RU2389507C2 - Лечение рака - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к новым лекарственным средствам и препаратам, включающим эффективные противораковые средства вместе с анти-Hsp90 антителом, которые вместе обеспечивают повышенную эффективность при лечении рака и лейкоза. 10 н. и 38 з.п. ф-лы, 25 табл.

Description

Настоящее изобретение относится к новым лекарственным средствам и препаратам, включающим эффективные фармацевтические средства вместе с анти-Hsp90 антителом, которые вместе обеспечивают повышенную эффективность при лечении разных форм рака, включая рак ободочной и прямой кишки. Другие аспекты изобретения касаются лечения лейкозов.

Лечение рака и лечение лейкоза

Первый аспект настоящего изобретения относится к новым лекарственным средствам и препаратам, включающим эффективные противораковые средства вместе с анти-Hsp90 антителом, которые вместе обеспечивают повышенную эффективность при лечении рака.

В последние годы появились члены семейства белков теплового шока (Hsp) как играющие важную роль в онкогенезе и гибели клеток. Действительно, белки теплового шока в течение многих лет были идентифицированы как потенциальные мишени для лечения рака (Whitesell L et al., PNAS USA, 1994 Aug 30, 91(18): 8324-8; PMID: 8078881), и члены семейства ансамицина (ранее именовавшиеся ингибиторами тирозинкиназы) были предложены в качестве средств, которые можно применять для осуществления лечения рака (Neckers L et al., Invest New Drugs, 1999, 17(4): 361-73; PMID: 10759403; Schulte TW et al., Cancer Chemother Pharmacol., 1998, 42(4): 273-9; PMID: 9744771).

Считалось, что один белок теплового шока, Hsp90, участвует в развитии карциномы молочных желез, предстательной железы, меланомы, лейкозов и лимфом, ободочной кишки и легких (Banerji U et al., Curr Cancer Drug Targets, 2003 Oct; 3(5): 385-90; PMID: 14529390), а также карцином щитовидной железы. Роль Hsp90 состоит в обеспечении правильной укладки «client proteins», которые участвуют в широком разнообразии клеточных процессов, например передаче сигналов. «Client proteins» Hsp90 включают факторы транскрипции, такие как индуцируемый р53 и гипоксией фактор 1α, и растворимые киназы, включая v-Src, Akt, Raf-1, и Bcr-Abl. Hsp90 конститутивно экспрессирован в опухолевых клетках на уровнях, в 2-10 раз превышающих их уровень в нормальных клетках, свидетельствуя о том, что он может быть важным для роста/выживания опухолевых клеток (Schwartz, J., et al,. 2003, Semin. Hematol. 40:p87-96). Поскольку связывание «client proteins» Hsp90 может регулировать их конформацию, то их устойчивость и судьба Hsp90 в клетке может оказывать существенное воздействие на пути, которые регулируют клеточный исход, включая рост, деление, дифференциацию, движение и гибель клеток (Workman, P., Cancer Lett. 2004 Apr 8; 206(2):149-57; PMID: 15013520). Значительная роль Hsp90 в клеточных процессах означает, что этот белок в настоящее время рассматривается как возможная мишень для разработки терапевтических лекарственных средств. Ингибиторы Hsp90 путем специфического взаимодействия с одиночной молекулярной мишенью вызывают дестабилизацию и конечное разрушение «client protein»s Hsp90.

Второй аспект настоящего изобретения относится к новым лекарственным средствам и препаратам, включающим эффективные противораковые средства вместе с анти-Hsp90 антителом, которые вместе обеспечивают повышенную эффективность при лечении лейкоза.

Лейкоз представляет собой рак, который поражает костный мозг. У людей с лейкозом костный мозг продуцирует большие количества патологических лейкоцитов. Патологические лейкоциты скапливаются в костном мозге, так что костный мозг не может производить достаточного количества нормальных эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов.

Различные типы лейкоза можно разделить на категории по скорости их развития (острый или хронический) и по типу пораженных лейкоцитов (миелоидные или лимфоидные клетки). Миелоидные лейкоциты представляют собой первую линию защиты иммунной системы против инфекции, и они обнаруживаются главным образом в крови, где они захватывают и уничтожают инородные организмы. Лимфоидные лейкоциты обнаруживаются в лимфатических узлах и в крови.

Четыре наиболее часто встречающихся типа лейкозов включают хронический лимфоидный (лимфоцитарный) лейкоз (CLL), острый миелоидный (миелобластический) лейкоз (AML), острый лимфоидный (лимфобластический) лейкоз (ALL) и хронический миелоидный лейкоз (CML).

CLL представляет собой также рак лимфоцитарных клеток, но он развивается медленнее, чем ALL. Это заболевание представляет собой наиболее часто встречающийся тип лейкоза, поражающего взрослых, и очень редко наблюдается у детей.

AML представляет собой рак, главным образом поражающий миелоидные клетки, известные как гранулоциты. Он создает слишком много миелобластов, которые могут блокировать кровеносные сосуды и недостаточно зрелые миелоидные клетки. Это заболевание возникает главным образом у взрослых, но может также поражать детей.

CML (также именуемый хроническим гранулоцитарным лейкозом) представляет собой обычно медленно прогрессирующий рак нейтрофильных клеток, который редко встречается у детей и обычно больше поражает взрослых мужчин, чем женщин. CML обычно легко диагностируется, потому что лейкозные клетки более чем 95% пациентов имеют отчетливую цитогенетическую аномалию, филадельфийскую хромосому (Ph1) (Kurzrock, R. et al., 2003, Ann. Intern. Med. 138 (10): p819-30, PMID: 12755554; Goldman, J.M. and Melo, J.V., 2003, N. Engl. J. Med. 349 (15): p1451-64, PMID: 14534339). Ph1 возникает в результате реципрокной транслокации между длинными плечами хромосом 9 и 22, и ее можно продемонстрировать во всех гематопоэтических предшественниках (Deininger, M.W. et al., 2000, Blood 96 (10): p3343-56, PMID: 11071626). Эта транслокация приводит к переносу онкогена Abelson (abl) на хромосоме 9 в область хромосомы 22, именуемую областью кластера точечного разрыва (BCR) (Deininger, M.W. et al., 2000, Blood 96 (10): p3343-56, PMID: 11071626). Это, в свою очередь, приводит к получению гибридного гена BCR/ABL, который кодирует химерную мРНК 8,5 т.п.н. Ген BCR/ABL представляет собой онкоген, который достаточен для получения у мышей заболевания, подобного CML. Транскрипт онкогена BCR/ABL транслируется для выхода белка 210 кДа или 190 кДа. Белок Bcr-Abl представляет собой аномальный белок протеинкиназы, который вызывает нарушение миелопоэза, обнаруживаемое при CML. CML прогрессирует через определенные клинические стадии, называемые хронической фазой, ускоренной фазой и бластным кризом. Онкоген BCR/ABL экспрессируется на всех стадиях, но бластный криз характеризуется множественными дополнительными генетическими и молекулярными изменениями (Gorre, M.E., et al., 2002, Blood, 100(8): p3041-3044).

Ph1-негативный CML представляет собой редкое заболевание, которое характеризуется клиническими характеристиками CML без цитогенетических или молекулярных (RT-PCR) доказательств транслокации t(9;22)(q34;q11), приводящей к конденсированной мРНК Bcr-Abl. Ph1-негативный CML представляет собой низко дифференцированную нозологическую форму, которая менее четко отличается от других миелопролиферативных синдромов. Ранее считалось, что Ph1-негативный CML составляет 5-10% всех клинических форм CML, но в настоящее время, при обычной доступности анализа RT-PCR для выявления транскрипта Bcr-Abl, это количество составляет существенно ниже 5%. Интересно, что у некоторых пациентов эта нозологическая форма может возникать в результате альтернативного слияния с Abl. Слияние TEL(ETV6)-ABL как результат t(9;12) было продемонстрировано в двух случаях Ph- CML. Пациенты с Ph1-негативным CML в целом имеют более слабую реакцию на лечение и меньшую продолжительность жизни, чем пациенты с Ph1-положительным CML (Onida, F. et al., 2002: Cancer 95 (8): p1673-84, PMID: 12365015).

ALL представляет собой рак из незрелых лимфоцитарных клеток, известных как лимфобласты. Это заболевание представляет собой самый распространенный тип лейкоза у маленьких детей, обычно в возрасте от 1 до 7 лет, и он достаточно редок у взрослых. ALL вызывает продукцию множества патологических лимфоцитов, которые вытесняют нормальные эритроциты и тромбоциты. Считалось, что белок Bcr-Abl 185 кДа прямо связан с развитием ALL.

Два препарата, гелданамицин (GA) и 17-аллиламино, 17-десметоксигелданамицин (17-AAG), которые действуют в качестве ингибиторов Hsp90, проявили перспективную биологическую и клиническую активность в клинических испытаниях. Действительно, гибридный белок Bcr-Abl 210 кДа (p210^Bcr-Abl) зависит от его связи с Hsp90 для его устойчивости, и обработка клеток GA или 17-AAG ведет к быстрому разрушению p210^Bcr-Abl.

Ингибитор Hsp90, такой как 17-AAG, в комбинации с обычными цитотоксическими средствами или другими новыми средствами, также были бы терапевтически ценными в воздействии на многоэтапный онкогенез (Workman P., Cancer Lett. 2004 Apr 8; 206(2):149-57; PMID: 15013520). В раковых клетках, которые характеризуются генетической неустойчивостью, возможно, что 17AAG блокированием активности Hsp90 высвобождает разнообразные мутации, которые вместе оказываются «синтетически летальными» для опухоли. Нормальные клетки, которые лишены генетической неустойчивости опухолевых клеток, являются относительно не пораженными (Garber, K., 2002, Journal of the National Cancer Institute, vol. 94, No. 22, p1666-1668). Значительная проблема с 17AAG состоит в том, что препарат является слишком токсичным для длительной терапии, и, следовательно, существует необходимость в нетоксичном замещении (Banerji et al., см. выше).

Иматиниб месилат (Gleevec (RTM)) представляет собой мелкомолекулярный ингибитор тирозинкиназы, который оказывал существенное воздействие на неопластическое заболевание в качестве единственного средства. Первоначально предназначенный в качестве ингибитора тирозинкиназы Bcr-Abl, характерной для злокачественных процессов, несущих патогенную транслокацию 9;22, иматиниб оказался умеренно специфическим и оказывал существенное воздействие на лечение хронического миелогенного лейкоза (CML) и положительного по филадельфийской хромосоме (Ph1+) ALL (Krystal, GW, 2004, Leukemia Research 28S1:pS53-S59). Одной из проблем, связанных с лечением CML иматинибом, является устойчивость к препарату в результате мутаций в тирозинкиназе Bcr-Abl. Важно, что клетки CML, которые стали устойчивыми к иматинибу in vivo, сохраняют их зависимость от Hsp90 и, таким образом, остаются чувствительными к 17AAG.

В последних публикациях речь идет о том, что Hsp90 присутствует полностью в многокомпонентных комплексах, которые содействуют злокачественному прогрессированию, и что они являются привлекательными мишенями для противораковых терапевтических средств. В частности, речь идет о том, что Hsp90 в многокомпонентных комплексах, полученных из опухолевых клеток, имеют аффинитет связывания с 17AAG, который в 100 раз выше, чем Hsp90 из нормальных клеток (т.е. Hsp90 в его латентном, не связанном в комплексы состоянии), указывая на то, что в многокомпонентном комплексе он может проявлять эпитопы (в частности, четвертичные эпитопы), не проявляемые латентным, не связанным в комплексы Hsp90.

Антитело микограб (RTM) может связываться с Hsp90 в его латентном, не связанном в комплексы состоянии, а также в многокомпонентных комплексах без каких-либо побочных эффектов на кинетику связывания.

В WO 01/76627 речь идет о композициях для лечения грибковых инфекций, причем композиции включают комбинацию (i) полиена или противогрибкового средства в виде ингибитора синтазы бета-глюкана; и (ii) антитела, специфичные против грибкового Hsp90, причем композиции эффективны против грибка, вызывающего инфекцию, несмотря на его устойчивость к одному противогрибковому средству.

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предоставляется применение

(i) антитела или его антиген-связывающего фрагмента, специфичного, по меньшей мере, к одному эпитопу Hsp90; и

(ii) по меньшей мере, одного противоракового средства, выбранного из группы, состоящей из: доксорубицина, даунорубицина, эпирубицина, герцептина, доцетаксела и цисплатина

в способе изготовления лекарственного средства для лечения рака.

Доксорубицин представляет собой антрациклиновое антибиотическое средство, ранее признанное в качестве противоопухолевого средства.

Эпирубицин представляет собой менее токсичный синтетический антрациклиновый антибиотик, также ранее признанный в качестве противоопухолевого средства.

Даунорубицин представляет собой антинеопластическое средство, используемое в ряде терапевтических областей, включая применение в качестве противоракового средства.

Герцептин (трастузумаб) представляет собой моноклональное антитело, применяемое для лечения метастатического рака молочной железы, избыточно экспрессирующего белок HER2.

Доцетаксел представляет собой признанное противораковое средство, и он является ингибитором митоза.

Цисплатин представляет собой признанное противораковое средство и включает комплекс платины.

Как в деталях описано ниже, в экспериментальных результатах («Эксперименты А»), доксорубицин и даунорубицин особенно предпочтительны и проявляют особенно хорошие синергические эффекты с анти-Hsp90 антителом. Герцептин также проявляет хорошие синергические эффекты с анти-Hsp90 антителом. Синергия также наблюдается с доцетакселом и цисплатином при комбинации с анти-Hsp90 антителом. Синергия между даунорубицином и антителом особенно очевидна в клетках, положительных по рецепторам эстрогенов, и, таким образом, лекарственные средства и способы лечения с использованием антитела и даунорубицина можно, в частности, применять (или вводить) по поводу наличия клеток, имеющих рецепторы эстрогенов.

Эксперименты («Эксперименты А») также показывают, что другие противораковые средства при использовании вместе с анти-Hsp90 антителом или проявляют неопределенные результаты (паклитаксел) или антагонизм (иматиниб). Это подтверждает удивительную/неожиданную природу синергии, достигаемой указанными выше противораковыми средствами, при комбинации с анти-Hsp90 антителом.

Предоставляется также комбинированный препарат, включающий:

(i) антитело или его антиген-связывающий фрагмент, специфичный, по меньшей мере, к одному эпитопу Hsp90; и

(ii) по меньшей мере, одно противораковое средство, выбранное из группы, состоящей из: доксорубицина, даунорубицина, эпирубицина, герцептина, доцетаксела и цисплатина,

для одновременного, отдельного или последовательного применения при лечении рака.

Также предоставляется способ лечения рака, включающий введение терапевтически эффективного количества

(i) антитела или его антиген-связывающего фрагмента, специфичного, по меньшей мере, к одному эпитопу Hsp90; и

(ii) по меньшей мере, одного противоракового средства, выбранного из группы, состоящей из: доксорубицина, даунорубицина, эпирубицина, герцептина, доцетаксела и цисплатина,

нуждающемуся в них пациенту.

Пока нет специального другого указания, используемый термин «лечение» имеет широкое значение. Таким образом, под «лечением» или «терапией» подразумевается любое лечение, которое предназначено для излечения, облегчения, устранения или уменьшения симптомов, или предотвращения или снижения вероятности развития расстройств или нарушений функций организма человека или животного. Таким образом, под термином «лечение» подразумевается и лечение патологических состояний, а также их профилактика.

Антитело или его антиген-связывающий фрагмент может быть специфичным для эпитопа, проявляемого пептидом, включающим последовательность SQ ID NO: 1.

Как обсуждено выше, хотя четвертичные эпитопы, проявляемые Hsp90 в многокомпонентных комплексах, были предложены в качестве соответствующих мишеней для лечения, эксперименты (ниже) показывают, что в действительности, линейный эпитоп представляет собой полезную и эффективную мишень для лечения.

Атитела, их получение и способы применения хорошо известны и раскрыты, например, в документе Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999.

Антитела можно генерировать, используя стандартные способы, известные в данной области. Примеры антител включают (но не ограничиваются) поликлональные, моноклональные, химерные, одноцепочечные фрагменты Fab, фрагменты, продуцируемые библиотекой экспрессии Fab, и антиген-связывающие фрагменты антител.

Антитела можно получить у ряда хозяев, например коз, кроликов, крыс, мышей, людей и других. Они могут быть иммунизированы инъекцией грибковых стрессовых белков или любого его фрагмента или олигопептида, который имеет иммуногенные свойства. В зависимости от вида хозяина можно использовать различные адъюванты для увеличения иммунологической реакции. Такие адъюванты включают, но не ограничиваются, полный адъювант Фрейнда, минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, и поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцинанин моллюска Megathura cremulata и динитрофенол. Среди адъювантов, используемых у людей, особенно полезны БЦЖ (бацилла Кальмета-Герена) и Corynebacterium parvum.

Моноклональные антитела к грибковым белкам или их фрагментам или олигопептидам можно получить с использованием любой методики, которая обеспечивает продукцию молекул антител постоянными линиями клеток в культуре. Они включают, но не ограничиваются, методику гибридомы, методику гибридомы человеческих В клеток и методику гибридомы EBV (вируса Эпштейна-Барра) (Koehler et al., 1975, Nature, 256: 495-497; Kosbor et al., 1983, Immunol. Today 4: 72; Cote et al., 1983, PNAS USA, 80: 2026-2030; Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., New York, pp. 77-96).

Кроме того, можно использовать методики, разработанные для продукции «химерных антител», сплайсинга гена мышиного антитела в гены человеческого антитела для получения молекулы с соответствующей антигенной специфичностью и биологической активностью (Morrison et al., 1984, PNAS USA, 81: 6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452-454). Альтернативно, можно адаптировать методики, описанные для получения одноцепочечных антител, используя способы, известные в данной области, для получения специфичных для грибковых стрессовых белков одноцепочечных антител. Антитела с родственной специфичностью, но с отличным идиотипическим составом, можно генерировать перетасовкой цепи из случайных комбинаторных библиотек иммуноглобулина (Burton, D.R., 1991, PNAS USA, 88: 11120-11123).

Антитела можно также получить индукцией выработки in vivo в популяции лимфоцитов или скринингом библиотек рекомбинантного иммуноглобулина или панелей реагентов высокоспецифичного связывания (Orlandi et al., 1989, PNAS USA, 86: 3833-3837; Winter, G. et al., 1991, Nature, 349: 293-299).

Можно также получать антиген-связывающие фрагменты, например, фрагменты F(ab')2, которые можно получить перевариванием молекулы антитела пепсином, и фрагменты Fab, которые можно получать восстановлением дисульфидных мостиков фрагментов F(ab')2. Альтернативно, библиотеки экспрессии Fab можно сконструировать для обеспечения возможности быстрой и легкой идентификации фрагментов моноклонального Fab с желательной специфичностью (Huse et al., 1989, Science, 256: 1275-1281).

Различные иммунные анализы можно использовать для скрининга с целью идентификации антител, обладающих желательной специфичностью. Многочисленные протоколы конкурентного связывания или иммунорадиометрических анализов с использованием или поликлональных, или моноклональных антител с установленной специфичностью хорошо известны в данной области. Такие иммунные анализы обычно включают измерение образования комплексов между грибковым стрессовым белком или его любым фрагментом или олигопептидом и его специфическим антителом. Можно использовать двухсайтовый иммунный анализ на моноклональной основе с использованием моноклональных антител, специфичных к двум не интерферирующим эпитопам грибкового стрессового белка, но также можно использовать конкурентный анализ связывания (Maddox et al., 1983, J. Exp. Med., 158: 1211-1216).

Например, антитело, используемое в композиции или комбинированном препарате, может включать последовательность SEQ ID NO: 2.

Было обнаружено, что формы рака, которые можно успешно лечить, включают фибросаркомы и карциномы, выбранные из группы, состоящей из карциномы молочной железы, предстательной железы, меланомы, лейкоза, лимфом, карциномы ободочной кишки, зародышевоклеточной карциномы семенников, карциномы поджелудочной железы, яичников, эндометрия, щитовидной железы и легких.

В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения предоставляется применение

(i) антитела или его антиген-связывающего фрагмента, специфичного, по меньшей мере, к одному эпитопу Hsp90;

в способе изготовления лекарственного средства для лечения лейкоза.

Также предоставляется применение

(i) антитела или его антиген-связывающего фрагмента, специфичного, по меньшей мере, к одному эпитопу Hsp90; и

(ii) по меньшей мере, одного противоракового средства, выбранного из группы, состоящей из: иматиниба, паклитаксела, доцетаксела, даунорубицина, доксорубицина и гидроксимочевины,

в способе изготовления лекарственного средства для лечения лейкоза.

Иматиниб, производное 2-фениламинопиримидина, представляет собой мелкомолекулярный антагонист с активностью против белковых протеинкиназ и проявляет сильное и специфическое ингибирование Bcr-Abl. Иматиниб показан для лечения пациентов с CML, при бластных кризах, ускоренной фазе или при хронической фазе после неудачи лечения IFN (интерфероном).

Паклитаксел представляет собой химиотерапевтическое средство, которое вводят в качестве лечения по поводу некоторых типов рака. Он чаще всего применяется для лечения рака яичников, молочной железы и не мелкоклеточного рака легких.

Доцетаксел представляет собой противораковое средство и является ингибитором митоза.

Даунорубицин представляет собой антинеопластический препарат, используемый в ряде терапевтических областей, включая применение в качестве противоракового средства.

Доксорубицин представляет собой антрациклиновое антибиотическое средство, ранее признанное в качестве противоопухолевого средства.

Гидроксимочевина представляет собой антинеопластическое средство, являющееся ингибитором рибонуклеотидредуктазы.

Как детально описано ниже, в экспериментальных результатах («Эксперименты В»), доксетаксел и паклитаксел особенно предпочтительны и проявляют особенно хорошие синергические эффекты с анти-Hsp90 антителом. Синергия также наблюдается с иматинибом, доксорубицином, даунорубицином и гидроксимочевиной при комбинации с анти-Hsp90 антителом. Противораковое средство цисплатин при использовании вместе с анти-Hsp90 антителом проявило неопределенные результаты. Это подтверждает удивительную/неожиданную природу синергии, достигаемой указанными выше противораковыми средствами при комбинации с анти-Hsp90 антителом.

Также предоставляется комбинированный препарат, включающий:

(i) антитело или его антиген-связывающий фрагмент, специфичные, по меньшей мере, к одному эпитопу Hsp90; и

(ii) по меньшей мере, одно противораковое средство, выбранное из группы, состоящей из иматиниба, паклитаксела, доцетаксела, даунорубицина, доксорубицина и гидроксимочевины,

для одновременного, отдельного или последовательного применения при лечении лейкоза.

Примеры комбинированных препаратов включают фармацевтические упаковки, содержащие антитело (i) и, по меньшей мере, одно противораковое средство (ii) в отдельных объемах (т.е. не смешанные вместе в одном препарате).

Предоставляется также способ лечения лейкоза, включающий введение терапевтически эффективного количества

(i) антитела или его антиген-связывающего фрагмента, специфичных, по меньшей мере, к одному эпитопу Hsp90; и

(ii) по меньшей мере, одного противоракового средства, выбранного из группы, состоящей из: иматиниба, паклитаксела, доцетаксела, даунорубицина, доксорубицина и гидроксимочевины,

для лечения нуждающегося в нем пациента.

Лейкоз может представлять собой хронический миелоидный лейкоз или острый лимфоидный лейкоз, и, по меньшей мере, одно противораковое средство может представлять собой иматиниб.

Антитело или его антиген-связывающий фрагмент могут быть специфичными к эпитопу, проявляемому пептидом, включающим последовательность SEQ ID NO:1.

Например, антитело, используемое в композиции или комбинированном препарате, может включать последовательность SEQ ID NO:2.

Противораковое средство может представлять собой иматиниб.

Было обнаружено, что лейкозы, которые можно успешно лечить, включают лейкозы, выбранные из группы, состоящей из острого миелобластического лейкоза, острого лимфобластического лейкоза, хронического миелоидного лейкоза и хронического лимфоцитарного лейкоза.

Лейкоз может представлять собой хронический миелоидный лейкоз или острый лимфоидный лейкоз.

Хронический миелоидный лейкоз может быть Ph1-положительным или Ph1-отрицательным, т.е. характеризуется лейкозными клетками, которые содержат филадельфийскую хромосому (Ph1-положительные), или не содержат филадельфийскую хромосому (Ph1-отрицательные).

Было обнаружено, что хронический миелоидный лейкоз, который можно успешно лечить иматинибом, может быть или Ph1-положительным, или Ph1-отрицательным.

Лейкоз может представлять собой хронический миелоидный лейкоз, который является Ph1-положительным, а противораковое средство может представлять собой иматиниб. В частности, заявитель обнаружил лечение CML, который является Ph1-положительным, можно осуществить комбинацией иматиниба и антитела, включающего последовательность SEQ ID NO:2. Не желая быть связанным с какой-либо теорией, заявитель предполагает, что Hsp90, возможно, секвестрируется антителом, включающим последовательность SEQ ID NO:2, что, в свою очередь, означает, что аномальная Bcr-Abl тирозинкиназа (которая вызывает нарушенный миелопоэз, обнаруживаемый при CML), например, неправильно уложена, нацелена на разрушение белка, и/или существуют препятствия оказанию ее эффектов на миелопоэтические пути.

Это лечение, кроме того, эффективно в отношении устойчивых к иматинибу Ph1-положительных клеток CML. Без желаемой связи с какой-либо теорией устойчивость к иматинибу, вероятно, связана с накопленными мутациями в аномальной Bcr-Abl тирозинкиназе, которые могут, например, помешать препарату связываться с белком и/или препятствовать действию препарата. Возможно, что в клетках, устойчивых к иматинибу, секвестрация Hsp90 антителом, включающим последовательность SEQ ID NO:2, вызывает неправильную укладку, нацеливание на разрушение белка и/или препятствие оказанию эффектов на миелопоэтические пути мутированной аномальной тирозинкиназы. Секвестрация Hsp90, которая обычно служит для «забуферивания» генетических мутаций, связанных с раковыми клетками, связыванием с аномальными белками и блокированием их экспрессии может также вызвать высвобождение разнообразных мутаций, которые вместе оказываются синтетически летальными для опухолевой клетки. Нормальные клетки, которые лишены генетической нестабильности опухолевых клеток, являются относительно не пораженными.

Кроме того, и к особому удивлению, заявитель обнаружил, что лечение CML, который является Ph1-отрицательным, можно осуществить комбинацией иматиниба и антитела, включающего последовательность SEQ ID NO:2.

Лейкоз может представлять собой хронический миелоидный лейкоз, который является Ph1-отрицательным, а противораковое средство может представлять собой иматиниб.

Эти данные удивительны, потому что клетки Ph1-отрицательного CML лишены аномального белка тирозинкиназы, связанного с Ph1-положительными клетками. Однако и без желаемой связи с какой-либо теорией, возможно, что имеются низкие или базальные уровни этой киназы (аномальной или иной) в Ph1-отрицательных клетках, и, как описано выше, то, что секвестрация Hsp90 осуществляется антителом, включающим последовательность SEQ ID NO:2, означает, что белок тирозинкиназы, например, неправильно уложен или нацелен на разрушение белка или каким-то образом имеет препятствия оказанию его эффектов на миелопоэтические пути. Может также иметь место то, что путем секвестрации Hsp90, опухолевыми клетками высвобождаются разнообразные мутации, которые вместе оказываются синтетически летальными.

Удивительный эффект иматиниба и анти-Hsp90 антитела в Ph1-отрицательных клетках может быть вызван присутствием слияния TEL(ETV6)-ABL, которое было продемонстрировано в двух случаях Ph1-отрицательного CLM (Krystal, GW, 2004, Leukemia Research 28S1:pS53-S59), и который чувствителен к иматинибу.

Лейкоз может характеризоваться клетками, которые устойчивы к иматинибу.

Композиция или препарат по настоящему изобретению может, кроме того, включать известный ингибитор Hsp90, например AG или 17-AAG.

Третий аспект настоящего изобретения (эксперименты С) относится к новым лекарственным средствам и препаратам, включающим эффективные противораковые средства вместе с анти-Hsp90 антителом, которые вместе обеспечивают повышенную эффективность при лечении рака ободочной и прямой кишки или аденокарцином.

Рак ободочной и прямой кишки представляет собой злокачественную опухоль ободочной и прямой кишки. Рак ободочной и прямой кишки представляет собой ведущую причину осложнений и смертности при раке. Это третья по частоте форма рака у мужчин и вторая по частоте форма рака в Великобритании. 95% раковых опухолей ободочной и прямой кишки представляют собой аденокарциномы, которые представляют собой раковые опухоли из железистых клеток, которые выстилают внутреннюю часть ободочной и прямой кишки.

Стандартное лечение рака ободочной и прямой кишки представляет собой обычно комбинацию 5-фторурацила и лейковорина (фолиновой кислоты).

5-фторурацил (5-FU) используется для лечения ряда солидных опухолей, включая желудочно-кишечные раковые опухоли и рак молочной железы. Он обычно применяется с фолиновой кислотой при запущенном раке ободочной и прямой кишки. 5-FU превращается в FdUMP в клетке, который образует комплекс с тимидилатсинтазой (TS), ингибирующей синтез ДНК, белка и РНК.

Фолиновая кислота (лейковорин) представляет собой витамин, который вводится в комбинации с 5-FU. Фолиновая кислота увеличивает частоту реакции на 5-фторурацил при значительном удлинении выживания без признаков заболевания и общего выживания. Фолиновая кислота увеличивает внутриклеточное количество фолата и стабилизирует комплекс FdUMP/TS.

Другие средства, которые, как обнаружено, оказывают эффект, включают иринотекан и оксалипатин, которые лицензированы в качестве средства первой линии у пациентов с запущенным раком ободочной и прямой кишки в комбинации с 5-фторурацилом и фолиновой кислотой. Иринотекан или ралтитрексед лицензированы для применения в качестве монотерапии второй линии, когда терапия на основе фторурацила неудачна или нецелесообразна.

Оксалиплатин представляет собой признанное противораковое средство и содержит новое соединение диаминоциклогексанплатина, которое образует поперечные сшивки в ДНК и, таким образом, ингибирует репликацию ДНК.

“FOLFOX” представляет собой обычно применяемую комбинированную химиотерапию из 5-фторурацила, фолиновой кислоты и оксалиплатина.

Иринотекан (CPT-11, Campto) ингибирует топоизомеразу I, раскручивающий ДНК фермент, существенный для деления клеток, что приводит к остановке репликации с разрывами однонитевой ДНК. В Великобритании иринотекан лицензирован для применения у пациентов с запущенным раком ободочной и прямой кишки, не подвергавшихся химиотерапии, в комбинации с 5FU/FA и в качестве единственного средства для химиотерапии второй линии у пациентов, у которых установленная схема на основе 5FU была безуспешной.

Ралтитрексед (ZD 1694, Tomudex) ингибирует фермент тимидилат синтетазу, который участвует в синтезе ДНК. Это тот же фермент, на который нацелен 5FU. Ралтитрексед лицензирован в Великобритании для паллиативного лечения запущенного рака ободочной и прямой кишки, когда схемы на основе 5FU/FA или непереносимы, или нецелесообразны (см. Tebbutt et al., 2002, European Journal of Cancer, 38: 1000-1015; Cutsem et al., 2002, Best Practice and Research Clinical Gastroenterology, 16: 319-330; Beretta et al., 2004, Surgical Oncology, 13: 63-73; NICE guidelines for Irinotecan, Oxaliplatin and raltitrexed for advanced colorectal cancer, 2002).

В соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения предоставляется применение

(i) антитела или его антиген-связывающего фрагмента, специфичного, по меньшей мере, к одному эпитопу Hsp90; и

(ii) по меньшей мере, одного противоракового средства, выбранного из группы, состоящей из 5-фторурацила, оксалиплатина, иринотекана и ралтитрекседа

в способе изготовления лекарственного средства для лечения рака.

Альтернативно предоставляется комбинированный препарат, включающий:

(i) антитело или его антиген-связывающий фрагмент, специфичный, по меньшей мере, к одному эпитопу Hsp90; и

(ii) по меньшей мере, одно противораковое средство, выбранное из группы, состоящей из: 5-фторурацила, оксалиплатина, иринотекана и ралтитрекседа

для одновременного, отдельного или последовательного применения при лечении рака.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предоставляется способ лечения рака, включающий введение терапевтически эффективного количества

(i) антитела или его антиген-связывающего фрагмента, специфичного, по меньшей мере, к одному эпитопу Hsp90; и

(ii) по меньшей мере, одного противоракового средства, выбранного из группы, состоящей из 5-фторурацила, оксалиплатина, иринотекана и ралтитрекседа

нуждающемуся в них пациенту.

Предпочтительно, рак представляет собой рак или аденокарциному ободочной и прямой кишки.

Наиболее предпочтительно, противораковое средство 5-фторурацил, кроме того, включает или вводится с фолиновой кислотой (лейковорином).

Дополнительно или альтернативно, 5-фторурацил, фолиновая кислота и оксалиплатин вводятся вместе.

Композиция или препарат в соответствии с любым аспектом настоящего изобретения может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель. Аналогичным образом, любой способ изготовления по настоящему изобретению или применения может таким же образом также включать применение фармацевтически приемлемого носителя, разбавителя или наполнителя. Примеры фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и наполнителей хорошо известны в данной области, например, см.: Remington's Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopoeia, (1984, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA).

Лекарственные средства или комбинированный препарат можно, например, вводить перорально, хотя это не означает, что следует исключить другие пути введения.

Антитело или его антиген-связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением могут быть меченными выявляемой меткой или могут быть конъюгированы с эффекторной молекулой, например, препаратом, таким как противораковое средство, такое как доксорубицин, даунорубицин, или цисплатин, или 5-фторурацил, оксалиплатин, иринотекан или фармацевтическое средство, которое можно применять при лечении лейкоза, например иматиниб, паклитаксел, доцетаксел, даунорубицин, доксорубицин и гидроксимочевина. Или токсин, такой как рицин, или фермент, используя обычные процедуры, и изобретение распространяется на такие меченые антитела или конъюгаты антител.

При желании смеси антител можно использовать для диагностики или лечения, например, смеси двух или более антител, распознающих различные эпитопы стрессового белка в соответствии с изобретением, и/или смеси антител другого класса, например смеси IgG и IgM антител, распознающих тот же или другой эпитоп(ы) по изобретению.

Как обсуждалось выше, хотя четвертичные эпитопы, проявляемые Hsp90 в многокомпонентных комплексах, были предложены в качестве соответствующих мишеней для лечения, эксперименты (ниже) показывают, что, в действительности, линейный эпитоп представляет собой полезную и эффективную мишень для лечения.

Содержание каждой из обсужденных здесь ссылок, включая приведенные в них ссылки, полностью включено сюда в качестве ссылки.

Когда указано “PMID” и для публикаций приведены номера ссылок, то это идентификационные номера PubMed, присвоенные им Национальной Медицинской Библиотекой США, в которой имеется полная библиографическая информация и реферат для каждой публикации на сайте . Этот сайт может также обеспечить прямой доступ к электронным копиям полных публикаций, в частности, в случае, например, публикаций PNAS, JBC и MBC.

Настоящее изобретение будет еще очевиднее из следующего описания, которое показывает, только в качестве примера, определенные варианты осуществления композиции и экспериментирования с ней.

Эксперименты

В первой группе экспериментов («Эксперименты А»), описанной ниже, приведены детали исследования противоракового эффекта анти-Hsp90 антитела, имеющего последовательность SEQ ID NO: 2, и специфичного для эпитопа, проявляемого пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 1, используемого отдельно или в комбинации с противораковыми средствами доксорубицином, даунорубицином, доцетакселом, герцептином, иматинибом, цисплатином и паклитакселом.

Во второй группе экспериментов («Эксперименты В»), описанной ниже, приведены детали исследования эффекта анти-Hsp90 антитела, имеющего последовательность SEQ ID NO: 2, и специфичного для эпитопа, проявляемого пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 1, используемого отдельно или в комбинации с противораковыми средствами иматинибом, паклитакселом, доцетакселом, даунорубицином, доксорубицином, цисплатином и гидроксимочевиной, на линию клеток К562 хронического миелогенного лейкоза людей-европеоидов, и линии клеток KU-812 миелогенного лейкоза человека.

В третьей группе экспериментов («Эксперименты С»), описанной ниже, приведены детали исследования эффекта анти-Нзр90 антитела, имеющего последовательность SEQ ID NO: 2, и специфичного для эпитопа, проявляемого пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 1, используемого отдельно или в комбинации с противораковыми средствами 5-фторурацилом (5-FU) и фолиновой кислотой (лейковорином, LV) и/или оксалиплатином, на линию клеток НТ20 аденокарциномы ободочной кишки человека.

Общие материалы и методы

При отсутствии других указаний все процедуры выполнялись с использованием стандартных протоколов и, где применимо, в соответствии с инструкциями изготовителя. Стандартные протоколы для различных методик, включая PCR (полимеразную реакцию синтеза цепи), молекулярное клонирование, манипуляцию и секвенирование, получение антител, картирование эпитопов и конструкцию мимитопов, культивирование клеток и фаговый дисплей, описаны в таких документах как McPherson, MJ et al. (1991, PCR: A practical approach, Oxford University Press, Oxford), Sambrook, J. and Russell, D., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New York, 2001, Huynh and Davies (1985, "DNA Cloning vol. I - A Practical Approach", IRL Press, Oxford, Ed. DM Glover), Sanger, F. et al. (1977, PNAS USA 74(12): 5463-5467), Harlow, E. and Lane, D. ("Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1998), Jung, G. and Beck-Sickinger, AG (1992, Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 31: 367-486), Harris, M.A. and Rae, I.F. ("General Techniques of Cell Culture", 1997, Cambridge University Press, ISBN 0521 573645), "Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual" (Eds. Kay, BK, Winter, J., and McCafferty, J., Academic Press Inc., 1996, ISBN 0-12-402380-0).

Реагенты и оборудование, которые можно использовать, наряду с другими, в способах, детально описанных здесь, доступны из подобных им от компаний Amersham (www.amersham.co.uk), Boehringer Mannheim (www.boehringer-ingeltheim.com), Clontech (www.clontech.com), Genosys (www.genosys.com), Millipore (www.millipore.com), Novagen (www.novagen.com), Perkin Elmer (www.perkinelmer.com), Pharmacia (www.pharmacia.com), Promega (www.promega.com), Qiagen (www.qiagen.com), Sigma (www.sigma-aldrich.com) and Stratagene (http://www.stratagene.com).

Антитело

Антитело, использованное в Экспериментах А и В ниже, представляет собой антитело, описанное в WO 01/76627, и оно именуется здесь «микограб» (RTM), имеющее последовательность SEQ ID NO: 2 и являющееся специфичным для эпитопа, проявляемого пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 1. Основной раствор антитела представлял собой маточный раствор 4 мг/мл в воде. Дальнейшие разведения проводили в полной среде RPMI.

Вкратце, последовательность ДНК бывшего антитела, специфичного для эпитопа Hsp90 Candida albicans, раскрытого в GB 2240979 и EP 0406029, была генетически модифицирована оптимизацией кодона для экспрессии у Escherichia coli (Operon Technologies Inc., Alameda, CA, USA) и вставлена в вектор экспрессии E. coli. Аминокислотная последовательность анти-Hsp90 антитела включает последовательность SEQ ID NO: 2 (включает тяжелый, легкий и спейсерный домены). Антитело распознает эпитоп, включающий последовательность SEQ ID NO: 1.

Анти-Hsp90 антитело было экспрессировано у хозяина Escherichia coli и затем очищено аффинной хроматографией и имидазольный обменной колонкой до чистоты 95%. Использовались стандартные протоколы молекулярной биологии (см., например, Harlow & Lane, supra; Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Sambrook, J. & Russell, D., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).

Лекарственные средства

Цисплатин получали от Bristol-Myers Squibb, Mayne, поставляемый в виде раствора 1 мг/мл.

Доцетаксел получали от Sigma. 5 мг растворяли первоначально до 16 мг/мл диметилсульфоксидом (DMSO).

Доксорубицин получали от Pharmacia; 5 мл поставлялись в виде доксорубицина гидрохлорида 2 мг/мл.

Иматиниб (Glivec (RTM)), полученный от Njvartis, поставлялся в виде капсул по 100 мг. Иматиниб первоначально разбавляли в воде для получения маточного раствора 10 мг/мл.

Паклитаксел получали от Sigma, растворяли в 250 мкл метанола, доведенных до объема 2,5 мл водой для получения 2 мг/мл.

Даунорубицин получали от Sigma; 5 мг разбавляли в 2,5 мл воды для получения 2 мг/мл.

Герцептин (RTM) (транстузумаб) получали от Roche и растворяли в 7,2 мл воды для получения 21 мг/мл.

Гидроксимочевину получали от Sigma, при разбавлении 1 г в 4 мл воды для получения 25 мг/мл.

5-фторурацил (5-FU) получали от Sigma; 96 мг растворяли в 1 мл DMSO, разбавленного 1/10 в полной среде RPMI, для получения 9,6 мг/мл.

Фолиновую кислоту (LV) получали от Sigma; 100 мг растворяли в 25 мл воды для получения маточного раствора 4 мг/мл.

Оксалиплатин получали от Sigma; 12,5 мг растворяли в 2,5 мл воды для получения 5 мг/мл.

Каждый из указанных выше препаратов дополнительно разбавляли полной средой RPMI.

Определение концентрации и жизнеспособности клеток

Клетки подсчитывали и процентную долю жизнеспособности определяли, используя стандартный гемоцитометр, следуя окрашиванию равным объемом 0,4% раствора трипана синего (Sigma).

Анализ жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток оценивали после каждого эксперимента, используя анализ клеточного титра синим реагентом (Promega). Среду удаляли из клеток и добавляли 100 мкл свежей полной среды с последующим добавлением 20 мкл синего реагента клеточного титра. Этот раствор инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 4 ч, и спектральную поглощательную способность считывали при 570 нм, используя 600 нм в качестве эталона. В этом анализе используется индикаторный краситель ресазурин (синий) для измерения метаболической способности клеток. Жизнеспособные клетки восстанавливают ресазурин в ресоруфин (розовый).

Интерпретация данных

Рост клеток оценивали, как описано выше. Концентрации IC₅₀ (дозу препарата, необходимую для того, чтобы вызвать цитотоксичность у 50% клеток) определяли однократно для каждого препарата в течение периода инкубации 48 ч.

Анализ медианы эффекта, показателя синергизма, аддитивных эффектов или антагонизма на основании уравнения Hill определяли способом Chou и Talaly, используя продукт калкусин (BioSoft, Cambridge, UK - ). CI (комбинированный показатель), который отражает синергию, когда он меньше 1, аддитивный эффект, когда он равен 1, и антагонизм, когда он больше 1, подсчитывали для варьирующихся уровней эффекта препарата. Фиксированные соотношения препаратов выше и ниже IC₅₀ (концентрацию препарата, требовавшуюся для оказания 50% цитотоксического эффекта) при диапазоне 0,0156N-8N, где N представляет собой величину около IC₅₀ отдельного препарата, исследовали инкубацией комбинаций препарата с клетками в течение 48 ч и затем определением степени цитотоксичности. Fa50 определяется в той точке, где поражены 50% клеток. Величины CI показаны для Fa50.

Эксперименты А

Результаты показывают, что антитело свидетельствовало об антагонизме с иматинибом и индифферентности к паклитакселу. Имелась некоторая синергия с цисплатином и с доцетакселом, но последняя вероятна в концентрациях, которые нельзя достичь клинически. Доксорубицин продемонстрировал синергию на клинически достижимых уровнях препарата с обеими линиями клеток и независимо от того, был ли рецептор эстрогена. Результаты, достигнутые с доксорубицином, трактуются как высоко значимая синергия. Результаты при использовании даунорубицина были одинаково впечатляющими при линии клеток с рецептором эстрогена, но меньше с линией клеток, отрицательных по рецептору эстрогена, при синергии, ограниченной 6 и 12,5 мг/л. Результаты по герцептину показали отсутствие синергии против линии клеток, положительной по рецептору эстрогена, но синергия наблюдалась при линии клеток, отрицательных по рецептору эстрогена.

Материалы и методы

Информация о линии клеток и культуре

Линию клеток аденокарциномы молочной железы человека-европеоида MCF7, экспрессирующую рецепторы эстрогена и дикого типа, и вариантные рецепторы эстрогена, а также рецептор прогестерона, получали от ЕСАСС (номер ЕСАСС - 86012803).

Другие использованные линии клеток следующие:

HS578T - ECACC номер 86082104, карцинома молочной железы человека, эпителиальная. Канцерогенная у мышей с подавленным иммунитетом и образует колонии в полутвердой среде. Отрицательная по рецептору эстрогена.

SK-BR-3 - (ATCC) Аденокарцинома молочной железы. Положительная по рецептору эстрогена. Избыточно экспрессирует ген HER2/C-erb-2.

UACC-812 - (ATCC) - Карцинома протоков - перед операцией у пациентки была интенсивная химиотерапия. Отрицательная по рецептору эстрогена, отрицательная по рецептору прогестерона, отрицательная по Р-гликопротеиду. Амплификация последовательности онкогена HER-2/ neu.

НСТ116 - (АТСС) - Карцинома ободочной и прямой кишки. Положительная по экспрессии TGF бета 1 и бета 2.

Клетки расщепляли, используя 0,25% трипсин/EDTA (Sigma), и поддерживали в среде RPMI без фенола красного, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку, 1% не незаменимых аминокислот, 2 мМ глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина (Sigma) при 37°С, 5% СО₂.

Эксперименты А

Воздействие микограба на клетки MCF7

Линии клеток расщепляли и клетки подсчитывали. Клетки добавляли в 12- или 96-луночные планшеты с плоским дном для культуры ткани. В случае 12-луночных планшет добавляли 1 мл 4×10⁴ клеток/мл плюс 1 мл среды. В случае 96-луночных планшет в планшету добавляли 100 мкл 4×10⁴ клеток/мл с последующим добавлением еще 100 мкл полной среды. Планшеты инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% СО₂. На следующий день клетки наблюдали под фазово-контрастным микроскопом для того, чтобы убедиться в их сцеплении с планшетами, и надосадочную среду удаляли аспирацией. Затем в лунки добавляли свежую среду, содержащую вдвое увеличивающиеся концентрации микограба (1,5-200 мкг/мл) или составной буфер или одну среду. Планшеты возвращали в инкубатор на 48 ч. После этого проводили анализ клеточного титра синим реагентом или подсчет жизнеспособных клеток, используя гемоцитометр.

Воздействие противораковых средств доксорубицина, даунорубицина, герцептина, доцетаксела, иматиниба, паклитаксела и цисплатина на клетки MCF7

Линии клеток расщепляли и клетки подсчитывали. 100 мкл 4×10⁴ клеток/мл добавляли в 96-луночные планшеты с плоским дном для культуры ткани, и в планшету добавляли еще 100 мкл полной среды. Затем планшеты инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% СО₂. На следующий день клетки наблюдали под фазово-контрастным микроскопом для того, чтобы убедиться в их сцеплении с планшетами, и надосадочную среду удаляли аспирацией. В лунки добавляли свежую среду, содержащую увеличивающиеся концентрации исследуемого препарата (доксорубицин - 0,55-600 мкг/мл, даунорубицин - 0,45-1000 мкг/мл, герцептин - 0,2-200 мкг/мл, доцетаксел - 0,75-800 мкг/мл, иматиниб - 4,5-5000 мкг/мл, цисплатин - 0,04-50 мкг/мл, паклитаксел - 1,8-1000 мкг/мл) или одну среду. Планшеты возвращали в инкубатор на 48 ч, после чего проводили анализ клеточного титра синим реагентом.

Воздействие микограба в комбинации с противораковыми средствами доксорубицином, даунорубицином, герцептином, доцетакселом, иматинибом, паклитакселом и цисплатином на клетки MCF7

Линии клеток расщепляли и клетки подсчитывали. 100 мкл 4×10⁴ клеток/мл добавляли в 96-луночные планшеты с плоским дном для культуры ткани, и в планшету добавляли еще 100 мкл полной среды. Затем планшеты инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% СО₂. На следующий день клетки наблюдали под фазово-контрастным микроскопом для того, чтобы убедиться в их сцеплении с планшетами, и надосадочную среду удаляли аспирацией. В планшеты добавляли 100 мкл свежей среды и составляли «шахматную доску» микограба в сравнении с другим препаратом, как представлено ниже в табл.1 (используя доксорубицин в качестве примера) для получения общего объема 200 мкл на лунку.

Планшеты возвращали в инкубатор на 48 ч, после чего проводили анализ клеточного титра синим реагентом.

Эксперименты также выполняли с клетками HS578T, используя описанные выше методологии, и результаты представлены ниже.

Результаты экспериментов А

Линия клеток MCF7

Цисплатин

IC₅₀ составила 6 мг/л, и не было эффекта после добавления микограба, за исключением синергии при более высоких концентрациях - см. табл.2.

Иматиниб

IC₅₀ составила 37,5 мг/л, и не было доказательств антагонизма с Csp в диапазоне 3,3-10 с микограбом в дозах иматиниба ниже 37,5 мг/л. Выше этой дозы иматиниб уничтожал линию клеток.

Доцетаксел

IC₅₀ составила 225 мг/л, и не было доказательств какой-либо синергии с микограбом в высоких дозах доцетаксела - см. табл.3.

Паклитаксел

IC₅₀ составила 225 мг/л, и не было различия с низкими концентрациями препарата и незначительная синергия при высоких уровнях, таких как 500 мг/л паклитаксела. Эти уровни находятся за пределами уровней, которые являются клинически релевантными.

Доксорубицин

IC₅₀ составила 1,75 мг/л. Наблюдалась отчетливая синергия с микограбом по диапазону концентраций препарата - см. табл.4.

Даунорубицин

IC₅₀ составила 1 мг/л. Были доказательства синергии с микограбом по диапазону концентраций препарата - см. табл.5.

Герцептин

Не было выявляемой активности вследствие герцептина и доказательств синергии.

Линия клеток HS578T

Эта линия клеток была нечувствительна к микограбу при увеличивающихся концентрациях до 400 мг/л. Это было не удивительно в том, что эти опухоли не являются чувствительными к стероидам и, таким образом, нет эндогенной вероятности их реакции на ингибитор Hsp90, такой как микограб. Однако в комбинации с антрациклином доксорубицином, а также даунорубицином и герцептином была неожиданная синергия.

Доксорубицин

IC₅₀ составила 1 мг/л. Имелись данные за синергию с микограбом по диапазону концентраций препарата - см. табл.6.

Даунорубицин

IC₅₀ составила 1 мг/л. Были некоторые доказательства синергии, но, главным образом, индифферентности к микограбу - см. табл.7.

Герцептин

С HS578T, один герцептин не смог уничтожить 50% клеток при концентрациях до 200 мг/л, но в присутствии микограба наблюдалась синергия - см. табл.8.

Доцетаксел

Он дал IC₅₀ 50 мг/л для линии клеток HS578T и не проявил данных за синергию с микограбом.

Цисплатин

Цисплатин имел IC₅₀ 12,5 мг/л для линии клеток HS578T и не проявил данных за синергию с микограбом.

Вывод

Были доказательства антагонизма с иматинибом и индифферентности к паклитакселу. Наблюдалась некоторая синергия с цисплатином и с доцетакселом, но последняя вероятна в концентрациях, которые нельзя достичь клинически. Доксорубицин продемонстрировал синергию на клинически достижимых уровнях препарата с обеими линиями клеток и независимо от наличия рецептора эстрогена. Результаты, достигнутые доксорубицином, трактуются как высоко значимая синергия. Результаты применения даунорубицина были одинаково впечатляющими при линии клеток с рецептором эстрогена, но менее с линией клеток, отрицательной по рецептору эстрогена, при синергии, ограниченной 6 и 12,5 мг/л.

Этот указанный выше синергический эффект наблюдается между антителом и определенными противораковыми препаратами, но не с другими противораковыми средствами, такими как иматиниб.

Эксперименты В

Во второй группе экспериментов (описанных ниже) в деталях описано исследование эффекта анти-Hsp90 антитела, имеющего последовательность SEQ ID NO: 2, и специфичного для эпитопа, проявляемого пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 1, применяемого отдельно или в комбинации с противораковыми средствами иматинибом, паклитакселом, доцетакселом, даунорубицином, доксорубицином, цисплатином и гидроксимочевиной, на линию клеток К562 хронического миелогенного лейкоза людей-европеоидов и линии клеток KU-812 миелогенного лейкоза человека.

Результаты показывают, что антитело дало свидетельство о наличии синергии с иматинибом, паклитакселом, доцетакселом, даунорубицином. Антитело дало свидетельство о наличии некоторой синергии с доксорубицином и гидроксимочевиной. Результаты показывают, что антитело дало свидетельство об индифферентности к цисплатину.

Результаты, достигнутые с доцетакселом и паклитаселом, трактуются как высоко значимая синергия.

Материалы и методы

Информация о линии клеток и культуре

Линию клеток KU-812 миелогенного лейкоза человека получали от ЕСАСС (номер ЕСАСС - 90071807). В этой линии клеток была выявлена филадельфийская хромосома (Ph1). Клетки морфологически характерны для базофилов.

Линию клеток К562 хронического миелогенного лейкоза людей-европеоидов получали от ЕСАСС (номер ЕСАСС - 89121407). К562 была установлена из плеврального выпота 53-летней женщины с хроническим миелогенным лейкозом при терминальном бластном кризе. Кариологические исследования различных подлиний К-562 делили на 3 группы (A, B, C) (Dimery, I. W. et al., 1983, Exp. Hematol.; 11(7):p601-10). Линия, использованная в этих экспериментах, представляла собой К562В. Эксперименты продемонстрировали, что эти линии в целом одинаковы, с точки зрения, морфологии, кинетики роста в жидкой суспензионной культуре, эффективности клонирования в мягкой агаровой культуре, связывания анти-К562 моноклональных антител и поверхностных белков. К562В сравнивали с К562А и К562С в отношении кинетики роста, маркеров белков клеточной поверхности, поверхностных антигенов, цитогенетики и продукции гемоглобина. Наблюдались различия между линиями клеток, причем самое важное различие состоит в том, что в то время как более чем 90% клеток К562А или С оказались Ph1-положительными, менее чем 15% клеток К562В содержали Ph1 (Dimery, IW, et al., 1983, Exp. Hematol.; 11(7):p601-10). Хотя цитогенетические тесты не выявляют присутствия истинной хромосомы Ph1, представляется, что К562 содержат часть хромосомы Ph1, которая, по меньшей мере, амплифицирована вчетверо. Эта часть хромосомы Ph1 кодирует химерный транскрипт bcr/c-abl, который при трансляции дает составной белок bcr/c-abl (Grosveld, G., et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6, No. 2: p607-616). Составной белок bcr/c-abl обладает повышенной активностью тирозинкиназы, которая ответственна за патогенез CML.

Клетки поддерживали в концентрации от 2×10⁶ до 9×10⁶ клеток/мл в среде RPMI без фенола красного, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку, 2 мМ глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина (Sigma) при 37°С, 5% СО₂.

Эксперименты

Воздействие микограба на клетки К562

Линии клеток подсчитывали. Клетки добавляли в 12- или 96-луночные планшеты с плоским дном для культуры ткани, используя аликвотные количества 100 мкл, содержащие 4×10⁵ клеток/мл. В планшету добавляли свежую среду, содержащую или вдвое увеличивающиеся концентрации микограба (RTM) (1,5-200 мкг/мл), или одну среду. Планшеты возвращали в инкубатор на 48 ч, после чего проводили анализ клеточного титра синим реагентом или определяли количество жизнеспособных клеток, используя гемоцитометр.

Воздействие противораковых средств доксорубицина, даунорубицина, доцетаксела, паклитаксела, иматиниба, цисплатина и гидроксимочевины на клетки К562

Линии клеток подсчитывали. 100 мкл 2×10⁵ или 4×10⁵ клеток/мл добавляли в 96-луночные планшеты с плоским дном для культуры ткани. Затем планшеты инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% СО₂. В планшету добавляли свежую среду, содержащую увеличивающиеся концентрации исследуемого препарата (доксорубицин - 0,55-600 мкг/мл, даунорубицин - 0,07-100 мкг/мл, доцетаксел - 0,75-800 мкг/мл, паклитаксел - 0,5-500 мкг/мл, иматиниб - 4,5-5000 мкг/мл, цисплатин - 0,04-50 мкг/мл,) или одну среду. Планшеты возвращали в инкубатор на 48 ч, после чего проводили анализ клеточного титра синим реагентом.

Воздействие микограба в комбинации с противораковыми средствами доксорубицином, даунорубицином, доцетакселом, паклитакселом, иматинибом, цисплатином и гидроксимочевиной на клетки К562

Линии клеток подсчитывали. 100 мкл 2×10⁵ или 4×10⁵ клеток/мл добавляли в 96-луночные планшеты с плоским дном для культуры ткани. Затем планшеты инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% СО₂. В планшеты добавляли 100 мкл свежей среды и составляли «шахматную доску» микограба, в сравнении с другим препаратом, как представлено ниже в табл.9 (используя доксорубицин в качестве примера) для получения общего объема 200 мкл на лунку.

Эксперименты также выполняли с клетками KU-812, используя описанные выше методологии, и результаты представлены ниже.

Результаты

Воздействие микограба (RTM) на клетки К562

В отношении линии клеток К562 один микограб в концентрации 12,5 мкг/мл продемонстрировал снижение жизнеспособности клеток на 40%.

Воздействие микограба (RTM) и противораковых средств на клетки К562

Иматиниб

IC₅₀ составила 16 мкг/мл. Были некоторые доказательства синергии между иматинибом и микограбом (RTM) в диапазоне концентраций препарата (см. табл.10).

Доксорубицин

IC₅₀ составила 1 мкг/мл. Были некоторые доказательства синергии между доксорубицином и микограбом (RTM) при некоторых концентрациях препарата, но, главным образом индифферентности к микограбу (RTM).

Даунорубицин

IC₅₀ составила 0,75 мкг/мл. Были некоторые доказательства синергии между даунорубицином и микограбом (RTM) при низких концентрациях препарата (см. табл. 11).

Доцетаксел

IC₅₀ составила 70 мкг/мл. Было четкое доказательство синергии между доцетакселом и микограбом (RTM) в диапазоне концентраций препарата (см. табл. 12).

Паклитаксел

IC₅₀ составила 32 мкг/мл. Было четкое доказательство синергии между паклитакселом и микограбом (RTM) в диапазоне концентраций препарата (см. табл.13).

Цисплатин

IC₅₀ составила 12,5 мкг/мл. Не было доказательств синергии между цисплатином и микограбом (RTM).

Гидроксимочевина

IC₅₀ никогда не достигалась гидроксимочевиной как единственным средством. Однако было некоторое доказательство синергии между гидроксимочевиной и микограбом (RTM) в низких концентрациях препарата (см. табл.14).

Линия клеток KU-812

Воздействие микограба (RTM) на клетки KU-812

В отношении линии клеток KU-812 один микограб в концентрации 50 мкг/мл продемонстрировал снижение жизнеспособности клеток на 40%.

Воздействие микограба (RTM) и противораковых средств на клетки KU-812

Иматиниб

IC₅₀ составила 0,12 мкг/мл. Были некоторые доказательства синергии между иматинибом и микограбом (RTM) в низких концентрациях препарата (см. табл.15).

Резюме

При использовании линии клеток К562 было доказательство синергии с иматинибом, паклитакселом и доцетакселом. Было доказательство некоторой синергии с даунорубицином, доксорубицином и гидроксимочевиной. Индифферентность наблюдалась к цисплатину.

При использовании линии клеток KU-812 было доказательство некоторой синергии с иматинибом.

Выводы

Представленные здесь данные ясно демонстрируют, что антитело микограб (RTM) отдельно может уменьшить жизнеспособность и Ph1-положительных, и Ph1-отрицательных линий клеток CML. Кроме того, имеется удивительная синергия между противораковыми средствами, включая иматиниб, и анти-Hsp90 антителом в Ph1-положительных линиях клеток CML. Данные также демонстрируют, что существует синергизм между паклитакселом, доцетакселом, даунорубицином, доксорубицином, гидроксимочевиной и анти-Hsp90 антителом в Ph1-положительных линиях клеток лейкоза. Эти результаты позволяют применять композиции, включающие противораковые средства, такие как иматиниб, вместе с анти-Hsp90 антителом (микограбом RTM) для лечения CML. Синергизм, проявляемый комбинацией противоракового средства и антитела микограб (RTM), потенциально обеспечивает возможность применения более низких лечебных дозировок, что было бы очень значимо с учетом проблематичной токсичности многих противораковых средств и, в частности, иматиниба, или более эффективных и длительных курсов лечения в тех же дозировках, снижая, посредством этого, нежелательные побочные эффекты.

Возможные аспекты клинического использования настоящего изобретения включают: (i) получение синергической комбинации противораковых средств, например, иматиниба, и анти-Hsp90 антитела при лечении CML должно стать лечением выбора. Это, вероятно, привело бы к снижению смертности от CML; (ii) иматиниб токсичен, и синергия, обеспечиваемая настоящим изобретением, означает, что можно применять более низкую дозу иматиниба при сохранении эффективности и одновременном снижении токсичности; и (iii) снижающий токсичность эффект анти-Hsp90 антитела обеспечил бы возможность использования клинической эффективности более высоких доз иматиниба и дополнительно улучшил бы клинический исход.

Эксперименты С

В третьей группе экспериментов (описанных ниже) в деталях описано исследование эффекта анти-Hsp90 антитела, имеющего последовательность SEQ ID NO: 2, и специфичного для эпитопа, проявляемого пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 1, применяемого отдельно или в комбинации с противораковыми средствами 5-FU и фолиновой кислотой и/или оксалиплатином, на линию клеток аденокарциномы ободочной кишки НТ29.

Результаты показывают, что антитело дало свидетельство о синергии с 5-FU и фолиновой кислотой и с оксалиплатином. Было также доказательство синергии с комбинацией из четырех препаратов микограба/анти-Hsp90 антитела с 5-FU, фолиновой кислотой и оксалиплатином. Было обнаружено, что особенно полезны концентрации 5-FU более чем 75 мкг/мл и оксалиплатина более чем 10,5 мкг/мл.

Материалы и методы

Информация о линии клеток и культуре

Линию клеток НТ29 аденокарциномы II стадии толстой кишки человека-европеоида получали от ЕСАСС (номер ЕСАСС - 91072201).

Клетки расщепляли, используя 0,25% трипсина/EDTA (Sigma), и поддерживали в среде McCoy 5a, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку, 2 мМ глутамина, 1000 ЕД пенициллина, 0,1 мг стрептомицина (Sigma) при 37°С, 5% СО₂.

Другие линии клеток включают НСТ116.

Эксперименты

Воздействие микограба на клетки НТ29

Линии клеток расщепляли и клетки подсчитывали. Клетки добавляли в 12- или 96-луночные планшеты с плоским дном для культуры ткани. В случае 12-луночных планшет, в каждую лунку добавляли 1 мл 4×10⁴ клеток/мл или 4×10⁵ клеток/мл плюс 1 мл полной среды McCoy 5a. В случае 96-луночных планшет, в каждую лунку добавляли 100 мкл 4×10⁴ или 4×10⁵ клеток/мл с последующим добавлением еще 100 мкл полной среды McCoy 5a. Планшеты затем инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% СО₂. На следующий день клетки наблюдали под фазово-контрастным микроскопом для того, чтобы убедиться в их сцеплении с планшетами, и надосадочную среду удаляли аспирацией. Затем в лунки добавляли свежую среду RPMI, содержащую вдвое увеличивающиеся концентрации микограба (RTM) (1,5-200 мкг/мл) или одну среду. Планшеты возвращали в инкубатор на 48 ч, после чего проводили анализ клеточного титра синим реагентом или подсчет жизнеспособных клеток.

Воздействие противораковых средств 5FU и фолиновой кислоты и оксалиплатина на клетки НТ29

Линии клеток расщепляли и клетки подсчитывали. 100 мкл 4×10⁴ клеток/мл или 4×10⁵ клеток/мл добавляли в 96-луночные планшеты с плоским дном для культуры ткани и в планшеты добавляли еще 100 мкл полной среды McCoy 5a. Затем планшеты инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% СО₂. На следующий день клетки наблюдали под фазово-контрастным микроскопом для того, чтобы убедиться в их сцеплении с планшетами, и надосадочную среду удаляли аспирацией. Затем в лунки добавляли 100 мкл свежей полной среды RPMI, содержащей вдвое увеличивающиеся концентрации исследуемого препарата (5-FU 4,5-2400 мкг/мл плюс 1 мг/мл фолиновой кислоты или оксалиплатина 1-500 мкг/мл) или одной среды (среды + 2,5% DMSO для контроля 5-FU). Планшеты возвращали в инкубатор на 48 ч, после чего проводили анализ клеточного титра синим реагентом.

Воздействие микограба (RTM) в комбинации с противораковыми средствами 5FU и фолиновой кислотой и оксалиплатином на клетки НТ29

Линии клеток расщепляли и клетки подсчитывали. 100 мкл 4×10⁴ клеток/мл или 4×10⁵ клеток/мл добавляли в 96-луночные планшеты с плоским дном для культуры ткани, и в планшеты добавляли еще 100 мкл полной среды McCoy 5a. Затем планшеты инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% СО₂. На следующий день клетки наблюдали под фазово-контрастным микроскопом для того, чтобы убедиться в их сцеплении с планшетами, и надосадочную среду удаляли аспирацией. В лунки добавляли 100 мкл свежей полной среды RPMI и составляли «шахматную доску» микограба (RTM) в сравнении с исследуемым препаратом ((5-FU 4,5-2400 мкг/мл плюс 1 мг/мл фолиновой кислоты или оксалиплатина 1-500 мкг/мл) или одной средой (среда + 2,5% DMSO для контроля 5-FU)), как представлено в табл.16, для получения общего объема 200 мкл на лунку.

Воздействие микограба (RTM) в комбинации с противораковыми средствами 5FU и фолиновой кислотой и оксалиплатином на клетки НТ29

Линии клеток расщепляли и клетки подсчитывали. 100 мкл 4×10⁴ клеток/мл или 4×10⁵ клеток/мл добавляли в 96-луночные планшеты с плоским дном для культуры ткани, и в планшеты добавляли еще 100 мкл полной среды McCy 5a. Затем планшеты инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% СО₂. На следующий день клетки наблюдали под фазово-контрастным микроскопом для того, чтобы убедиться в их сцеплении с планшетами, и надосадочную среду удаляли аспирацией. В лунки добавляли 100 мкл свежей полной среды RPMI и составляли «шахматную доску» микограба (RTM) в сравнении с исследуемым препаратом ((5-FU:фолиновая кислота:оксалиплатин в соотношении 3:1:0,42) или одной среды (среда +2,5% DMSO для контроля 5-FU)), как представлено в табл.16 для 5-FU, для получения общего объема 200 мкл на лунку.

Результаты

Воздействие микограба (RTM) на клетки НТ29

В отношении линии клеток НТ29 один микограб (RTM) в концентрации 125 мкг/мл продемонстрировал снижение жизнеспособности клеток на 50%.

Воздействие противораковых средств 5FU или оксалиплатина отдельно и микограба (RTM) в комбинации с противораковыми средствами 5FU или оксалиплатина на клетки НТ29

5FU

IC₅₀ для 5-фторурацила составила 150 мкг/мл. Было четкое доказательство синергии между 5-FU и микограбом (RTM) в диапазоне концентраций препарата (см. табл.17-20).

Оксалиплатин

IC₅₀ для оксалиплатина составила 16 мкг/мл. Были некоторые доказательства синергии между оксалиплатином и микограбом (RTM) в диапазоне концентраций препарата (см. табл.21).

Воздействие микограба (RTM) в комбинации с противораковыми средствами 5FU и оксалиплатином на клетки НТ29

IC₅₀LV (лейковорин/5FU/Ох составила 25/75/10,5 мкг/мл. Были некоторые доказательства синергии между 5-FU и оксиплатином и микограбом (RTM) в диапазоне концентраций препарата (см. табл.22-24).

Резюме

Результаты показывают, что антитело давало свидетельство о синергии с 5FU и фолиновой кислотой или оксалиплатином и некоторое свидетельство синергии с комбинацией четырех препаратов с 5-FU и фолиновой кислотой и оксалиплатином при концентрациях более чем 75 мкг/мл 5-FU и больше чем 10,5 мкг/мл оксалиплатина. Не было доказательств синергии с 5-FU и оксалиплатином, в таблице 25 приведены величины CI при ED₅₀, ED₇₅ и ED₉₀.

Выводы

Представленные здесь данные ясно демонстрируют, что антитело микограб (RTM) отдельно может уменьшить жизнеспособность линии клеток аденокарциномы ободочной кишки. Была синергия между противораковыми средствами, включая 5-фторурацил и оксиплатин, и анти-Hsp90 антителом на линии клеток аденокарциномы ободочной кишки. Данные также демонстрируют, что существует синергия между 5-фторурацилом и оксалиплатином с анти-Hsp90 антителом на линии клеток аденокарциномы ободочной кишки.

Таблица 1 Шахматная доска микограба (MG) (мкг/мл), в сравнении с доксорубицином (DR) (мкг/мл)

Таблица 2
Цисплатин	Микограб	CI
12,5	25	0,012
25	50	0,024
Таблица 3
Микограб	Доцетаксел	CI
12,5	100	0,400
25	200	0,098
50	40	0,002
Таблица 4
Микограб	Доксорубицин	CI
0,75	2,25	0,249
1,5	4,5	0,261
3	9	0,248
6	18	0,476
12,5	37,5	0,186
25	75	0,155
50	150	0,159
Таблица 5
Микограб	Даунорубицин	CI
0,75	0,75	0,189
1,5	1,5	0,257
3	3	0,512
6	6	0,676
12,5	12,5	0,469
25	25	0,082
50	50	0,176
Таблица 6
Доксорубицин	Микограб	CI
0,55	0,75	0,573
1,12	1,5	0,541
2,25	3	0,824
4,5	6	0,254
9	12	0,507
18,5	25	0,538
37	50	1,033
Таблица 7
Микограб	Даунорубицин	CI
0,75	0,75	1,153
1,5	1,5	1,300
3	3	1,557
6	6	0,763
12,5	12,5	0,367
25	25	1,014
Таблица 8
Микограб	Герцептин	CI
0,75	0,75	0,007
1,5	1,5	0,008
3	3	0,005
6	6	0,034
12,5	12,5	0,025
25	25	0,170

Таблица 9 Шахматная доска микограба (MG) (мкг/мл) в сравнении с доксорубицином (DR) (мкг/мл)

Таблица 10
Иматиниб (мкг/мл)	Микограб, мкг/мл	CI
1	0,75	0,033
2	1,5	0,069
4	3	0,114
8	6	0,218
16	12,5	0,366
32	25	0,558
64	50	0,799
Таблица 11
Даунорубцин (мкг/мл)	Микограб (мкг/мл)	CI
0,75	1,5	0,696
1,5	3	0,872
Таблица 12
Доцетаксел (мкг/мл)	Микограб (мкг/мл)	CI
1,5	1,5	0,001
3	3	0,008
6	6	0,707
12,5	12,5	0,051
25	25	0,013
50	50	0,003
100	100	0,004
Таблица 13
Паклитаксел (мкг/мл)	Микограб (мкг/мл)	CI
1	1,5	0,064
2	3	0,145
4	6	0,011
8	12,5	0,05
16	25	0,04
32	50	0,06
64	100	0,077
Таблица 14
Гидроксимочевина (мкг/мл)	Микограб (мкг/мл)	CI
0,3	0,75	0,798
0,6	0,75	0,694
Таблица 15
Иматиниб (мкг/мл)	Микограб (мкг/мл)	CI
1	0,375	0,131
2	1,5	0,093
4	3	0,016
8	6	0,001
16	12,5	0,002
32	25	0,327

Таблица 16 Шахматная доска микограба (RTM) (MG в мкг/мл), в сравнении с 5-фторурацилом (5-FU в мкг/мл)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

Среда 2,5% DMSO

5FU 4,5

5FU 9

5FU 18,5

5FU 37

5FU 75

5FU 150

5FU 300

5FU 600

5FU 1200

5FU 2400

Только среда без клеток

В

2,5% DMSO MG 3

5FU 4,5 MG 3

5FU 9 MG 3

5FU 18,5 MG 3

5FU 37 MG 3

5FU 75 MG 3

5FU 150 MG 3

5FU 300 MG 3

5FU 600 MG 3

5FU 1200 MG 3

5FU 2400 MG 3

Только среда без клеток

С

2,5% DMSO MG 6

5FU 4,5 MG 6

5FU 9 MG 6

5FU 18,5 MG 6

5FU 37 MG 6

5FU 75 MG 6

5FU 150 MG 6

5FU 300 MG 6

5FU 600 MG 6

5FU 1200 MG 6

5FU 2400 MG 6

Только среда без клеток

D

2,5% DMSO MG 12,5

5FU 4,5 MG 12,5

5FU 9 MG 12,5

5FU 18,5 MG 12,5

5FU 37 MG 12,5

5FU 75 MG 12,5

5FU 150 MG 12,5

5FU 300 MG 12,5

5FU 600 MG 12,5

5FU 1200 MG 12,5

5FU 2400 MG 12,5

Только среда без клеток

E

2,5% DMSO MG 25

5FU 4,5 MG 25

5FU 9 MG 25

5FU 18,5 MG 25

5FU 37 MG 25

5FU 75 MG 25

5FU 150 MG 25

5FU 300 MG 25

5FU 600 MG 25

5FU 1200 MG 25

5FU 2400 MG 25

Только среда без клеток

F

2,5% DMSO MG 50

5FU 4,5 MG 50

5FU 9 MG 50

5FU 18,5 MG 50

5FU 37 MG 50

5FU 75 MG 50

5FU 150 MG 50

5FU 300 MG 50

5FU 600 MG 50

5FU 1200 MG 50

5FU 2400 MG 50

Только среда без клеток

G

2,5% DMSO MG 100

5FU 4,5 MG 100

5FU 9 MG 100

5FU 18,5 MG 100

5FU 37 MG 100

5FU 75 MG 100

5FU 150 MG 100

5FU 300 MG 100

5FU 600 MG 100

5FU 1200 MG 100

5FU 2400 MG 100

Только среда без клеток

H

2,5% DMSO MG 200

5FU 4,5 MG 200

5FU 9 MG 200

5FU 18,5 MG 200

5FU 37 MG 200

5FU 75 MG 200

5FU 150 MG 200

5FU 300 MG 200

5FU 600 MG 200

5FU 1200 MG 200

5FU 2400 MG 200

Только среда без клеток

Таблица 17 5-фторурацил и микограб в соотношении 0,37:1
5-FU (мкг/мл)	Микограб (мкг/мл)				CI
4,5	12,5				0,001
9	25				0,004
18,5	50				0,008
37	100				0,049
Таблица 18 5-фторурацил и микограб в соотношении 0,75:1
5-FU (мкг/мл)	Микограб (мкг/мл)				CI
4,5	6				0,184
9	12,5				0,295
Таблица 19 5-фторурацил и микограб в соотношении 12:1
5-FU (мкг/мл)	Микограб (мкг/мл)				CI
37	3				0,557
75	6				0,228
150	12,5				0,198
300	25				0,540
600	50				0,250
1200	100				0,478
2400	100				0,212
Таблица 20 5-фторурацил и микограб в соотношении 50:1
5-FU (мкг/мл)	Микограб (мкг/мл)				CI
75	1,5				0,004
150	3				0,342
300	6				0,482
Таблица 21 Оксалиплатин и микограб в соотношении 1,25:1
Оксалиплатин (мкг/мл)	Микограб (мкг/мл)				CI
7,5	6				0,378
15,5	12,5				0,182
31	25				0,153
62,5	50				0,046
125	100				0,616
250	200				0,185
Таблица 22 5-фторурацил, оксалиплатин и микограб в соотношении 3:1:0,42
5-FU (мкг/мл)	Микограб (мкг/мл)				Оксалиплатин (мкг/мл)			CI
9	3				1,3			0,053
18,5	6				2,6			0,109
37	12,5				5,25			0,239
75	25				10,5			3,120
Таблица 23 5-фторурацил, оксалиплатин и микограб в соотношении 3:2:0,42
5-FU (мкг/мл)	Микограб (мкг/мл)				Оксалиплатин (мкг/мл)			CI
9	6				1,3			0,074
18,5	12,5				2,6			0,152
37	25				5,25			0,405
75	50				10,5			1,519
Таблица 24 5-фторурацил, оксалиплатин и микограб в соотношении 3:0,5:0,42
5-FU (мкг/мл)	Микограб (мкг/мл)				Оксалиплатин (мкг/мл)			CI
9	1,5				1,3			0,043
18,5	3				2,6			0,089
37	6				5,25			0,184
75	12,5				10,5			2,202
Таблица 25
Препарат (соотношение)		Величины комбинированного показателя при
			ED50	ED75		ED90	Dm		r
5-FU			N/A	N/A		N/A	297,1493		0,95571
Микограб			N/A	N/A		N/A	96,46543		0,87307
Оксалиплатин			N/A	N/A		N/A	27,77133		0,94124
5-FU/микограб/ оксалиплатин			0,77008	0,11419		0,02256	64,92005		0,87996
(3:1:0,42)
5-FU/микограб/ оксалиплатин			0,85085	0,16415		0,03924	55,54798		0,97163
(1,5:1:0,21)
5-FU/микограб/ оксалиплатин			0,62267	0,09916		0,02224	61,08042		0,9142
(6:1:0,85)

Claims (48)

1. Применение
(i) антитела или его антиген-связывающего фрагмента, который распознает эпитоп, имеющий последовательность SEQ ID NO:1; и
(ii) по меньшей мере, одного противоракового средства, выбранного из группы, состоящей из доксорубицина, даунорубицина, эпирубицина, герцептина, доцетаксела и цисплатина
в способе изготовления лекарственного средства для лечения рака.

2. Комбинированный препарат, включающий:
(i) антитело или его антиген-связывающий фрагмент, который распознает эпитоп, имеющий последовательность SEQ ID NO:1; и
(ii) по меньшей мере, одно противораковое средство, выбранное из группы, состоящей из доксорубицина, даунорубицина, эпирубицина, герцептина, доцетаксела и цисплатина,
для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении рака.

3. Применение по п.1, где указанный рак выбран из группы, состоящей из фибросаркомы, карциномы молочной железы, предстательной железы, меланомы, лейкоза, лимфом, карциномы ободочной кишки, зародышевоклеточной карциномы семенников, карциномы поджелудочной железы, яичников, эндометрия, щитовидной железы и легких.

4. Комбинированный препарат по п.2, где указанный рак выбран из группы, состоящей из фибросаркомы, карциномы молочной железы, предстательной железы, меланомы, лейкоза, лимфом, карциномы ободочной кишки, зародышевоклеточной карциномы семенников, карциномы поджелудочной железы, яичников, эндометрия, щитовидной железы и легких.

5. Способ лечения рака, включающий введение терапевтически эффективного количества:
(i) антитела или его антиген-связывающего фрагмента, который распознает эпитоп, имеющий последовательность SEQ ID NO:1; и
(ii) по меньшей мере, одного противоракового средства, выбранного из группы, состоящей из доксорубицина, даунорубицина, эпирубицина, герцептина, доцетаксела и цисплатина,
нуждающемуся в них пациенту.

6. Применение
(i) антитела или его антиген-связывающего фрагмента, который распознает эпитоп, имеющий последовательность SEQ ID NO:1;
в способе изготовления лекарственного средства для лечения лейкоза.

7. Применение
(i) антитела или его антиген-связывающего фрагмента, который распознает эпитоп, имеющий последовательность SEQ ID NO:1; и
(ii) по меньшей мере, одного противоракового средства, выбранного из группы, состоящей из иматиниба, паклитаксела, доцетаксела, даунорубицина, доксорубицина и гидроксимочевины,
в способе изготовления лекарственного средства для лечения лейкоза.

8. Комбинированный препарат, включающий
(i) антитело или его антиген-связывающий фрагмент, который распознает эпитоп, имеющий последовательность SEQ ID NO:1; и
(ii) по меньшей мере, одно противораковое средство, выбранное из группы, состоящей из иматиниба, паклитаксела, доцетаксела, даунорубицина, доксорубицина и гидроксимочевины,
для одновременного, раздельного или последовательного введения при лечении лейкоза.

9. Применение по любому из пп.6 или 7, где указанный лейкоз выбран из группы, состоящей из острого миелобластического лейкоза, острого лимфобластического лейкоза, хронического миелоидного лейкоза и хронического лимфоцитарного лейкоза.

10. Комбинированный препарат по п.8, где указанный лейкоз выбран из группы, состоящей из острого миелобластического лейкоза, острого лимфобластического лейкоза, хронического миелоидного лейкоза и хронического лимфоцитарного лейкоза.

11. Применение по любому из пп.6 или 7, где указанное, по меньшей мере, одно противораковое средство представляет собой иматиниб.

12. Комбинированный препарат по п.8, где указанное, по меньшей мере, одно противораковое средство представляет собой иматиниб.

13. Применение по любому из пп.6 или 7, где указанный лейкоз представляет собой хронический миелоидный лейкоз или острый лимфоидный лейкоз.

14. Комбинированный препарат по п.8, где указанный лейкоз представляет собой хронический миелоидный лейкоз или острый лимфоидный лейкоз.

15. Применение по п.13, где указанный лейкоз характеризуется клетками, которые являются положительными по филадельфийской хромосоме, или клетками, которые являются отрицательными по филадельфийской хромосоме.

16. Комбинированный препарат по п.14, где указанный лейкоз характеризуется клетками, которые являются положительными по филадельфийской хромосоме, или клетками, которые являются отрицательными по филадельфийской хромосоме.

17. Применение по п.13, где указанное противораковое средство представляет собой иматиниб, а указанный лейкоз характеризуется клетками, которые являются положительными по филадельфийской хромосоме.

18. Комбинированный препарат по п.14, где указанное противораковое средство представляет собой иматиниб, а указанный лейкоз характеризуется клетками, которые являются положительными по филадельфийской хромосоме.

19. Применение по п.13, где указанное противораковое средство представляет собой иматиниб, а указанный лейкоз характеризуется клетками, которые являются отрицательными по филадельфийской хромосоме.

20. Комбинированный препарат по п.14, где указанное противораковое средство представляет собой иматиниб, а указанный лейкоз характеризуется клетками, которые являются отрицательными по филадельфийской хромосоме.

21. Применение по любому из пп.6 или 7, где указанный лейкоз характеризуется клетками, которые являются устойчивыми к иматинибу.

22. Комбинированный препарат по любому из пп.8,16,18 или 20, где указанный лейкоз характеризуется клетками, которые являются устойчивыми к иматинибу.

23. Способ лечения лейкоза, включающий введение терапевтически эффективного количества:
(i) антитела или его антиген-связывающего фрагмента, который распознает эпитоп, имеющий последовательность SEQ ID NO:1; и
(ii) по меньшей мере, одного противоракового средства, выбранного из группы, состоящей из иматиниба, паклитаксела, доцетаксела, даунорубицина, доксорубицина и гидроксимочевины,
нуждающемуся в нем пациенту.

24. Способ по п.23, где указанный лейкоз представляет собой хронический миелоидный лейкоз, а указанное, по меньшей мере, одно противораковое средство представляет собой иматиниб.

25. Применение
(i) антитела или его антиген-связывающего фрагмента, который распознает эпитоп, имеющий последовательность SEQ ID NO:1; и
(ii) по меньшей мере, одного противоракового средства, выбранного из группы, состоящей из: 5-фторурацила, оксалиплатина, иринотекана и ралтитрекседа
в способе изготовления лекарственного средства для лечения рака.

26. Комбинированный препарат, включающий:
(i) антитело или его антиген-связывающий фрагмент, который распознает эпитоп, имеющий последовательность SEQ ID NO:1; и
(ii) по меньшей мере, одно противораковое средство, выбранное из группы, состоящей из: 5-фторурацила, оксалиплатина, иринотекана и ралтитрекседа
для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении рака.

27. Применение по любому из пп.1, 6, 7 или 25, где указанное антитело или его антиген-связывающий фрагмент специфичны к эпитопу, представленному пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:1.

28. Комбинированный препарат по любому из пп.2,8 или 26, где указанное антитело или его антиген-связывающий фрагмент специфичны к эпитопу, представленному пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:1.

29. Применение по любому из пп.1, 6, 7 или 25, где указанное антитело включает последовательность SEQ ID NO:2.

30. Комбинированный препарат по любому из пп.2, 8 или 26, где указанное антитело включает последовательность SEQ ID NO:2.

31. Применение по п.25, где указанный рак выбран из группы, состоящей из фибросаркомы, аденокарциномы, рака молочной железы, предстательной железы, меланомы, лейкоза, лимфом, карциномы ободочной и прямой кишки, зародышевоклеточной карциномы семенников, карциномы поджелудочной железы, яичников, эндометрия, щитовидной железы и легких.

32. Комбинированный препарат по п.26, где указанный рак выбран из группы, состоящей из фибросаркомы, аденокарциномы, рака молочной железы, предстательной железы, меланомы, лейкоза, лимфом, карциномы ободочной и прямой кишки, зародышевоклеточной карциномы семенников, карциномы поджелудочной железы, яичников, эндометрия, щитовидной железы и легких.

33. Применение по п.31, где указанный рак представляет собой рак ободочной и прямой кишки или аденокарциному.

34. Комбинированный препарат по п.32, где указанный рак представляет собой рак ободочной и прямой кишки или аденокарциному.

35. Способ лечения рака, включающий введение терапевтически эффективного количества
(i) антитела или его антиген-связывающего фрагмента, который распознает эпитоп, имеющий последовательность SEQ ID NO:1; и
(ii) по меньшей мере, одного противоракового средства, выбранного из группы, состоящей из: 5-фторурацила, оксалиплатина, иринотекана и ралтитрекседа,
нуждающемуся в них пациенту.

36. Применение по п.25, где противораковое средство представляет собой 5-фторурацил и, кроме того, включает фолиновую кислоту (лейковорин).

37. Комбинированный препарат по п.26, где противораковое средство представляет собой 5-фторурацил и, кроме того, включает фолиновую кислоту (лейковорин).

38. Способ по п.35, где противораковое средство представляет собой 5-фторурацил и, кроме того, включает фолиновую кислоту (лейковорин).

39. Применение по п.36, где противораковое средство включает 5-фторурацил, фолиновую кислоту (лейковорин) и оксалиплатин.

40. Комбинированный препарат по п.37, где противораковое средство включает 5-фторурацил, фолиновую кислоту (лейковорин) и оксалиплатин.

41. Способ по п.38, где противораковое средство включает 5-фторурацил, фолиновую кислоту (лейковорин) и оксалиплатин.

42. Способ по любому из пп.5, 23, 24, 35, 38 или 41, где указанная композиция или комбинированный препарат вводится перорально.

43. Применение по любому из пп.1, 6, 7 или 25, где указанное антитело или антиген-связывающий фрагмент мечен детектируемой меткой.

44. Комбинированный препарат по любому из пп.2, 8 или 26, где указанное антитело или антиген-связывающий фрагмент мечен детектируемой меткой.

45.Способ по любому из пп.5, 23, 24, 35, 38 или 41, где указанное антитело или антиген-связывающий фрагмент мечен детектируемой меткой.

46. Применение по п.43, где указанное антитело или антиген-связывающий фрагмент конъюгирован с эффекторной молекулой.

47. Комбинированный препарат по п.44, где указанное антитело или антиген-связывающий фрагмент конъюгирован с эффекторной молекулой.

48. Способ по п.45, где указанное антитело или антиген-связывающий фрагмент конъюгирован с эффекторной молекулой.