RU2461624C2 - Fad-2-мутанты и растения с высоким содержанием олеиновой кислоты - Google Patents
Fad-2-мутанты и растения с высоким содержанием олеиновой кислоты Download PDFInfo
- Publication number
- RU2461624C2 RU2461624C2 RU2008141698/10A RU2008141698A RU2461624C2 RU 2461624 C2 RU2461624 C2 RU 2461624C2 RU 2008141698/10 A RU2008141698/10 A RU 2008141698/10A RU 2008141698 A RU2008141698 A RU 2008141698A RU 2461624 C2 RU2461624 C2 RU 2461624C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nucleic acid
- plant
- fad2
- seq
- wild
- Prior art date
Links
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 54
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 54
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 54
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 54
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 title claims abstract description 54
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 54
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 title claims abstract description 54
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims abstract description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 87
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 68
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 68
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 49
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 49
- 101150058769 FAD2 gene Proteins 0.000 claims description 37
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 25
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 21
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 17
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 12
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 4
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 claims description 2
- 101000877236 Siganus canaliculatus Acyl-CoA Delta-4 desaturase Proteins 0.000 claims 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 claims 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 123
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 abstract description 19
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 abstract description 19
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 abstract description 19
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 abstract description 18
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 65
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 48
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 description 30
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 16
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 13
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 12
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 9
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 9
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 9
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 8
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 8
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 4
- 241000270725 Caiman Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- XIWFQDBQMCDYJT-UHFFFAOYSA-M benzyl-dimethyl-tridecylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 XIWFQDBQMCDYJT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N diazepam Chemical compound N=1CC(=O)N(C)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- -1 CAPVERT Chemical compound 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- 101150086146 FAD2-2 gene Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 2
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 108010007577 Exodeoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102100029075 Exonuclease 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150016855 FAD2-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100446349 Glycine max FAD2-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- NHTMVDHEPJAVLT-UHFFFAOYSA-N Isooctane Chemical compound CC(C)CC(C)(C)C NHTMVDHEPJAVLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000003225 biodiesel Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003195 fascia Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002614 leucines Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- FLTJDUOFAQWHDF-UHFFFAOYSA-N trimethyl pentane Natural products CCCCC(C)(C)C FLTJDUOFAQWHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
- C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии растений. Настоящее изобретение включает растение вида Brassica napus, которое имеет мутантные последовательности, придающие маслу из семян высокий профиль олеиновой кислоты. В частности, настоящее изобретение относится к мутантным последовательностям дельта-12-десатуразы жирных кислот, которые увеличивают содержание олеиновой кислоты в растении. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 10 ил., 2 табл., 3 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к растениям, семенам и продуктам, их производным, в частности к растениям рода Brassica, продуктам семян, полученным из них, которые имеют мутантные последовательности, придающие маслу из семян высокий профиль олеиновой кислоты.
Более конкретно, изобретение относится к мутантным последовательностям дельта-12-десатуразы жирных кислот, также обозначенным в настоящей заявке как мутантные FAD2-последовательности в таких растениях, которые придают маслу из семян высокий профиль олеиновой кислоты.
Предшествующий уровень техники
Дельта-12-десатураза жирных кислот (также известная как олеиндесатураза или десатураза олеиновой кислоты) участвует в ферментативном превращении олеиновой кислоты в линоленовую кислоту.
Сорта с высоким содержанием олеиновой кислоты (возможно в комбинации с низким уровнем линоленовой кислоты) используются для многих различных приложений (для применения в пищевой промышленности, применения в здравоохранении, применения в качестве биодизельного топлива и пр.).
Ранее в литературе сообщалось, что мутантные семена, из которых получают масло, с высоким содержанием олеиновой кислоты (содержание олеиновой кислоты выше 70% веса из расчета на общий вес присутствующих в масле жирных кислот) имеют недостаточную агрономическую ценность, и/или плохие характеристики корневой системы, и/или очень низкую продуктивную способность.
Все еще существует потребность в материале, имеющем стабильно высокое содержание олеиновой кислоты (возможно в сочетании со стабильно низким содержанием линоленовой кислоты) на всей территории его выращивания и на протяжении ряда лет, а также с хорошими агрономическими характеристиками и с нормальной морфологией семян масличной культуры. В частности, растения не должны иметь фасциации и должны иметь нормальное развитие корневой системы.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к растению, или части растения, или семени, содержащему первый ген FAD2 и, возможно, второй ген FAD2, причем указанный первый или указанный второй ген FAD2 имеют делецию в положении 1421 и в соответствующем ему положении (также обозначаемый как DEL.1421) в сравнении с геном FAD2 дикого типа, таким как ген FAD2 дикого типа с последовательностью SEQ ID NO 9.
Другим объектом настоящего изобретения является растение, или часть растения, или семя, содержащее первый ген FAD-2, имеющий делецию в положении 1421 или в соответствующем ему положении в сравнении с геном FAD2 дикого типа, таким как ген FAD2 дикого типа с последовательностью SEQ ID NO 9, и второй ген FAD2, кодирующий FAD-2-белок, имеющий замену аминокислоты в положении 118 или в соответствующем ему положении в сравнении с белком FAD-2 дикого типа, таким как белок FAD-2 дикого типа с последовательностью SEQ ID NO 2 или 6.
Растение, или часть растения, или семя согласно изобретению предпочтительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую SEQ ID NO 1 или 5, в которой нуклеотид (C) в положении 215 удален, или содержащую (вариантную) последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO 1 или 5, в которой нуклеотид, соответствующий положению 215, удален.
Растение, или часть растения, или семя согласно изобретению может содержать (вариантную) последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO 9, в которой нуклеотид, соответствующий положению 1421, удален (т.е. с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1421). Предпочтительно, растение, или часть растения, или семя согласно изобретению содержит последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую SEQ ID NO 9, в которой нуклеотид в положении 1421 удален (т.е. с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1421).
Растение, или часть растения, или семя согласно изобретению может содержать (различную) последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO 10, в которой нуклеотид, соответствующий положению 1453, удален (т.е. с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1453). Предпочтительно, чтобы растение, или часть растения, или семя согласно изобретению содержало последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую SEQ ID NO 10, в которой нуклеотид в положении 1453 удален (т.е. с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1453).
Предпочтительное растение, или часть растения, или семя согласно изобретению дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок FAD-2, имеющий замену аминокислоты в положении 118 или в соответствующем ему положении в сравнении с белком FAD-2 дикого типа, таким как белок FAD2 дикого типа с последовательностью SEQ ID NO 2 или 6. Предпочтительно, указанной замещенной аминокислотой в положении 118 или соответствующем положении является фенилаланин.
Растение, или часть растения, или семя согласно изобретению может быть получено посредством обработки мутагеном, в частности обработки этилметансульфонатом (EMS).
Другим объектом настоящего изобретения является изолированная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая (или состоящая из) последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 1 или 5, в которой нуклеотид в положении 215 удален (т.е. SEQ ID NO 1 или 5 с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 215).
Объектом изобретения также является (вариантная) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок FAD2 (или фрагмент указанного белка), по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичная SEQ ID NO 1 или 5, в которой нуклеотид, соответствующий положению 215, удален (т.е. с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 215).
Изолированная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может содержать (или состоять из) (вариантную) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок FAD2 (или фрагмент), по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO 9, в которой нуклеотид, соответствующий положению 1421, удален (т.е. с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1421). Предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению содержала (или состояла из) последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 9, в которой нуклеотид в положении 1421 удален (т.е. SEQ ID NO 9 с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1421).
Изолированная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может содержать (или состоять из) (вариантную) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок FAD2 (или фрагмент), по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO 10, в которой нуклеотид, соответствующий положению 1453, удален (т.е. с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1453). Предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению содержала (или состояла из) последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 10, в которой нуклеотид в положении 1453 удален (т.е. SEQ ID NO 10 с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1453).
Предпочтительная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению содержит (состоит из) последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 3, комплементарную ей форму или форму ее РНК.
Также объектом изобретения является фрагмент по меньшей мере из 10 нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере из 15, 20, 25, 30 или 40 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере из 50 или 100 нуклеотидов изолированной молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, причем указанный фрагмент содержит мутантный кодон, полученный в результате указанной делеции.
Другим объектом настоящего изобретения является способ получения линий растений с высоким содержанием олеиновой кислоты, включающий в себя
a) индукцию мутагенеза предпочтительно посредством обработки EMS по меньшей мере в некоторых клетках растения, в частности, растения рода Brassica, и предпочтительно, сорта Brassica napus, у которого содержание олеиновой кислоты менее 70%;
b) регенерацию растения по меньшей мере из одной указанной мутантной клетки;
c) селекцию регенерировавших растений, которые имеют последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению; и
d) получение следующих поколений растений из указанных регенерировавших растений.
Указанные регенерировавшие растения содержат последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, и еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO 9, в которой нуклеотид, соответствующий положению 1421, удален (т.е. с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1421), или последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, и еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO 10, в которой нуклеотид, соответствующий положению 1453, удален (т.е. с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1453).
Предпочтительно, чтобы указанные регенерировавшие растения содержали последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 9, в которой нуклеотид 1421 удален (т.е. SEQ ID NO 9 с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1421), или последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 10, в которой нуклеотид 1453 удален (т.е. SEQ ID NO 10 с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 1453), или последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 3.
Более предпочтительно, чтобы указанные регенерировавшие растения дополнительно содержали последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок FAD-2, имеющий замену аминокислоты в положении 118 или в соответствующем ему положении в сравнении с белком FAD2 дикого типа, таким как белок FAD2 дикого типа SEQ ID NO 2 или 6. Предпочтительно, чтобы указанной замещенной аминокислотой в положении 118 или в соответствующем ему положении являлся фенилаланин.
Стадия c) может включать в себя любой способ, известный в области техники, с тем, чтобы идентифицировать указанную(ые) мутацию(ии) (DEL.1421, DEL.1453, DEL.215 и , возможно, SNP1590), в частности стадия c) может включать в себя применение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP), определение полиморфизмов путем случайной амплификации (RAPD) или методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Другим объектом настоящего изобретения является способ получения линий растений с высоким содержанием олеиновой кислоты, включающий в себя
i. скрещивание первого растения согласно изобретению со вторым растением,
ii. получение семян после скрещивания на стадии (a),
iii. выращивание фертильных растений из таких семян,
iv. получение семян от потомства растений на стадии (c) и
v. идентификацию среди потомства тех семян, которые обладают высоким содержанием олеиновой кислоты.
Стадия (v) по идентификации указанных семян может включать в себя использование молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению.
Более конкретно, стадия (v) может включать в себя любой способ, известный в данной области, с тем, чтобы идентифицировать указанную(ые) мутацию(и) согласно изобретению, и, более конкретно, стадия (v) может включать в себя использование полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP), обнаружение полиморфизмов путем случайной амплификации (RAPD) или метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Другой объект настоящего изобретения относится к растительному маслу, полученному из семян согласно изобретению, причем указанное масло содержит более чем (приблизительно) 72%, 75%, 80% или 85% олеиновой кислоты из расчета на общий вес присутствующих в указанном масле жирных кислот.
Предпочтительно, чтобы растительное масло согласно изобретению дополнительно содержало менее чем (приблизительно) 4%, 3,5%, 3%, 2%, 1% или 0,5% линоленовой кислоты.
Краткое описание фигур
Фиг.1 соответствует списку последовательностей согласно изобретению.
Фиг.2 соответствует документам о депонировании сортов MSP05, 28DHS.086 и MSP12.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к растениям, в частности к растениям рода Brassica, предпочтительно, к сортам Brassica napus, из которых получают масло, обладающее содержанием олеиновой кислоты выше чем 70% по весу из расчета на общий вес присутствующих в масле жирных кислот.
Более конкретно, растение согласно изобретению содержит по меньшей мере один мутантный ген FAD2 согласно изобретению.
Предпочтительно, чтобы указанный мутантный ген FAD2 наделял семена указанных растений и масло, экстрагированное из указанных семян, высоким содержанием олеиновой кислоты (то есть когда содержание олеиновой кислоты выше чем 70% по весу из расчета на общий вес присутствующих в масле жирных кислот).
Настоящее изобретение относится также к любой части или любому продукту указанного растения, имеющему по меньшей мере один мутантный ген FAD2.
В контексте настоящего изобретения под частью или продуктом растения подразумевают лист, семядолю, стебель, черешок, стебель, семя или любую другую ткань или фрагмент ткани указанного растения.
Настоящее изобретение относится также к любому потомству указанного растения, имеющему по меньшей мере один мутантный ген FAD2 согласно изобретению.
В контексте настоящего изобретения термин "потомство" относится к прямым и косвенным потомкам, потомству и производным растения или растений согласно изобретению и включает в себя первое, второе, третье и/или последующие поколения, которые могут быть получены посредством самоопыления, скрещивания с растениями такого же или отличного генотипа и могут быть модифицированы многими подходящими методами генной инженерии.
Настоящее изобретение относится также к указанным мутантным генам FAD2, которые, если присутствуют в растении, наделяют семена высоким содержанием олеиновой кислоты.
В частности, изобретение относится к новым изолированным молекулам нуклеиновой кислоты, которые соответствуют новым вариантным формам генов FAD2 с делецией нуклеотида в положении 1421 или в соответствующем ему положении в сравнении с геном FAD2 дикого типа, например геном FAD2 дикого типа, представленным последовательностью SEQ ID NO 9.
Указанная делеция изменяет функции продукта гена FAD2, посредством чего в растении, в котором экспрессируется мутантная последовательность(и), уровень олеиновой кислоты повышается по сравнению с соответствующим уровнем в растении, в котором экспрессируется последовательность(и) дикого типа.
В частности, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может содержать (или состоять из) нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична любой из SEQ ID NO 9 или ее комплементарной форме или форме ее РНК, в которой нуклеотид в положении 1421 или в соответствующем ему положении удален (то есть дополнительно удален нуклеотид, соответствующий положению 1421).
Молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению, которая содержит указанную делецию в положении 1421 или в соответствующем ему положении (также обозначаемая как DEL.1421), может быть получена из сортов Brassica napus, например из сортов CONTACT, CABRIOLET, 28DHS.086 и/или MSP12.
Термином "в положении 1421" обозначают нуклеотид в положении 1421 в гене FAD2 дикого типа, представленном последовательностью SEQ ID NO 9, а также нуклеотид, соответствующий указанному положению в гене дикого типа или вариантном гене, который будет иметь отличную последовательность нуклеиновой кислоты из-за делеций или добавочных нуклеотидов в последовательности.
Термин "соответствующий положению" в настоящем описании означает, что положение определено не только числом предшествующих нуклеотидов. Положение данного нуклеотида в соответствии с настоящим изобретением может измениться из-за делеций или добавочных нуклеотидов в последовательности нуклеиновой кислоты. Таким образом, под "соответствующим положением" в соответствии с настоящим изобретением следует подразумевать, что нуклеотид, на который ссылаются, может отличаться по указанному номеру, но все еще имеет сходные соседние нуклеотиды в линейной последовательности. Например, таким положением являются положение 1453 в SEQ ID NO 10 или положение 215 в SEQ ID NO 1 или 5.
Точно также термин "в положении 118" следует понимать как обозначение положения аминокислоты 118 в белке FAD2 дикого типа, представленном последовательностью SEQ ID NO 2 или 6, а также как ссылку на аминокислоту, соответствующую указанному положению в белке дикого типа или вариантом белке FAD2, который будет иметь отличную аминокислотную последовательность из-за делеций или добавочных аминокислот в полипептиде.
Термин "соответствующий положению" в настоящем описании означает, что положение не только определено числом предшествующих аминокислот. Положение данной аминокислоты в соответствии с настоящим изобретением может измениться из-за делеций или добавочных аминокислот в полипептиде. Таким образом, под "соответствующим положением" согласно изобретению следует подразумевать, что аминокислота(ы), на которую(ые) ссылаются, может(гут) отличаться по указанному номеру, но все еще имеет(имеют) сходные соседние аминокислоты в линейной последовательности.
В другом аспекте молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению кодирует белок FAD2, в котором аминокислота в положении 118 или в соответствующем ему положении заменена в сравнении с белком FAD2 дикого типа, например белком FAD2 дикого типа, представленным последовательностью SEQ ID NO 2 или 6.
Изолированная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению содержит по меньшей мере одну мутацию, причем указанная мутация приводит к указанной замене в положении 118 или в соответствующем ему положении, предпочтительно, замене лейцина на триптофан, более предпочтительно, замене на фенилаланин, в сравнении с белком FAD2 дикого типа, таким как белок FAD2 дикого типа, представленный последовательностью SEQ ID NO 2 или 6.
Указанная мутация (мутации) изменяет функциональные свойства полученного продукта гена FAD2, посредством чего в растении, в котором экспрессируется(ются) мутантная(ые) последовательность(и), изменяется уровень олеиновой кислоты, предпочтительно, увеличивается по сравнению с соответствующим уровнем в растении, в котором экспрессируется(ются) последовательность(и) дикого типа.
В частности, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению кодирует белок FAD2, имеющий замену лейцина в положении 118 на фенилаланин, в сравнении с белком FAD2 дикого типа, представленным аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 6.
Молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может содержать (или состоять из) последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 1, 5, 9 или 10, в которой кодон, кодирующий аминокислоту в положении 118, имеет по меньшей мере одну мутацию, в результате чего кодирует отличную от лейцина аминокислоту и предпочтительно кодирует фенилаланин в положении 118 согласно белку FAD2 согласно изобретению.
Другими словами, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может содержать (или состоять из) последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 1, 5, 9 или 10, которая дополнительно содержит по меньшей мере одну мутацию в кодоне, кодирующем аминокислоту в положении 118, в результате кодирующем отличную от лейцина аминокислоту и предпочтительно кодирующем фенилаланин в положении 118.
Предпочтительная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению содержит (или состоит из) последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 7.
В другом аспекте молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может кодировать белок FAD2, имеющий делецию в положении 118 относительно белка FAD2 дикого типа, например белка FAD2 дикого типа, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2 или 6.
Более конкретно, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может кодировать белок FAD2, в котором в сравнении с белком FAD2, представленным аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2 или 6, лейцин в положении 118 удален.
Молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может содержать (или состоять из) последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 1, 5, 7, 9 или 10, в которой кодон, кодирующий аминокислоту в положении 118, удален (то есть SEQ ID NO 1, 5, 7, 9 или 10 с дополнительно удаленным кодоном, кодирующим аминокислоту в положении 118).
Как будет очевидно для специалистов, последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 1, 5, 7, 9 и 10 не являются единственными последовательностями, которые могут быть использованы для получения белка FAD2 согласно изобретению. Также предполагаются любые молекулы нуклеиновой кислоты, имеющие различные последовательности, но которые в силу вырожденности генетического кода кодируют белок FAD2, содержащий замену аминокислоты в положении 118 (или в соответствующем ему положении) в сравнении с аминокислотной последовательностью дикого типа, такой как последовательность белка FAD2 дикого типа SEQ ID NO 2 или 6.
В частности, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может содержать (или состоять из) нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична любой из SEQ ID NO 1, 5, 7, 9 и 10, или их комплементарной форме, или форме их РНК, кодирующим белок FAD2, имеющий замену аминокислоты в положении 118 в сравнении с белком FAD2 дикого типа.
Молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению, имеющая указанную мутацию(и), приводящую к указанной замене аминокислоты в положении 118, может быть получена из сортов Brassica napus, таких как сорт 28DHS.086 и/или сорт MSP12.
В частности, в молекуле нуклеиновой кислоты согласно изобретению есть мутация в положении 1590 (также обозначаемая как SNP1590) последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 10, которая вызывает изменение в генетическом кодоне с CTT на TTT, приводящее к замене аминокислоты в положении 118 относительно аминокислотной последовательности дикого типа, такой как белок FAD2 дикого типа, представленный последовательностью SEQ ID NO 6.
Изолированная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению, содержащая указанную мутацию SNP1590, приводящую к замене лейцина в положении 118 на фенилаланин, изменяет функциональные свойства полученного продукта гена FAD2, посредством чего уровень олеиновой кислоты в растении, в котором экспрессируется мутантная последовательность, увеличен по сравнению с соответствующим уровнем в растении, в котором экспрессируется последовательность дикого типа.
В рамках настоящего изобретения термин "SNP1590" относится к однонуклеотидному полиморфизму, соответствующему указанной мутации в положении 1590 нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 10, и может также относиться к соответствующей мутации в любой молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей белок FAD2 согласно изобретению с заменой аминокислоты в положении 118 (или в соответствующем 118 положении) в сравнении с белком FAD2 дикого типа, таким как белок FAD2 дикого типа, представленным последовательностью SEQ ID NO 2 или 6.
Рассматривается любой фрагмент молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению по меньшей мере из 10, 15, 20, 25, 50, 100 или более нуклеотидов, содержащий по меньшей мере одну мутацию, приводящую к белку FAD2 согласно изобретению.
В частности, рассматривается фрагмент молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению по меньшей мере из 10, 15, 20, 25, 50, 100 или более нуклеотидов, содержащий указанную делецию DEL1421, DEL1453 или DEL215 или указанный SNP1590.
Также рассматривается фрагмент молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению по меньшей мере из 20, 25, 50, 100 или более нуклеотидов, включающий указанную DEL1421 и указанный SNP1590.
Такие фрагменты могут быть использованы в качестве праймеров, в качестве зондов и/или в качестве маркеров.
Фрагменты нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть использованы в качестве маркеров при генетическом картировании в растениях.
В частности, фрагменты нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть использованы в качестве маркеров в программах по селекции растений.
Такие маркеры могут включать в себя полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (RFLP), обнаружение полиморфизма путем случайной амплификации (RAPD), полимеразную цепную реакцию (ПЦР) или, например, самоподдерживающуюся репликацию последовательностей (3SR).
Методики маркер-опосредованной селекции могут быть использованы для идентификации и селекции растений согласно изобретению или его потомства, также являющегося объектом изобретения, в процессе селекции.
Методики маркер-опосредованной селекции могут быть использованы в дополнение или в качестве альтернативы другим видам методов идентификации.
Примером маркер-опосредованной селекции является использование ПЦР-праймеров, которые специфически амплифицируют молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению.
Настоящее изобретение, таким образом, связано со способами анализа сегрегации и селекции генетических гибридов, включающих в себя растения, имеющие последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению.
Объектом настоящего изобретения также является молекула нуклеиновой кислоты по меньшей мере из 10 или 15 нуклеотидов, предпочтительно, из 20, 25, 50, 100 или более нуклеотидов, которая в жестких условиях гибридизуется с любой последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO 1, 3, 5, 7 и с 9 по 12, которая содержит (или дополнительно содержит) мутацию согласно изобретению.
Примером жестких условий гибридизации является гибридизация приблизительно при 50°C, или при приблизительно 60°C или выше, и 0.1xSSC (буфер 0,15 M NaCl, 0,015 M тринатрия цитрат).
Способ согласно изобретению может, например, включать в себя определение наличия в геноме конкретных аллелей FAD2, содержащих по меньшей мере указанную делецию в (или соответствующем) положении 1421 в сравнении с геном FAD2 дикого типа, таким как ген FAD2 дикого типа, представленный последовательностью SEQ ID 9, и/или указанную замену, SNP1590, (приводящую к замене лейцина на фенилаланин) в (или соответствующем) положении 118 в сравнении с белком FAD2 дикого типа, таким как белок FAD2 дикого типа SEQ ID NO 2 или 6.
Такое определение можно, например, осуществить рядом методов, таких как ПЦР-амплификация, ДНК-«фингерпринт», РНК-«фингерпринт», гель-блоттинг и RFLP-анализ, методы защиты от нуклеазы, секвенирование соответствующего фрагмента нуклеиновой кислоты, получение антител (моноклональных или поликлональных) или альтернативные методы, предназначенные для различения белков, полученных с использованием соответствующих аллелей от других вариантных форм такого белка или от формы дикого типа.
В частности, такие фрагменты могут быть использованы в способе маркер-опосредованной селекции характеристик растений с высоким содержанием олеиновой кислоты, предпочтительно для видов рода Brassica, более конкретно для сортов Brassica napus.
Другой аспект настоящего изобретение относится к рекомбинантной нуклеотидной последовательности, содержащей одну или несколько смежных регуляторных последовательностей, функционально связанных с нуклеотидной последовательностью согласно изобретению. Указанная смежная регуляторная последовательность предпочтительно происходит из соответствующих организмов.
Однако указанные смежные регуляторные последовательности могут также происходить из несоответствующих организмов.
Указанные смежные регуляторные последовательности являются определенными последовательностями, такими как промоторы, энхансеры, последовательности сигнала секреции и/или терминаторы.
Другой аспект изобретения относится к вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению, возможно, функционально связанную с одной или несколькими смежными регуляторными последовательностями, происходящими из соответствующего или из несоответствующего организмов.
В контексте настоящего изобретения "вектор" определен как любой биохимический конструкт, который может быть использован для введения нуклеотидной последовательности (посредством трансдукции, трансфекции, трансформации, инфекции, конъюгации и т.д.) в клетку.
Преимущественно вектор согласно изобретению выбран из группы, состоящей из плазмид (включая реплицирующиеся и интегрирующиеся плазмиды), вирусов, фагмид, хромосом, транспозонов, липосом, катионных пузырьков или их смеси. Указанный вектор может уже содержать одну или более смежных регуляторных последовательностей, обеспечивающих экспрессию указанной молекулы нуклеиновой кислоты и ее транскрипцию в полипептид согласно изобретению.
Настоящее изобретение охватывает также любой пептид, который все еще обладает дельта-12-олеиндесатуразной активностью, полученный в результате экспрессии нуклеиновой кислоты согласно изобретению, содержащей указанную делецию (DEL1421, DEL1453 или DEL215), как, например, пептид SEQ ID NO 4.
Молекулы нуклеиновой кислоты, рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты и/или векторы согласно изобретению являются подходящими для трансформации растений-мишеней и, таким образом, наделяют растение, в котором экспрессируется мутантный FAD2 согласно изобретению, измененным продуктом гена FAD2, в результате чего уровень олеиновой кислоты изменяется, предпочтительно, возрастает, по сравнению с соответствующим уровнем в растении, в котором экспрессируется последовательность дикого типа.
Настоящее изобретение относится также к трансформированной клетке-хозяину или рекомбинантной клетке-хозяину, содержащей (или в которую включена) одну или несколько нуклеотидных последовательностей и/или векторов согласно изобретению, имеющих делецию 1421.
В контексте настоящего изобретения "трансформированная клетка-хозяин" или "рекомбинантная клетка", также называемая "трансформантом", является клеткой, содержащей одну или несколько нуклеотидных последовательностей и/или векторов согласно изобретению. Трансформированная клетка-хозяин может быть клеткой, в которой указанный вектор(ы) и/или указанная нуклеотидная последовательность(и) введены посредством генетического трансформации, предпочтительно посредством гомологической рекомбинации или посредством любых других известных способов, применяемых при получении рекомбинантного организма.
Любой способ, посредством которого новая последовательность может быть включена в геном хозяина, рассматривается в настоящем изобретении.
В частности, любой способ, посредством которого новая последовательность может быть включена в геном хозяина и стабильно унаследована его потомством, рассматривается в настоящем изобретении.
В настоящее время существует широкий диапазон методов для достижения прямой или косвенной трансформации высших растений экзогенной ДНК.
Трансформация растительных клеток может быть произведена с использованием векторов. В общепринятой методике достижения трансформации используют Agrobacterium tumefaciens для введения чужеродного гена в растительную клетку-мишень.
Вирусы растений также являются возможным средством для переноса экзогенной ДНК.
Может быть использован также прямой захват растительной клеткой. Как правило, протопласты растения-мишени помещают в культуру в присутствии молекул нуклеиновой кислоты, которые будут перенесены, и вещества, которое обеспечивает поглощение протопластом указанных молекул нуклеиновой кислоты. Полезными веществами в этом отношении являются полиэтиленгликоль или фосфат кальция.
В качестве альтернативы поглощение молекул нуклеиновой кислоты может стимулироваться путем электропорации. В этом способе для временного открытия пор в мембране протопласта клетки используется электрический импульс, и указанные молекулы нуклеиновой кислоты из окружающего раствора поступают в клетку через поры. Точно также для доставки указанных молекул нуклеиновой кислоты непосредственно в клетку и, предпочтительно, непосредственно в ядро клетки, можно использовать микроинъецирование.
В этих методах трансформация происходит в растительной клетке в культуре. После этапа трансформации растительные клетки могут быть регенерированы в целые растения.
Известны методы для регенерации зрелых растений из каллюса или культуры протопласта.
Также доступны дополнительные способы, которые не обязательно требуют использования изолированных клеток и, соответственно, способов регенерации растений для достижения трансформации. Такие способы обычно обозначаются как "баллистические", или способы “ускорения частиц”, в которых частицы металла, покрытые молекулами нуклеиновой кислоты, доставляются в растительные клетки посредством или заряда пороха, или электрического разряда. Таким же образом растительные клетки в культуре или репродуктивная система растения, или клетки, например пыльца, могут быть устойчиво трансформированы представляющими интерес молекулами нуклеиновой кислоты.
Настоящее изобретение может быть использовано для трансформации фактически любого типа растений, однодольных растений или двудольных растений.
Подходящие растения, которые предстоит трансформировать, являются предпочтительно масличными культурами, такими как подсолнечник, соя, хлопок, зерновые и т.д., предпочтительно, рода Brassica, более предпочтительно, сорта Brassica napus.
Настоящее изобретение относится к растению, или части растения, или семени, содержащему первый ген FAD2 и, возможно, второй ген FAD2, причем указанный первый или указанный второй ген FAD2 имеют указанную делецию (DEL.1421, DEL.1453 или DEL.215).
В частности, растение, или часть растения, или семя согласно изобретению содержит первый ген FAD2 и, возможно, второй ген FAD2, причем указанный первый или указанный второй ген FAD2 имеет делецию в положении 1421 или в соответствующем ему положении (обозначаемый также DEL.1421) в сравнении с геном FAD2 дикого типа, таким как ген FAD2 дикого типа с последовательностью SEQ ID NO 9.
Предпочтительно, растение, или часть растения, или семя согласно изобретению содержит первый ген FAD-2, имеющий делецию в положении 1421 или в соответствующем ему положении в сравнении с геном FAD2 дикого типа, таким как ген FAD2 дикого типа с SEQ ID NO 9, и второй ген FAD2, кодирующий белок FAD-2, имеющий замену аминокислоты в положении 118 или соответствующем положении в сравнении с белком FAD-2 дикого типа, таким как белок FAD-2 дикого типа с SEQ ID NO 2 или 6.
В частности, растение, или часть растения, или семя согласно изобретению предпочтительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую SEQ NO 1 или 5, в которой нуклеотид (C) в положении 215 удален (то есть соответствующая SEQ ID NO 1 или 5 с дополнительно удаленным нуклеотидом в положении 215), или содержит (вариантную) последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную SEQ ID NO 1 или 5, в которой нуклеотид, соответствующий положению 215, удален (то есть с SEQ ID NO 1 или 5 с дополнительно удаленным нуклеотидом, соответствующим положению 215).
Примерами таких растений являются сорта CONTACT и CABRIOLET, которые являются зарегистрированными сортами.
Предпочтительное растение, или часть растения, или семя согласно изобретению дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую FAD-2 белок, имеющий замену аминокислоты в положении 118 или в соответствующем ему положении в сравнении с белком FAD-2 дикого типа, таким как белок FAD2 дикого типа с SEQ ID NO 2 или 6. Предпочтительно, чтобы указанной замещенной аминокислотой в положении 118 или в соответствующем ему положении являлся фенилаланин.
Примерами таких растений являются сорта 28DHS.086 и MSP12.
Сорт MSP05 зарегистрирован согласно Будапештскому Договору о Международном Признании Депонирования Микроорганизмов для Патентной Процедуры под инвентарным номером NCIMB 41233, присвоенным 9 июля 2004 года.
Сорт 28DHS.086 зарегистрирован согласно Будапештскому Договору о Международном Признании Депонирования Микроорганизмов для Патентной Процедуры под инвентарным номером NCIMB 41365, присвоенным 22 декабря 2005 года.
Сорт MSP12 зарегистрирован согласно Будапештскому Договору о Международном Признании Депонирования Микроорганизмов для Патентной Процедуры под инвентарным номером NCIMB 41374, присвоенным 10 февраля 2006 года.
Мутантное растение, или часть растения, или семя согласно изобретению проявляет неожиданное преимущество в развитии хорошей корневой системы. Более конкретно, относясь к мутантному сорту Brassica napus согласно изобретению, основной корень и вторичная корневая система имеют длину, сопоставимую (сходную) с длиной основного корня и вторичной корневой системы сортов дикого типа. Для сравнения, мутантный Brassica napus, полученный способом, описанным в WO98/56239, имеет основной корень намного меньший, чем у особи дикого типа, и его вторичная корневая система существенно ослаблена.
Растение, или часть растения, или семя согласно изобретению может быть получено путем обработки мутагеном, более предпочтительно путем обработки этилметансульфонатом (EMS).
Другим объектом настоящего изобретения является способ получения линий растений с высоким содержанием олеиновой кислоты, включающий в себя (a) скрещивание первого растения со вторым растением, имеющим по меньшей мере один ген FAD2, содержащий указанную делецию согласно изобретению, (b) получение семян от гибридов на стадии (a), (c) выращивание фертильных растений из таких семян, (d) получение семян потомства от растений со стадии (c), (e) идентификацию таких семян среди потомства, которые обладают высоким содержанием олеиновой кислоты.
В указанном способе получения линий растений с высоким содержанием олеиновой кислоты указанное второе растение предпочтительно имеет второй мутантный ген FAD2, содержащий мутацию SNP1590.
В другом аспекте изобретение связано со способом увеличения содержания олеиновой кислоты в растениях, более конкретно в растениях рода Brassica и, предпочтительно в растениях Brassica napus, включающим в себя следующие стадии:
(a) индукцию мутагенеза по меньшей мере в нескольких клетках растения, более конкретно, растения рода Brassica и, предпочтительно, растения Brassica napus, у которого содержание олеиновой кислоты составляет менее 70%;
(b) регенерацию растения по меньшей мере из одной указанной мутантной клетки;
(c) селекцию регенерировавших растений, которые имеют последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению и/или которые экспрессируют белок FAD2 согласно изобретению; и
(d) получение следующих поколений растений из указанных регенерировавших растений.
Предпочтительно, из семян указанных растений получают масло, имеющее содержание олеиновой кислоты более чем 70 вес.%, более предпочтительно, более чем 75 вес.% из расчета на общий вес присутствующих в масле жирных кислот.
Другим объектом настоящего изобретения является растительное масло, полученное по меньшей мере из одного растения согласно изобретению, причем это растительное масло содержит более чем (приблизительно) 70%, 72%, 75%, 80% или 85% олеиновой кислоты.
Более конкретно, растительное масло согласно изобретению, предпочтительно, полученное по меньшей мере из одного сорта рода Brassica согласно изобретению, более предпочтительно, по меньшей мере из одного сорта Brassica napus согласно изобретению, содержит более чем (приблизительно) 70%, 72%, 75%, 80% или 85% олеиновой кислоты. Указанное масло дополнительно содержит менее чем (приблизительно) 4%, 3,5%, 3%, 2%, 1% или 0,5% линоленовой кислоты относительно общего веса присутствующих в масле жирных кислот.
Предпочтительно, чтобы указанное масло содержало более чем (приблизительно) 70%, 72%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90%, предпочтительно, от (приблизительно) 70% до (приблизительно) 90%, более предпочтительно, от (приблизительно) 72% до (приблизительно) 89% олеиновой кислоты. Указанное масло дополнительно содержит менее чем (приблизительно) 4%, 3,5%, 3%, 2%, 1% или 0,5%, предпочтительно, от (приблизительно) 4% до (приблизительно) 0,4% линоленовой кислоты относительно общей массы жирных кислот, присутствующих в масле.
Согласно предпочтительному варианту осуществления два двойных низких озимых сорта рапса (ENVOL и LIBERATOR) были обработаны этилметансульфонатом (EMS) в 1992 году. Обработку EMS в концентрации 2,5% и 5% проводили в течение 4 часов или 8 часов.
Поколение М1 выращивали в оранжерее после 8 недель яровизации в камере роста и затем собирали в июле 1993 г.
Семена М1 были высеяны в поле в сентябре 1993 г., накрыты мешочками в начале цветения, и семена M2 были собраны в июле 1994 г.
Семена M2 были высеяны в сентябре 1994 г., накрыты мешочками в начале цветения, и семена M3 были собраны в июле 1995 г.
Далее потомства анализировали на предмет определения состава жирных кислот, используя аналитический метод на основе газовой хроматографии, который является общеизвестным в данной области.
Все потомства с содержанием олеиновой кислоты выше 68% были сохранены.
Отобранное потомство повторно высевали в поле в сентябре 1995 г., накрывали мешочками в апреле, затем собирали в июле 1996 г.
На этой стадии потомство подвергали скринингу на предмет определения хороших агрономических и морфологических характеристик, таких как хорошая всхожесть семян, хорошая осенняя ростовая способность, хорошая зимостойкость, хорошая корневая система, хорошая резистентность к фомозу и пятнистости листьев на свету, а также превосходная устойчивость к полеганию.
Материал, который был слишком высок и слишком поздно всходил, был устранен, также как и материал, который образовывал сильную фасциацию.
Анализ оставшегося потомства методом газовой хроматографии был снова проведен для селекции особей с уровнями олеиновой кислоты выше 68%. Все такие особи были высажены в поле в сентябре 1996-1997 г.
Потомство под названием MUT 152-96 выглядело особенно интересным в силу агрономических и морфологических характеристик, а также по содержанию в нем олеиновой кислоты. Это потомство выращивали в изоляции в течение вегетационного периода в сентябре 1996-1997 г. Наиболее интересные из потомков [MUT 152-96] по агрономическим и морфологическим характеристикам были отобраны для дальнейшей расфасовки и скрещивания. Скрещивание производили с озимыми масличными сортами рапса, имеющими обычно в два раза более низкий профиль жирных кислот (то есть содержание олеиновой кислоты ниже 70%) или с низким содержанием линоленовой кислоты (то есть менее чем приблизительно 3,5%), для выведения линий с высоким содержанием олеиновой кислоты в сочетании с низким содержанием линоленовой кислоты (HOLL).
Материал подвергали внутриродовому скрещиванию, самоопылению по меньшей мере до поколения F7.
Ко всем поколениям применяли сильное давление отбора против фасциаций и в сторону нормального развития растения и нормальной корневой системы.
Состав жирных кислот проверяли в каждом поколении и оставляли только материал с содержанием олеиновой кислоты выше 75% и содержанием линоленовой кислоты ниже 3,5%.
Таким способом были получены различные сорта HOLL, такие, например, как MSP05.
И посредством скрещивания сорта MSP05 и сорта CABRIOLET был получен сорт 28DHS.086.
MSP12 был получен посредством такого же способа размножения, что и MSP05, но в качестве исходного родителя, вместо родителей, имеющих обычный профиль жирных кислот, был использован CONTACT.
Использованными в этой работе сортами, у которых обычные профили жирных кислот вдвое ниже были BRISTOL, CAPITOL, CAPVERT, VIVOL и CAIMAN, и эти сорта размножали или поддерживали, используя такую же схему поддержания, как описано в настоящем описании выше для линий HOLL (в соответствии с техническими правилами, изданными "GNIS" и отредактированными SEDIS, например, смотрите выпуск 2003, издание 1, pp.135-147, которые относятся к злаковым растениям).
Для определения содержания жирных кислот в испытаниях - небольших исследовательских испытаниях (6-12 м2) или испытаниях на этапе разработки (500 м2) и для работы по секвенированию - использовали элитные семена.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Семена перемалывали в первом растворе, состоящем из метанола (800 мл), триметилпентана (200 мл) и 5 г NaOH. Приблизительно на 10 г семян использовали приблизительно 3 мл раствора (другими словами, приблизительно 10-50 семян на 1 мл раствора).
Экстракцию проводили в течение 20 минут и после этого добавляли второй раствор, состоящий из триметиламина (900 мл) и пропанола-2 (100 мл), в таком же объеме, как и первый раствор.
Полученный раствор перемешивали на вортексе и оставляли отстаиваться до образования верхней фазы.
Верхнюю фазу отбирали и переносили в пробирки.
Один микролитр полученного раствора вносили в газовый хроматограф (Fisons от thermo-electron с колонкой DB3-30 метров с диаметром 0,25 мм и толщиной 25 микрометров). Продолжительность измерения составляла приблизительно 4 минуты.
Результаты по содержанию олеиновой кислоты вкратце изложены в таблице 1.
| Таблица 1 | ||
| Сорта | Содержание олеиновой кислоты (вес.%) | Оценка |
| CONTACT | 71,8-75,2 | Высокое |
| CABRIOLET | 73,2-76,8 | Высокое |
| 28DHS086 | 80,3-83,1 | Очень высокое |
| MSP12 | 80,3-83,5 | Очень высокое |
| MSP05 | 78,1-81,9 | Очень высокое |
| BRISTOL | 61,4-65,7 | Нормальное |
| VIVOL | 60,8-63,2 | Нормальное |
| CAPVERT | 58,9-65,9 | Нормальное |
| CAIMAN | 61,9-64,0 | Нормальное |
| CAPITOL | 59,7-64,6 | Нормальное |
Содержание олеиновой кислоты из расчета на общую массу жирных кислот, присутствующих в экстрагированном масле.
Пример 2
Материалы растений, использованные для секвенирования:
- мутантные линии с более высоким содержанием олеиновой жирной кислоты: CONTACT, CABRIOLET и 28DHS.086; и
- сорта дикого типа с нормальным содержанием олеиновой кислоты: Bristol, Capitol, Vivol, Capvert и Caiman.
Все эти линии выращивали в камере роста, и у 7-дневных растений собирали семядоли и стебли.
Растительные ткани лиофилизировали и использовали для экстракции ДНК.
ДНК выделяли с помощью наборов Qiagen Plant DNA (Qiagen INC.-USA, Valencia CA).
ПЦР выполняли по протоколу TaqGold (AB Biosystem, Inc.).
Реакционная смесь содержала 2,5 мкл 10× буфера, 0,2 мкл TaqGold, 0,2 мкл dNTP (25 мМ), 2 мкл праймеров (5 мкМ) и 10 мкл ДНК матрицы (2 нг/мкл) и 10,1 мкл H2O.
Циклы ПЦР были следующие: 94°C 5 минут; 8 циклов 94°C 40 секунд, 62°C 40 секунд, 72°C 1 минута, 94°C 40 секунд, 60°C 40 секунд, 72°C 1 минута, 94°C 40 секунд, 58°C 40 секунд, 72°C 1 минута, 94°C 40 секунд, 56°C 40 секунд, 72°C 1 минута; 3 цикла 94°C 40 секунд, 55°C 40 секунд, 72°C 1 минута; задержка на 72°C в течение 7 минут.
Продукты ПЦР анализировали на 1% агарозном геле.
Для секвенирования 5 мкл продуктов ПЦР и 1 мкл экзонуклеазы I (разведение 1:50) и 1 мкл щелочной фосфатазы креветок (разведение 1:5) переносили в новую пробирку.
Смесь инкубировали при 37°C в течение 20 минут и затем при 80°C в течение 15 минут для инактивации ферментов.
Добавляли 40 мкл H2O и 6 мкл использовали в качестве матрицы с 1 мкл праймера для секвенирования.
Секвенирование выполняли на анализаторе ДНК 3730 DNA Analyzer (поставляемый компанией Biosystems).
Последовательности собирали и выравнивали, используя программу SeqMan II от LaserGene (DNASTAR, INC, Madison. WI).
Пример 3
Четыре последовательности гена дельта-12-олеиндесатуразы (FAD2) Brassica napus, 4684997, 46399190, 8705228 и 4092878, загружали из Genebank (NCBI). Эти последовательности использовали в качестве запросов для поиска в базе данных последовательностей Monsanto.
Используя программы "blastn" (NCBI), получали несколько результатов с высокой оценкой попадания. Все найденные последовательности были загружены и повторно обработаны программой SeqmanII (DNASTAR Inc, Madison, Wisconsin, США).
Два различных транскрипта было идентифицировано и обозначено Fad2-1 (SEQ ID NO 11) и Fad2-2 (SEQ ID NO 12). Fad2-1 и Fad2-2 имеют высокую гомологию последовательностей с 97% идентичностью последовательностей.
Для идентификации причинных мутаций, связанных с высоким содержанием олеиновой кислоты в мутантных линиях и их потомствах, были разработаны вложенные праймеры, полностью покрывающие последовательности.
3'-конец праймера всегда располагался у нуклеотида, которым Fad2-1 отличался от Fad2-2, кроме тех, которые располагались на 5'- и 3'-концах консенсусных последовательностей, в которых не было нуклеотида, отличного между этими двумя генами.
Праймеры были также разработаны таким способом, чтобы каждый ампликон накладывался на другой, с тем, чтобы гарантировать полное покрытие всей последовательности. Эти праймеры упорядочивали и использовали для получения локус-специфических ампликонов у мутантов и у дикого типа. Результаты секвенирования указывают, что все локус-специфические ПЦР-праймеры отжигались, как ожидалось.
Последовательности, принадлежащие одному и тому же гену, собирали вместе с помощью программы SeqManII.
Консенсусные геномные последовательности генов Fad2-1 и Fad2-2 дикого типа представлены в SEQ ID NO 9 и 10 соответственно.
В таблице 2 суммированы характеристики последовательностей обоих генов Fad2-1 и Fad2-2.
| Таблица 2 | ||
| Характеристики | Положение в FAD2-1 | Положение в FAD2-2 |
| Ген | 1-2601 | 1-2666 |
| 5'UTR | 1-1206 | 1-1238 |
| Экзон | 1-108 | 1-111 |
| Интрон | 109-1202 | 112-1234 |
| Экзон | 1207-2601 | 1235-2619 |
| CDS | 1207-2361 | 1239-2393 |
| 3'UTR | 2362-2601 | 2394-2666 |
Характеристики основаны на консенсусных геномных последовательностях после нескольких прочтений с различных генотипов.
Оба гена Fad2-1 и Fad2-2 имеют каждый по одному интрону.
Размеры интрона немного различаются между двумя генами. Для Fad2-1 интрон охватывает 1105 п.н., начиная с положения 109 по 1213, в то время как для Fad2-2 интрон состоит из 1123 п.н., начиная с положения 112 по 1234 в консенсусных последовательностях.
Интрон расположен в 5'UTR-области.
Предполагаемые кодоны инициации трансляции имеют положения 1207 и 1239 для генов Fad2-1 и Fad2-2 соответственно.
Кодоны терминации трансляции имеют положения 2370-2372 и 2391-2393 соответственно для Fad2-1 и Fad2-2.
3'UTR-последовательности составляют 247 пар оснований для гена Fad2-1 и 273 пары оснований для гена Fad2-2.
Делеция в положении 1421 (обозначенная как DEL.1421) гена FAD2-1 вызывала сдвиг рамки считывания в генетических кодонах, приводящий к преждевременной терминации полипептидов.
Точечная мутация в положении 1590 (SNP1590) гена FAD2-2 (как представлено в SEQ ID NO 7) вызывала замену аминокислотного остатка с лейцина (CTT) на фенилаланин (TTT).
И лейцин, и фенилаланин являются по природе гидрофобными и имеют некоторые общие аминокислотные свойства, но фенилаланин содержит большую жесткую ароматическую группу в боковой цепи, которая вызывает некоторые изменения в функции фермента.
Кроме того, в сочетании с DEL.215 эта мутация более заметно отражается на фенотипе.
Комбинацией различных аллелей с этими мутациями создавали градиент содержания олеиновой кислоты, как это можно наблюдать в различных мутантных линиях (смотрите таблицу 1).
Две мутантные линии, 28DHS.086 и MSP12, несли двойные мутации по DEL1421 и SNP1590. Поскольку обе мутации были миссенс-мутациями, функции гена FAD2 были сильно изменены, что привело к самому высокому содержанию олеиновой кислоты в этой мутантной линии.
Нужно отметить, что сорта Brassica napus, несущие только мутацию SNP1590, демонстрируют нормальное содержание олеиновой кислоты (то есть содержание олеиновой кислоты эквивалентно содержанию олеиновой кислоты у диких типов).
Две мутантные линии, CONTACT и CABRIOLET, несли единственную точечную мутацию в DEL.1421, приводящую к несколько меньшему содержанию олеиновой кислоты по сравнению с двойными мутантами.
Вкратце, данные последовательностей убедительно свидетельствуют о том, что такие мутации в Fad2-1 и Fad2-2 ассоциированы с содержанием олеиновой кислоты в различных мутантных линиях.
Идентификация причинных вариаций в последовательностях крайне важна для создания диагностических анализов, специфичных для каждого мутантного аллеля.
Познание взаимосвязей между вариациями последовательностей и фенотипами может позволить создать методы анализа маркеров для точного предсказания содержания олеиновой кислоты в растениях без необходимости проведения химического анализа содержания жирных кислот.
Claims (4)
1. Фрагмент нуклеиновой кислоты для применения в качестве праймера, содержащий 20-50 последовательных нуклеотидов выделенной молекулы нуклеиновой кислоты последовательности SEQ ID NO 1 или SEQ ID NO 5; или для применения в качестве маркера или зонда, содержащий, по меньшей мере, 20 последовательных нуклеотидов выделенной молекулы нуклеиновой кислоты последовательности SEQ ID NO 1 или SEQ ID NO 5, где фрагмент содержит мутированный кодон, полученный в результате делеции в положении 215.
2. Растение Brassica napus, имеющее повышенное содержание олеиновой кислоты, содержащее первый ген FAD2, где нуклеотид в положении, соответствующем положению 1421 SEQ ID NO 9, удален, и второй ген FAD2, имеющий замену аминокислоты в положении, соответствующем положению 118, относительно белка FAD2 дикого типа, такого как белок FAD2 дикого типа последовательности SEQ ID NO 2 или 6.
3. Набор для анализа для селекции растений с помощью маркера, включающий контейнер, содержащий фрагмент нуклеиновой кислоты по п.1 для применения в качестве праймеров, зондов и/или маркеров.
4. Набор для анализа по п.3, дополнительно включающий нуклеотидный фрагмент, содержащий, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов выделенной молекулы нуклеиновой кислоты последовательности SEQ ID NO 10, где указанный фрагмент содержит мутированный кодон в положении 1590, причем указанный нуклеотидный фрагмент применяют в качестве праймеров, зондов и/или маркеров.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP06290457A EP1837397A1 (en) | 2006-03-21 | 2006-03-21 | FAD-2 mutants and high oleic plants |
| EP06290457.8 | 2006-03-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2008141698A RU2008141698A (ru) | 2010-04-27 |
| RU2461624C2 true RU2461624C2 (ru) | 2012-09-20 |
Family
ID=37309824
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008141698/10A RU2461624C2 (ru) | 2006-03-21 | 2007-03-21 | Fad-2-мутанты и растения с высоким содержанием олеиновой кислоты |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8143485B2 (ru) |
| EP (2) | EP1837397A1 (ru) |
| AR (1) | AR060041A1 (ru) |
| AU (1) | AU2007228741B2 (ru) |
| CA (1) | CA2644669C (ru) |
| DK (1) | DK2004812T3 (ru) |
| ES (1) | ES2609696T3 (ru) |
| HU (1) | HUE030561T2 (ru) |
| PL (1) | PL2004812T3 (ru) |
| RU (1) | RU2461624C2 (ru) |
| UA (1) | UA96442C2 (ru) |
| WO (1) | WO2007107590A2 (ru) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007092569A1 (en) | 2006-02-07 | 2007-08-16 | Battelle Memorial Institute | Esters of 5 -hydroxymethylfurfural and methods for their preparation |
| CA2693630C (en) | 2006-07-14 | 2021-08-31 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Altering the fatty acid composition of rice |
| AU2009273754B2 (en) * | 2008-07-21 | 2016-07-14 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Improved cottonseed oil and uses |
| CA2768737A1 (en) | 2008-07-21 | 2010-01-28 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Improved vegetable oils and uses therefor |
| AU2009311636B2 (en) * | 2008-11-04 | 2015-05-28 | Corteva Agriscience Llc | Omega-9 quality Brassica juncea |
| MX2011006961A (es) | 2008-12-31 | 2011-09-27 | Battelle Memorial Institute | Uso de acidos grasos como material de alimentacion en el proceso de poliol. |
| MX2011007002A (es) | 2008-12-31 | 2012-09-28 | Battelle Memorial Institute | Pre-esterificacion de polioles primarios para mejorar la solubilidad en solventes usados en el proceso de poliol. |
| BRPI0923801B1 (pt) | 2008-12-31 | 2020-10-13 | Battelle Memorial Institute | Métodos para produzir um éster, e para produzir amidas |
| JP6075952B2 (ja) | 2008-12-31 | 2017-02-08 | バテル・メモリアル・インスティテュートＢａｔｔｅｌｌｅ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ | 最初の脂肪酸の酸化的開裂と次のエステル化反応によるエステルとポリオールの製造 |
| US9359572B2 (en) | 2009-03-13 | 2016-06-07 | Battelle Memorial Institute | Modified vegetable oil lubricants |
| WO2011075716A1 (en) | 2009-12-18 | 2011-06-23 | Cargill, Incorporated | Brassica plants yielding oils with a low total saturated fatty acid content |
| WO2011150028A2 (en) | 2010-05-25 | 2011-12-01 | Cargill, Incorporated | Brassica plants yielding oils with a low alpha linolenic acid content |
| US9695434B2 (en) | 2010-05-25 | 2017-07-04 | Cargill, Incorporated | Brassica plants yielding oils with a low alpha linolenic acid content |
| WO2012000026A1 (en) | 2010-06-28 | 2012-01-05 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Methods of producing lipids |
| US8754290B2 (en) | 2011-02-09 | 2014-06-17 | Dow Agrosciences, Llc | HO/LL canola with resistance to clubroot disease |
| JP6425381B2 (ja) * | 2011-02-22 | 2018-12-05 | アグリジェネティクス，インコーポレイテッド | オメガ９形質を有する強化キャノーラ粕栄養価をもたらす種子の組成上の属性を示すキャノーラ生殖質 |
| GB201103569D0 (en) * | 2011-03-02 | 2011-04-13 | Plant Bioscience Ltd | Mutants |
| EP3447151A1 (en) * | 2011-09-27 | 2019-02-27 | Dow AgroSciences LLC | Ho/ll canola with resistance to clubroot disease |
| RU2639508C2 (ru) * | 2011-10-21 | 2017-12-21 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Способ определения зиготности гена fad-2 канолы с использованием пцр с детекцией по конечной точке |
| US11639507B2 (en) | 2011-12-27 | 2023-05-02 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Processes for producing lipids |
| AU2012324024B2 (en) | 2011-12-27 | 2016-06-16 | Nuseed Global Innovation Ltd | Processes for producing lipids |
| US8809026B2 (en) | 2011-12-27 | 2014-08-19 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Processes for producing lipids |
| UA116538C2 (uk) | 2012-04-25 | 2018-04-10 | Коммонвелт Сайнтіфік Енд Індастріел Рісерч Організейшн | Насінина сафлору з високим вмістом олеїнової кислоти |
| MX2017000109A (es) | 2014-07-07 | 2017-05-23 | Commw Scient Ind Res Org | Procesos para producir productos industriales de lipidos vegetales. |
| CA2983893A1 (en) | 2015-04-28 | 2016-11-03 | Bayer Cropscience Nv | Brassica plants with modified seed oil composition |
| CA3035570A1 (en) | 2016-09-02 | 2018-03-08 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Plants with modified traits |
| CA3095047A1 (en) * | 2018-04-04 | 2019-10-10 | Cibus Us Llc | Fad2 genes and mutations |
| CN109295253A (zh) * | 2018-11-16 | 2019-02-01 | 山东省花生研究所 | 高油酸花生快速选种试剂盒 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU99104591A (ru) * | 1996-08-14 | 2001-01-20 | БРУКХЕЙВЕН САЙЕНС АССОШИЭЙТС, ЭлЭлСи | Модифицированная ацил-аср десатураза |
| US20050039233A1 (en) * | 2002-05-15 | 2005-02-17 | Saskatchewan Wheat Pool | High oleic acid Brassica juncea |
Family Cites Families (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB642718A (en) | 1942-10-24 | 1950-09-13 | Severoceske Tukova Zd Y Drive | Process for the esterification of fatty acids with low-molecular univalent alcohols |
| US4627192B1 (en) * | 1984-11-16 | 1995-10-17 | Sigco Res Inc | Sunflower products and methods for their production |
| AU639319B2 (en) | 1990-04-04 | 1993-07-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Production of improved rapeseed exhibiting a reduced saturated fatty acid content |
| JPH0539497A (ja) | 1991-01-23 | 1993-02-19 | Tsukishima Shokuhin Kogyo Kk | 耐寒性植物油 |
| DK0668919T3 (da) | 1992-11-17 | 2003-09-15 | Du Pont | Gener for mikorsomale delta-12-fedtsyredesaturaser og beslægtede enzymer fra planter |
| AT397966B (de) | 1993-01-25 | 1994-08-25 | Wimmer Theodor | Verfahren zur herstellung von fettsäureestern niederer einwertiger alkohole |
| AU692791B2 (en) * | 1993-10-12 | 1998-06-18 | Agrigenetics, Inc. | Brassica napus variety AG019 |
| US5338471A (en) * | 1993-10-15 | 1994-08-16 | The Lubrizol Corporation | Pour point depressants for industrial lubricants containing mixtures of fatty acid esters and vegetable oils |
| BR9504838A (pt) * | 1994-11-15 | 1997-10-07 | Lubrizol Corp | Ester de poliol composição de óleo lubrificante |
| EP0743973B2 (en) * | 1994-12-13 | 2013-10-02 | Infineum USA L.P. | Fuel oil composition containing polyoxyalkylenes |
| CA2557769A1 (en) | 1995-12-14 | 1997-06-19 | Cargill, Incorporated | Plants having mutant sequences that confer altered fatty acid profiles |
| AU750363B2 (en) * | 1997-06-12 | 2002-07-18 | Cargill Incorporated | Fatty acid desaturases and mutant sequences thereof |
| US6312623B1 (en) * | 1996-06-18 | 2001-11-06 | Abb Power T&D Company Inc. | High oleic acid oil compositions and methods of making and electrical insulation fluids and devices comprising the same |
| CA2180386C (en) | 1996-07-03 | 2006-09-12 | Lorin R. Debonte | Canola oil having increased oleic acid and decreased linolenic acid content |
| US5705391A (en) * | 1996-08-14 | 1998-01-06 | Associated Universities, Inc. | Modified acyl-ACP desaturase |
| US7109392B1 (en) * | 1996-10-09 | 2006-09-19 | Cargill, Incorporated | Methods for increasing oleic acid content in seeds from transgenic plants containing a mutant delta 12 desaturase |
| AU761152B2 (en) | 1998-03-17 | 2003-05-29 | Cargill Incorporated | Genes for mutant microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants |
| FI111513B (fi) * | 1998-05-06 | 2003-08-15 | Raisio Benecol Oy | Uudet fytosteroli- ja fytostanolirasvahappoesterikoostumukset, niitä sisältävät tuotteet sekä menetelmät niiden valmistamiseksi |
| US6534454B1 (en) | 2000-06-28 | 2003-03-18 | Renewable Lubricants, Inc. | Biodegradable vegetable oil compositions |
| US20030229237A1 (en) | 2002-04-02 | 2003-12-11 | Haas Michael J. | In situ production of fatty acid alkyl esters |
| CA2515684C (en) | 2003-02-11 | 2015-10-06 | Xueyi Hu | Altered fad2 and fad3 genes in brassica and the molecular marker-assisted detection thereof |
| DE10357877B4 (de) * | 2003-12-11 | 2008-05-29 | Clariant Produkte (Deutschland) Gmbh | Brennstofföle aus Mitteldestillaten und Ölen pflanzlichen oder tierischen Ursprungs mit verbesserten Kälteeigenschaften |
| US20080168705A1 (en) * | 2004-07-02 | 2008-07-17 | Monsanto S.A.S. | Biofuel Composition |
| AU2006208701A1 (en) | 2005-01-28 | 2006-08-03 | Bayer Bioscience N.V. | Brassica plant comprising a mutant fatty acid desaturase |
| US7579306B2 (en) | 2005-03-02 | 2009-08-25 | Chemtura Corporation | Method for improving the oxidative stability of industrial fluids |
| EP1741770A1 (en) * | 2005-07-04 | 2007-01-10 | Monsanto S.A.S. | Use of rapeseed oil in biolubricants |
| EP1806398A1 (en) | 2006-01-04 | 2007-07-11 | Monsanto S.A.S. | Fad-2 mutants and high oleic plants |
| EP1862551A1 (en) | 2006-05-29 | 2007-12-05 | Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) | Genetic markers for high oleic acid content in plants |
-
2006
- 2006-03-21 EP EP06290457A patent/EP1837397A1/en not_active Withdrawn
-
2007
- 2007-03-21 CA CA2644669A patent/CA2644669C/en active Active
- 2007-03-21 WO PCT/EP2007/052702 patent/WO2007107590A2/en active Application Filing
- 2007-03-21 HU HUE07727178A patent/HUE030561T2/en unknown
- 2007-03-21 PL PL07727178T patent/PL2004812T3/pl unknown
- 2007-03-21 US US12/282,696 patent/US8143485B2/en active Active
- 2007-03-21 EP EP07727178.1A patent/EP2004812B1/en active Active
- 2007-03-21 ES ES07727178.1T patent/ES2609696T3/es active Active
- 2007-03-21 UA UAA200812339A patent/UA96442C2/ru unknown
- 2007-03-21 AR ARP070101157A patent/AR060041A1/es unknown
- 2007-03-21 AU AU2007228741A patent/AU2007228741B2/en active Active
- 2007-03-21 RU RU2008141698/10A patent/RU2461624C2/ru active
- 2007-03-21 DK DK07727178.1T patent/DK2004812T3/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU99104591A (ru) * | 1996-08-14 | 2001-01-20 | БРУКХЕЙВЕН САЙЕНС АССОШИЭЙТС, ЭлЭлСи | Модифицированная ацил-аср десатураза |
| US20050039233A1 (en) * | 2002-05-15 | 2005-02-17 | Saskatchewan Wheat Pool | High oleic acid Brassica juncea |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TOPFER R et al. Modification of Plant Lipid Synthesis. Science. (1995), vol.268, p.681-688. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2644669A1 (en) | 2007-09-27 |
| UA96442C2 (ru) | 2011-11-10 |
| PL2004812T3 (pl) | 2017-05-31 |
| AR060041A1 (es) | 2008-05-21 |
| EP1837397A1 (en) | 2007-09-26 |
| ES2609696T3 (es) | 2017-04-21 |
| RU2008141698A (ru) | 2010-04-27 |
| WO2007107590A3 (en) | 2007-11-15 |
| AU2007228741B2 (en) | 2012-04-19 |
| AU2007228741A1 (en) | 2007-09-27 |
| CA2644669C (en) | 2017-03-07 |
| US20090202703A1 (en) | 2009-08-13 |
| EP2004812A2 (en) | 2008-12-24 |
| DK2004812T3 (en) | 2017-01-23 |
| WO2007107590A2 (en) | 2007-09-27 |
| HUE030561T2 (en) | 2017-06-28 |
| EP2004812B1 (en) | 2016-11-02 |
| US8143485B2 (en) | 2012-03-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2461624C2 (ru) | Fad-2-мутанты и растения с высоким содержанием олеиновой кислоты | |
| RU2484137C2 (ru) | Мутанты fad-2 и высокоолеиновые растения | |
| US20100196580A1 (en) | Fad-2 mutants and high oleic acid plants | |
| US6967243B2 (en) | Fatty acid desaturases and mutant sequences thereof | |
| CA2293810C (en) | Fatty acid desaturases and mutant sequences thereof | |
| CN102202496B (zh) | 抗性基因 | |
| US7541519B2 (en) | Fatty acid desaturases and mutant sequences thereof | |
| US20030150020A1 (en) | Plant fatty acid desaturases and alleles therefor | |
| AU2005244560B2 (en) | Fatty acid desaturases and mutant sequences thereof | |
| AU2006202694A1 (en) | Plant fatty acid desaturases and alleles therefor |