RU2358761C2 - Терапевтическое средство при повреждении спинного мозга, включающее антагонист интерлейкина-6 - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине и касается терапевтического средства, применяемого при повреждении спинного мозга, включающего антагонист интерлейкина-6. Терапевтическое средство при повреждении спинного мозга включает в качестве активного ингредиента антитело к рецептору IL-6. Преимущество изобретения заключается в создании композиции, пригодной для лечения повреждений спинного мозга. 3 н. и 24 з.п. ф-лы, 5 ил.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение имеет отношение к терапевтическому средству, применяемому при повреждении спинного мозга, включающему в качестве активного ингредиента антагонист интерлейкина-6 (IL-6).

Уровень техники

В современном обществе человек может страдать повреждением спинного мозга, возникающим в результате автомобильных аварий, падений, спортивных травм и т.п. В Японии ежегодное число пострадавших составляет около 5000, а общее число пострадавших к настоящему времени составляет около 100000. Симптомы повреждения спинного мозга очень тяжелые и включают постоянную тетраплегию (паралич четырех конечностей), двигательный и сенсорный паралич, поражения мочевого пузыря и прямой кишки, нарушения дыхания и т.д. Повседневное решение этих проблем включает реабилитацию, контроль за дыханием, предупреждение появлений пролежней, помощь и уход при дефекации и мочеиспускании и т.п.

В настоящее время эффективные методы лечения повреждений спинного мозга отсутствуют, и существуют лишь симптоматические способы, включающие местную стабилизацию, например хирургию. Чтобы предотвратить обострение патологических состояний, пациентам вводили в больших количествах стероиды, но результатов, указывающих на выздоровление от паралича, получено не было. Многие повреждения спинного мозга начинаются с повреждения (первичное повреждение), вызванного внешним механическим воздействием, и затем прогрессируют, приводя к разрушению тканей (вторичное повреждение) через метаболические пути живого организма. Единственным лекарственным средством, применяемым для замедления прогрессирования вторичных повреждений, является метилпреднизолон, который вводили в больших количествах, таких как 10000 мг. Было показано, однако, что этот способ сопровождается побочными эффектами, такими как обострение сахарного диабета и пневмонии.

В конце XIX в. нейроанатом Рамон-и-Кахаль (Ramon у Cajal) в своей книге утверждал: «центральная нервная система (головной и спинной мозг) млекопитающих не способна к регенерации после того, как была повреждена», и с тех пор это утверждение не подвергалось сомнению. В 1980-х годах, однако, было сообщено об имплантации периферических нервов в поврежденный спинной мозг (A.Aquayo et al., J. Exp. Biol. 95:231-240, 1981) и об имплантации эмбрионального спинного мозга (Bregman B.S., Dev. Brain Res., 34:265-279, 1987), что указывало на то, что даже после повреждения спинного мозга можно наблюдать регенерацию поврежденных аксонов, если в поврежденном месте создать соответствующую среду. Также было представлено множество данных об аксональной регенерации, например о стимулировании регенерации поврежденных аксонов нейротрофическими факторами (Cat D. et al., Neuron, 22:89-101, 1999), об идентификации факторов, ингибирующих рост аксонов (Chen D. et al., Nature 403:434-439, 2000), и похожие сведения, предполагающие, что регенерация поврежденного спинного мозга может стать реальностью. Однако клиническое применение имплантации эмбрионального спинного мозга затруднительно из-за недостатка доноров и из-за этических проблем.

Кроме того, нервные стволовые клетки являются недифференцированными (плюрипотентными) клетками нервной системы, которые могут размножаются и многократно пассируются (способность к самовоспроизведению) и одновременно приводят к образованию трех типов клеток (нейроны, астроциты, олигодендроциты), которые составляют центральную нервную систему и, так как они также обнаруживаются в спинном мозге взрослых людей, предполагают, что они способны к репарации поврежденных тканей. Однако в действительности, после повреждения они не дифференцируются в нейроны и целиком превращаются в глиальные клетки, формируя, таким образом, рубцы.

Встречаются отдельные сообщения о том, что в индукцию дифференцировки нервных стволовых клеток вовлечены цитокины. Weiss et al., сообщили о том, что дифференцировка нервных стволовых клеток, происходящих из стриатума (полосатое тело, «центр удовольствия» головного мозга) эмбрионов мыши, в нейроны ускоряется нейротрофическим фактором мозга (BDNF, brain-derived neurotrophic factor) (Ahmed, S. et al., J. Neurosci. 150:5765-5778, 1995). Grosh et al., сообщили также, что дифференцировка нервных стволовых клеток, происходящих из мозговой оболочки эмбрионов крысы, в нейроны активируется нейротрофином-3 (NT-3) (Grosh, A. et al., Neuron 15:89-103, 1995). McKay et al., сообщили, что дифференцировка нервных стволовых клеток, происходящих из гиппокампа эмбрионов крысы, в нейроны «инструктивно» индуцируется нейротрофическим фактором тромбоцитов (PDNF), в астроциты - цилиарным (глиальным) нейротрофическим фактором (CNTF), а в олигодендроциты - тиреоидным гормоном (Т3) (Jone, К. et al., Gene & Dev. 10:3129-3140).

Кроме того, недавно Taga et al., сообщили, что дифференцировка нервных стволовых клеток, происходящих из нервных эпителиальных клеток эмбрионов мыши, в астроциты стимулируется фактором, ингибирующим лейкемию (LIF, leukaemia inhibitory factor), и морфогенным протеином-2 из костной ткани (BMP-2) (Nakashima et al., Science 284:479-482, 1999). Общим для этих сообщений является так называемое суперсемейство IL-6, например, CNTF и LIF. Таким образом, полагают, что сигнал через gp130, который является субъединицей цитокинового рецептора, индуцирует дифференцировку нервных стволовых клеток в астроциты.

Однако литературные данные, демонстрирующие, что повреждение спинного мозга может быть восстановлено с помощью индукции цитокинами дифференцировки нервных стволовых клеток, отсутствуют.

Интерлейкин-6 (IL-6) представляет собой цитокин, который также называют фактором 2, стимулирующим В-клетки (BSF2) или интерфероном β2. IL-6 был открыт как фактор дифференцировки, вовлеченный в активацию В-лимфатических клеток (Hirano, Т. et al., Nature 324:73-76, 1986). Впоследствии было обнаружено, что он является полифункциональным цитокином, который влияет на многие функции клеток (Akira, S. et al., Adv. in Immunology 54:1-78, 1993). Было показано, что IL-6 индуцирует созревание Т-лимфатических клеток (Lotz, M. et al., J. Exp.Med. 167:1253-1258, 1988).

IL-6 сообщает клетке свою биологическую активность через два типа белков. Один из них является рецептором IL-6, белком, связывающем лиганды, с молекулярной массой около 80 кДа, к которому присоединяется IL-6 (Taga, Т. et al., J. Exp.Med. 166:967-981, 1987; Yamasaki, К. et al., Science 241:825-828, 1987). Рецептор IL-6 обнаружен не только в мембрано-связанной форме, которая проникает и экспрессируется в клеточной мембране, но также и в форме растворимого IL-6 рецептора, обнаруживаемого в большинстве экстраклеточных областей.

Другой белок представляет собой мембрано-связанный белок gp130, имеющий молекулярную массу около 130 кДа, который вовлечен в передачу сигнала без связывания лигандов. IL-6 и рецептор IL-6 образуют комплекс IL-6/рецептор IL-6, который после связывания с gp130 передает клетке биологически активный сигнал от IL-6 (Taga, Т. et al., Cell 58:573-581,1989).

Антагонист IL-6 представляет собой вещество, которое ингибирует передачу биологически активного сигнала IL-6. В настоящее время известны антитела к IL-6 (анти-IL-6 антитело), антитела к рецептору IL-6 (aHTH-IL-6-рецепторное антитело), антитела к gp130 (анти-gp130 антитело), модифицированный IL-6, неполные пептиды IL-6 или рецептора IL-6 и т.п.

Антитела к рецептору IL-6 описаны в нескольких работах (Novick, D. et al., Hybridoma 10:137-146, 1991; Huang, Y.W. et al., Hybridoma 12:621-630, 1993; International Patent Publication WO 95-09873, French Patent Application FR 2694767, United States Patent US 521628). Гуманизированное (химерное антитело, в котором большую часть составляет белок человека, «очеловеченное») РМ-1 антитело было получено путем пересадки участка, определяющего комплементарность (CDR, complementarity determining region), одного из антител, типа мышиного РМ-1 антитела (Hirata, Y. et al., Immunology 143:2900-2906, 1989), в антитело человека (International Patent Publication WO 92-19759).

Patent document 1: WO 95-09873

Patent document 2: FR 2694767

Patent document 3: USP 0521628

Non-patent document 1: A. Aguayo et al., J. Exp. Biol. 95:231-240, 1981

Non-patent document 2: Bregman B.S., Dev. Brain Res. 34:265-279, 1987

Non-patent document 3: Cai D. et al., Neuron 22:89-101, 1999

Non-patent document 4: Chen D. et al., Nature 403:434-439, 2000

Non-patent document 5: Ahmed S. et al., J. Neurosci. 150:5765-5778, 1995

Non-patent document 6: Grosh A. et al., Neuron 15:89-103, 1995

Non-patent document 7: Jone K. et al., Gene & Dev. 10:3129-3140, 1996

Non-patent document 8: Nakashima K. et al., Science 284:479-482, 1999

Non-patent document 9: Hirano T. et al., Nature 324:73-76, 1986

Non-patent document 10: Akira S. et al., Adv. Immunology 54:1-78, 1993

Non-patent document 11: Lotz M. et al., J. Exp.Med. 167:1253-1258, 1988

Non-patent document 12: Taga T. et al., Cell 58:573-581, 1989

Non-patent document 13: Yamasaki K. et al., Science 241:825-828, 1987

Non-patent document 14: Novick D. et al., Hybridoma 10:137-146, 1991

Non-patent document 15: Huang Y.W. et al., Hybridoma 12:621-630, 1993

Non-patent document 16: Hirata Y. et al., J. Immunol. 143:2900-2906, 1989

Раскрытие изобретения

Таким образом, существует необходимость в терапевтическом средстве, которое не только предупреждает обострение симптомов повреждения спинного мозга, но также помогает выздоровлению, и настоящее изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, пригодную для этих целей.

После тщательного и исчерпывающего изучения, направленного на решение проблемы, указанной выше, авторы настоящего изобретения обнаружили, что антагонист IL-6, например антитела к рецептору IL-6, способствуют восстановлению при повреждении спинного мозга. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает терапевтическое средство для лечения повреждений спинного мозга, включающее в качестве активного ингредиента антагонист интерлейкина-6 (IL-6).

Настоящее изобретение также предоставляет модулятор дифференцировки нервных стволовых клеток, включающий в качестве активного ингредиента антагонист интерлейкина-6 (IL-6).

Настоящее изобретение также предоставляет ингибитор дифференцировки в глиальные клетки, включающий в качестве активного ингредиента антагонист интерлейкина-6 (IL-6).

Указанный антагонист IL-6 предпочтительно является антителом к рецептору IL-6, и, наиболее предпочтительно, моноклональным антителом. В качестве такого моноклонального антитела можно отметить, например, моноклональное антитело к человеческому рецептору IL-6 и моноклональное антитело к мышиному рецептору IL-6. В качестве отдельного примера указанного выше моноклонального антитела к человеческому рецептору IL-6 можно упомянуть, например, антитело РМ-1, а в качестве отдельного примера указанного выше моноклонального антитела к мышиному рецептору IL-6, можно упомянуть например, антитело MR16-1. Кроме того, в качестве примера антител к рецептору IL-6 можно упомянуть рекомбинантное антитело, например химерное антитело, гуманизированное антитело и другие, которые можно получить с помощью искусственно сконструированного гена, клонированного из гибридомы, продуцирующей антитело.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. График, демонстрирующий оценку восстановления двигательной функции нижних конечностей после повреждения спинного мозга у мышей с поврежденным спинным мозгом, которые получали антитела к рецептору IL-6 (MR16-1), по сравнению с мышами с поврежденным спинным мозгом (контроль), которые не получали указанных антител.

Фиг.2. График, показывающий тестирование на вращающемся стержне ротарод восстановление двигательной координации после повреждения спинного мозга у мышей с поврежденным спинным мозгом, которые получали антитела к рецептору

IL-6 (MR 16-1), по сравнению с мышами с поврежденным спинным мозгом (контроль), которые указанные антитела не получали.

Фиг.3. График, показывающий, что формирование глии в поврежденной области спинного мозга, ингибировалось у мышей с поврежденным спинным мозгом, которые получали антитела к рецептору IL-6 (MR16-1), по сравнению с мышами с поврежденным спинным мозгом (контроль), которые указанные антитела не получали.

Фиг.4. Рисунок (вестерн-блот), показывающий, что рецептор IL-6 экспрессировался в поврежденной области спинного мозга у мышей с поврежденным спинным мозгом по сравнению с ложнооперированными мышами (SHAM), у которых повреждение спинного мозга отсутствовало.

Фиг.5. Вестерн-блот фосфорилированного STAT3, показывающий, что введение антител к рецептору IL-6 (MR16-1) действительно ингибирует сигнальный каскад IL-6 в поврежденной области спинного мозга.

Осуществление изобретения

Антагонисты IL-6, применяемые в настоящем изобретении, могут быть любого происхождения, любого вида и любой формы до тех пор, пока они демонстрируют терапевтический эффект на повреждение спинного мозга.

Антагонисты IL-6 блокируют передачу сигнала от IL-6 и ингибируют биологическую активность IL-6. Антагонисты IL-6 предпочтительно являются веществами, обладающими активностью, ингибирующей связывание друг с другом любого компонента сигнальной цепи - IL-6, рецептора IL-6 или gp130. В качестве антагонистов IL-6 могут быть упомянуты, например, антитела к IL-6, антитела к рецептору IL-6, антитела к gp130, измененный IL-6, измененный растворимый рецептор IL-6, неполные пептиды IL-6 или рецептора IL-6 и вещество с низкой молекулярной массой, обладающее такой же активностью, как и они.

Антитела к IL-6 для применения в настоящем изобретении можно получить в виде поликлональных или моноклональных антител с помощью известного метода. В качестве антител к IL-6 в настоящем изобретении предпочтительно применяются моноклональные антитела, в особенности, антитела млекопитающих. Моноклональные антитела млекопитающих включают антитела, продуцируемые гибридомой, и рекомбинатные антитела, продуцируемые «хозяином», который был трансформирован с помощью экспрессионного вектора, содержащего генетически сконструированные гены антител. Эти антитела, связываясь с IL-6, блокируют связывание IL-6 с рецептором IL-6 и, таким образом, блокируют передачу биологически активного сигнала от IL-6 в клетку.

Примеры таких антител включают антитело МН166 (Matsuda Т. et al., Eur. J. Immunol. 18:951-956, 1988) и антитело SK2 [Sato, К. et al., The 21^st Nihon Menekigakkai Soukai (General Meeting of the Japan Immunology Society), Academic Record 21:166, 1991] и т.п.

Гибридому, продуцирующую антитела к IL-6, можно сконструировать, используя известную процедуру, описанную ниже. Таким образом, в качестве сенсибилизирующего антигена можно применять IL-6 и им иммунизируют с помощью традиционного метода иммунизации. Полученные таким образом иммунные клетки сливают с известными родительскими клетками в обычном процессе клеточного слияния, и затем, для получения желаемой гибридомы, клетки, продуцирующие моноклональные антитела, отбирают с помощью традиционных методов скрининга.

В частности, антитела к IL-6 можно получить следующим способом. Например, человеческий IL-6, применяемый в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антител, можно получить, используя ген/аминокислотную последовательность IL-6, подробно описанную в Eur. J. Biochem. 168:543-550, 1987, J. Immunol. 140:1534-1541, 1988 или Agr. Biol. 54:2685-2688, 1990.

После этого подходящую клетку-хозяина трансформируют с помощью вставки генной последовательности IL-6 в известную систему экспрессионного вектора, интересующий белок IL-6 очищают из хозяйских клеток или их культурального супернатанта, и очищенный белок IL-6 может быть использован в качестве сенсибилизирующего антигена. Альтернативно, в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать слитый белок, образованный комбинацией белка IL-6 и другого белка.

Антитела к рецептору IL-6 для применения в настоящем изобретении могут быть получены в виде поликлональных или моноклональных антител с использованием известного метода. В качестве антител к рецептору IL-6 для применения в настоящем изобретении предпочтение имеют моноклональные антитела, в особенности антитела млекопитающих. Моноклональные антитела млекопитающих включают антитела, продуцируемые гибридомой, и антитела, продуцируемые хозяином, который был трансформирован с помощью экспрессионного вектора, включающего генетически сконструированные гены антитела. Эти антитела, связываясь с рецептором IL-6, блокируют связывание IL-6 с рецептором IL-6 и, таким образом, блокируют передачу биологически активного сигнала от IL-6 в клетку.

Примеры таких антител включают антитело MR16-1 (Tamura, Т. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11924-11928, 1993), антитело PM-1 (Hirata, Y. et al., J. Immunol. 143:2900-2906, 1989), или антитело AUK12-20, антитело AUK64-7 или антитело AUK146-15 (International Patent Publication WO 92-19759) и т.п. Среди них наиболее предпочтительным является антитело PM-1.

В этой связи клеточная линия PM-1 гибридомы, которая продуцирует PM-1 антитело, была депонирована для международного признания 12 июля 1989 г. по условиям Будапештского договора как FERM ВР-2998 Депозитарием для патентуемых микроорганизмов Национального института индустриальной науки и технологии (Patent Microorganism Depository of National Institute of Industrial Science and Technology, of Chuo 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan). Клеточная линия крысино-мышиной гибридомы MR16-1, которая продуцирует антитела MR16-1, была депонирована для международного признания 13 марта 1997 г. по условиям Будапештского договора как PERM BP-5875 Депозитарием для патентуемых микроорганизмов Национального института индустриальной науки и технологии (Patent Microorganism Depository of National Institute of Industrial Science and Technology, of Chuo 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan).

Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к рецептору IL-6, могут быть получены в основном с помощью известной процедуры, описанной ниже. Таким образом, в качестве сенсибилизирующего антигена применяется рецептор IL-6, и им иммунизируют с помощью обычного метода иммунизации. Полученные таким образом иммунные клетки сливают с известными родительскими клетками в обычном процессе клеточного слияния, и затем, для получения желаемой гибридомы, клетки, продуцирующие моноклональные антитела, отбирают с помощью традиционного метода скрининга.

В частности, антитела к рецептору IL-6 можно получить следующим способом. Например, человеческий рецептор IL-6, применяемый в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антител, можно получить, используя ген/аминокислотную последовательность рецептора IL-6, подробно описанную в European Patent Application EP 325474, и мышиный рецептор IL-6 можно получить, используя последовательность гена и аминокислотную последовательность рецептора IL-6, подробно описанную в Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 3-155795.

Существуют два типа белков рецептора IL-6: рецептор IL-6, экспрессированный на клеточной мембране и рецептор IL-6, отделенный от клеточной мембраны (растворимый рецептор IL-6) (Yasukawa К. et al., J. Biochem. 108:673-676, 1990). Растворимый рецептор IL-6 формируется в значительной степени из экстраклеточного участка рецептора IL-6, связанного с клеточной мембраной, и, таким образом, отличается от мембрано-связанной формы рецептора IL-6 тем, что растворимый рецептор не содержит трансмембранный участок или трансмембранный участок вместе с внутриклеточным участком. В качестве белка рецептора IL-6 можно использовать любой рецептор IL-6 до тех пор, пока его можно применять в качестве сенсибилизирующего антигена для использования в настоящем изобретении.

После того, как последовательность гена рецептора IL-6 включают в известную экспрессионную векторную систему для трансформации клетки подходящего хозяина, желаемый белок рецептора IL-6 может быть очищен из хозяйских клеток или из культурального супернатанта с помощью известного метода, и очищенный белок рецептора IL-6 может быть использован в качестве сенсибилизирующего антигена. Альтернативно, в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать клетки, экспрессирующие рецептор IL-6, или слитый белок, образованный комбинацией белка рецептора IL-6 и другого белка.

Escherichia coli (E.coli) HB101-pIBIBSF2R, которая содержит плазмиду pIBIBSF2R, включающую кДНК, которая кодирует рецептор IL-6 человека, была депонирована для международного признания 9 января 1989 г. по условиям Будапештского договора как FERM ВР-2232 Депозитарием для патентуемых микроорганизмов Национального института индустриальной науки и технологии (Patent Microorganism Depository of National Institute of Industrial Science and Technology, of Chuo 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan).

Антитела к gp130, применяемые в настоящем изобретении, могут быть получены в виде поликлональных или моноклональных антител с использованием известного метода. В качестве антител к gp130 для применения в настоящем изобретении предпочтительно используются моноклональные антитела, в особенности антитела млекопитающих. Моноклональные антитела млекопитающих включают антитела, продуцируемые гибридомой, и антитела, продуцируемые хозяином, который был трансформирован с помощью экспрессионного вектора, включающего генетически сконструированные гены антитела. Эти антитела, связываясь с gp130, блокируют связывание комплекса IL-6/рецептор IL-б с gp130, и, таким образом, блокируют передачу биологически активного сигнала от IL-6 в клетку.

Примеры таких антител включают антитело АМ64 (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 3-219894), антитело 4В11 и антитело 2Н4 (US 5571513), антитело

B-S12 и антитело В-Р8 (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 8-291199) и т.п.

Гибридома, продуцирующая моноклональные антитела к gp130, может быть получена в основном с помощью известной процедуры, описанной ниже. Таким образом, gp130 применяется в качестве сенсибилизирующего антигена и им иммунизируют с помощью обычного метода иммунизации. Полученные таким образом иммунные клетки сливают с известными родительскими клетками в обычном процессе клеточного слияния, и затем, для получения желаемой гибридомы, клетки, продуцирующие моноклональные антитела, отбирают с помощью традиционного метода скрининга.

В частности, моноклональные антитела можно получить следующим способом. Например, gp130, применяемый в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антител, можно получить, используя ген/аминокислотную последовательность gp130, подробно описанную в European Patent Application EP 411946.

После того, как клетку подходящего хозяина трансформируют путем включения последовательности гена gp130 в известную экспрессионную векторную систему, интересующий белок gp130 очищают из хозяйских клеток или из культурального супернатанта с помощью известного метода. Очищенный белок gp130 может быть использован в качестве сенсибилизирующего антигена. Альтернативно в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать клетки, экспрессирующие gp130, или слитый белок, образованный комбинацией gp130 и другого белка.

Хотя выбор млекопитающих, применяемых для иммунизации, специально не ограничен, их предпочтительно выбирают из соображений их совместимости с родительскими клетками, используемыми для клеточного слияния. Обычно они включают грызунов, таких как мыши, крысы, хомяки и т.п.

Иммунизацию животных сенсибилизирующим антигеном проводят, используя известный способ. Основной способ, например, включает внутрибрюшинную или подкожную инъекцию млекопитающим сенсибилизирующего антигена. В частности, сенсибилизирующий антиген, который был разведен и суспендирован в подходящем количестве фосфатно-солевого буфера (PBS) или физиологического раствора и т.д., смешивают, по желанию, с подходящим количеством обычного адъюванта, например полного адъюванта Фрейнда. После эмульгирования он вводится млекопитающему предпочтительно в несколько приемов каждые 4-21 дня. Альтернативно, во время иммунизации сенсибилизирующим антигеном может быть использован подходящий носитель.

Клетки миеломы млекопитающих как другой тип родительских клеток, которые сливают с упомянутыми выше иммунными клетками, предпочтительно включают различные известные клеточные линии, такие как P3X63Ag8.653 (Keamey J. F. et al., J. Immunol. 123:1548-1550, 1979), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology 81:1-7, 1978), NS-1 (Kohler G. and Milstein C., Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976), MPC-11 (Margulies D.H. et al., Cell 8:405-415, 1976), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature 276:269-270, 1978), FO (de St. Groth S. F. et al., J. Immunol. Methods 35:1-21, 1980), S194 (Trowbridge I.S., J. Exp. Med. 148:313-323, 1978), R210 (Galfre G. et al., Nature 277:131-133, 1979) и т.п.

Слияние клеток между указанными выше иммунными клетками и клетками миеломы по существу может быть проведено в соответствии с известным способом, таким как способ, описанный в работе Milstein et al. (Kohler G. and Milstein C., Methods Enzymol. 73:3-46, 1981) и т.п.

Более конкретно указанное слияние клеток проводят в подходящем питательном бульоне в присутствии, например, катализатора клеточного слияния. В качестве катализатора клеточного слияния, например, можно использовать полиэтиленгликоль (PEG), вирус Сендай (HVJ) и нечто подобное, и, кроме того, чтобы усилить эффективность слияния, по желанию, можно добавлять адъювант, такой как диметилсульфоксид и т.д.

Предпочтительное соотношение используемых иммунных клеток и клеток миеломы составляет, например, от 1- до 10-кратного избытка иммунных клеток по сравнению с клетками миеломы. Примеры культуральных сред, применяемых для клеточного слияния, включают среду RPMI1640 и культуральную среду MEM, подходящую для роста клеточных линий миеломы, а также обычную культуральную среду, используемую для такого типа клеточной культуры, и, помимо этого, можно вводить сывороточные добавки, такие как фетальная сыворотка теленка (FCS).

При слиянии клеток в указанных выше культуральных жидкостях, к которым добавляют предварительно прогретый до 37°С раствор PEG, например раствор PEG с молекулярной массой от 1000 до 6000 в концентрации от 30 до 60% (вес/объем), тщательно смешивают предварительно определенное количество иммунных клеток и клеток миеломы и перемешивают для образования желаемых слитых клеток (гибридома). Затем с помощью процедуры повторного последовательного добавления подходящей культуральной среды и центрифугирования можно удалить супернатант, агенты клеточного слияния и т.д., присутствие которых нежелательно для роста гибридомы.

Гибридома может быть отобрана с помощью культивирования в обычной селекционной среде, например в культуральной среде HAT (культуральная жидкость, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культивирование в указанной культуральной среде HAT продолжают обычно в течение времени, достаточного для гибели неслившихся клеток, отличающихся от желаемой гибридомы, и которое обычно длится от нескольких дней до нескольких недель. Затем, чтобы осуществить скрининг и клонирование гибридом, продуцирующих желаемое антитело, используют обычный метод предельных (конечных) разведений.

Кроме получения указанной выше гибридомы с помощью иммунизации антигеном животного, но не человека, для получения желаемых человеческих антител, обладающих активностью связывания с желаемым антигеном или клетками, экспрессирующими желаемый антиген (см. Japanese Post-examined Patent Publication (Kokoku) No 1-59878), также лимфоциты человека можно сенсибилизировать in vitro желаемым белком-антигеном или клетками, экспрессирующими желаемый антиген; и полученные сенсибилизированные В-лимфоциты сливают с клетками миеломы человека, например с клетками U266. Кроме этого, чтобы получить желаемое человеческое антитело с помощью способа, описанного выше (см. International Patent Publication WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735), антигеном или клетками, экспрессирующими антиген, можно иммунизировать трансгенное животное, имеющее набор всех генов антител человека.

Сконструированную таким образом гибридому, продуцирующую моноклональные антитела, можно культивировать как инокулят в обычной культуральной жидкости или можно хранить длительное время в замороженном состоянии при температуре жидкого азота.

Чтобы получить моноклональные антитела из указанной гибридомы, можно использовать способ, в котором гибридому культивируют обычным образом и получают антитела в виде супернатанта, или с помощью способа, в котором гибридому вводят и выращивают в животных, совместимых с указанной гибридомой, а антитела получают в виде асцита. Первый способ подходит для получения высокоочищенных антител, тогда как последний способ подходит для производства больших количеств антител.

Например, гибридому, продуцирующую антитела к рецептору IL-6, можно сконструировать, используя способ, раскрытый в Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 3-139293. Ее можно сконструировать с помощью способа, в котором гибридому, продуцирующую антитело РМ-1, которая была депонирована для международного признания 12 июля 1989 г. по условиям Будапештского договора как FERM ВР-2998 Депозитарием для патентуемых микроорганизмов Национального института индустриальной науки и технологии (Patent Microorganism Depository of National Institute of Industrial Science and Technology, of Chuo 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan), вводят внутрибрюшинно мышам BALB/c для получения асцитов, из которых очищают антитела РМ-1; или с помощью способа, в котором указанную гибридому культивируют в подходящей культуральной среде, такой как среда RPMI1640, содержащая 10%-ную фетальную сыворотку теленка и 5%-ный MB-Condimed HI (производство фирмы Boehringer Mannheim), или гибридомная среда SFM (производство фирмы GIBCO-BRL), или среда PFHM-II (производство фирмы GIBCO-BRL) и т.п. Затем антитела РМ-1 можно очистить из супернатанта.

Рекомбинантное антитело, продуцированное с помощью технологии рекомбинантных генов, в которой ген антитела был клонирован из гибридомы и интегрирован в подходящий вектор, который затем был введен в организм хозяина, может быть использовано в настоящем изобретении как моноклональное антитело (см., например, Borrebaeck C.A.K. and Larrick J.W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD. 1990).

В частности, мРНК, кодирующую вариабельную (V) область желаемого антитела, выделяют из клеток, продуцирующих антитело, таких как гибридома. Выделение мРНК проводят, получая суммарный препарат РНК с использованием, например, известного способа, такого как метод ультрацентрифугирования в присутствии гуанидина (Chirgwin J.M. et al., Biochemistry 18:5294-5299, 1979), метода AGPC (Chomczynski P. et al., Anal., Biochem. 162:156-159, 1987), и затем мРНК получают из суммарного препарата РНК, используя набор фирмы Pharmacia «mRNA Purification Kit» и подобные наборы. Альтернативно, мРНК можно выделить непосредственно, используя набор фирмы Pharmacia «QuickPrep mRNA Purification Kit».

кДНК V-области антитела можно синтезировать из полученной таким способом мРНК, используя обратную транскриптазу. кДНК можно синтезировать, используя набор «AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit» и сходные наборы. Альтернативно, для синтеза и амплификации кДНК можно использовать набор фирмы Clontech «5'-Ampli FINDER RACE Kit» и метод 5'-RACE (Frohman M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998-9002, 1988; Belyavsky A. et al., Nucleic Acids Res. 17:2919-2932, 1989), в котором используется полимеразная цепная реакция (ПЦР). Желаемый фрагмент ДНК очищают из продукта ПНР, и его можно лигировать в ДНК вектора. Кроме того, из него конструируют рекомбинантный вектор и вводят его в Е. coli и т.д., отбирая колонии, продуцирующие желаемый рекомбинантный вектор. Последовательность оснований желаемой ДНК может быть подтверждена с помощью известного способа, такого как дидезокси-метод секвенирования.

После получения ДНК, кодирующей V-область желаемого антитела, ее можно лигировать в молекулу ДНК, кодирующую константную область (С-область) желаемого антитела, которую затем интегрируют в экспрессионный вектор. Альтернативно, ДНК, кодирующую V-область антитела, можно интегрировать в экспрессионный вектор, содержащий ДНК, кодирующую С-область антитела.

Чтобы продуцировать антитела для применения в настоящем изобретении, ген антитела интегрируют, как описано ниже, в экспрессионный вектор для того, чтобы он экспрессировался под контролем регуляторного участка, например энхансера и/или промотора. Затем экспрессионный вектор может быть трансформирован в клетку-хозяина, и в ней затем могут экспрессироваться антитела.

В соответствии с настоящим изобретением в целях снижения гетерологичной антигенности у человека, можно применять искусственно измененные рекомбинантные антитела, такие как химерное антитело, гуманизированное антитело и человеческое антитело.

Химерное антитело можно получить с помощью лигирования полученной таким образом ДНК, кодирующей V-область антитела, в ДНК, кодирующую С-область человеческого антитела, которую затем интегрируют в экспрессионный вектор и вводят в хозяина для продуцирования в нем антител (см. European Patent Application EP 125023 и International Patent Publication WO 92-19759). С использованием этого известного способа можно получить химерное антитело, полезное в настоящем изобретении.

Например, плазмида, которая содержит ДНК, кодирующую L-цепь V-области или Н-цепь V-области химерного антитела РМ-1, была обозначена как pPM-k3 или pPM-h1, соответственно, и Е. coli, обладающие этими плазмидами, были депонированы для международного признания 12 февраля 1991 г. по условиям Будапештского договора как NCIMB 40366 и NCIMB 40362, соответственно, Компанией Национальные коллекции промышленных и морских бактерий.

Гуманизированное антитело, которое также называют «измененным человеческим антителом», может быть получено с помощью трансплантации участка, детерминирующего комплементарность антитела (CDR) млекопитающих, но не человека, например мышиного антитела, в участок, детерминирующий комплементарность человеческого антитела. Общепринятая технология рекомбинантных ДНК для получения таких антител также известна (см. European Patent Application EP 125023 и International Patent Publication WO 92-19759).

В частности, последовательность ДНК, которая была сконструирована для лигирования CDR мышиного антитела без нарушения рамки считывания (FR, framework region) в человеческое антитело, синтезируется с помощью метода ПЦР, используя олигонуклеотиды, имеющие на концах перекрывающиеся области. Полученную таким образом ДНК лигируют в ДНК, кодирующую С-область человеческого антитела, и затем объединяют в экспрессионный вектор, который вводят в хозяина для продукции антител (см. European Patent Application EP 239400 и International Patent Publication WO 92-19759).

Чтобы получить FR человеческого антитела, дотированного по CDR-участку, выбирали такие, в которых присутствовал участок, определяющий комплементарность, формирующий подходящий участок связывания антигена. При желании можно было заменить аминокислоты без нарушения рамки считывания в вариабельном участке антитела так, чтобы участок, определяющий комплементарность человеческого антитела с измененной формой, мог образовать соответствующее место связывания антигена.

Например, для химерного антитела или гуманизированного антитела используют С-область человеческого антитела. В качестве С-области человеческого антитела могут быть использованы Сγ и Сγ1, Сγ2, Сγ3 и Сγ4, которые следует упомянуть в качестве примеров. С-область человеческого антитела можно модифицировать для улучшения стабильности антитела или его продукции.

Химерное антитело включает вариабельную область антитела, происходящего из млекопитающих, отличных от человека, и С-область, происходящую из человеческого антитела, тогда как гуманизированное антитело включает участок, определяющий комплементарность антитела, происходящего из млекопитающих, отличных от человека, а также рамку считывания и С-область, происходящие из человеческого антитела. В соответствии с этим их антигенность в организме человека снижена таким образом, что они полезны в качестве антител для применения в настоящем изобретении.

В качестве предпочтительного воплощения гуманизированного антитела для применения в настоящем изобретении можно упомянуть гуманизированное антитело РМ-1 (см. International Patent Publication WO 92-19759).

Кроме того, в дополнение к способам, описанным выше, для получения человеческих антител известна технология, использующая «просмотр» библиотеки человеческих антител. Например, используя метод фагового отображения (phage display), можно отобрать фаг, который связывается с нужным антигеном, так как вариабельная область человеческого антитела экспрессируется на поверхности фага в виде отдельной цепи антитела (scFv). С помощью генного анализа отобранного фага можно определить последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область человеческого антитела, которая связывается с антигеном. После того, как последовательность ДНК цепи scFv, которая связывает антиген, выяснена, можно сконструировать подходящий экспрессионный вектор, который содержит указанную последовательность, и использовать его в дальнейшем для получения человеческого антитела. Эти способы известны и их можно найти в WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 и WO 95/15388.

Гены антител, сконструированных как описано выше, можно экспрессировать и получить с помощью известного метода. В случае клеток млекопитающих экспрессию можно выполнить, используя вектор, включающий обычно используемый промотор, с которого идет экспрессия гена антитела, ДНК, к 3'-концу которой эффективно присоединена поли-А сигнальная последовательность, или вектор, включающий указанную ДНК. Примеры промотора/энхансера включают промотор/энхансер ранней экспрессии цитомегаловируса человека.

Кроме того, в качестве промотора/энхансера, которые могут быть использованы для экспрессии антител для применения в настоящем изобретении, можно использовать вирусные промоторы/энхансеры, такие как промоторы/энхансеры ретровируса, вируса полиомы, аденовируса и вируса обезьян 40 (SV40), а также промоторы/энхансеры, имеющие происхождение из клеток млекопитающих, таких как в гене фактора элонгации человека 1α (HEF1α).

Например, экспрессию можно легко выполнить с помощью метода Mulligan et al. (Mulligan R. С.et al., Nature 277:108-114, 1979) или с помощью метода Mizushima et al. (Mizushima S. and Nagata, S., Nucleic Acids Res. 18:5322, 1990), в которых используют промотор/энхансер HEF1α.

В случае Е. coli экспрессию можно контролировать с помощью эффективного присоединения обычно используемого в данной системе промотора, сигнальной последовательности для секреции антител и экспрессируемого гена антитела, с последующей их экспрессией. В качестве промотора, например, следует отметить промоторы lacZ и araB. При использовании промотора lacZ можно применять метод Ward et al. (Ward Е.S. et al. Nature 341:544-546, 1989; Ward Е.S. et al. FASEB J. 6:2422-2427, 1992), а при использовании промотора araB можно применять метод Better et al. (Better M. et al., Science 240:1041-1043, 1988).

В качестве сигнальной последовательности для секреции антитела, продуцирующегося в периплазме Е. coli, можно использовать сигнальную последовательность pe1B (Lei S.P. et al., J. Bacteriol. 169:4379-4383, 1987). После выделения антител, продуцируемых в периплазме, пространственную структуру антитела перед их использованием изменяют подходящим образом (см., например, WO 96/30394).

В качестве ориджена (точка инициации) репликации можно использовать производные SV40, вируса полиомы, аденовируса, вируса бычьей папилломы (BPV) и т.п. Кроме того, для амплификации числа копий гена в клеточной системе хозяина экспрессионные векторы могут включать в качестве селективных маркеров ген аминогликозидфосфотрансферазы (АРН), ген тимидинкиназы (ТК), ген ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы Е. coli (Ecogpt), ген дигидрофолатредуктазы (dhfr) и т.п.

Чтобы получить антитела для применения в настоящем изобретении можно использовать любую продуцирующую систему. Продуцирующая система для получения антител включает систему, продуцирующую in vitro или in vivo. В качестве продуцирующей системы in vitro следует упомянуть продуцирующую систему, в которой используют эукариотические клетки, и продуцирующую систему, в которой используют прокариотические клетки.

При использовании эукариотических клеток существуют продуцирующие системы, в которых используют клетки животных, растительные клетки или клетки грибов. Известные клетки животных включают (1) клетки млекопитающих, такие как СНО клетки, COS клетки, клетки миеломы, клетки почек детенышей хомяка (ВНК), клетки HeLa и клетки ВЕРО (перевиваемая клеточная линия африканских зеленых мартышек), (2) клетки амфибий, такие как ооциты Xenopus, или (3) клетки насекомых, такие как sf9, sf21 и Tn5. Известные клетки растений включают, например, те, которые происходят из Nicotiana tabacum, которые могут быть переведены в каллусную культуру. Известные клетки грибов включают дрожжи, такие как род Saccharomyces, в частности Saccharomyces cerevisae, или нитевидные грибы, такие как род Aspergillus, в частности Aspergillus niger.

Если используют прокариотические клетки, существуют продуцирующие системы, в которых применяют бактериальные клетки. Известные бактериальные клетки включают Escherichia coli (E.coli) и Bacillus subtilis.

Антитело можно получить путем введения гена желаемого антитела в эти клетки с помощью трансформации и культивирования трансформированных клеток in vitro. Культивирование проводят с помощью известных методов. Например, в качестве культуральной жидкости можно использовать DMEM, MEM, RPMI1640 и IMDM и вместе с ними можно использовать сывороточные добавки, такие как фетальная сыворотка теленка (FCS). Кроме этого, антитела можно получать in vivo, с помощью имплантирования клеток, в которые был введен ген антитела, в брюшную полость животного и т.п.

В качестве систем, продуцирующих in vivo, следует отметить те, в которых используются животные, и те, в которых используются растения. При использовании животных существуют продуцирующие системы, в которых применяют млекопитающих и насекомых.

В качестве млекопитающих могут быть использованы козы, свиньи, овцы, мыши и крупный рогатый скот (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Application, 1993). Также в качестве насекомых может быть использован тутовый шелкопряд. При использовании растений можно применять, например, табак.

Гены антител вводят в эти животные или растения, и в таких животных или растениях продуцируют антитела, которые затем выделяют. Например, чтобы получить слитые гены, ген антитела вставляют в середину гена, кодирующего белок, который наследственно продуцируется в клетках молочной железы (т.е. белок попадает в молоко), например, в такой как козий β-казеин. Фрагменты ДНК, содержащие слитые гены, в которые был вставлен ген антитела, вводят с помощью инъекции в эмбрион козы, и эмбрион вводят в самку козы. Желаемое антитело получают из молока, производимого трансгенной козой, рожденной от козы, которой был подсажен эмбрион, или ее потомством. Чтобы увеличить количество молока, содержащего желаемое антитело, производимое трансгенной козой, при необходимости трансгенной козе можно давать гормоны (Ebert К.М. et al., Bio/Technology 12:699-702, 1994).

Если используют тутовый шелкопряд, его инфицируют бакуловирусом, в который вставили ген желаемого антитела. Желаемое антитело получают из жидкости, выделяемой из тела шелкопряда (Maeda S. et al., Nature 315:592-594, 1985). Кроме этого, если используют табак, ген желаемого антитела вставляют в растительный экспрессионный вектор, например, в pMON 530, и затем этот вектор вводят в бактерии, такие как Agrobacterium tumefaciens. Чтобы получить желаемые антитела из листьев табака, этими бактериями инфицируют табак, например, Nicotiana tabacum (Julian K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. 24:131-138, 1994).

Если антитело получают с помощью продуцирующих систем in vitro или in vivo, как описано выше, ДНК, кодирующие тяжелую цепь (Н-цепь) или легкую цепь (L-цепь) антитела, можно интегрировать в экспрессионный вектор по отдельности и одновременно трансформировать ими хозяина, или ДНК, кодирующую Н- и L-цепи можно интегрировать в один и тот же экспрессионный вектор и трансформировать им хозяина (см. International Patent Publication WO 94-11523).

Антитела для применения в настоящем изобретении могут быть фрагментами антител или их модифицированными вариантами до тех пор, пока они предпочтительно используются. Например, в качестве фрагментов антитела можно упомянуть Fab, F(ab')₂, Fv или одноцепочечный Fv (scFv), в которых фрагменты Fv Н-цепи и L-цепи были лигированы через подходящий линкер.

В частности, чтобы получить фрагменты антитела, антитела обрабатывают с помощью фермента, например папаина или пепсина, или конструируют гены, кодирующие эти фрагменты антитела, и затем вставляют их в экспрессионный вектор, который экспрессируется в клетке подходящего хозяина (см., например, Со М.S. et al., J. Immunol. 152:2968-2976, 1994; Better М. and Horwitz A.N., Methods in Enzymology 178:476-496, 1989; Pluckthun A. and Skerra A., Methods in Enzymology 178:497-515. 1989; Lamoyi E., Methods in Enzymology 121:652-663, 1989; Rousseaux J. et al., Methods in Enzymology 121:663-666, 1989; Bird R. E. et al., TIBTECH 9:132-137, 1991).

Фрагмент scFv можно получить лигированием V-области Н-цепи и V-области L-цепи антитела. Во фрагменте scFv V-область Н-цепи и V-область L-цепи предпочтительно лигируют через линкер, предпочтительно пептидный линкер (Huston J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988). V-область Н-цепи и V-область L-цепи в scFv могут происходить из любого из упомянутых выше антител. В качестве пептидного линкера для лигирования V-областей может быть использован любой одноцепочечный пептид, включающий, например, 12-19 аминокислотных остатков.

ДНК, кодирующую scFv, можно получить с помощью амплификации участка ДНК, кодирующего желаемую аминокислотную последовательность между указанными выше последовательностями, методом ПЦР с помощью пары праймеров, определяющих оба их конца, используя в качестве матрицы ДНК, кодирующую Н-цепь или Н-цепь V-области указанного выше антитела, и ДНК, кодирующую L-цепь или L-цепь V-области указанного выше антитела; и с помощью последующей амплификации комбинации ДНК, кодирующей участок пептидного линкера, и пары праймеров, которые определяют синтез так, чтобы оба конца указанной ДНК были лигированы в Н-цепь и L-цепь, соответственно.

После конструирования молекул ДНК, кодирующих scFv, с помощью общепринятых методов можно получить экспрессионный вектор, содержащий эти ДНК, и трансформировать указанным экспрессионным вектором клетки-хозяина, и с помощью общепринятых методов, используя полученный трансформированный организм хозяина, можно получить scFv.

Эти фрагменты антитела можно продуцировать путем получения их гена указанным выше способом и после его экспрессии в организме хозяина. Применяемый здесь термин «антитело» также включает эти фрагменты антитела.

В качестве модифицированных антител можно использовать антитела, связанные с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (PEG). Применяемый здесь термин «антитело» также включает эти модифицированные антитела. Эти модифицированные антитела могут быть получены с помощью химической модификации полученных таким образом антител. Эти методы являются уже устоявшимися в этой области техники.

Произведенные и экспрессированные, как описано выше, антитела можно отделить от внешних и внутренних компонентов клетки-хозяина и затем очистить до гомогенного состояния. Разделение и очистка антител для применения в настоящем изобретении могут быть выполнены с помощью аффинной хроматографии. В качестве колонок, используемых для такого рода аффинной хроматографии, можно упомянуть Protein А и Protein G колонки. Примеры носителей, используемых в Protein А колонке, включают Hyper D, POROS, Sepharose F.F. и т.п. Альтернативно без каких-либо ограничений могут быть использованы любые подходящие общепринятые методы разделения и очистки белков.

Разделение и очистка антител для применения в настоящем изобретении при необходимости могут быть выполнены с помощью комбинирования хроматографии, отличной от указанной выше аффинной хроматографии, фильтрации, ультрафильтрации, обессоливания, диализа и т.п. Хроматография включает в себя, например, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию и т.п. Эти разновидности хроматографии можно применять в жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLC). Альтернативно можно использовать обращенно-фазовую HPLC.

Концентрацию антител, полученных, как описано выше, можно определить, измеряя оптическое поглощение или с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) и т.п. Таким образом, если проводят измерение оптического поглощения, образец разводят подходящим образом с помощью PBS (-) и затем измеряют оптическое поглощение при 280 нм, далее производят расчеты, используя коэффициент поглощения, равный 1,35 OD при 1 мг/мл. При использовании метода ELISA измерение проводят следующим образом. Так, 100 мкл козьих антител к иммуноглобулинам IgG человека (производство фирмы TAG), разведенных до концентрации 1 мкг/мл в 0,1М бикарбонатном буфере, рН 9,6, вносят в 96-луночный планшет (производство фирмы NUNC) и инкубируют в течение ночи при 4°С для иммобилизации антител. После блокировки вносят по 100 мкл каждого разведенного подходящим образом антитела, применяемого в настоящем изобретении, или образца, включающего антитело, или 100 мкл человеческого IgG (производство фирмы CAPPEL) в качестве стандарта и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.

После промывания вносят 100 мкл разведенных в 5000 раз антител к иммуноглобулинам IgG человека, меченых щелочной фосфатазой (производство фирмы BIO SOURCE), и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывания добавляют и инкубируют раствор субстрата, а затем, чтобы рассчитать концентрацию желаемого антитела, измеряют поглощение при 405 нм с помощью фотометра MICROPLATE READER Model 3550 (производство фирмы Bio-Rad).

Измененный IL-6 для применения в настоящем изобретении обладает биологической активностью связывания с IL-6-рецептором и не передает биологически активный сигнал IL-6. Таким образом, измененный IL-6, так как он конкурирует с IL-6 за связывание с IL-6-рецептором, не передает биологически активный сигнал IL-6 и, в связи с этим, он блокирует передачу сигнала IL-6.

Измененный IL-6 может быть сконструирован путем ввода мутации с помощью замены аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности IL-6. IL-6, являющийся источником измененного IL-6, может быть любого происхождения, но если принимать во внимание антигенность, то предпочтительно он должен быть человеческим IL-6.

В частности с использованием известной программы молекулярного моделирования аминокислотной последовательности, например программы WHATIF (Vriend et al., J. Mol. Graphics 8:52-56, 1990), была предсказана вторичная структура IL-6 и оценены полные эффекты замены отдельных аминокислотных остатков. После того, как был сделан выбор подходящего аминокислотного остатка, для аминокислотной замены с помощью обычно применяемого метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием в качестве матрицы вектора, включающего последовательность оснований, кодирующую человеческий ген IL-6, вводят мутацию, чтобы в результате получить ген, кодирующий измененный IL-6. Этот ген затем, по желанию, вставляют в подходящий экспрессионный вектор, из которого можно получить измененный IL-6 в соответствии со способами экспрессии, продукции и очистки упомянутых выше рекомбинантных антител.

Специальные примеры измененного IL-6 раскрыты в работе Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. 269:86-93, 1994 и Savino et al., EMBO J. 13:1357-1367, 1994, WO 96-18648 и WO 96-17869.

Неполный пептид IL-6 или неполный пептид рецептора IL-6 для применения в настоящем изобретении обладают активностью связывания с рецептором IL-6 или с IL-6, соответственно, но не передают биологически активный сигнал IL-6. В связи с этим неполный пептид IL-6 или неполный пептид рецептора IL-6 специфически ингибируют связывание IL-6 с рецептором IL-6, связываясь с рецептором IL-6 или с IL-6, соответственно, и, таким образом, фиксируя их. В результате они не передают биологически активный сигнал IL-6 и, таким образом, блокируют преобразование сигнала IL-6.

Неполный пептид IL-6 или неполный пептид рецептора IL-6 являются пептидом, включающим некоторую часть или полную аминокислотную последовательность участка, вовлеченного в связывание с IL-6 или рецептором IL-6, в аминокислотной последовательности IL-6 или рецептора IL-6. Такие пептиды обычно включают 10-80, предпочтительно 20-50, еще более предпочтительно 20-40 аминокислотных остатков.

Неполный пептид IL-6 или неполный пептид рецептора IL-6 могут быть сконструированы путем точного определения участка, вовлеченного в связывание с IL-6 или рецептором IL-6 в аминокислотной последовательности IL-6 или рецептора IL-6, и с помощью продукции некоторой части или всей аминокислотной последовательности с помощью общепринятого метода, такого как генная инженерия или метод пептидного синтеза.

Чтобы получить неполный пептид IL-6 или неполный пептид рецептора IL-6 с помощью генной инженерии, последовательность ДНК, кодирующую желаемый пептид, вводят в экспрессионный вектор, из которого можно получить пептид, используя способы экспрессии, продукции и очистки упомянутых выше рекомбинантных антител.

Получение неполного пептида IL-6 или неполного пептида рецептора IL-6 с помощью пептидного синтеза можно осуществить, используя метод, обычно применяемый в пептидном синтезе, например твердофазный синтез или жидкофазный синтез.

В частности, можно использовать метод, описанный в работе Zoku-Iyakuhin no Kaihatsu (Sequel to Development of Pharmaceuticals), Vol.14, Peptido Gousei (Peptide Synthesis), edited by Haruaki Yajima, Hirokawa Shoten, 1991. Применяемый метод твердофазного синтеза включает, например, реакцию, в которой аминокислоту, соответствующую С-концу синтезируемого пептида, присоединяют к носителю, который нерастворим в органических растворителях, и затем конденсируют аминокислоту, у которой α-аминогруппа или функциональная группа боковой цепи защищена с помощью подходящей защищающей группы, с аминокислотой единовременно с С-терминального конца по направлению к N-терминальному концу; и для удлинения пептидной цепи попеременно повторяют реакцию, в которой удаляют указанную защищающую группу α-аминогруппы аминокислоты или пептида, присоединенных к носителю. Метод твердофазного пептидного синтеза делится на Boc-метод и Fmoc-метод, в зависимости от типа применяемой защищающей группы.

После завершения синтеза желаемого пептида проводят реакцию снятия защиты и реакцию отщепления пептидной цепи от носителя. Для отщепления от пептидной цепи обычно используют фтористый водород или трифторметансульфоновую кислоту в Boc-методе и TFA в Fmoc-методе. В Boc-методе, например, упомянутый выше носитель защищенного пептида обрабатывают фтористым водородом в присутствии анизола. Затем убирают защищающую группу и получают пептид, отщепляя его от подложки. С помощью лиофилизации можно получить неочищенный препарат пептида. С другой стороны, в Fmoc-методе реакцию снятия защиты и реакцию отщепления пептида с подложки можно проводить в TFA, например, с помощью процедуры, сходной с описанной выше.

Неочищенный пептид, полученный таким образом, может быть нанесен на колонку HPLC для разделения и очистки. Его элюцию можно проводить в системе растворителей вода-ацетонитрил, которую обычно используют для очистки белков в оптимальных условиях. Фракцию, соответствующую полученному пику хроматографического профиля, собирают и лиофилизируют. Очищенную таким образом пептидную фракцию идентифицируют, анализируя молекулярную массу с помощью масс-спектроскопического анализа, анализа аминокислотного состава или анализа аминокислотной последовательности и т.п.

Специальные примеры неполного пептида IL-6 или неполного пептида рецептора IL-6 раскрыты в Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 2-188600, Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 7-324097, Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 8-311098 и United States Patent Publication US 5210075.

Активность антагониста IL-6 для применения в настоящем изобретении, проявляющаяся в блокировании передачи сигнала IL-6, может быть оценена с использованием общепринятого метода. В частности, IL-6-зависимую линию клеток человеческой миеломы (S6B45, КРММ2), линию клеток человеческой Т-лимфомы Леннерта КТ3 или IL-6-зависимые клетки MH60.BSF2 культивируют в присутствии добавленного IL-6, и активность может быть оценена с помощью измерения включения ³Н-тимидина в IL-6-зависимые клетки, сосуществующую с антагонистом IL-6.

Альтернативно, можно культивировать U266 клетки, экспрессирующие рецептор IL-6, к которым добавляют ¹²⁵I-меченый IL-6 и одновременно добавляют антагонист

IL-6, и затем определяют ¹²⁵I-меченый IL-6, связанный с клеткой, экспрессирующей рецептор IL-6. В описанной выше системе измерения в дополнение к группе, в которой присутствует антагонист рецептора IL-6, набирается отрицательная контрольная группа, не содержащая антагонисты IL-6, и результаты, полученные для этих групп, сравнивают, чтобы оценить IL-6-ингибирующую активность антагониста IL-6.

Как описано в примере, приведенном ниже, антитела к рецептору IL-6 демонстрируют терапевтический эффект у пациентов с повреждениями спинного мозга. Субъект, который проходит лечение, в настоящем изобретении является млекопитающим. Более предпочтительным субъектом, относящимся к млекопитающим, является человек.

Терапевтические средства при повреждении спинного мозга в настоящем изобретении могут быть введены как перорально, так и парентерально, системно или локально. Например, можно выбрать внутривенную инъекцию, такую как капельное вливание, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, суппозитории, промывание кишечника, пероральные кишечные покрытые оболочкой таблетки и т.п., способ введения может быть при необходимости выбран в зависимости от возраста и состояния пациента.

Эффективная дозировка выбирается в диапазоне от 0,01 до 100 мг на кг веса тела на прием. Альтернативно, можно выбрать дозировку в диапазоне от 1 до 1000 мг, предпочтительно от 5 до 50 мг на одного пациента. Предпочтительные дозировки и предпочтительные способы приема таковы, что в случае применения антител к рецептору IL-6 эффективными дозировками являются такие количества, при которых в крови присутствуют свободные антитела. В специальных примерах назначают от 0,5 до 40 мг на кг веса тела, предпочтительно от 1 до 20 мг, в месяц (4 недели) в виде одной или нескольких доз, например, в схеме приема два раза в неделю, один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз каждые четыре недели и т.п. с помощью внутривенной инъекции, такой как капельное вливание, или с помощью подкожной инъекции. Схему приема средства можно регулировать путем наблюдения за состоянием заболевания и с помощью лабораторных тестов на содержание средства в крови, например, увеличивая интервал приема с двух раз в неделю или одного раза в неделю до одного раза в две недели, одного раза в три недели, одного раза в четыре недели и т.п.

Терапевтические средства при повреждении спинного мозга в настоящем изобретении могут включать фармацевтически приемлемые носители или добавки в зависимости от пути приема. Примеры таких носителей или добавок включают воду, фармацевтически приемлемый органический растворитель, коллаген, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, карбоксивиниловый полимер, натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, полиакрилат натрия, альгинат натрия, водорастворимый декстран, натриевую соль карбоксиметилированного крахмала, пектин, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, ксантановую камедь, гуммиарабик, казеин, желатин, агар, диглицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, вазелин, парафин, стеариловый спирт, стеариновую кислоту, человеческий сывороточный альбумин (HSA), маннит, сорбит, лактозу, фармацевтически приемлемые поверхностно-активные вещества и т.п. В зависимости от дозировочной формы применяемые добавки выбирают из перечисленных выше соединений или их комбинаций, которыми указанные добавки не ограничиваются.

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение теперь будет детально описано со ссылками на примеры и с помощью типичных примеров. Следует отметить, однако, что объем настоящего изобретения в любом случае не ограничен этими примерами.

Пример 1

Материалы и Методы

Животные

Во всех экспериментальных группах были использованы взрослые (18-22 г) самки мышей c57BL/6J.

Повреждение спинного мозга

Самок мышей анестезировали с помощью внутрибрюшинной инъекции кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). Спинку мыши брили, делали 20 миллиметровый надрез по средней линии спины и затем открывали позвоночник. После того, как был вскрыт грудной участок позвоночника путем раздвигания в стороны мышц спины открывали шиповидный отросток Т7-Т13 позвонков. Чтобы открыть спинной мозг, на уровне девятого грудного позвонка делали ламинэктомию, соблюдая осторожность, чтобы не повредить твердую мозговую оболочку. Позвоночник закрепляли с помощью щипцов и зажимов на Т7- и Т11-шиповидных отростках и на лигаменте. После того как тело животного было подвешено в воздухе за счет опускания платформы, проводили повреждение спинного мозга (SCI, spinal cord injury) с помощью NYU-импактора. Грузик весом 3 г (диаметром 1,2 мм) кидали с высоты 25 мм на Т9-й уровень спинного мозга. Мышцы и рассеченные части послойно зашивали, и животных помещали в камеру с контролируемой температурой до тех пор, пока температурный контроль вновь не восстанавливался. Дважды в день совершали освобождение мочевого пузыря вручную до тех пор, пока не восстанавливалось спонтанное мочеиспускание.

Протокол и инъекция крысиными моноклональными антителами к мышиному рецептору IL-6 (MR16-1)

Сразу же после повреждения вводили 100 мкг MR16-1 на 1 г веса тела мыши путем однократной внутрибрюшинной инъекции (группа MR16-1, n=15), контрольная группа получала такое же количество крысиных иммуноглобулинов IgG путем внутрибрюшинной инъекции (контрольная группа, n=15). Для гистологического и иммуногистохимического анализов обеих групп проводили внутрибрюшинную инъекцию BrdU (50 мг/кг веса тела) в течение двух недель со дня операции, чтобы пометить делящиеся клетки.

Оценка моторной функции

Используя три различных теста, авторы настоящего изобретения оценили восстановление моторной функции после повреждения. Функциональную оценку продолжали до 6-й недели после повреждения.

Оценка моторной функции нижних конечностей. Чтобы оценить функциональный эффект SCI, авторы настоящего изобретения провели оценку моторной функции с помощью подсчета баллов по шкале Basso-Beattie-Bresnahan (BBB), которая обычно и широко используется. Три независимых испытателя оценивали индивидуальных животных в течение четырех минут дважды слепым способом и подсчитывали баллы (0-21) функции индивидуальных нижних конечностей, как было описано. Все тесты записывали на видеопленку.

SCANET. SCANET представляет собой автоматическую аналитическую систему слежения за движением животных, включающую клетку, оснащенную инфракрасной сенсорной схемой. Эта система следит за небольшими (M1) и значительными (М2) латеральными и вертикальными движениями (RG), т.е. за количеством вставаний, и которая количественно оценивает число движений, спонтанно выполненных животными за данное время. В частности, упоминается, что существует позитивная статистическая связь между счетом RG и счетом BBB.

Вращающаяся планка ротарод. Координированное движение четырех конечностей оценивалось путем помещения мыши на устройство с вращающейся планкой (rotarod), включающее пластиковую планку, для того чтобы вынудить мышь двигаться. Мышь помещали на планку, вращающуюся со скоростью 5, 10 и 15 об/мин, и латентное время, пока не происходило падение, контролировали в течение 120 секунд. Каждый раз функцию координированного движения оценивали из величины среднего значения и максимума.

Иммуногистохимия

Для гистологического исследования мышей анестезировали путем ингаляции диэтилового эфира и транскардиально перфузировали 4% раствором параформальдегида, а затем мышей фиксировали. Спинной мозг извлекался и постфиксировался 4% раствором параформальдегида при комнатной температуре в течение нескольких часов. Образец ткани погружали в 10%-ный раствор сахарозы на 24 часа при температуре 4°С и перед тем, как погрузить образец в соединение ОТС, его помещали в 30%-ный раствор сахарозы на 48 часов. Пропитанную таким образом ткань замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80°С. С помощью сагиттальных и аксиальных рассечений изготавливали криосрезы толщиной 20 микрометров и окрашивали их краской НЕ или двойной иммунофлюоресцентной краской.

Для двойного иммунофлюоресцентного окрашивания срезы спинного мозга размораживали в 0,03%-ном растворе Тритона Х-100 и 10%-ном растворе нормальной сыворотки козы в 0,01 М PBS (рН 7,4) в течение 30 минут. В качестве первичных антител использовали кроличьи антитела к GFAP, крысиные антитела к Brd-U и человеческие антитела к Hu (как нейронному маркеру), инкубацию с ними проводили в течение ночи при температуре 4°С. В качестве вторичных антител использовали кроличьи IgG антитела, конъюгированные с FITC, и крысиные антитела, конъюгированные с Texas Red, с помощью которых проводили двойное окрашивание. Срезы промывали, фиксировали во влажной среде и анализировали с помощью флюоресцентного микроскопа.

Вестерн-блот анализ

Спустя 12 часов после повреждения (n=4 для каждой группы) вырезали 8-миллиметровый сегмент спинного мозга (из центра повреждения, 4 мм стволовой части и 4 мм каудальной части), который затем гомогенизировали в бактериолитическом МАРК буфере, включающем ингибитор протеаз, и озвучивали ультразвуком, после чего центрифугировали при 15000 об/мин. Белок отделяли от супернатанта каждого образца с помощью ПААГ-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) и с помощью электрофореза переносили на поли(дифтор)этиленовую мембрану. После переносили мембрану в TBST-буфер, содержащий 5%-ное обезжиренное молоко, 150 мМ NaCl и 0,05%-ный Tween 20 (рН 7,5) и инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа, используя в качестве первичных антител поликлональное кроличье антитело к STAT3, или кроличье антитело к фосфорилированному STAT3, или кроличье антитело к IL-6Rα, а затем инкубировали вместе со вторичным антителом к кроличьим иммуноглобулинам IgG, конъюгированным с HRP. После проявления пленки с помощью автоматического устройства для проявления результат оценивают количественно с помощью прибора α-imager.

Результаты

1) Оценка моторной функции нижних конечностей

Определяли средние значения баллов ВВВ для 15 мышей с повреждением спинного мозга, получавших антитела к рецептору IL-6 (MR16-1), и для 15 мышей с повреждением спинного мозга (контроль), которые не получали указанных антител, средние значения баллов ВВВ показаны графически на фиг.1. После повреждения спинного мозга, на седьмой день и после, восстановление движения было лучше в группе мышей, получавших антитела MR16-1, а на 5- и 6-й неделе уже была замечена значительная разница.

2) SCANET

Сравнивали латеральную подвижность и количество вставаний для 15 мышей с повреждением спинного мозга, получавших антитела к рецептору IL-6 (MR16-1), и для 15 мышей с повреждением спинного мозга (контроль), которые не получали указанных антител. В результате не было замечено существенной разницы в латеральных движениях, но движение в виде вставания наблюдалось у 12 из 15 мышей с повреждением спинного мозга, получавших антитела к рецептору IL-6 (MR16-1), тогда как оно наблюдалось только у 3 из 15 мышей с повреждением спинного мозга (контроль), которые не получали указанные антитела. Эта разница была значительной в тесте Фишера оценки точности вероятности, при р<0,05.

3) Вращающаяся планка ротарод

Указанный выше эксперимент проводили для 15 мышей с поврежденным спинным мозгом, получавших антитела к рецептору IL-6 (MR16-1), и для 15 мышей с повреждением спинного мозга (контроль), которые не получали указанных антител, в результате не было замечено существенной разницы, когда скорость вращения планки была 10 об/мин (10 оборотов в минуту) и 15 об/мин, тогда как при скорости в 5 об/мин, как показано на фиг.2, на 358-й день после повреждения спинного мозга или позже восстановление у мышей с повреждением спинного мозга, получавших антитела к рецептору IL-6 (MR16-1), было значительно (р<0,05) выше, чем у мышей с повреждением спинного мозга (контроль), которые не получали указанных антител.

4) Иммуногистохимическое исследование

Несмотря на присутствие собственных нервных стволовых клеток в спинном мозге взрослого организма, восстановления спинного мозга благодаря дифференцировке клеток не происходит. Возможно, это происходит из-за того, что собственные нервные стволовые клетки в поврежденной части спинного мозга дифференцируются в предшественники глиальных клеток и затем в астроциты, и, таким образом, не дифференцируются в нейрональные клетки. Подсчет реактивных астроцитов с помощью иммунофлюоресцентного метода с использованием антител к GFAP и антител к BrDU в спинном мозге у группы, состоявшей из четырех мышей с повреждением спинного мозга, получавших антитела к рецептору IL-6 (MR16-1), и у группы, состоявшей из четырех мышей с повреждением спинного мозга (контроль), которые не получали указанных антител, показал, как видно на фиг.3, что введение указанных выше антител значительно уменьшает образование реактивных астроцитов (р<0,05).

5) Вестерн-блот анализ

Методом вестерн-блот анализа изучали экспрессию рецептора IL-6 через 12 часов после повреждения спинного мозга в группе из четырех мышей с повреждением спинного мозга и в контрольной группе из четырех мышей. Полученные результаты показаны на фиг.4. Экспрессию рецептора IL-6 наблюдали только у мышей с повреждением спинного мозга. Также, как показано на фиг.5, введение MR16-1 уменьшило количество фосфорилированного STAT3, что служит указанием на то, что введенный внутрибрюшинно MR16-1 действует в спинном мозге.

Последующие исследования подтвердили, что антагонисты IL-6 активируют восстановление поврежденного спинного мозга.

Типичный пример 1. Получение растворимого человеческого рецептора IL-6

Растворимый рецептор IL-6 получали с помощью метода ПЦР с использованием плазмиды pBSF2R.236, содержащей кДНК, которая кодирует рецептор IL-6, полученной согласно методу Yamasaki et al. (Yamasaki K. et al., Science 241:825-828, 1988). Плазмиду pBSF2R.236 расщепляли с помощью рестриктазы Sph I, чтобы получить кДНК рецептора IL-6, которую затем вставили в вектор mp18 (производство фирмы Amersham). Используя синтетический олигопраймер, сконструированный для ввода стоп-кодона в кДНК рецептора IL-6, с помощью метода ПЦР с использованием «in vitro Mutagenesis System» (производство фирмы Amersham), вводили мутацию в кДНК рецептора IL-6. В результате этой процедуры произошел ввод стоп-кодона в 345-е положение аминокислотной цепи, что привело к получению кДНК, кодирующей растворимый рецептор IL-6.

Для того чтобы экспрессировать кДНК растворимого рецептора IL-6 в клетках СНО, ее лигировали в плазмиду pSV (производство фирмы Pharmacia), чтобы получить плазмиду pSVL344. кДНК растворимого рецептора IL-6, которую расщепляли с помощью Hind III-Sall, вставляли в плазмиду pECEdhfr, содержащую кДНК dhfr, чтобы получить плазмиду pECEdhfr-344, которую можно ввести в клетки СНО.

Десятью мкг плазмиды pECEdhfr344 трансфицировали dhfr(-) СНО-линию клеток DXB-11 (Urlaub G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980) методом соосаждения с фосфатом кальция (Chen С.et al., Mol. Cell. Biol. 7:2745-2751, 1987). Трансфицированные СНО-клетки выращивали в течение 3 недель в селекционной среде α-МЕМ, не содержавшей нуклеозиды и содержавшей 1 мМ глутамина, 10%-ную диализованную FCS, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.

Отбор СНО-клеток проводили с помощью метода предельного разведения, чтобы получить клон из отдельной СНО-клетки. Клон клетки СНО был размножен в присутствии 20-200 нМ метотрексата (МТХ) для получения линии СНО-клеток 5Е27, которая продуцирует человеческий растворимый рецептор IL-6. Линию СНО-клеток 5Е27 культивировали в среде Дульбекко в модификации Iscow (IMDM, произведено фирмой Gibco), содержащей 5%-ную FBS. Супернатант культуры клеток собирали и с помощью метода ELISA определяли концентрацию растворимого рецептора IL-6 в супернатанте клеточной культуры. Результаты подтвердили, что растворимый рецептор IL-6 присутствует в супернатанте клеточной культуры.

Типичный пример 2. Получение антитела к человеческому IL-6

Для иммунизации мышей BALB/c использовали 10 мкг рекомбинантного IL-6 (Hirano et al., Immunol. Lett., 17:41, 1988) вместе с полным адъювантом Фрейнда, и эту процедуру повторяли каждую неделю до тех пор, пока в сыворотке не были обнаружены антитела к IL-6. Иммунные клетки извлекали из локальных лимфатических узлов и затем их сливали с линией клеток миеломы P3U1, используя при этом полиэтиленгликоль 1500. Клетки гибридомы отбирали согласно методу Oi et al. (Selective Methods in Cellular Immunology, W.H.Freeman and Co., San Francisco, 351, 1980), в котором используют среду HAT, и убеждались в получении гибридомы, которая продуцирует антитела к человеческому IL-6.

Гибридому, которая продуцирует антитела к человеческому IL-6, использовали в измерении связывания IL-6, которое проводили следующим образом.

Итак, 96-луночный микротитровальный планшет, сделанный из гибкого поливинила (производство фирмы Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA), покрывали 100 мкл козьих антител к мышиным иммуноглобулинам IgG (10 мкл/мл, производство фирмы Cooper Biomedical, Inc., Malvern, PA) в течение ночи при 4°С в 0,1 М карбонатгидрокарбонатном буфере, рН 9,6. Затем планшет обрабатывали 100 мкл PBS, содержащим 1%-ный бычий сывороточный альбумин (BSA) при комнатной температуре в течение 2 часов.

После промывания планшета в PBS в каждую лунку вносили по 100 мкл супернатанта гибридомной культуры и затем планшет инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшет промывали, в каждую лунку вносили ¹²⁵I-меченый рекомбинантный IL-6 до концентрации 2000 cpm/0,5 нг/лунка, затем после промывания в каждой лунке измеряли радиоактивность с помощью гамма-счетчика (Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA). Из 216 клонов гибридомы 32 клона были позитивными при измерении связывания IL-6. Из этих клонов в конечном итоге был получен стабильный клон MH166.BSF2. Антитела к IL-6 МН166, продуцируемые указанной гибридомой, относились к субтипу IgG1κ.

Затем клон MH166.BSF2 IL-6-зависимой мышиной гибридомы использовали для изучения нейтрализирующей активности антител МН166 по отношению к росту гибридомы. Клетки MH166.BSF2 вносили в количестве 1×10⁴/200 мкл/лунка и туда же вносили образцы, содержавшие антитело МН166, инкубировали их в течение 48 часов, добавляли 0,5 мкКи/лунку ³H-тимидина (New England Nuclear, Boston, MA) и инкубацию продолжали следующие 6 часов. Клетки помещали на стекловолоконный фильтр и обрабатывали с помощью автоматического устройства «Харвестер» (Labo Mash Science Co., Tokyo, Japan). В качестве контроля использовали кроличьи антитела к IL-6.

В результате антитела МН166 ингибировали дозозависимым способом включение ³H-тимидина в клетки MH60.BSF2, индуцированные IL-6. Это показало, что антитела МН166 нейтрализует активность IL-6

Типичный пример 3. Получение антитела к человеческому рецептору IL-6

Антитело МТ18 к рецептору IL-6, полученное по методу Hirata et al. (Hirata Y. et al., J. Immunol. 143:2900-2906, 1989) было присоединено к CNBr-активированной Сефарозе 4В (производство фирмы Pharmacia Fine Chemicals, Piskataway, NJ) в соответствии с прилагаемым протоколом, и рецептор IL-6 был очищен (Yamasaki К. et al., Science 241:825-828, 1988). Линия клеток человеческой миеломы U266 была солюбилизирована с помощью 1 мМ пара-аминофенилметансульфонилфторидгидрохлорида (производство фирмы Wako Chemicals) (дигитониновый буфер), содержащего 1%-ный дигитонин, 10 мМ триэтаноламина (рН 7,8) и 0,15М NaCl, и смешана с антителами МТ18, присоединенными к шарикам Сефарозы 4В. Затем шарики промывали шесть раз дигитониновым буфером, чтобы получить частично очищенный препарат рецептора IL-6 для использования в иммунизации.

Мыши BALB/c были иммунизированы четыре раза каждые десять дней указанным выше частично очищенным рецептором IL-6, полученным из 3×10⁹ клеток U266, и затем с помощью стандартного метода получали гибридому. Супернатант гибридомной культуры из рост-позитивных лунок анализировали на активность его связывания с рецептором IL-6 в соответствии со способом, описанным ниже. 5×10⁷ клеток U266 были помечены ³⁵S-метионином (2,5 мКи) и были солюбилизированы указанным выше дигитониновым буфером. Солюбилизированные клетки U266 были смешаны с 0,04 мл объема антител МТ18, присоединенным к шарикам сефарозы 4В, и затем были промыты шесть раз дигитониновым буфером. ³⁵S-метионин-меченый рецептор IL-6 элюировали 0,25 мл дигитонинового буфера (рН 3,4) и нейтрализовали в 0,025 мл 1М триса (рН 7,4).

0,05 мл супернатанта культуры клеток гибридомы смешивали с 0,01 мл Protein G-Сефарозы (производство фирмы Phamarcia). После промывания Сефарозу инкубировали с 0,005 мл раствора ³⁵S-меченого рецептора IL-6, полученного, как было описано выше. Иммунопреципитат анализировали с помощью ПААГ-электрофореза в присутствии SDS, чтобы выяснить, какие супернатанты культуры клеток гибридомы реагируют с рецептором IL-6. В результате были выявлен реакционно-позитивный клон гибридомы РМ-1 (FERM ВР-2998). Антитела, продуцируемые клетками гибридомы РМ-1, относится к подтипу IgG1κ.

С помощью линии клеток человеческой миеломы U266 изучали ингибирующую активность антител, продуцируемых клетками гибридомы РМ-1, направленную на связывание IL-6 с человеческим рецептором IL-6. Человеческий рекомбинантный IL-6 был получен из Е. coli (Hirano et al., Immunol. Lett. 17:41-45, 1988) и помечен ¹²⁵I с использованием реагента Болтон-Хантера (New England Nuclear, Boston, MA) (Taga, T. et al., J. Exp. Med. 166:967-981, 1987).

4×10⁵ клеток U266 выращивали в 70%-ном (v/v) супернатанте культуры клеток гибридомы РМ-1 вместе с IL-6, меченым ¹²⁵I (14000 cpm), в течение одного часа. Семьдесят мкл образца наслаивали на 300 мл FCS в микроцентрифужной полиэтиленовой пробирке на 400 мкл. После центрифугирования определяли радиоактивность клетки.

Полученные результаты показали, что антитела, продуцируемые гибридомой РМ-1, ингибируют связывание IL-6 с рецептором IL-6.

Типичный пример 4. Получение мышиного антитела к рецептору IL-6

Моноклональное антитело, направленное против мышиного рецептора IL-6, было получено по методу, описанному Saito et al., J. Immunol. 147:168-173, 1991.

Клетки СНО, которые продуцируют растворимый мышиный рецептор IL-6, выращивали в культуральной жидкости IMDM, содержащей 10%-ную FCS. Растворимый мышиный рецептор IL-6 очищали из супернатанта культуры клеток с помощью аффинной колонки, в которой антитела RS12 (см. выше Saito et al.) к мышиному рецептору IL-6 были пришиты к гелю Affigel 10 (производство фирмы Biorad).

Полученный таким образом растворимый мышиный рецептор IL-6 смешивали с полным адъювантом Фрейнда и вводили его с помощью инъекции в брюшную полость крыс Wistar. Спустя две недели после введения животным вводили поддерживающую дозу неполного адъюванта Фрейнда. На 45-й день отбирали клетки селезенки крыс и около 2×10⁸ этих клеток сливали с 1х10⁷ клеток мышиной миеломы P3U1, используя 50%-ный PEG 1500 (производство фирмы Boehringer Mannheim), в соответствии с традиционным методом, а затем отбирали клетки с помощью культуральной среды HAT.

После добавления супернатанта культуры клеток гибридомы в планшет, покрытый кроличьими антителами к крысиным иммуноглобулинам IgG (производство фирмы Cappel), мышиный растворимый рецептор IL-6 демонстрировал реактивность. Затем, используя кроличьи антитела к мышиному рецептору IL-6 и бараньи антитела к кроличьим иммуноглобулинам IgG, меченные щелочной фосфатазой, с помощью метода ELISA отбирали гибридомы, продуцирующие антитела к растворимому мышиному рецептору IL-6. Клоны гибридом, для которых было показано продуцирование антител, дважды подвергали скринингу для того, чтобы получить единственный клон гибридомы. Клон был обозначен как MR16-1.

Нейтрализующую активность антител, продуцированных гибридомой, на передачу сигнала мышиного IL-6 изучали с помощью включения ³H-тимидина с использованием клеток MH60.BSF2 (Matsuda Т. et al., J. Immunol. 18:951-956, 1988). Клетки MH60.BSF2 помещали в 96-луночный планшет из расчета 1×10⁴ клеток/200 мкл/лунка. В планшет вносили 10 пг/мл мышиного IL-6 и антитела MR16-1 или антитела RS12 в количестве 12,3-1000 нг/мл, затем клетки выращивали при температуре 37°С при 5%-ном содержании CO₂ в течение 44 часов, после чего вносили 1 мкКи/лунку ³H-тимидина. Спустя 4 часа измеряли включение ³H-тимидина. В результате было обнаружено, что антитела MR16-1 подавляли включение Н-тимидина в клетки MH60.BSF2.

Таким образом, было показано, что антитела, продуцируемые гибридомой MR16-1 (TERM BP-5875), ингибируют связывание IL-6 с рецептором IL-6.

Claims (27)

1. Терапевтическое средство при повреждении спинного мозга, включающее в качестве активного ингредиента антитело к рецептору IL-6, которое блокирует трансдукцию сигнала IL-6 и ингибирует биологическую активность IL-6.

2. Терапевтическое средство при повреждении спинного мозга по п.1, в котором антитело является моноклональным антителом.

3. Терапевтическое средство при повреждении спинного мозга по п.2, в котором антитело является моноклональным антителом к человеческому рецептору IL-6.

4. Терапевтическое средство при повреждении спинного мозга по п.2, в котором антитело является моноклональным антителом к мышиному рецептору IL-6.

5. Терапевтическое средство при повреждении спинного мозга по п.1, в котором антитело является рекомбинантным антителом.

6. Терапевтическое средство при повреждении спинного мозга по п.3, в котором моноклональное антитело к человеческому рецептору IL-6 является антителом РМ-1.

7. Терапевтическое средство при повреждении спинного мозга по п.4, в котором моноклональное антитело к мышиному рецептору IL-6 является антителом MR16-1.

8. Терапевтическое средство при повреждении спинного мозга по п.1, в котором антитело является химерным антителом, гуманизированным антителом или человеческим антителом к рецептору IL-6.

9. Терапевтическое средство при повреждении спинного мозга по п.8, в котором гуманизированное антитело является гуманизированным антителом РМ-1.

10. Применение антитела к рецептору IL-6, которое блокирует трансдукцию сигнала IL-6 и ингибирует биологическую активность IL-6, для приготовления терапевтического средства при повреждении спинного мозга.

11. Применение по п.10, при котором антитело является моноклональным антителом.

12. Применение по п.11, при котором антитело является моноклональным антителом к человеческому рецептору IL-6.

13. Применение по п.11, при котором антитело является моноклональным антителом к мышиному рецептору IL-6.

14. Применение по п.10, при котором антитело является рекомбинантным антителом.

15. Применение по п.12, при котором моноклональное антитело к человеческому рецептору IL-6 является антителом РМ-1.

16. Применение по п.13, при котором моноклональное антитело к мышиному рецептору IL-6 является антителом MR16-1.

17. Применение по п.10, при котором антитело является химерным антителом, гуманизированным антителом или человеческим антителом к IL-6 рецептору.

18. Применение по п.17, при котором гуманизированное антитело является гуманизированным антителом РМ-1.

19. Способ лечения при повреждении спинного мозга у субъекта, который включает введение антитела к рецептору IL-6, которое блокирует трансдукцию сигнала IL-6 и ингибирует биологическую активность IL-6, субъекту.

20. Способ по п.19, в котором антитело является моноклональным антителом.

21. Способ по п.20, в котором антитело является моноклональным антителом к человеческому рецептору IL-6.

22. Способ по п.20, в котором антитело является моноклональным антителом к мышиному рецептору IL-6.

23. Способ по п.19, в котором антитело является рекомбинантным антителом.

24. Способ по п.21, в котором моноклональное антитело к человеческому рецептору IL-6 является антителом РМ-1.

25. Способ по п.22, в котором моноклональное антитело к мышиному рецептору IL-6 является антителом MR16-1.

26. Способ по п.19, в котором антитело является химерным антителом, гуманизированным антителом или человеческим антителом к человеческому IL-6 рецептору.

27. Способ по п.26, в котором гуманизированное антитело является гуманизированным антителом РМ-1.

Images