifuncional que adiciona os dois resíduos Kdo na biossíntese de Kdo2-Iipideo A (Clementz e Raetz, 1991).

Embora o OS de núcleo de Bordetella e E. coli mostrem alguma semelhança, a composição e configuração exatas dos resíduos 10 demonstram diferenças acentuadas. Por exemplo, o OS de núcleo de Bordetella contém apenas um resíduo Kdo, ao invés dos dois ou três resíduos que são encontrados na maioria das outras bactérias Gram negativas, incluindo a E. coli. Recentemente, isto foi mostrado ser devido ao funcionamento de KdtA de Bordetella como uma Kdo transferase 15 monofuncional, ao invés de como uma bifuncional (Isobe et al., 1999). As enzimas responsáveis pela síntese da porção remanescente do OS de núcleo de Bordetella são correntemente desconhecidas e aguardam identificação adicional.

Embora a sua parte de lipídeo A seja no geral observada como 20 o determinante principal para a atividade biológica do LPS através da ativação do complexo receptor TLR4/MD-2, a região de oligossacarídeo também pode desempenhar um papel importante na sua interação com as células que apresentam antígeno (APCs). Os receptores implicados neste tipo de reconhecimento de LPS incluem o receptor de complemento CR3 e o 25 receptor descontaminador SR-A (van Amersfoort et al., 2003; Pluddemann et al., 2006).

Diversas vacinas de Bordetella pertussis já foram usadas. A introdução das vacinas contra a coqueluche (wP) de célula inteira nos idos de 1940 e 1950 e mais tarde das vacinas contra a coqueluche acelulares (aP) nos idos de 1980 e 1990, levou a um declínio gradual na incidência da coqueluche e morbidez e mortalidade reduzida da doença em níveis baixos. A despeito da alta cobertura da vacinação, a doença da coqueluche tem permanecida endêmica e mantida mostrando um padrão cíclico com picos em incidência a 5 cada 2 a 5 anos. Durante as últimas duas décadas, diversos países, incluindo os Países Baixos, experimentaram aumentos nos números de casos de coqueluche relatados. De modo interessante, em algumas áreas, uma mudança na distribuição da idade também foi observada. Ao passo que na fase da prévacinação e vacina inicial os casos de coqueluche foram predominantemente 10 relatados em crianças jovens, adultos e adolescentes foram responsáveis por uma proporção crescente dos casos em anos recentes. Diversas razões para a re-emergência da coqueluche relatada foram propostas, incluindo: (1) mudanças genéticas nas cepas de B. pertussis circulantes que diminuíram a eficácia da vacina, (2) potência reduzida das vacinas contra a coqueluche, (3) 15 imunidade decrescente, (4) relatos aumentados de casos de coqueluche e (5) o diagnóstico melhorado de doença da coqueluche.

Portanto, existe ainda uma necessidade quanto a novas vacinas contra Bordetella pertussis que não exiba todas as desvantagens das vacinas existentes.

Descrição da invenção

A presente invenção está fundamentada na hipótese de que mutantes de B. pertussis com uma cadeia de oligossacarídeo alterada poderiam ser afetados na sua interação com as células dendríticas (DC)s. O alvejamento específico das células que apresentam antígeno (APC)s, tais 25 como DCs, de modo concebível afetaria a conseqüência da resposta imune contra uma vacina contra a coqueluche de célula inteira. Como uma primeira etapa para a melhora das vacinas de célula inteira por esta via, nós agora identificamos um grupo de genes envolvidos na biossíntese de oligossacarídeo de LPS em B. pertussis. Especialmente dois genes dentro deste grupo quando inativados ou superexpressados dão mutantes tendo uma potencialidade melhorada para interagir com DC e ativá-la.

Polipeptideos

Em um primeiro aspecto, a invenção fornece dois

polipeptídeos.

O primeiro polipeptídeo é uma polissacarídeo desacetilase e tem uma seqüência de aminoácido com pelo menos 50 % de identidade com a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1.

O segundo polipeptídeo é uma glicosil transferase e tem uma seqüência de aminoácido com pelo menos 50 % de identidade com a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2.

A atividade da polissacarídeo desacetilase respectivamente do polipeptídeo da glicosil transferase é preferivelmente avaliada pela super expressão respectivamente inativando o respectivo gene codificado em uma cepa de Bordetella pertussis como mais tarde aqui definida e analisando o LPS obtenível. Quando o LPS produzido pela cepa de Bordetella pertussis transformada compreende pelo menos quantidades detectáveis do LPS da invenção como mais tarde aqui definido, a polissacarídeo desacetilase, respectivamente os polipeptídeos da glicosil transferase poderiam ser ditos serem ativos e funcionais. Quantidades detectáveis de LPS são preferivelmente detectáveis como descrito nos exemplos: depois da isolação com a extração em fenol/água quentes (Westphal e Jann, 1965), a Odesacilação pela hidrólise branda (Hoist 2000) e a análise pela ESI-MS (Espectrometria de massa por eletropulverização-ionização) no modo de íon negativo.

De acordo com uma forma de realização ainda mais preferida, o polipeptídeo tem pelo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % ou 85 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 %, 92 %, 95 %, 97 % , 98 % ou 99 % de identidade com a seqüência de aminoácido da SEQ BD NO: 1. Em uma forma de realização mais preferida, a polissacarídeo desacetilase tem a SEQ ID NO: I. Esta polissacarídeo desacetilase origina-se da Bordetella pertussis. A seqüência de ácido nucleico que codifica a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 é dada na SEQ ID NO: 3.

De acordo com uma outra forma de realização ainda mais

preferida, o polipeptídeo tem pelo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % ou 85 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. Em uma forma de realização preferida, a glicosil transferase tem a 10 SEQ ID NO: 2. Esta glicosil transferase origina-se da Bordetella pertussis. A seqüência de ácido nucleico que codifica a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 é dada na SEQ ID NO: 4.

A porcentagem de identidade é calculada como o número de resíduos de aminoácido idênticos entre as seqüências alinhadas dividido pelo 15 comprimento das seqüências alinhadas menos o comprimento de todos os intervalos. O alinhamento de seqüência múltipla foi realizado usando o programa de alinhamento ótimo DNAman 4.0 usando os ajustes de default. O alinhamento é usualmente realizado entre as seqüências identificadas pela sua SEQ ID NO ou partes destas. Preferivelmente, o alinhamento é realizado 20 usando seqüências identificadas pela sua SEQ ID NO.

A pessoa habilitada entenderá que os polipeptídeos da presente invenção poderiam ser obtidos de outros organismos que não a Bordetella pertussis contanto que eles tenham a atividade e identidade requeridas. Em uma forma de realização preferida, cada polipeptídeo como identificado 25 acima é obtido de uma espécie de Bordetella tal como a pertussis, bronchiseptica, parapertussis. Mais preferivelmente, cada polipeptídeo como identificado acima é obtido de Bordetella pertussis. Uma única cepa de Bordetella pertussis ou várias cepas distintas de Bordetella pertussis podem ter diversos polipeptídeos homólogos de acordo com a presente invenção. De acordo com uma outra forma de realização preferida, o polipeptídeo da invenção, é uma variante de qualquer uma das seqüências de polipeptídeo como definidas antes. Um polipeptídeo variante pode ser uma forma que não ocorre naturalmente do polipeptídeo. Uma variante de 5 polipeptídeo pode diferir em algum modo engendrado do polipeptídeo isolado de sua fonte nativa. Uma variante pode ser fabricada pela mutagênese Iocodirigida partindo da seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou da SEQ ID NO: 2 ou da seqüência de ácido nucleico que codifica a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, que é a SEQ ID NO: 3, ou da seqüência de 10 ácido nucleico que codifica a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, que é a SEQ ID NO: 4. Preferivelmente, a variante de polipeptídeo contém mutações que não alteram a função biológica do polipeptídeo codificado. A função biológica ou a atividade da polissacarídeo desacetilase ou da glicosil transferase já foram aqui definidas.

Em um outro aspecto da invenção, é fornecido uma

polissacarídeo desacetilase, respectivamente uma glicosil transferase como mais no princípio definidas ambas sendo para o uso na preparação de um medicamento. Preferivelmente o dito medicamento é uma vacina ou um adjuvante como mais tarde aqui definido.

Seqüências de ácido nucleico

Em um segundo aspecto da invenção, são fornecidos duas seqüências de ácido nucleico.

O primeiro codifica uma polissacarídeo desacetilase tendo uma seqüência de aminoácido com pelo menos 50 % de identidade com a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, preferivelmente tendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, e/ou originando de uma espécie de Bordetella, preferivelmente Bordetellapertussis.

A primeira seqüência de ácido nucleico é preferivelmente uma seqüência de ácido nucleico tendo pelo menos 50 % de identidade com a seqüência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 3. Preferivelmente, a identidade é de pelo menos 55 %, mais preferivelmente pelo menos 60 %, mais preferivelmente pelo menos 65 %, mais preferivelmente pelo menos 70 %, mais preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 80 5 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 98 % e ainda mais preferivelmente pelo menos 99 %. O mais preferivelmente, a seqüência de ácido nucleico tem a seqüência de ácido nucleico da SEQID NO: 3 corresponde a NP 8809668.

A segunda seqüência de ácido nucleico codifica uma glicosil

transferase tendo uma seqüência de aminoácido com pelo menos 50 % de identidade com a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, preferivelmente tendo a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 2, e/ou que se origina de uma espécie de Bordetella, preferivelmente Bordetella pertussis.

A segunda seqüência de ácido nucleico é preferivelmente uma

seqüência de ácido nucleico tendo pelo menos 50 % de identidade com a seqüência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4. Preferivelmente, a identidade é de pelo menos 55 %, mais preferivelmente pelo menos 60 %, mais preferivelmente pelo menos 65 %, mais preferivelmente pelo menos 70 %, 20 mais preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo mènos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 98 % e ainda mais preferivelmente pelo menos 99 %. O mais preferivelmente, a seqüência de ácido nucleico tem a seqüência 25 de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4 corresponde a NP 8809669.

A porcentagem de identidade foi determinada calculando-se a razão do número de nucleotídeos idênticos na seqüência dividida pelo comprimento dos nucleotídeos totais menos os comprimentos de quaisquer intervalos. O alinhamento de seqüência múltipla de DNA foi realizado usando DNAman versão 4.0 usando o programa Optimal Alignment (Full Alignment). O comprimento mínimo de uma seqüência de DNA relevante que mostra nível de identidade de 50 % ou mais alto deve ser de 40 nucleotídeos ou mais longo. O alinhamento é usualmente realizado entre as seqüências 5 identificadas pela sua SEQ ID NO ou partes destas. Preferivelmente, o alinhamento é realizado usando seqüências identificadas pela sua SEQ ID NO.

De acordo com uma outra forma de realização preferida, a seqüência de ácido nucleico da invenção é uma variante de qualquer uma das 10 seqüências de ácido nucleico como definido acima. As variantes de seqüência de ácido nucleico podem ser usadas para preparar variantes de polipeptídeo como definido mais no princípio. Uma variante de ácido nucleico pode ser um fragmento de qualquer uma das seqüências de ácido nucleico como definido acima. Uma variante de ácido nucleico também pode ser uma seqüência de 15 ácido nucleico que difere da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 em virtude da degenerescência do código genético. Uma variante de ácido nucleico também pode ser uma variante alélica da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4. Uma variante alélica denota qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo local cromossoma. Uma variante de ácido

nucleico preferida é uma seqüência de ácido nucleico, que contém mutação(ões) silenciosa(s). Alternativamente ou em combinação, uma variante de ácido nucleico também pode ser obtida pela introdução de substituições de nucleotídeo, que não dão origem a uma outra seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado pela seqüência de ácido nucleico, mas 25 que corresponde ao uso de códon do organismo hospedeiro intencionado para a produção do polipeptídeo da invenção. De acordo com uma forma de realização preferida, a variante de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que ainda exibe a sua função biológica como mais no princípio aqui definida. Mais preferivelmente, a variante da seqüência de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que exibe a atividade de polissacarídeo desacetilase ou glicosil transferase respectivamente. As seqüências de ácido nucleico que codificam um tal polipeptídeo pode ser isolado de qualquer microorganismo.

Todas estas variantes podem ser obtidas usando técnicas conhecidas pela pessoa habilitada, tal como a triagem de biblioteca pela hibridização (procedimentos de southem blotting) sob condições de hibridização de baixa para média para alta para a seqüência de ácido nucleico SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou um variante destas que podem ser usadas para planejar uma sonda. As condições de severidade baixa para média para alta significa pré-hibridização e hibridização a 42° C em 5X SSPE, 0,3 % de SDS, 200 pg/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e 25 % 35 % ou 50 % de formamida para severidades baixa a média a alta respectivamente. Subsequentemente, a reação de hibridização é lavada três vezes por 30 minutos cada usando 2X SSC, 0,2 % de SDS e 55° C, 65° C ou 75° C para severidades de baixa a média a alta.

A informação de seqüência como aqui fornecida não deve ser tão estreitamente interpretada como para requerer a inclusão de bases erroneamente identificadas. A pessoa habilitada é capaz de identificar tais bases erroneamente identificadas e sabe como corrigir quanto a tais erros.

Em um outro aspecto da invenção, é fornecido um ácido

nucleico que codifica uma polissacarídeo desacetilase, respectivamente uma glicosil transferase como mais no princípio definida ambos ácidos nucleicos sendo para o uso para preparar um medicamento. Preferivelmente o dito medicamento é uma vacina ou um adjuvante como mais tarde aqui definido.

Construção de ácido nucleico

Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a uma construção de ácido nucleico que compreende qualquer uma das seqüências de ácido nucleico definidas na seção precedente, a dita seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que exibe: - atividade de polissacarídeo e tendo uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos 50 % de identidade com a seqüência de aminoácido da SEQ ED NO: 1 ou

- atividade de glicosil transferase e tendo uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos 50 % de identidade com a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2.

Opcionalmente, a seqüência de ácido nucleico presente na construção de ácido nucleico é operavelmente ligada a uma ou mais seqüências de controle, que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão adequado.

Operavelmente ligada é aqui definido como uma configuração em que uma seqüência de controle é apropriadamente colocada em uma posição relativa à seqüência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da invenção tal que a seqüência de controle direciona a produção do polipeptídeo da invenção.

A expressão será entendida incluir qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas não limitada à transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós-translacional e secreção.

A construção de ácido nucleico é definida como uma molécula de ácido nucleico, que é isolada de um gene que ocorre naturalmente ou que foi modificado para conter segmentos de ácido nucleico que são combinados ou justapostos em uma maneira que de outro modo não existiria na natureza.

Seqüência de controle é aqui definida incluir todos os componentes, que são necessários ou vantajosos para a expressão de um polipeptídeo. Em um mínimo, as seqüências de controle incluem um promotor e sinais de parada de transcricional e translacional.

Vetor de expressão

A invenção diz respeito ainda a um vetor de expressão que compreende uma construção de ácido nucleico que compreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que exibe a atividade da polissacarídeo desacetilase e tendo uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos 50 % de identidade com a seqüência de aminoácido da 5 SEQ ID NO: 1 como definida na seção precedente. Preferivelmente, o vetor de expressão compreende a dita seqüência de ácido nucleico, que é operavelmente ligada a uma ou mais seqüências de controle, que direciona a produção do polipeptídeo codificado em um hospedeiro de expressão adequado. Em um mínimo as seqüências de controle incluem um promotor e 10 sinais de parada transcricional e translacional. O vetor de expressão pode ser observado como um vetor de expressão recombinante. O vetor de expressão pode ser qualquer vetor (por exemplo, plasmático, viral), que possa ser convenientemente submetido aos procedimentos de DNA recombinante e possa realizar a expressão da seqüência de ácido nucleico que codifica o 15 polipeptídeo. Dependendo da identidade do hospedeiro em que este vetor de expressão será introduzido e da origem da seqüência de ácido nucleico da invenção, a pessoa habilitada saberá como escolher o vetor de expressão e as seqüências de controle mais adequadas. As células hospedeiras mais preferidas são apresentadas na seção intitulada células hospedeiras.

No contexto da invenção, um vetor de expressão quando

introduzido em uma célula hospedeira levará a uma célula tendo um nível de expressão aumentado da seqüência de ácido nucleico presente no vetor de expressão, e/ou um nível de expressão aumentado do polipeptídeo codificado pela seqüência de ácido nucleico presente no vetor de expressão e/ou um nível 25 de atividade aumentado do polipeptídeo codificado pela seqüência de ácido nucleico presente no vetor de expressão. Neste contexto, o aumento é avaliado pela comparação com a célula hospedeira que não compreende o dito vetor de expressão e/ou com a célula hospedeira que não compreende um polipeptídeo endógeno tendo pelo menos 50 % de identidade com a SEQ ID NO: I.

Em um outro aspecto da invenção, é fornecido um vetor de expressão como mais no princípio definido sendo para o uso para preparar um medicamento. Preferivelmente o dito medicamento é uma vacina ou um adjuvante como mais tarde aqui definidos.

Vetor de inativação

A invenção diz respeito ainda a um vetor de inativação que compreende uma construção de ácido nucleico que compreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que exibe atividade 10 de glicosil transferase e tendo uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos 50 % de identidade com a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 como definida na seção precedente. Um vetor de inativação é planejado para diminuir ou inativar a expressão da seqüência de ácido nucleico que tem pelo menos 50 % de identidade com a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 15 em um dado hospedeiro.

O vetor de inativação pode ser observado como um vetor de expressão recombinante. O vetor de inativação pode ser qualquer vetor (por exemplo, plasmático, viral), que possa ser convenientemente submetido aos processos de DNA recombinante e possa realizar a inativação da expressão da 20 seqüência de ácido nucleico como definido acima. Dependendo da identidade do hospedeiro no qual este vetor de inativação será introduzido e da origem da seqüência de ácido nucleico da invenção, a pessoa habilitada saberá como escolher o vetor de inativação mais adequado. As células hospedeiras mais preferidas são apresentadas na seção intitulada células hospedeiras.

No contexto da invenção, um vetor de inativação quando

introduzido em uma célula hospedeira levará a uma célula tendo um nível de expressão diminuído (ou rebaixado) da seqüência de ácido nucleico presente no vetor de expressão e/ou um nível de expressão diminuído do polipeptídeo codificado pela seqüência de ácido nucleico presente no vetor de expressão e/ou um nível de atividade diminuído do polipeptídeo codificado pela seqüência de ácido nucleico presente no vetor de expressão. Neste contexto, a diminuição é preferivelmente avaliada pela comparação com a célula hospedeira que não compreende o dito vetor de inativação.

A diminuição do nível de expressão do polipeptídeo que exibe

atividade de glicosil transferase e tendo uma seqüência de aminoácido que tenha pelo menos 50 % de identidade com a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 e/ou o rebaixamento do seu nível de atividade pode ter sido obtido pelos métodos convencionais conhecidos na técnica, tais como pela inativação ou regulagem negativa da expressão da seqüência de ácido nucleico endógena que codifica a dita glicosil transferase no hospedeiro. Esta inativação ou regulagem negativa podem ter sido obtidas pela deleção de uma ou mais nucleotídeos na seqüência de ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo. Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a um hospedeiro, preferivelmente uma Bordetella que tenha uma mutação na sua seqüência de ácido nucleico que codifica a dita glicosil transferase. Preferivelmente para construir um hospedeiro tendo uma seqüência de ácido nucleico inativada que codifique uma glicosil transferase, um vetor de substituição ou inativação é preparado e é subsequentemente introduzido no hospedeiro pela transformação. A pessoa habilitada saberá como construir um tal vetor.

Alternativamente ou em combinação com a inativação da seqüência de ácido nucleico endógena que codifica a glicosil transferase, a expressão da seqüência de ácido nucleico que codifica a glicosil transferase pode ser rebaixada fundindo-a a um promotor fraco adequado para a expressão da proteína em nível baixo no organismo selecionado.

Alternativamente ou em combinação com a inativação da seqüência de ácido nucleico que codifica a glicosil transferase endógena, a expressão da seqüência de ácido nucleico que codifica a glicosil transferase pode ser tomada indutível fundindo-a a um promotor indutível adequado para a expressão de proteína de nível indutível no organismo selecionado.

Alternativamente ou em combinação com as formas de realização preferidas anteriormente definidas, a inativação da seqüência de ácido nucleico que codifica a glicosil transferase endógena é preferivelmente obtida pelo uso de um vetor suicida. Mais preferivelmente, o vetor suicida é pSSl 129 (Stibitz et al, 1994).

Em um outro aspecto da invenção, é fornecido um vetor de inativação como mais no princípio definido para o uso para preparar um medicamento. Preferivelmente o dito medicamento é uma vacina ou um adjuvante como mais tarde aqui definido.

Célula hospedeira

Em um outro aspecto, a invenção fornece uma célula hospedeira que compreende o vetor de expressão da invenção e/ou o vetor de inativação da invenção ambos como definidos nas seções precedentes. A 15 escolha da célula hospedeira em uma grande proporção dependerá da fonte da seqüência de ácido nucleico da invenção. Dependendo da identidade da célula hospedeira, a pessoa habilitada saberá como transformá-la com a construção ou vetor da invenção.

A célula hospedeira pode ser qualquer célula microbiana, procariótica ou eucariótica, que é adequado para a expressão do LPS da invenção. Em uma forma de realização preferida, a célula hospedeira é uma espécie de Bordetella como mais no princípio mencionado. Mais preferivelmente, a Bordetella é uma Bordetella pertussis.

Os procedimentos adequados para a transformação de Bordetella pode envolver um processo que compreende a conjugação em uma maneira conhecida pela pessoa habilitada. Os procedimentos de transformação adequados para Bordetella são descritos em Stibitz et al, 1994.

De acordo com uma primeira forma de realização preferida, a célula hospedeira consequentemente obtida tem um nível de expressão aumentado da seqüência de ácido nucleico presente no vetor de expressão, e/ou tem um nível de expressão aumentado do polipeptídeo codificado pela seqüência de ácido nucleico presente no vetor de expressão e/ou tem um nível de atividade aumentado do polipeptídeo codificado pela seqüência de ácido 5 nucleico presente no vetor de expressão. Nesta forma de realização, a seqüência de ácido nucleico presente na construção de expressão codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 50 % de identidade com a SEQ ID NO: 1. Neste contexto, o aumento é avaliado pela comparação com a célula hospedeira que não compreende o dito vetor de expressão e/ou com a célula 10 hospedeira que não compreende um polipeptídeo endógeno tendo pelo menos 50 % de identidade com a SEQ ID NO: 1 quando ambos cultivados e/ou ensaiados sob as mesmas condições.

“Aumenta o nível de expressão do polipeptídeo” é aqui preferivelmente definido como produzindo mais do polipeptídeo como mais 15 no princípio definido do que a célula hospedeira precursora da qual a célula hospedeira transformada deriva produzirá quando ambos os tipos de células (células precursora e transformada) são cultivadas sob as mesmas condições. Preferivelmente, a célula hospedeira da invenção produz pelo menos 3 %, 6 %, 10 % ou 15 % mais do polipeptídeo da invenção tendo pelo menos 50 % 20 de identidade com a SEQ ID NO: 1 do que a célula hospedeira precursora da qual a célula hospedeira transformada deriva produzirá quando ambos os tipos de células (células precursora e transformada) são cultivadas sob as mesmas condições. Também hospedeiros que produzem pelo menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % ou 150 % mais do dito polipeptídeo 25 do que a célula precursora são preferidos. De acordo com uma outra forma de realização preferida, o nível de produção deste polipeptídeo da célula hospedeira da invenção é comparado com o nível de produção da cepa B213 de Bordetella pertussis (Kasuga et al 1953, ver também a Tabela 1), que é tomada como controle. De acordo com uma forma de realização ainda mais preferida, quando a célula hospedeira da invenção é uma cepa de Bordetella pertussis, o nível de produção do polipeptídeo da célula hospedeira da invenção é comparado com o nível de produção da cepa B213 como definido acima, que é tomada como controle.

A avaliação do nível de produção do polipeptídeo pode ser

realizada ao nível de mRNA pela realização de uma Northern Blot ou uma análise de série e/ou ao nível de polipeptídeo pela realização de uma Western blot. Todos estes métodos são bem conhecidos pela pessoa habilitada.

“Aumento na atividade de polipeptídeo” é aqui definido como IO exibindo uma atividade de polissacarídeo desacetilase mais alta do que aquela da célula hospedeira precursora da qual a célula hospedeira transformada deriva usando um ensaio específico para a dita atividade. Preferivelmente, o ensaio é aquele mencionado sob a seção polipeptídeos. Preferivelmente, a célula hospedeira da invenção exibe pelo menos 3 %, 6 %, 10 % ou 15 % mais alto de atividade da polissacarídeo desacetilase do que a célula hospedeira precursora da qual a célula hospedeira transformada deriva exibirá como ensaiado usando um ensaio específico para a dita atividade, que é preferivelmente o ensaio mencionado sob a seção polipeptídeos. Também o hospedeiro que exibe pelo menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % ou 150 % mais da dita atividade do que a célula precursora são preferidos. De acordo com uma outra forma de realização preferida, o nível da atividade da polissacarídeo desacetilase da célula hospedeira da invenção é comparada com a atividade correspondente da cepa B213 como definida antes, que é tomada como o controle. De acordo com uma forma de realização mais preferida, quando a célula hospedeira da invenção é uma cepa de Bordetella pertussis, o nível de atividade da polissacarídeo desacetilase da célula hospedeira da invenção é comparada com a atividade correspondente da cepa B213 como definida antes, que é tomada como o controle.

O aumento na expressão e/ou atividade de polipeptídeo pode ter sido obtido pelos métodos convencionais conhecidos na técnica, tais como pela introdução de mais cópias da seqüência de ácido nucleico que codifica a polissacarídeo desacetilase no hospedeiro, esteja ela em um carreador ou no cromossoma, além de naturalmente presente. Alternativamente, a seqüência 5 de ácido nucleico que codifica a polissacarídeo desacetilase pode ser super expressada fundindo-a ao promotor altamente expressado ou forte adequado para a expressão de proteína de nível alto no organismo selecionado, ou combinação dos dois métodos. A pessoa habilitada saberá que o promotor forte é o mais apropriado dependendo da identidade da célula hospedeira. 10 Preferivelmente quando a célula hospedeira é uma cepa de Bordetella pertussis, o promotor forte é o promotor tac do vetor pMMB67EH (Methods for General and Molecular Bacteriology, Editores P. Gerhardt et al., American Society for Microbiology, Washington DC, 1994, p. 409-410).

Alternativamente ou em combinação com a primeira forma de realização preferida, a invenção fornece uma segunda forma de realização preferida, em que a célula hospedeira tem um nível de expressão diminuído da seqüência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo tendo pelo menos 50 % de identidade com a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, e/ou tem um nível de expressão diminuído do dito polipeptídeo e/ou tem um nível de atividade aumentado do dito polipeptídeo, preferivelmente por intermédio do uso do vetor de inativação da invenção como mais no princípio aqui definido. Nesta forma de realização, a seqüência de ácido nucleico presente no vetor de inativação codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 50 % de identidade com a SEQID NO: 2. Neste contexto, a diminuição é avaliada pela comparação com a célula hospedeira que não compreende o dito vetor de inativação quando ambos cultivados e/ou ensaiados sob as mesmas condições.

“Nível de expressão diminuído do polipeptídeo” é aqui preferivelmente definido como produzindo menos do polipeptídeo como mais no princípio definido do que o que a célula hospedeira precursora da qual a célula hospedeira transformada deriva produzirá quando ambos os tipos de células (células precursora e transformada) são cultivadas sob as mesmas condições. Preferivelmente, a célula hospedeira da invenção produz pelo menos 3 %, 6 %, 10 % ou 15 % menos do polipeptídeo da invenção tendo 5 pelo menos 50 % de identidade com a SEQ ID NO: 2 do que a célula hospedeira precursora da qual a célula hospedeira transformada deriva produzirá quando ambos os tipos de células (células precursora e transformada) são cultivadas sob as mesmas condições. Também hospedeiros que produzem pelo menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 10 100 % ou 150 % menos do dito polipeptídeo do que a célula precursora são preferidos. De acordo com uma outra forma de realização preferida, o nível de produção deste polipeptídeo da célula hospedeira da invenção é comparado com o nível de produção da cepa B213 como definida antes, que é tomada como o controle. De acordo com uma forma de realização ainda mais 15 preferida, quando a célula hospedeira da invenção é uma cepa de Bordetella pertussis, o nível de produção do polipeptídeo da célula hospedeira da invenção é comparada com o nível de produção da cepa B213 como definidas antes, que é tomada como o controle.

A avaliação do nível de produção do polipeptídeo pode ser realizado ao nível de mRNA realizando-se uma Northern Blot ou uma análise de série e/ou ao nível do polipeptídeo realizando-se uma Western blot. Todos estes métodos são bem conhecidos pela pessoa habilitada.

“Diminuição na atividade de polipeptídeo" é aqui definida como exibindo uma atividade mais baixa de glicosil transferase do que aquela 25 da célula hospedeira precursora da qual a célula hospedeira transformada deriva usando um ensaio específico para a dita atividade. Preferivelmente, o ensaio é aquele que já foi aqui descrito sob a seção polipeptídeos. Preferivelmente, a célula hospedeira da invenção exibe atividade de glicosil transferase pelo menos 3 %, 6 %, 10 % ou 15 % mais baixa do que a célula hospedeira precursora da qual a célula hospedeira transformada deriva exibirá como ensaiado usando um ensaio específico para a dita atividade, que é preferivelmente o ensaio descrito sob a seção polipeptídeos. Também o hospedeiro que exibe pelo menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 5 %, 90 %, 100 % ou 150 % mais da dita atividade do que a célula precursora são preferidos. De acordo com uma outra forma de realização preferida, o nível de atividade de glicosil transferase da célula hospedeira da invenção é comparada com a atividade correspondente da cepa B213 como definida antes, que é tomada como o controle. De acordo com uma forma de realização 10 mais preferida, quando a célula hospedeira da invenção é uma cepa de Bordetella pertussis, o nível da atividade da polissacarídeo desacetilase da célula hospedeira da invenção é comparada com a atividade correspondente da cepa B213 como definida antes, que é tomada como o controle.

A diminuição na expressão e/ou atividade do polipeptídeo pode ter sido obtida pelos métodos convencionais conhecidos na técnica, tais como pela introdução de mais cópias da seqüência de ácido nucleico que codifica a polissacarídeo desacetilase no hospedeiro, esteja ela em um carreador ou no cromossoma, além de naturalmente presente. Alternativamente, a seqüência de ácido nucleico que codifica a polissacarídeo desacetilase pode ser super expressada fundindo-a ao promotor altamente expressado ou forte adequado para a expressão de proteína de nível alto no organismo selecionado, ou combinação dos dois métodos. A pessoa habilitada saberá que o promotor forte é o mais apropriado dependendo da identidade da célula hospedeira. Preferivelmente quando a célula hospedeira é uma cepa de Bordetella pertussis, o promotor forte é o promotor tac do vetor pMMB67EH como definido antes.

De acordo com um forma de realização mais preferida, a célula hospedeira não produz nenhuma quantidade detectável da glicosil transferase da invenção e/ou não exibe nenhuma atividade da glicosiltransferase detectável. Preferivelmente, a célula hospedeira não produz ou não produz substancialmente nenhuma glicosil transferase.

Alternativamente, de acordo com uma outra forma de realização mais preferida, a célula hospedeira produz uma quantidade indutível da glicosil transferase da invenção e/ou exibe uma atividade indutível da glicosil transferase.

A diminuição do nível de expressão da glicosil transferase da invenção e/ou a diminuição do seu nível de atividade pode ter sido obtido pelos métodos convencionais conhecidos na técnica, tal como pela inativação 10 ou regulagem negativa da seqüência de ácido nucleico que codifica a glicosil transferase endógena do hospedeiro. Esta inativação ou regulagem negativa pode ter sido obtida pela deleção de um ou mais nucleotídeos no gene codificador. Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a um hospedeiro, preferivelmente uma BordeteIla pertussis que tem uma mutação 15 na sua seqüência de ácido nucleico que codifica a glicosil transferase. Preferivelmente para construir um hospedeiro tendo uma seqüência de ácido nucleico que codifica a glicosil transferase inativada, um vetor de substituição ou inativação é preparado e é subsequentemente introduzido no hospedeiro pela transformação. A pessoa habilitada saberá como construir um tal vetor.

Alternativamente ou em combinação com a inativação da

seqüência de ácido nucleico endógena, a expressão da seqüência de ácido nucleico que codifica a glicosil transferase pode ser diminuída fundindo-a a um promotor fraco adequado para a expressão de proteína de nível baixo no organismo selecionado.

Alternativamente ou em combinação com a inativação da

seqüência de ácido nucleico endógena, a expressão da seqüência de ácido nucleico que codifica a glicosil transferase pode ser tomada indutível fundindo-a a um promotor indutível adequado para a expressão de proteína de nível indutível no organismo selecionado. Preferivelmente quando a célula hospedeira é uma cepa da Bordetella pertussis, o promotor indutível é o promotor tac do vetor pMMB67EH como definido antes.

Surpreendentemente, a célula hospedeira da invenção tem propriedades atraentes, que a toma muito atraente para ser usada como uma 5 vacina contra a coqueluche integral ou como um adjuvante: potencialidade melhorada para interagir com DC e para induzir subsequentemente a sua maturação e induzir a produção de citocinas pró inflamatórias. Alternativamente ou em combinação, o LPS obtenível a partir destas células também é muito apropriado para ser usado como uma vacina ou como um 10 adjuvante como apresentado abaixo.

Consequentemente, em um outro aspecto da invenção, é fornecida uma célula hospedeira como mais no princípio definida para o uso como um medicamento. Preferivelmente o dito medicamento é uma vacina ou um adjuvante como mais tarde aqui definido.

LPS obtenível pela célula hospedeira

Em um outro aspecto, a invenção diz respeito ao LPS obtenível a partir da célula hospedeira da invenção como mais no princípio aqui definido. Preferivelmente, a célula hospedeira é uma espécie de Bordetella, mais preferivelmente uma Bordetella pertussis, ainda mais 20 preferivelmente uma Bordetella pertussis que carrega uma super expressão da polissacarídeo desacetilase da invenção e/ou uma inativação da glicosil transferase da invenção. Mais preferivelmente, o LPS da invenção é obtenível a partir do mutante 2331 como preparado nos exemplos. Ainda mais preferivelmente, quando analisado depois da isolação com extração com 25 fenol/água quentes (Westphal e Jann, 1965), O-desacilação pela hidrólise branda (Hoist 2000) e análise por ESI-MS no modo de íon negativo, o espectro de ESI-MS do LPS da invenção é caracterizado por dar mais íons do que o espectro de ESI-MS correspondente do LPS derivado de uma Bordetella pertussis do tipo selvagem, o chamado LPS do tipo selvagem. Preferivelmente a Bordetella pertussis tipo selvagem é a cepa B213 como definida antes. Sem desejar estar ligado por qualquer teoria, estes íons adicionais podem refletir pelo menos parcialmente a substituição aumentada dos grupos fosfato 1 ou 4’ da parte de lipídeo A do LPS com resíduos de hexosamina.

Tipicamente o espectro de ESI-MS do LPS do tipo selvagem é caracterizado por dar 7 íons (ver a tabela 3), ao passo que o espectro de ESIMS do LPS da invenção é caracterizado por dar mais do que 7 íons, pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12 e mais preferivelmente 14 íons.

Alternativamente ou em combinação com a forma de

realização precedente, preferivelmente, o espectro de ESI-MS do LPS da invenção compreende mais íons que compreendem hexosamina do que o espectro de ESI-MS do LPS do tipo selvagem. Tipicamente, o espectro de ESI-MS do LPS do tipo selvagem dá dois íons com hexosamina (ver a tabela 15 3), ao passo que o espectro de ESI-MS do LPS da invenção é caracterizado por dar mais do que dois íons, pelo menos 4, pelo menos 6 e mais preferivelmente 8 íons.

Composições farmacêuticas e usos médicos

A invenção diz respeito ainda a uma composição farmacêutica 20 que compreende a célula hospedeira da invenção e/ou o LPS da invenção ambos como mais no princípio aqui definidos. A composição farmacêutica pode ser usada como uma vacina ou como um adjuvante. A vacina pode ser usada para a imunização (incitando uma resposta imune) ou vacinação de um mamífero.

Os adjuvantes são aqui definidos para incluir qualquer

substância ou composto que, quando usado em combinação com um antígeno, para imunizar um mamífero, preferivelmente um ser humano, estimula o sistema imune, provocando, realçando ou facilitando deste modo a resposta imune contra o antígeno, preferivelmente sem gerar uma resposta imune específica para o próprio adjuvante. Os adjuvantes preferidos realçam a resposta imune contra um dado antígeno por pelo menos um fator de 1,5, 2, 2,5, 5, 10 ou 20, quando comparada com a resposta imune gerada contra o antígeno sob as mesmas condições mas na ausência do adjuvante. Testes para 5 determinar o realce médio estatístico da resposta imune contra um dado antígeno como produzido por um adjuvante em um grupo de animais ou seres humanos em relação a um grupo de controle correspondente estão disponíveis na técnica. O adjuvante preferivelmente é capaz de realçar a resposta imune contra pelo menos dois antígenos diferentes. O adjuvante da invenção 10 usualmente será um composto que é estranho a um mamífero, excluindo desse modo compostos imunoestimulatórios que são endógenos para os mamíferos, tais como por exemplo, interleucinas, interferons e outros hormônios.

Em uma forma de realização preferida, quando a composição farmacêutica é usada como um adjuvante, a composição compreende ainda um antígeno.

Quando a composição é usada como uma vacina, o antígeno está presente na superfície da célula hospedeira da invenção e/ou está presente dentro do LPS obtenível a partir de tais células. Neste caso a vacina é preferivelmente uma vacina contra o hospedeiro da invenção e/ou contra qualquer hospedeiro capaz de expressar uma molécula de LPS relacionada.

Quando a composição é usada como um adjuvante, preferivelmente um antígeno está presente. O antígeno é preferivelmente um antígeno de uma bactéria, um vírus, um fungo, um parasita, uma célula cancerosa ou um alérgeno ou produzido pelos mesmos como ainda definido 25 abaixo. O antígeno e a célula hospedeira da invenção e/ou o LPS obtenível por tais células são preferivelmente usados no tratamento e/ou prevenção de uma doença infecciosa causada pela bactéria, vírus, fungo, ou parasita, ou do tumor causado pela célula cancerosa, ou da alergia causada pelo alérgeno.

Em uma outra forma de realização preferida, a composição farmacêutica que compreende uma célula hospedeira da invenção e/ou um LPS obtenível a partir desta e opcionalmente um antígeno como aqui definido acima compreende ainda um carreador farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas podem compreender ainda agentes de 5 estabilização, agentes osmóticos, agentes de tampão, agentes de dispersão e outros farmaceuticamente aceitáveis. A forma preferida da composição farmacêutica depende do modo pretendido de administração e aplicação terapêutica. O carreador farmacêutico pode ser qualquer substância compatível, não tóxica adequada para liberar os ingredientes ativos, isto é, a 10 célula hospedeira da invenção e/ou o LPS obtenível desta célula hospedeira e opcionalmente o antígeno, ao paciente. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis para a liberação intranasal são exemplificados por água, soluções salinas tamponadas, glicerina, polissorbato 20, cremofor EL e uma mistura aquosa de glicerídeo caprílico/cáprico e pode ser tamponada para fornecer um 15 ambiente de pH neutro. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis para a liberação parenteral são exemplificados pelo NaCl tamponado estéril a 0,9 % ou glicose a 5 % opcionalmente suplementada com uma albumina a 20 %. As preparações para a administração parenteral devem ser estéreis. A via parenteral para a administração dos ingredientes ativos está de acordo com os 20 métodos conhecidos, por exemplo, injeção ou infusão pelas vias subcutânea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial Ou intralesional. As composições da invenção são preferivelmente administradas pela injeção de bolo. Uma composição farmacêutica típica para a injeção intramuscular seria fabricada para conter, por exemplo, de 1 a 10 ml de solução salina tamponada 25 com fosfato e de I a 100 μΐ, preferivelmente de 15 a 45 μg de antígeno e de 1 a 100 μg, preferivelmente de 15 a 45 μg da célula hospedeira e/ou LPS da invenção. Para a administração oral, o ingrediente ativo pode ser administrado nas formas de dosagem líquida, tais como elixires, xaropes e suspensões. As formas de dosagem líquidas para a administração oral podem conter corantes e flavorizantes para aumentar a aceitação do paciente. Métodos para preparar composições parenteral, oral ou intranasalmente administráveis são bem conhecidos na técnica e descritos em mais detalhes em várias fontes, incluindo, por exemplo, Remington5S Pharmaceutical Science (15a ed., Mack 5 Publishing, Easton, PA, 1980) (incorporada por referência em sua totalidade para todos os propósitos).

O antígeno na composição da invenção preferivelmente é um antígeno que é de uma bactéria, um vírus, um fungo, um parasita, uma célula cancerosa ou um alérgeno ou produzido pelos mesmos. Os antígenos virais 10 que podem ser combinados com a célula hospedeira e/ou LPS da invenção podem ser derivados de todos os tipos de vírus, os exemplos não limitantes de tais vírus são: Retroviridae tais como o vírus da Imunodeficiência Humana (HTV); um rubellavírus; paramyxoviridae tais como os vírus da parainfluenza, sarampo, cachumba, vírus sincicial respiratório, metapneumovírus humano; 15 flaviviridae tal como o vírus da febre amarela, vírus da dengue, Vírus da Hepatite C (HCV), Vírus da Encefalite Japonesa (JEV), encefalite transmitida pelo carrapato, encefalite de St. Louis ou vírus West Nile; Herpesviridae tais como Vírus Simples do Herpes, citomegalovírus, vírus de Epstein-Barr; Bunyaviridae; Arenaviridae; Hantaviridae tais como Hantaan; 20 Coronaviridae', Papovaviridae tal como Papilomavírus humano; Rhabdoviridae tal como o vírus da raiva. Coronaviridae tal como coronavírus humano; Alphaviridae, Arteriviridae, filoviridae tal como vírus Ebola, Arenaviridae, poxviridae tais como o vírus da varíola e vírus da febre suína africana. Do mesmo modo a célula hospedeira e/ou LPS da invenção podem 25 ser combinados com antígenos derivados de bactérias, fungos (incluindo leveduras), ou parasitas patogênicos. Tais antígenos incluem antígenos bacterianos por exemplo, de Helicobacter, tal como H. pilori, Neisseria, tal como N. mengitidis, Haemophilus, tal como H. influenza, Bordetella, tal como B. pertussis, Chlamydia, Streptococcus, tal como Streptococcus sp. sorotipo A, Vibrio, tal como V. cholera, patógenos entéricos Gram negativos incluindo por exemplo, Salmonella, Shigella, Campilobacter e Escherichia, assim como antígeno de bactérias que causam antraz, lepra, tuberculose, difteria, doença de Lyme, sífilis, febre tifóide e gonorréia. Antígenos de 5 parasitas por exemplo, incluem antígenos de protozoários, tais como Babeosis bovis, Plasmodium, Leishmania spp. Toxoplasma gondii e Tiypanosoma, tais como T. cruzi. Os antígenos fungicos podem incluir antígenos de fungos tais como Aspergillus sp., Candida albícans, Cryptococcus, tais como por exemplo,, C. neoformans e Histoplasma capsulatum.

Embora a vacinação seja no geral aplicada para a proteção

profilática contra patógenos ou para o tratamento de doenças a seguir da infecção patogênica, a pessoa habilitada na técnica está ciente da aplicação de vacinas para o tratamento de tumor. Além disso, um número crescente de proteínas específicas de tumor são descobertas serem entidades próprias que 15 podem ser alvejadas pelos anticorpos humanos ou humanizados. Tais proteínas específicas de tumor também estão dentro do escopo da presente invenção. Muitos antígenos específico de tumor são conhecidos na técnica. Portanto, em uma forma de realização preferida, a invenção fornece composições que compreende um antígeno específico de tumor e uma célula 20 hospedeira e/ou LPS como definidos acima. Os antígenos de tumor adequados incluem por exemplo, antígeno carcinoembrionário, antígeno de membrana específica da próstata, antígeno específico da próstata, proteína MZ2-E, mucina epitelial polimórfica (PEM), proteína que liga foliato LK26, receptor do fator de crescimento epidérmico (truncado) (EGRF), HER2, antígeno de 25 Thomsen-Friedenreich (T), gangliosídeos GM-2 e GD-2, Ep-CAM, mucina-1, glicoproteína epitelial 2 e antígeno específico do cólon.

Além disso, antígenos podem ser alvejados a DC’s de modo a induzir a tolerância na prevenção da doença autoimune. Tais alérgenos também estão dentro do escopo da presente invenção. Consequentemente, em um outro aspecto, a célula hospedeira da invenção, preferivelmente uma de Bordetella pertussis e/ou o LPS obtenível de tal célula é/são para o uso como um medicamento. Preferivelmente, o medicamento é uma vacina contra a coqueluche.

Em uma outra forma de realização preferida, a célula

hospedeira da invenção, preferivelmente uma de Bordetella pertussis e/ou o LPS obtenível de tal célula é/são para o uso como um adjuvante. Mais preferivelmente, a célula hospedeira da invenção, preferivelmente uma de Bordetella pertussis e/ou o LPS obtenível de tal célula são usadas em combinação com um antígeno.

Consequentemente em um outro aspecto, a invenção diz respeito ao uso da célula hospedeira da invenção, preferivelmente uma de Bordetella pertussis e/ou do LPS obtenível de tal célula para a preparação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento da coqueluche. Em uma 15 forma de realização preferida, a célula hospedeira da invenção, preferivelmente uma de Bordetella pertussis e/ou o LPS obtenível de tal célula são usados como adjuvante para a preparação de um medicamento para incitar uma resposta imune contra um antígeno. Mais preferivelmente, a célula hospedeira da invenção e/ou o LPS obtenível de tal célula são usadas 20 como adjuvante em combinação com o dito antígeno.

Consequentemente em um outro aspecto, a invenção diz respeito ao uso de um polipeptídeo da invenção como mais no princípio aqui definido e/ou uma seqüência de ácido nucleico da invenção como aqui definida para a preparação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento da coqueluche.

Consequentemente em um outro aspecto, a invenção diz respeito ao uso de um polipeptídeo da invenção como mais no princípio aqui definido e/ou uma seqüência de ácido nucleico da invenção como mais no princípio aqui definida para a preparação de um adjuvante. Preferivelmente, neste aspecto, o polipeptídeo da invenção como mais no princípio aqui definido e/ou a seqüência de ácido nucleico da invenção como mais no princípio aqui definida são usados em combinação com um antígeno para a preparação de um medicamento para incitar uma resposta imune contra o antígeno.

Nos métodos e usos da invenção, o mamífero é preferivelmente um ser humano.

Neste documento e nas suas reivindicações, o verbo “compreender” e as suas conjugações são usados no seu sentido não limitante 10 para significar que os itens que seguem a palavra são incluídos, mas os itens não especificamente mencionados não são excluídos. Além disso, referência a um elemento pelos artigos indefinidos “um” ou “uma” não exclui a possibilidade de que mais do que um do elemento esteja presente, a menos que o contexto claramente requeira que exista um e apenas um dos elementos. 15 Os artigos indefinidos “um” ou “uma” assim usualmente significa “pelo menos um(a)”.

Descrição das figuras

Fig. I. (A) Representação esquemática do operon da glicosil transferase identificado. As setas cinza escuro indicam os genes que 20 codificam glicosil transferases putativas, ao passo que as setas cinza claro e brancas indicam o gene que codifica uma monossacarídeo desacetilase putativa e as ORFs flanqueadoras, respectivamente. (B) A análise de perfis LPS da cepa da B. pertussis do tipo selvagem (WT) e as cepas mutantes BP2329, BP2328 e BP2331 pela Tricina-SDS-PAGE.

Fig. 2. ESI-MS de íon negativo de LPS O-desacilado de B.

pertussis do tipo selvagem (A) e cepas mutantes de B. pertussis BP2328 (B), BP2329 (C) e BP2331 (D).

Fig. 3. Análise espectrométrica de massa em tandem no modo negativo de LPS O-desacilado da cepa mutante BP2331. (A) espectro de MS/MS extraído do íon em m/z 1108,3, (B) espectro MS/MS extraído do íon em m/z 1162,0, (C) espectro MS3 extraído do íon em m/z 1112,6 do íon em m/z 1162,0.

Fig. 4. A ativação de DC depois da estimulação com as células de B. pertussis do tipo selvagem e mutante. (A) Análise da expressão na superfície da célula de CD83, HLA-DR, CD86 e CD40 em DCs humanas depois de 24 horas de estimulação com células de B. pertussis do tipo selvagem e mutante fixadas em PFA em MOI 10 (linha preta) ou 100 (linha tracejada). DCs não estimuladas serviram como controle (histograma cheio cinza). São mostrados histogramas FACS para as cepas de B. pertussis indicadas de 5.000 eventos contados. O eixo vertical representa o número de célula, enquanto que o eixo horizontal representa a intensidade de tingimento. (B) Produção de IL-10 e IL-12p70 pelas DCs humanas cultivadas depois da estimulação com células de B. pertussis do tipo selvagem e mutante fixadas com PFA em MOI 10 ou 100. Os resultados são expressados como concentrações de citocina médias (± SD).

Fig. 5. A ativação de DC depois da estimulação com LPS de B. pertussis do tipo selvagem e mutante purificado. (A) Análise da expressão na superfície celular de CD83, CD86 e CD40 em DCs humanas depois de 24 20 horas de estimulação com 1 μg/ml de LPS purificado. As DCs não estimuladas serviram como controle (histograma cheio cinza). São mostrados histogramas FACS para o LPS das cepas de B. pertussis indicadas de 5.000 eventos contados. O eixo vertical representa o número de célula, enquanto que o eixo horizontal representa a intensidade de tingimento. (B) A produção 25 de IL-10 pelas DCs humanas cultivadas depois da estimulação com 1 μg/ml de LPS purificado. Os resultados são expressados como concentrações de citocina médias.

Fig. 6. Indução de IL-6 pelo LPS de B. pertussis purificado e células bacterianas integrais. A produção de IL-6 pela linhagem de célula de macrófago humana MM6 foi estimulada com diluições em série de soluções de estoque de LPS purificado (A) ou células bacterianas integrais (B) da cepa de B. pertussis do tipo selvagem (WT)5 ou das cepas mutantes BP2328, BP2329 e BP2331. As concentrações de IL-6 no sobrenadante de cultura 5 foram quantificadas em um ELISA contra IL-6 humana. Os dados representam as médias de três experimentos individuais.

Fig. 7. Estrutura de LPS de B. pertussis. As estruturas OS de núcleo truncadas propostas das cepas mutantes BP2328 e BP2329 são indicadas pelas setas vermelhas. Adaptada de Caroff et al. (2000).

Exemplos

Materiais e Métodos

Cepas bacterianas e condições de cultivo

Todas as cepas bacterianas usadas são descritas na Tabela 1. Tipicamente, as cepas da E. coli foram cultivadas a 37° C em caldo Luria15 Bertani sob agitação a 200 rpm. Quando apropriado, as bactérias foram cultivadas na presença de 100 μg/ml de ampicilina, 50 μg/ml de canamicina ou 10 μg/ml de gentamicina, para a manutenção de plasmídeo ou seleção da cepa. A B. pertussis foi cultivada a 35° C em Bordet-Gengou (BG) ágar suplementado com 15 % de sangue de ovelha desfibrinado (Tritium).

Técnicas de DNA recombinante

Todos os plasmídeos usados são descritos na Tabela I. O DNA plasmídico foi isolado usando o sistema Promega Wizard®Plus SV Minipreps. As endonucleases de restrição foram usadas de acordo com as instruções do fabricante (Roche). Os fragmentos de DNA foram isolados a partir de géis de 25 agarose usando o Promega Wizard® SV Gel e o sistema PCR Clean-Up. As ligações foram realizadas usando o kit de ligação de DNA rápida (Roche).

Todos os iniciadores usados são descritos na Tabela 2. O DNA cromossômico padrão para as reações de PCR foi preparado recolocando-se -IO9 bactérias em 50 μΐ de água destilada, depois que a suspensão foi aquecida por 15 min a 95° C. A suspensão foi depois centrifugada por 1 min a 16.100 x g, depois do que o sobrenadante foi usado como DNA padrão. Para construir as cepas mutantes de B. pertussis Β213ΔΒΡ2328 e ΔΒΡ2329, nós amplificamos segmentos de DNA que abrangem a região 5’ e as seqüências a 5 montante das ORFs correspondentes pelo uso dos iniciadores BP2328_FWsupra, BP2329 F Wsupra e iniciadores BP2328_REVsupra e BP2329_REVsupra, que ambas contendo um sítio BamHL Adicionalmente, os fragmentos de DNA contendo as regiões 3’ e as seqüências a jusante das ORFs foram obtidas pela PCR com os iniciadores BP2328_FWjnfra, 10 BP2329_F Winfra, ambos contendo um sítio BamHI e iniciadores BP2328_REVinfi-a e BP2329_REVjnfra. Para a construção de uma cepa mutante de B. pertussis BP2331, a ORF correspondente foi amplificada pelo uso dos iniciadores BP2331_FW e BP2331_REV. As PCRs foram realizadas usando pérolas de PCR Taq Ready-to-go puras (Amersham Biosciences) em um 15 volume de reação total de 25 μΐ com 5 pmol de cada iniciador. O programa de temperatura foi como segue: 95° C por 3 min, 30 ciclos de 15 s a 95° C, 30 s a 55° Cel min a 72° C, seguido por 7 min a 72° C e esfriamento subsequente a 4o C. Os produtos de PCR foram purificados a partir do gel de agarose e subsequentemente clonado em pGEM-T Easy resultando em plasmídeos 20 pGEM-BP2328supra, pGEM-BP2328infra, pGEM-BP2329supra, pGEMBP2329infra e pGEM-BP2331, respectivamente. Os fragmentos BamFII-SpeI de pGEM-BP2328infra e pGEMBP2329infra foram ligados no pGEMBP2328supra e pGEMBP2329supra restringidos por BamHI-SpeI, respectivamente. Os plasmídeos resultantes e o plasmídeo pGEM-BP2331 25 foram cortados com BamHI e EcoRV, respectivamente, para permitir a inserção do cassete de resistência à canamicina do plasmídeo pBSL128 obtido pela digestão com BamHI e HindIII, respectivamente. Finalmente, fragmentos EcoRI das construções obtidas foram ligados no plasmídeo suicida restringido com EcoRI pSS1129. As construções finais, designadas pSSl 129-BP2328Ko> pSSl 129-ΒΡ2329κο e pSS1129-BP2331KO, respectivamente, contiveram o cassete de resistência à canamicina na mesma orientação como a direção de transcrição do operon. Os plasmídeos com base em pSS1129 foram usados para transformar E. coli SMl O(Xpir), que permitiu a transferência subsequente 5 dos plasmídeos para a B. pertussis e a construção de mutantes BP2328, BP2329 e BP2331 de B. pertussis pela troca alélica. Os transformantes foram triados pela PCR usando vários conjuntos de iniciador.

Isolação e preparação de LPS de LPS des-O-acilado

O LPS foi isolado usando o método da extração com 10 fenol/água quentes (Westphal e Jann, 1965) com modificações leves (Geurtsen et al., 2006). A des-O-acilação de LPS foi obtida pela hidrazinólise branda (Hoist, 2000). Em resumo, o LPS foi dissolvido em hidrazina anidra (200 μΐ) e incubados a 37° C por 50 min com agitação constante para liberar as cadeias de acila graxas ligadas em O. A mistura foi esfriada e 600 μΐ de 15 acetona fria foram adicionados em porções pequenas para converter a hidrazina para acetona hidrazona. O precipitado do LPS des-O-acilado foi coletado pela centrifugação (4000 x g, a 7o C por 30 min). A pelota foi lavada duas vezes com 600 μΐ de acetona fria, centrifugada e dissolvida em água antes da liofilização.

Eletroforese capilar-espectrometria de massa de eletropulverização

Um sistema Prince CE (Prince Technologies) foi ligado a um espectrômetro de massa 4000 QTRAP (Applied Biosystems/MDS Sciex). Uma solução de revestimento (isopropanol-metanol, 2:1) foi liberada a uma razão de fluxo de 1,0 μΐ/min. As separações foram obtidas em um capilar de 25 sílica fundida simples de ~90 cm de comprimento usando 15 mM de acetato de amônio em água desionizada, pH 9,0. O 5 kV e -5 kV de voltagem de ionização de eletropulverização foram usados para as detecções no modo de íon positivo e negativo, respectivamente. Para todos os experimentos espectrométricos de massa, nitrogênio foi usada como gás de cortina e de colisão. Nos experimentos MS (varredura de íon de produto realçado ou EPI) e MS3, a velocidade de varredura foi ajustada a 4000 Da/s com sifonamento Q0, o tempo de enchimento do sifao foi ajustado como “dinâmico” e a resolução de Ql foi ajustada como “unidade”. Para os experimentos de MS3, o coeficiente de excitação foi ajustado a um valor para excitar apenas o primeiro isótopo para um precursor de carga única com tempo de excitação ajustado a 100 ms.

Análise de LPS pela Tricina-SDS-PAGE

Aproximadamente IO9 bactérias foram colocadas em suspensão em 50 μΐ de tampão de amostra (Laemmli, 1970) e 0,5 mg/ml de proteinase K (concentração final) foi adicionado. As amostras foram incubadas por 60 min a 55° C, seguido por 10 min a 95° C para inativar as proteinases K. As amostras foram depois diluídas 10 vezes pela adição de tampão de amostra, depois que 2 μΐ de cada amostra foram aplicadas a um gel de Tricina-SDS-PAGE (Lesse et al., 1990). O azul de bromofenol foi deixado colidir com o gel separado a 35 V, depois que a voltagem foi aumentada para 105 V. Depois que a parte da frente atingiu o fundo do gel, a eletroforese foi continuada por mais 45 min. Os géis foram fixados durante a noite em água/etanol/ácido acético 11:8:1 (v/v/v) e subsequentemente tingido com prata como descrito (Tsai e Frasch, 1982).

Preparação de suspensões de célula bacteriana

As bactérias foram inativadas em 0,5 % de paraformaldeído (PFA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 30 min e lavadas cuidadosamente em meio RPMI 1640 sem vermelho de fenol (Gibco). As suspensões bacterianas com uma densidade óptica a 600 nm (OD6oo) de 1, correspondente a ~109 bactérias/ml, foram preparadas em meio RPMI 1640 sem vermelho de fenol.

Geração e cultura de DC humana

DCs humanas imaturas foram geradas a partir das células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) como descrito anteriormente com modificações insignificantes (Sallusto e Lanzavecchia, 1994). Em resumo, as PBMCs foram isoladas do sangue heparinizado de voluntários saudáveis usando a centrifiigação de gradiente de densidade em um gradiente Ficoll (Amersham Biosciences). As frações de PBMC recuperadas foram lavadas três vezes em meio RPMI 1640, suplementado com 10 % de soro de bezerro fetal inativado por calor (FCS) (Bodinco BV). Em seguida, monócitos foram preparados a partir das PBMCs pela centrifugação em um gradiente Percoll de camada tripla (GE Healthcare BioSciences AB) (60 %, 47,5 % e 34 % de Percoll em RPMI 1640, 10 % de FCS). Os monócitos foram colhidos da interface superior e lavados três vezes com RPMI 1640, 10 % de meio FCS e incubados em uma placa de seis reservatórios (4 ml por reservatório, 0,5 x IO6 células/ml) em RPMI 1640, 10 % de FCS, suplementado com 2,4 mM de L-glutamina (Sigma-Aldrich), 100 U/ml de penicilina-estreptomicina (Gibco), 100 ng/ml de GM-CSF recombinante humano (Peprotech) e 50 ng/ml de IL-4 recombinante humana (Strathmann-Biotec AG). Depois de seis dias de cultura, as DCs imaturas (imDC) foram colhidas, que foram negativas quanto a CD 14 e CD83, níveis baixos expressados de CD86 e HLA-DR e níveis altos expressados de CD40 e CD Ilc como avaliado pela citometria de fluxo.

Estimulação de DC

ImDC foram lavadas e recolocadas em suspensão a uma concentração de 5 x IO5 células/ml em RPMI 1640 10 % de FCS e coincubadas com células de B. pertussis fixadas com PFA em uma 25 multiplicidade de infecção (MOI) de 10 ou 100 ou LPS purificado a uma concentração de 10 ou 1000 ng/ml. ImDCs não estimuladas serviram como controle em todos os experimentos. As DCs foram colhidas depois de 24 horas e diretamente tingidas quanto a expressão de marcadores de superfície celular; os sobrenadantes foram armazenados a -80° C antes das medições de citocina.

Análise citométrica de fluxo de marcadores de superfície celular

A expressão de superfície de marcadores de maturação de DC e moléculas co-estimulatórias foi avaliada pela citometria de fluxo. DCs imaturas ou estimuladas foram colhidas, lavadas em RPMI 1640, 10 % de FCS e recolocadas em suspensão em PBS esterilizado em filtro contendo 0,1 % de albumina sérica bovina (tampão FACS). Em seguida, as células foram incubadas por 30 min a 4o C com um dos seguintes anticorpos: CDllc (mlgGl) e CD83 (mlgGl) anti-ser humano conjugados a FITC, CD86 (mlgGl) e CD40 (mlgGl) anti-ser humano conjugados a ficoeritrina, CD 14 (mlgGl) e HLA-DR (mIgG2b) anti-ser humano conjugados a aloficocianina e controles de isótipo rotulado com fluorocromo apropriados (CD 11c, CD40 e CDl4 da eBioscience; CD83, CD86 e HLA-DR da BD Pharmingen). As células foram lavadas duas vezes com tampão FACS e analisadas usando a citometria de fluxo (FACScan, Becton Dickinson).

Medições de Citocina

As concentrações de IL-10 e IL-12p70 humanas nos sobrenadantes de DCs estimuladas foram determinadas usando um Ensaio Imunossorvente Ligado à Enzima (ELISA) de acordo com as instruções do fabricante (BD Biosciences Pharmingen).

Ensaios de atividade endotóxica

A linhagem de célula de macrófago humana MM6 (ZieglerHeitbrock et al., 1988) foi estimulada com diluições em série de suspensões de célula bacteriana integrais ou LPS purificado como descrito (Geurtsen et 25 al., 2006). As suspensões de célula bacteriana foram preparadas coletando-se as células das culturas pela centrifugação, depois que elas foram recolocadas em suspensão em PBS a uma OD590 de 1,0, inativadas por calor por 10 min na presença de 8 mM de formal dei do e armazenadas a 4o C. A seguir da estimulação, as concentrações de IL-6 nos sobrenadantes de cultura foram quantificadas com um ELISA contra IL-6 humana de acordo com as instruções do fabricante (PeliKine Compact®).

Resultados

Identificação de um novo operon da biossíntese de LPS em B. pertussis Foi verificado que um grupo de quatro genes (BP2328 a

BP2331, Acesso no GenBank Números NP 880966 a NP 880969) três dos quais mostraram similaridade de seqüência alta com as LPS glicosil transferases de várias bactérias, isto é, BP2328, BP2329 e BP2331. BP2330 mostra a similaridade mais alta com uma polissacarídeo desacetilase de 10 Xilella fastidiosa. As quatro ORFs estão próximas uma da outra e em alguns casos até se sobrepõem, sugerindo que elas constituem um operon (Fig. IA). Os genes a montante e, na orientação reversa, a jusante do operon, putativamente codificam homólogos da DNA polimerase III subunidade alfa DnaE e da sulfatase putativa YhbX da E. coli, respectivamente. De modo a 15 estudar o papel das LPS glicosil transferases putativas, nós fabricamos construções no plasmídeo suicida pSS1129 que carrega os genes BP2328, BP2329 e BP2331 individuais interrompidos por um cassete de resistência à canamicina para a inativação insercional pela mudança alélica. Usando este método, mutantes silenciados para todos os três genes puderam ser facilmente 20 obtidos na cepa B213 de B. pertussis. A análise de seu LPS pelo Tricina-SDSPAGE de lisados de célula inteira mostraram claramente LPS truncado quanto aos mutantes BP2328 e BP2329 (Fig. 1B). Ao contrário, o LPS da cepa mutante BP2331 foi mais heterogênica e consistiu de faixas múltiplas, incluindo o comprimento do tipo selvagem.

Análise estrutural do LPS

Para determinar a sua estrutura, o LPS do tipo selvagem e as cepas mutantes BP2328, BP2329 e BP2331 foi isolado, O-desacilado e analisado pela ESI-MS no modo de íon negativo (Fig. 2). As composições de LPS propostas estão resumidas na Tabela 3. O espectro de LPS do tipo selvagem (Fig. 2A) revelou um íon principal triplamente carregado em m/z 1108,5 correspondente ao LPS de tamanho natural de B. pertussis com a composição GlcNAceMan2NAc3NAcAeFuc2NAc4

r

NMeeGalNAeGlceGlcN2eGlcAeHep3ePeKdoe lipídeo A-OH. Ions adicionais 5 estavam presentes em m/z 770,1 ([M-3H]3'), 811,1 ([M-4H]4'), 831,4 ([M4H]4-), 888,3 ([M-3H]3'), 951,8 ([M-H]'), 987,1 ([M-2H]2’), 1081,7 ([M-3H]3' ), 1121,1 ([M-3H+K]3'), 1155,0 ([M-2H]2') e 1162,1 ([M-3H]3’). A maioria destes íons corresponderam às glicoformas desfosforiladas ou truncadas; entretanto, o íon triplamente carregado em m/z 1162,1 correspondeu ao LPS 10 de B. pertussis d tamanho natural substituído com uma porção de hexosamina adicional (Tabela 3). O espectro de ESI-MS do mutante de LPS BP2328 (Fig. 2B) mostrou íons triplamente carregados em m/z 743,6, 770,0 e 823,7, junto com os seus íons duplamente carregados correspondentes em m/.z. 1115,2, 1155,1 e 1235,7. Picos adicionais estavam presentes em m/z 777,3 ([M15 3H+Na]3'), 952,1 ([M-H]'), 1034,6 ([M-2H]2'), 1074,6 ([M-2H]2’) e 1166,1 ([M-2H+Na] "). A designação dos picos revelou que a estrutura de OS de núcleo mais completa foi representada pelos íons em m/z 823,7 e 1235,7 correspondentes à composição GalNAeGlceGlcN2eGlcAeHep2ePeKdo* lipídeo A-OH. O LPS mutante BP2329 (Fig. 2C) mostrou íons triplamente carregados 20 em m/z 603,9 e 657,6, juntos com seus íons duplamente carregados correspondentes em m/z 906,0 e 986,6. Além disso, os adutos de sódio e potássio destes íons estavam presentes em m/z 917,4 e 997,6 e ir/z 925,0 e 1005,6, respectivamente. Os picos adicionais estavam presentes em m/z 866,0 ([M-2H]2'), 937,4 ([M-2HH20]2') e 1067,1 ([M-2HJ2'). Neste caso, a estrutura 25 de núcleo mais completa foi representada pelo íon duplamente carregado em m/z 1067,1 correspondente à composição GlcN2eGlcAeHep2ePeKdoeIipideo A-OH, LPS mutante BP2331 (Fig. 2D) mostrou um grande número de picos, incluindo íons triplamente carregados em m/z 1108,3 e 1162,0 correspondentes ao LPS de B. pertussis de tamanho natural e LPS de B. pertussis de tamanho natural substituído com uma hexosamina adicional, respectivamente.

Para solucionar a localização da porção de hexosamina adicional, que foi observada tanto no LPS do tipo selvagem quanto no 5 mutante BP2331, os estudos de ESI-MS2 foram realizados no modo de íon negativo (Fig. 3). Os espectros de MS/MS dos íons em m/z 1108,3 (Fig. 3 A) e 1162,0 (Fig. 3B) ambos mostraram um íon de fragmento isoladamente carregado em m/z 951,5, que revelou que o lipídeo A-OH, que resulta da clivagem entre a ligação de Kdo-lipídeo A sob dissociação induzida por 10 colisão, consistiu de um dissacarídeo ligado em P-(l—>6) de resíduos de glicosamina (30H C14), N-acilada cada resíduo sendo substituído com um grupo de fosfato. O espectro de íon em m/z 1162,0 também mostrou um íon adicional em m/z 1112,6, que indica que o resíduo de hexosamina extra foi

λ

diretamente ligado ao lipídeo A. MS em m/z 1112,6 sustentou ainda esta conclusão (Fig. 3C).

Ativação de célula dendrítica pelos mutantes de LPS de B. pertussis

Para determinar a influência das mutações de LPS sobre a ativação de DC, DCs imaturos foram co-cultivados com B. pertussis do tipo selvagem fixadas com PFA e bactérias mutantes em um MOI de 10 e 100. A 20 ativação de DC foi monitorada pela análise de marcador de (CD83 e HLADR) e a expressão de molécula co-estimulatória (CD86 e CD40) pela citometria de fluxo (Fig. 4A) e a indução de IL-10 e IL12p70 pelo ELISA (Fig. 4B). As bactérias do tipo selvagem e todas as mutantes induziram a expressão de CD83, HLA-DR, CD86 e CD40, demonstrando que todas as 25 cepas foram capazes de ativar DCs. Entretanto, as bactérias mutantes BP2329 e BP2331 foram claramente menos e mais estimuladoras, respectivamente, do que as bactérias do tipo selvagem, ao passo que a cepa mutante BP2328 foi tão eficiente quanto a do tipo selvagem. A maturação de DC inferior observada no caso da cepa mutante BP2329 foi acompanhada pela indução mais baixa de IL-10 e IL-12p70 (Fig. 4B). Similarmente, o mutante BP2331, que demonstrou uma capacidade de maturação de DC realçada, induziu quantidades mais altas de IL-10 e IL-12p70. A cepa do tipo selvagem e a cepa mutante BP2328 induziram níveis comparáveis de IL-10, que está de acordo 5 com a expressão igual de moléculas co-estimulatórias e marcadores de maturação nas DCs em resposta a estas cepas. Entretanto, ao passo que a cepa do tipo selvagem claramente induziu a produção de IL-12p70, este foi dificilmente o caso para a cepa mutante BP2328 (Fig. 4B), sugerindo que a expressão de IL-10 e IL-12p70 pode ser diferencialmente regulada.

Para verificar se as diferenças observadas na capacidade de

ativação de DC entre as cepas do tipo selvagem e mutantes estão diretamente relacionadas com as diferenças na composição de LPS, estudos de ativação de DC foram realizados com IOe 1000 ng/ml de LPS purificado. Ao contrário do aumento alto na expressão de marcadores de maturação e moléculas co15 estimuladoras nas DCs em resposta às bactérias do tipo selvagem, mutantes BP2328 e BP2331, apenas aumentos menores na expressão de CD83, CD86 e CD40 (Fig. 5A) e nenhum aumento na expressão de HLA-DR (dados não mostrados) foi verificado mesmo com 1000 ng/ml de LPS destas cepas. Similarmente, a indução de IL-10 foi baixa (Fig. 5B) e IL-12p70 não pôde ser 20 detectada em sobrenadantes de DCs estimuladas com LPS (dados não mostrados). Não obstante, a comparação mútua (Figs. 5A e 5B) demonstraram que, de acordo com os resultados obtidos com bactérias intactas, a capacidade de ativação de DC mais alta foi encontrada para o LPS isolado da cepa mutante BP2331, seguida por aquela da cepa mutante BP2328 25 e a cepa do tipo selvagem, ao passo que aquela da cepa mutante BP2329 foi incapaz de maturar DCs. Assim, as alterações na estrutura do LPS dos mutantes diferencialmente afetam a capacidade de ativação de DC.

Atividade endotóxica de LPS e células bacterianas integrais

Para avaliar as conseqüências das mutações de LPS sobre a atividade endotóxica de LPS, a potência do LPS purificado para estimular a linhagem de célula de macrófago humana MM6 para a produção de IL-6 foi testada. Quando comparada com o LPS do tipo selvagem, o LPS purificado da cepa mutante BP2331 teve uma potência fortemente aumentada para 5 estimular os macrófagos (Fig. 6A). Ao contrário, o LPS da cepa mutante BP2329 teve uma potência reduzida para estimular a produção de IL-6, ao passo que o LPS do mutante BP2328 foi similarmente ativo como LPS do tipo selvagem (Fig. 6A). Apenas nas duas concentrações de LPS mais altas testadas, o último LPS foi mais ativo do que o LPS do tipo selvagem. 10 Compatível com os dados obtidos com LPS purificado, as suspensões de célula inteira do mutante BP2331 mostraram, quando comparadas com as células do tipo selvagem, uma potência claramente aumentada para estimular os macrófagos (Fig. 6B). Entretanto, também as células mutantes BP2328 mostraram este efeito (Fig. 6B), enquanto que as células mutantes BP2329 15 tiveram atividade similar como as células do tipo selvagem a despeito do seu LPS purificado menos ativo (Fig. 6A).

Debate

A meta do presente estudo foi identificar novas LPS glicosil transferases no genoma de B. pertussis. Pelo uso de seqüências de LPS 20 glicosil transferases conhecidas como guias, nós fomos capazes de identificar um operon de quatro genes. Em estudo anterior, em que a seqüência de genoma do patógeno de ave doméstica Bordetella avium foi comparado com as seqüências do genoma de outras Bordetellae, um grupo de genes homólogos para aquele aqui identificado foi descrito como estando envolvido 25 na biossíntese de LPS (Sebaihia et al., 2006). Entretanto, nenhum estudo funcional foi relatado que pudesse confirmar esta atribuição.

Para estudar o papel deste operon na biossíntese do LPS de B. pertussis, foram inativados os genes da glicosil transferase putativa pela mudança alélica e comparamos os perfis do LPS das cepas do tipo selvagem e mutantes usando Tricina-SDS-PAGE e ESI-MS. Inesperadamente, foi verificado que a cepa do tipo selvagem não apenas continha o LPS de B. pertussis de tamanho natural, mas também abrigou uma espécie de tamanho natural substituída com uma porção de hexosamina extra, que, como nós 5 mostramos, foi diretamente ligada ao lipídeo A. A substituição do lipídeo A de B. pertussis com hexosamina não foi anteriormente observada e portanto representa uma nova modificação do lipídeo A de B. pertussis.

As estruturas de oligossacarídeo truncado propostas para as cepas mutantes BP2328 e BP2329 estão resumidas na Fig. 7. A estrutura de 10 OS de núcleo mais completa na cepa mutante BP2328 consistiu de GalNAeGlceGlcN2eGlcAeHep2ePeKdoeIipideo A-OHeHexN, indicando que a cepa BP2328 mutante carece do trissacarídeo terminal, um resíduo de heptose e um dos resíduos GlcN. Esta composição sugere que as funções de proteína codificada por BP2328 como um GlcN (1-4) para Glc transferase (Fig. 7). A 15 análise do LPS mutante BP2329 mostrou que esta LPS foi ainda truncada e que a sua estrutura mais completa consistiu de GlcNeGlcAeHep2ePeKdoeIipideo A-OHeHexN. Visto que esta estrutura perde

o Glc ao qual o segundo GlcN do núcleo OS deve ser conectado, o resíduo GlcN remanescente presente deve ser ligado à segunda heptose. Portanto, esta 20 composição sugere que as proteína codificada por BP2329 funciona como uma glicosil transferase que liga Glc à primeira subunidade de heptose (Fig. 7). Isto estaria de acordo com a alta homologia deste produto de gene com as glicose (β1-4) heptose transferases, tais como rfaK e lgtF/icsB, que foram usadas para identificar o gene no primeiro ligar. O fenótipo mais complicado 25 foi observado no caso do mutante BP2331. Embora a proteína mostre alta similaridade de seqüência às várias LPS glicosil transferases, o LPS de B. pertussis de tamanho natural foi ainda presente na cepa mutante.

Esta observação sugere que o gene BP2331 não codifica uma LPS glicosil transferase ou que a enzima codificada mostra redundância. Compatível com esta última opção, nós identificamos um gene, isto é, BP3671 com Acesso no GenBank Número CAE43928, no genoma de B. pertussis que codifica uma proteína que mostra 69 % de identidade com a proteína codificada por BP2331. Embora os perfis de LPS da cepa do tipo 5 selvagem e da cepa mutante BP2331 fossem mais ou menos comparáveis, uma observação foi QUE O LPS mutante foi mais heterogênico. Embora a razão exata para este fenômeno permaneça para ser elucidado, uma explicação possível pode ser que o mutante BP2331 de certo modo demonstra uma substituição não estequiométrica aumentada do seu LPS, possivelmente 10 com hexosamina. A modificação de lipídeo A com açúcares de amino foi descrita em várias bactérias, por exemplo, substituição com 4-aminoarabinose na E. coli e Salmonella (Trent et al., 2001b) e com galactosamina em Francisella tularensis (Phillips et al., 2004). O caminho da aminoarabinose foi estudado em detalhes na E. coli e foi mostrado envolver a montagem da 15 porção de açúcar em um carreador de fosfato de undecaprenila separado antes da sua transferência para lipídeo A (Trent et al., 2001a). Visto que é concebível que a inserção do cassete de resistência à canamicina em BP2331 tem aumentado a expressão do gene BP2330 a jusante, poder-se-ia especular que uma expressão de BP2330 aumentada possa ter levado a uma 20 modificação de hexosamina aumentada de lipídeo A, e, consequentemente, uma heterogeneidade de LPS aumentada nas células mutantes BP2331. Sustentando esta interpretação está o nível aumentado de modificação da hexosamina no mutante BP2331, ver a Tabela 3.

Depois de ter tratado sobre a estrutura do LPS, LPS purificado 25 e células bacterianas integrais foram testadas quanto a sua capacidade para induzir a maturação de DCs e para estimular a produção de citocinas próinflamatórias pelos macrófagos humanos. Os resultados mostraram que, quando comparado com a cepa do tipo selvagem, a cepa mutante BP2331 demonstrou uma capacidade aumentada para induzir a maturação de DC e a produção de citocina pró-inflamatória. Resultados similares foram obtidos com LPS purificada. Ao contrário, as células bacterianas integrais e LPS purificados das cepas mutantes BP2328 e BP2329 demonstraram uma capacidade similar e diminuída para maturar DCs e estimular macrófagos, respectivamente. Estes resultados mostram que as alterações na composição de OS de núcleo do LPS diferencialmente afeta as propriedades biológicas do LPS de B. pertussis. A partir da perspectiva de desenvolvimento de vacina, esta é uma descoberta interessante, visto que isto pode permitir o desenvolvimento de cepas que mais eficientemente iniciam respostas imunes. Além disso, mutantes que demonstram uma heterogeneidade de LPS aumentada, tal como a cepa mutante BP2331, pode evocar uma grande variedade de anticorpos anti-LPS, que, por si só, pode influenciar positivamente a eficácia da vacina. A boa correlação encontrada entre o nível da DC e a ativação de macrófago por um lado e o grau de modificação de hexosamina de lipídeo A por outro lado (ver a Tabela 3), fortemente sugere

que a modificação aumentada no mutante BP2331 é crucial a este respeito.

Tabela 1

Cepa ou plasmídeo Genótipo ou descrição -onte ou Referência Cepas de B. pertussis Derivado resistente de Estreptomicina de B. pertussis cepa Tohama ICasugaet al., 1953 Mutante BP2328 da cepa B213, Stix, KmR Este estudo B213 ΔΒΡ2328 VIutante BP2329 da cepaB213, Strli, Km" Este estudo B213 ΔΒΡ2329 Mutante BP2331 da cepa B213, St/, KmR Este estudo B213 ΔΒΡ2331 E. coil F’{lacq TnlO (TetR)> mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) t>801acZAM15A!acX74 TOPIOF’ deoR recAl araD139 Δ (ara-leu) 7697 galU galK rpsL endAl nupG Invitrogen F A(lacZ,YA-algF)U169 thi-1 hsdR17 gyrA96 recAl endAl supE44 relAl DH5c phoA Φ80 d!acZAM15 Hanahan, 1983 thi thr Ieu thyA IacY supE recA::RP4-2-Tc::Mu-X pir R6K KmR N.V.L3 SMlO^pir) Plasmídeos vetor de clonagem da E. coli AmpR Promega pGEM-T Easy vetor da E. coli que abriga o cassete de resistência à canamicina, AmpR KmR VieiraeMessing, 1982 pUC4K vetor de troca alélica, bla gen rpsL onVColEl oriT 2 cos Stibitz, 1994 pSSl129 derivado de pGEM-T Easy que abriga a seqüência a montante de BP2328 Este estudo pGEM-BP2328supra derivado de pGEM-T Easy que abriga a seqüência a montante de BP2328 Este estudo pGEM-BP2328mrra derivado de pGEM-T Easy que abriga a seqüência a montante de BP2329 Este estudo pGEM-BP2329SUpra derivado de pGEM-T Easy que abriga a seqüência a jusante de BP2329 Este estudo pGEM-BP2329i,rfra derivado de pGEM-T Easy que abriga a seqüência de BP2331 Este estudo pGEM-BP2331 derivado de pSSl 129 que abriga a construção silenciada em BP2328, KmR Este estudo pSSl129-BP2328KO derivado de pSS1129 que abriga a construção silenciada em BP2329, KmR Este estudo pSSl129-ΒΡ2329κ0 derivado de pSSl 129 que abriga a construção silenciada em BP2331, KmR Este estudo pSS 1129-BP233 Iko a Netherlands Vaccine Institute, Bilthoven, The Netherlands Tabela 2

Iniciadores

Nome Seqüência (5’-3’)a BP2328 FWup TTCCGCACTTACTGGCTGAG BP2328 FWdoxvn GGATCCTCGCGGTACGACAGCACAT BP2328 REVup GGATCCTGTTGCGCGAGATGCTGGAG BP2328 REVdown CCTCATCGCCAAGGTCAATC BP2329 FWup TCACCTTCGACGACGGATAC BP2329 FWdown GGATCCGTGCGCATCTACCTGATCC BP2329 REVup GGAT C C GAAT CGAC CAC GAT GAAC BP2329 REVdown GATCCAGCTTGGCCTGGTTG BP2331 FW GTGACGTGGTGGTACATCAG BP2331 REV TGGTCTACCGCAGGAACAAT a os sítios de restrição BamHI estão sublinhados Tabela 3 Dados de ESI-MS de íon negativo e composições propostas para o LPS O-desacilado de cepas de B. pertussis do tipo selvagem e mutantes de B. pertussis BP2331, BP2328 e BP2329. As unidades de massa médias foram usadas para o cálculo dos valores da massa molecular com base em composições propostas como segue: glicose (Glc), 162,14; heptose (Hop), 192,17; ácido 2-ceto-3-desoxioctulosônico (Kdo), 220,18; fosfato (P), 79,98; glicosamina (GlcN), 161,17; hexosamina (HexN), 161,17; ácido glicurônico (GlcA), 176,13; N-acetil-glicosamina (GlcNAc), 203,19; 2-acetamido-4- N-metil-2,4-didesóxi-fucose (Fuc2NAc4NMe), 200,12; ácido 2,3-acetamido-2,3-didesóxi-manurônico (Man2NAc3NAcA), 258,09; ácido galactosaminurônico (GalNA), 175,13 e lipídeo A-OH, 953,02. A tabela não inclui adutos de sódio e

potássio e íons lipídeo A-OH isoladamente carregados (m/z 952 ([M-H]')).

Amostra íons observados Massa Molecular Abundância Composição proposta [m/z] [Da] relativa [%] ΪΜ-4Η14' [M-3H]3' ÍM-2H12· Observada Calculada 987,1 1976,2 1975,8 16,6 Gic»GlcA»Hep2».P»Kdo*lipidio A-OH WT 770,1 1155,0 2312,7 2312,1 12,8 GalNA»Glc»GlcN»GlcA»Hep2»P»Kdo· lipidio A-OH 888,3 2667,9 2665,4 4,9 GalNA«GlcGlcN2»GlcA»Hep3*?*Kdo· lipidio A-OH 811,1 1081,7 3248,3 3246,9 11,8 GlcNAc»Man2NAc3NAcA»Fuc2NAc4Nlvle»GalNA«Glc»GlcN2»GlcA»Hepj»Kdo· lipidio A-OH 27,4 GlcNAc»Man2NAc3NAcA»Fuc2NAc4NMe»GalNA«Glc»GlcN2»GlcA»Hep3».P*K.do· lipidio A-OH 831,4 1108,5 3329,0 3326,8 GlcNAc»Man2NAc3NAcA»Fuc2NAc4NMe»GalNA«Gic»GlcN»GlcA»Hep3«?»Kdo· lipidio AOH»HexN 1162,1 3489,3 3488,0 16,7 GlcNAc*Man2NAc3NAcA*Fuc2NAc4NMe*GalNA»Glc«GlcN2»GicA»Hep3»í’«Kdo· lipidio AOH*HexN 743,6 1115,2 2233,1 2232,1 13,8 GalNA»Glc»GlcN»GlcA*Hep2»Kdo· lipidio A-OH BP2328 770,0 1155,1 2312,6 2312,1 46,5 GaINA»Glc»GIcN«GlcA»Hep2«í’»Kdo· lipidio A-OH 15,3 GalNA»Glc*GlcA»Hep2*/3»Kdo· lipidio A-OH*HexN 823,7 1235,7 2473,8 2473,3 12,1 GalNA»GIcGlcN.GlcA.Hep2*P*Kdo· lipidio A-OH»HexN 1034,6 2071,2 2070,8 6,7 GalNA*Glc»GlcA»Hep2*Kdo· lipidio A-OH 1074,6 2151,2 2150,8 5,6 GaINA.Glc.GlcA.Hep2.P.Kdo· lipidio A-OH 866,0 1734,0 1733,7 8,6 GicA*Hep2*Kdo· lipidio A-OH BP2329 603,9 906,0 1814,4 1813,6 36,8 01οΑ·Ηερ2·.Ρ·Μο· lipidio A-OH 657,6 986,6 1975,5 1974,8 28,8 1067,1 2136,2 2136,0 8,4 6,6 ΒΡ2331 684,9 1027,5 2057,4 2057,0 16.3 4.3 711.5 1067,4 2137.2 2137.0 6,4 738.5 1148,0 2218,5 2218,2 6,1 765,2 2298.3 2298.1 3,7 6,3 1291,6 2585,2 2585,5 4,1 4,9 810,9 887,8 1332,0 2666,2 2665,4 5,6 1081,7 3247,9 3246,9 4,2 9,8 831,1 1108,3 3328,2 3326,8 11,7 7,3 871,2 1162,0 3488,9 3488,0 9,3 GlcN*GlcA*Hep2*P»Kdo· lipidio A-OH GIcA«Hep2»P»Kdo· lipidio A-OH»HexN

GlcN»GlcA»Hep2«JP»Kdo« lipidio A-OH»HexN_;_.

Glc»GlcN*GlcA»Hep2»Kdo· lipidio A-OH Glc»GlcA»Hep2*Kdo· lipidio A-OH·HexN Glc«GlcN*GlcA»Hep2»P»Kdo· lipidio A-OH Glc«GlcA»Hep2»í’«Kdo· lipidio A-OH*HexN Glc«GIcN*GlcA*Hep2«Kdo· lipidio A-OH«HexN GIc*GlcN*GlcA.Hep2«?»Kdo· lipidio A-OH»HexN GalNA*GIcGlcN2*GlcA»Hep3.Kdo. lipidio A-OH GalNA»Glc*GlcN«GlcA»Hep3*Kdo· lipidio A-OH·HexN GalNA»Glc*GlcN2*GlcA»Hep]«/3«Kdo· lipidio A-OH GalNA«Glc«GlcN*GIcA»Hep)»jD»Kdo· lipidio A-OH»HexN

GlcNAc«Man2NAc3NAcA*Fuc2NAc4NMe«GalNA*Glc»GlcN2»GlcA»Hep3*Kdo· lipidio A-OH GlcNAc*Man2NAc3NAcA*Fuc2NAc4NMe»GalNA«Glc*GlcN2*GlcA*Hep3*P*Kdo· lipidio A-OH GlcNAc«Man2NAc3NAcA«Fuc2NAc4NMe»GalNA»Glc»GlcN*GlcA*Hep3»?»Kdo· lipidio AOH*HexN

GlcNAc*Man2NAc3NAcA«Fuc2NAc4NMe«GalNA»Glc»GlcN2*GlcA»Hep]»/’»Kdo· lipidio AOH»HexN _ Referências

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Claims (27)

1. Polipeptídeo de glicosiltransferase, caracterizado pelo fato de que tem uma seqüência de aminoácido com pelo menos 50% de identidade com a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2.

2. Polipeptídeo de polissacarídeo desacetilase, caracterizado pelo fato de que tem uma seqüência de aminoácido com pelo menos 50% de identidade com a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1.

3. Polipeptídeo de polissacarídeo desacetilase de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que tem a SEQID NO: 1

4. Polipeptídeo de glicosiltransferase de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem a SEQ ID NO: 2.

5. Polipeptídeo de polissacarídeo desacetilase de acordo com as reivindicações 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é obtido de uma espécie de Bordetella, preferivelmente Bordetellapertussis.

6. Polipeptídeo de glicosiltransferase de acordo com as reivindicações 1 ou 4, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é obtido de uma espécie de Bordetella, preferivelmente Bordetella pertussis.

7. Seqüência de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações .1 e/ou 4 e/ou 6.

8. Seqüência de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações .2 e/ou 3 e/ou 5.

9. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende a seqüência de ácido nucleico como definida na reivindicação 7.

10. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende a seqüência de ácido nucleico como definida na reivindicação 8.

11. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 10.

12. Vetor de inativação, caracterizado pelo fato de que compreende a construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 9.

13. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de expressão como definido na reivindicação 11 e/ou o vetor de inativação como definido na reivindicação 12.

14. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma cepa de Bordetella pertussis.

15. Lipopolissacarídeo (LPS), caracterizado pelo fato de que é obtenível a partir da célula hospedeira como definida nas reivindicações 13 ou 14.

16. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a célula hospedeira como definida nas reivindicações 13 ou 14 e/ou o LPS como definido na reivindicação 15.

17. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um antígeno.

18. Célula hospedeira de acordo com as reivindicações 13 ou14 ou LPS de acordo com a reivindicação 15, caracterizadafo) pelo fato de que são para o uso como um medicamento.

19. Célula hospedeira e/ou LPS de acordo com a reivindicação 18, caracterizadafo) pelo fato de que são para o uso como uma vacina contra a coqueluche.

20. Célula hospedeira e/ou LPS de acordo com a reivindicação 18, caracterizadafo) pelo fato de que são para o uso como um adjuvante.

21. Célula hospedeira e/ou LPS de acordo com a reivindicação 20, caracterizadaío) pelo fato de que a célula hospedeira e/ou LPS são usados em combinação com um antígeno.

22. Uso da célula hospedeira como definida nas reivindicações 13 ou 14 e/ou do lipopolissacarídeo (LPS) como definido na reivindicação 15, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento da coqueluche.

23. Uso da célula hospedeira como definida na reivindicação 13 ou 14 e/ou do LPS como definido na reivindicação 15, caracterizado pelo fato de ser como um adjuvante.

24. Uso de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de ser em combinação com um antígeno para a preparação de um medicamento para incitar uma resposta imune contra o antígeno.

25. Uso de um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6 e/ou uma seqüência de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 7 ou 8, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento da coqueluche.

26. Uso de um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6 e/ou da seqüência de ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 7 ou 8, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um adjuvante.

27. Uso de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de ser em combinação com um antígeno para a preparação de um medicamento para incitar uma resposta imune contra o antígeno.