KR20060006004A

KR20060006004A - 인터루킨-6 길항제를 함유하는 척수손상 치료제

Info

Publication number: KR20060006004A
Application number: KR1020057015579A
Authority: KR
Inventors: 히데유키 오카노; 세이지 오카다; 마사야 나카무라; 카즈유키 요시자키
Original assignee: 각고호우징 게이오기주크; 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2003-02-24
Filing date: 2004-02-24
Publication date: 2006-01-18
Also published as: EP1607100A1; RU2009102845A; NZ541928A; EP1607100A4; NO20054072L; JP4555924B2; MXPA05008713A; BRPI0407747A; CN1753694A; PL378199A1; RU2358761C2; NO20054072D0; AU2004212843B2; KR101142624B1; US20060165696A1; CN100340294C; WO2004073741A8; CA2516945A1; IL170399A; IL205618A

Abstract

본 발명은 인터루킨-6 길항제를 유효성분로 하는 척수손상 치료제, 신경간세포의 분화조절제, 및 신경교세포로의 분화 억제제를 제공한다.

인터루킨-6 길항제, 척수손상 치료제, 신경간세포, 신경교세포

Description

인터루킨-6 길항제를 함유하는 척수손상 치료제{Remedy for Spinal Injury Containing Interleukin-6 Antagonist}

본 발명은 인터루킨-6(IL-6) 길항제를 유효성분으로 함유하는 척수손상 치료제에 관한 것이다.

현대사회에서 교통사고, 넘어짐, 굴러떨어짐, 스포츠 중의 사고 등으로 척수손상을 받을 기회가 많아, 예를 들어 일본에서의 연간 척수손상자는 5000명에 이르고, 누적 환자 수는 10만명 달한다고 알려져 있다. 척수손상의 증상으로는 영구적인 사지운동 지각마비, 방광·직장 장애, 호흡 장애 등 매우 심각하여, 일상적 관리로서 재활(rehabilitation), 호흡관리, 욕창예방, 배변·배뇨관리 등이 행해지게 된다.

척수손상의 치료방법이 근본적으로 존재하지 않고, 수술을 포함한 국소 안정 등의 대체요법만이 있다. 증상의 악화를 예방할 목적으로 스테로이드의 대량투여가 이루어지고 있으나, 마비의 회복에 유효한 효과는 얻어지지 않고 있다. 척수손상의 상당수는 외부로부터의 기계적인 작용에 의한 손상(1차 손상)으로 시작하여, 체내의 반응경로를 거쳐 조직파괴(2차 손상)로 더 진행한다. 이와 같은 2차적인 손상의 진행을 억제하기 위해 사용되는 유일한 의약은 메틸프레드니소론으로서, 10000mg에 가까운 대량투여가 이루어지고 있다. 그러나, 이 방법에서는 당뇨병의 급성악화나 폐렴 등의 부작용이 보고되고 있다.

19세기 초 신경해부학의 거장 Ramony Cajal이 그의 저서에서,「성체 포유류의 중추신경계(뇌와 척수)는 한번 손상되면 재생되지 않는다」고 말한 이래, 이 통설이 오랫동안 믿어져 오고 있다. 그러나, 1980년대에 들어와 척수손상에 대한 말초신경(A. Aguayo et a1., J. Exp. Bilo. 95:231-240, 1981), 태아 척수이식(Bregman B. S., Dev. Brain Res., 34:265-279, 1987)이 보고되어, 척수손상 후라 하더라도 손상부에 적절한 환경이 도입되면 손상된 축색(axon)이 재생되는 것을 볼 수가 있었다. 또, 신경영양인자가 손상된 축색의 재생을 촉진하는 것(Cai, D. et a1. Neuron, 22:89-101, 1999)이나 축색성장 저해인자의 동정(Chen, D. et al. Nature, 403:434-439, 2000) 등 척수재생에 관한 다수의 보고가 이루어져, 손상 척수의 재생이 현실로 되었다. 그러나, 태아척수의 이식은 기증자의 부족과 윤리적인 문제 때문에 임상적인 응용이 극히 곤란하다.

그리고, 신경간세포(Neural stem cell)는 증식과 계대(繼代)를 반복할 수 있음(자기복제능)과 동시에, 뉴런, 성상세포(astrocyte), 및 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)라고 하는 중추신경계를 구성하는 3가지 종류의 세포를 만들어 낼 수 있는(다분화능) 미분화한 신경계 세포로서, 성체 척수에도 존재하기 때문에 손상 후의 조직을 회복할 수 있는 것으로 가정된다. 그러나, 실제로 그들은 손상 후에는 뉴런으로 분화되지 않고, 모두 신경교세포(glia cell)로 분화되어 반흔을 만들게 된다.

신경간세포의 분화유도와 관계되는 사이토카인의 보고가 다수 발견되었다. Weiss 등은 태아 마우스의 선조체(線條體)에서 유래한 신경간세포가 뉴런으로 분화되는 것이 BDNF(brain-derived neurotrophic factor)에 의해 촉진된다고 보고하였다(Ahmed, S., et a1., J. Neurosci., 150:5765-5 778 1995). 또한, Ghosh 등은 태아 래트(rat)의 대뇌피부 유래의 신경간세포의 뉴런으로의 분화가 NT-3(Neurotrophin-3)에 의해 촉진된다는 것을 보고하였다(Ghosh, A., et al. Neuron 15:89-103 1995). McKay 등은 태아 래트 유래 신경간세포의 분화가 PDNF(Platelet-derived neurotrophic factor)에서 뉴런으로, CNTF(Ciliary neurotrophic factor)에서 성상세포로, 갑상선 호르몬(T3)에서 희소돌기아교세포와 instructive로 유도된다고 보고하였다(Jone, K., et al., Gene & Dev. 10: 3129-3140 1996).

그리고, 최근 타카(多賀) 등은, 태아마우스 신경상피세포 유래의 신경간세포의 성상세포로의 분화가 LIF(Leukemia inhibitory factor)와 BMP-2(Bone morphogenic protein-2)에 의해 촉진된다고 보고하였다(Nakashima, K., et al., Science, 284:479-482, 1999). 이들 보고의 공통점은 CNTF, LIF 등의 이른바 IL-6 슈퍼패밀리이다. 즉, 사이토카인 수용체의 서브유니트인 gp130을 개입시키는 시그널이 신경간세포를 성상세포로 분화유도한다고 판단된다.

그러나, 사이토카인에 의한 신경간세포의 분화유도에 의해 척수손상이 회복될 수 있음을 증명하는 문헌은 존재하지 않는다.

IL-6은 B 세포자극인자 2(BSF2) 또는 인터페론 β2로도 호칭되는 사이토카인이다. IL-6은 B 임파구계 세포의 활성화에 관여하는 분화인자로 발견되고(Hirano, T. et al., Nature(1986) 324, 73-76), 그 후 여러 가지 세포의 기능에 영향을 미치는 다기능 사이토카인임이 밝혀졌다(Akira, S. et al., Adv. in Immunology(1993) 54, 1-78). IL-6은 T 임파구계 세포의 성숙화를 유도한다고 보고되었다(Lotz, M. et al., J. Exp. Med.(1988) 167, 1253-1258).

IL-6은 세포 상에서 2가지 종류의 단백질을 매개로 그 생물학적 활성을 전달한다. 그 하나는, IL-6이 결합하는 분자량 약 80 kD의 리간드 결합성 단백질의 IL-6 수용체이다(Taga, T. et al., J. Exp. Med.(1987) 166, 967-981, Yamasaki, K. et al., Science(1987) 241, 825-828). IL-6 수용체는 세포막을 관통해서 세포막 상에 발현하는 막결합형 외에, 주로 그 세포 외 영역으로 이루어지는 가용성 IL-6 수용체로도 존재한다.

또 하나는, 비(非)리간드 결합성의 시그널 전달과 관계되는 분자량 약 130 kD의 막단백질 gp130이다. IL-6와 IL-6 수용체는 IL-6/IL-6 수용체 복합체를 형성하고, 그 다음 gp130과 결합함으로써 IL-6의 생물학적 활성이 세포 내로 전달된다(Taga, T. et a1., Cell(1989) 58, 573-581).

IL-6 길항제는 IL-6의 생물학적 활성의 전달을 저해하는 물질이다. 지금까지 IL-6에 대한 항체(항IL-6 항체), IL-6 수용체에 대한 항체(항IL-6 수용체 항체), gp130에 대한 항체(항 gp130 항체), IL-6 개변체, IL-6 또는 IL-6 수용체 부분펩티드 등이 알려져 있다.

항IL-6 수용체 항체에 관해서는 몇 가지 보고가 있다(Novick, D. et a1., Hybridoma(1991) 10, 137-146, Huang, Y. W. et a1., Hybridoma(1993) 12, 621- 630, 국제특허 출원공개 WO 95-09873호, 프랑스 특허출원공개 FR 2694767호, 미국특허 US 521628호). 그 중 하나인 마우스 항체 PM-1(Hirata, Y. et a1., J. Immunol.(1989) 143, 2900-2906)의 상보성 결정영역(CDR; complementarity determining region)을 인간항체에 이식함으로써 얻어진 인간화 PM-1 항체가 알려져 있다(국제특허 출원공개 \O 92-19759).

특허문헌 1 : WO 95-09873호

특허문헌 2 : FR 2694767호

특허문헌 3 : USP 0521628호

비특허문헌 1 : A. Aguayo et a1., J. Exp. Bilo.95:231-240, 1981

비특허문헌 2 : Bregman B. S., Dev. Brain Res., 34:265-279, 1987

비특허문헌 3 : Cai, D. et al. Neuron, 22:89-101, 1999

비특허문헌 4 : Chen, D. et al. Nature, 403:434-439, 2000

비특허문헌 5 : Ahmed, S., et al., J. Neurosci., 150:5765-5778, 1995

비특허문헌 6 : Ghosh, A., et al. Neuron 15:89-103, 1995

비특허문헌 7 : Jone, K., et al., Gene & Dev. 10: 3129-3140, 1996

비특허문헌 8 : Nakashima, K., et al., Science, 284:479-482, 1999

비특허문헌 9 : Hirano, T. et al., Nature(1986) 324, 73-76

비특허문헌 10 : Akira, S. et al., Adv. in Immunology(1993) 54, 1-78

비특허문헌 11 : Lotz, M. et al., J. Exp. Med.(1988) 167, 1253-1258

비특허문헌 12 : Taga, T. et al., Cell(1989) 58, 573-581

비특허문헌 13 : Yamasaki, K. et al., Science(1987) 241, 825-828

비특허문헌 14 : Novick, D. et al., Hybridoma(1991) 10, 137-146

비특허문헌 15 : Huang, Y. W. et al., Hybridoma(1993) 12, 621-630

비특허문헌 16 : Hirata, Y. et al., J. Immunol.(1989) 143, 2900-2906

따라서, 본 발명은 척수손상에 대한, 증상악화의 예방뿐만 아니라 회복을 가져오는 치료수단이 요구되고 있어, 그 예방 및 치료수단으로서 유용한 의약조성물을 제공한다.

또한, 본 발명자들은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 다양하게 검토한 결과, IL-6에 대한 길항제(antagonist), 예컨대 IL-6 수용체에 대한 항체가 척수손상을 회복시키는 작용을 갖는다는 것을 알아내었다. 따라서, 본 발명은 인터루킨-6(IL-6) 길항제를 유효성분으로 함유하여 이루어진 척수손상 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한 인터루킨-6(IL-6) 길항제를 유효성분으로 함유하여 이루어지는 신경간세포의 분화조절제를 제공한다.

그리고 본 발명은 인터루킨-6(IL-6) 길항제를 유효성분으로 함유하여 이루어지는 신경교세포로의 분화억제제를 제공한다.

상기 IL-6 길항제로는 IL-6 수용체에 대한 항체가 바람직하고, 모노크로날 항체가 특히 바람직하다. 모노크로날 항체로는 인간 IL-6 수용체에 대한 모노크로날 항체 및 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로날 항체를 예로 들 수 있다. 상기 인간 IL-6 수용체에 대한 모노크로날 항체의 구체적인 예로는 예컨대 PM-l 항체를 들 수 있고, 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로날 항체로는 예컨대 MR16-1 항체를 들 수 있다. 그리고, IL-6 수용체에 대한 항체로는 모노크로날 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 클로닝(cloning)한 유전자를 인위적으로 조작해서 얻어지는 조환형 항체, 예를 들면 키메라 항체, 인간화 항체 등을 들 수 있다.

도 1은 하지 운동기능평가에서 항 IL-6 수용체 항체(MR16)를 투여하지 않은 척수손상 마우스(대조)에 비해, 상기 항체를 투여한 척수손상 마우스에서 척수손상 후의 운동의 회복이 크다는 것을 나타낸 그래프이다.

도 2는 로타로드 트레드밀 시험에서 항IL-6 수용체 항체(MR16)를 투여하지 않은 척수손상 마우스(대조)에 비해, 상기 항체를 투여한 척수손상 마우스에서 척수손상 후의 운동강조(運動强調)의 회복이 크다는 것을 나타낸 그래프이다.

도 3은 항IL-6 수용체 항체(MR16)를 투여하지 않은 척수손상 마우스(대조)에 비해, 상기 항체를 투여한 척수손상 마우스에 대해, 척수손상부에서의 신경교세포의 형성이 억제되는 것을 나타낸 그래프이다.

도 4는 척수손상이 없는 (샴)마우스에 비해, 척수손상을 받은 마우스의 척수손상부에서 IL-6 수용체의 발현이 이루어짐을 나타낸 그래프이다.

도 5는 항IL-6 수용체 항체(MRA) 투여에 의해 실제로 척수손상부에서 IL-6 시그널 캐스케이드가 억제되어 있음을 나타낸 인산화 STAT3 웨스턴 블롯 도면이다.

발명의 실시 형태

본 발명에서 사용되는 IL-6 길항제는 척수손상의 치료효과를 나타내는 것이 기만 하면 그 유래, 종류, 및 형상을 불문한다.

IL-6 길항제는 IL-6에 의한 시그널 전달을 차단하여, IL-6의 생물학적 활성을 저해하는 물질이다. IL-6 길항제는 바람직하기는 IL-6, IL-6 수용체 및 gp130 중 어떤 것과 결합하는 것을 저해하는 작용을 가진 물질이다. IL-6 길항제로는 예를 들면 항 IL-6 항체, 항 IL-6 수용체 항체, 항 gp130 항체, IL-6 개변체, 가용성 IL-6 수용체 개변체 또는 IL-6 또는 IL-6 수용체의 부분 펩티드 및, 이들과 같은 활성을 나타내는 저분자 물질을 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항 IL-6 항체는 공지의 수단을 이용하여 폴리크로날 항체 또는 모노크로날 항체로서 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항 IL-6 항체로는 특히 포유동물 유래의 모노크로날 항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 모노크로날 항체로는 하이브리도마에서 생산되는 것 및 유전공학적 방법에 의해 항체유전자를 포함한 발현벡터에서 형질전환된 숙주(宿主)로부터 생산되는 것이 있다. 이러한 항체는 IL-6와 결합함으로써, IL-6의 IL-6 수용체로의 결합을 저해하여 IL-6의 생물학적 활성이 세포 내로 전달되는 것을 차단한다.

이와 같은 항체로는 MH166(Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol.(1988) 18, 951-956)이나 SK2 항체(Sato, K. et al., 제21회 일본면역학회총회, 학술기록(1991) 21, 166) 등을 들 수 있다.

항 IL-6 항체 생산 하이브리도마는 기본적으로는 공지의 기술을 사용하여 이하와 같이 제작될 수 있다. 즉, IL-6을 감작항원으로 사용하여, 이를 통상의 면역방법에 따라 면역시키고, 얻어지는 면역세포를 통상의 세포융합법으로 공지의 모세 포와 융합시켜, 통상의 스크리닝법으로 모노크로날인 항체생산세포를 스크리닝함으로써 제작될 수 있다.

구체적으로 항 IL-6 항체를 제작하기 위하여 다음과 같이 할 수 있다. 예를 들어, 항체취득의 감작항원으로 사용되는 인간 IL-6는 Eur. J. Biochem (1987) 168, 543-550, J. Immunol.(1988) 140, 1534-1541, 또는 Agr. Biol. Chem.(1990) 54, 2685-2688에 개시된 IL-6 유전자/아미노산 배열을 이용함으로써 얻어지게 된다.

IL-6의 유전자 배열을 공지의 발현벡터계에 삽입해서 적당한 숙주세포를 형질전환한 후, 그 숙주세포 중 또는 배양상청(上淸) 중에서 목적하는 IL-6 단백질을 공지의 방법으로 정제하고, 이 정제된 IL-6 단백질을 감작항원으로 사용할 수 있다. 또한, IL-6 단백질과 다른 단백질의 융합단백질을 감작항원으로 사용할 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 항IL-6 수용체 항체는 공지의 수단을 이용하여 폴리크로날 또는 모노크로날 항체로서 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항IL-6 수용체 항체로는 특히 포유동물 유래의 모노크로날 항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 모노크로날 항체로는 하이브리도마에서 생산되는 것 및 유전공학적 수법에 따라 항체유전자를 포함한 발현벡터로 형질전환된 숙주에서 생산되는 것이 있다. 이러한 항체는 IL-6 수용체와 결합함으로써 IL-6의 IL-6 수용체로의 결합을 저해하여 IL-6의 생물학적 활성이 세포 내로 전달되는 것을 차단한다.

이와 같은 항체로는 MR16-1 항체(Tamura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1993) 90, 11924-11928), PM-1 항체(Hirata, Y. et al., J. Immunol.(1989) 143, 2900-2906), AUK12-20 항체, AUK64-7 항체 또는 AUK146-15 항체(국제특허출원공개 WO 92-19759호) 등을 들 수 있다. 이들 중에서, 특히 바람직한 항체로서 PM-1 항체를 들 수 있다.

한편, PM-1 항체생산 하이브리도마 세포주는 PM-1로서, 이는 일본 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물 기탁센터(일본 이바라키현 츠쿠바시 히까시1쵸메 1번지 1 중앙 제6)에 평성 원년 7월 12일에 FERM BP-2998로 부다페스트조약에 기해 국제기탁되어 있다. 또한, MR16-1 항체생산 하이브리도마 세포주는 랫트-마우스 하이브리도마 MR 16-1로서, 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허생물 기탁센터(일본 이바라키현 츠쿠바시 히카시1쵸메 1번지 1 중앙 제 6)에 평성 9년 3월 13일에 FERM BP-5875로서 부다페스트 조약에 기해 국제기탁되어 있다.

항 IL-6 수용체 모노크로날 항체생산 하이브리도마는 기본적으로는 공지의 기술을 사용하여 이하와 같이 제작될 수 있다. 즉, IL-6 수용체를 감작항원으로 이용하여 이를 통상의 면역방법에 따라 면역시키고, 얻어지는 면역세포를 통상의 세포융합법으로 공지의 모세포와 융합시키고, 통상의 스크리닝법으로 모노크로날 항체생산세포를 스크리닝함으로써 제작될 수 있다.

구체적으로, 항 IL-6 수용체 항체를 만드는 것은 다음과 같이 할 수 있다. 예를 들어, 항체취득의 감작항원으로 사용되는 인간 IL-6 수용체는 유럽특허 출원공개 EP 325474호에 개시된 것을, 마우스 IL-6 수용체는 일본특허 출원공개 특개평3-155795호에 개시된 IL-6 수용체유전자/아미노산 배열을 이용함으로써 얻을 수 있 다.

IL-6 수용체 단백질은 세포막 상에 발현되어 있는 것과 세포막에서 이탈되어 있는 것(가용성 IL-6 수용체)(Yasukawa, K. et al., J. Biochem.(1990) 108, 673-676)의 2가지 종류가 있다. 가용성 IL-6 수용체 항체는 세포막에 결합되어 있는 IL-6 수용체의 실질적으로 세포 외 영역으로 구성되어 있어, 세포막 관통영역 또는 세포막 관통영역과 세포 내 영역이 결손되어 있다는 점에서 막결합형(막결합형) IL-6 수용체와 차이가 난다. IL-6 수용체 단백질은 본 발명에서 이용되는 항IL-6 수용체 항체를 제작하는 감작항원으로 사용될 수 있는 한 어떤 IL-6 수용체를 사용하여도 좋다.

IL-6 수용체의 유전자배열을 공지의 발현벡터계에 삽입해서 적당한 숙주세포를 형질전환한 후, 그 숙주세포 중 또는 배양 상청 중에서 목적하는 IL-6 수용체 단백질을 공지의 방법으로 정제하여, 이 정제된 IL-6 수용체 단백질을 감작항원으로 이용하는 것이 좋다. 또한, IL-6 수용체가 발현되어 있는 세포나 IL-6 수용체 단백질과 다른 단백질과의 융합 단백질을 감작항원으로 이용하여도 좋다.

인간 IL-6 수용체를 코드하는 cDNA를 함유한 플라스미드 pIBIBSF2R를 함유하는 대장균(E. coli)은 일본 평성 원년(1989년) 1월 9일자로 일본 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본 이바라키현 츠쿠바시 히까시1쵸메 1번지 1 중앙 제6)에 HB101-pIBIBSF2R로서, 수탁번호 FERM BP-2232로 부다페스트조약에 기해 국제기탁되어 있다.

본 발명에서 사용되는 항 gp130 항체는 공지의 수단을 사용하여 폴리크로날 또는 모노크로날 항체로서 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항 gp130 항체로는 특히 포유동물 유래의 모노크로날 항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 모노크로날 항체로는 하이브리도마에서 생산되는 것 및 유전공학적 수법으로 항체유전자를 포함한 발현벡터로 형질전환된 숙주에서 생산되는 것이 있다. 이 항체는 gp130과 결합함으로써, IL-6/IL-6 수용체 복합체가 gp130과 결합되는 것을 저해하여 IL-6의 생물학적 활성의 세포 내로의 전달을 차단한다.

이와 같은 항체로는 AM64 항체(일본 특개평 3-219894), 4B11 항체 및 2H4 항체(US5571513), B-S12 항체 및 B-P8 항체(일본 특개평 8-291199) 등을 들 수 있다.

항 gp130 모노크로날 항체생산 하이브리도마는 기본적으로는 공지 기술을 사용해서 다음과 같이 제조될 수 있다. 즉, gp130을 감작항원으로 사용하여 이를 통상적인 면역방법에 따라 면역하고, 얻어지는 면역세포를 통상의 세포융합법으로 공지의 모세포와 융합시켜, 통상의 스크리닝법으로 모노크로날 항체생산세포를 스크리닝함으로써 만들 수 있다.

구체적으로, 모노크로날 항체를 만들기 위하여 다음과 같이 하면 좋다. 예를 들어, 항체취득의 감작항원으로 사용되는 gp130는 유럽특허 출원공개 EP 411946호에 개시된 gp130 유전자/아미노산 배열을 이용하여 얻어진다.

gp130의 유전자 배열을 공지의 발현벡터계에 삽입하여 적당한 숙주세포를 형질전환시킨 후, 그 숙주세포 중 또는 배양 상청 중에서 목적하는 gp130 단백질을 공지의 방법으로 정제하고, 이 정제된 gp130 수용체 단백질을 감작항원으로 이용하면 좋다. 또한, gp130을 발현하고 있는 세포나 gp130 단백질과 다른 단백질과의 융 합단백질을 감작항원으로 이용하여도 좋다.

감작항원에서 면역되는 포유동물은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 세포융합에 사용되는 모세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하며, 일반적으로는 설치류 동물, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터 등이 사용된다.

감작항원을 동물에 면역시키는 것은 공지의 방법으로 실행된다. 예컨대, 일반적인 방법은 감작항원을 포유동물의 복강 내 또는 피하에 주사함으로써 실행된다. 구체적으로는, 감작항원을 PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리식염수 등으로 적당량 희석하여 현탁시킨 것을 소망에 따라 통상의 보강제(adjuvant), 예를 들어 프로인트 완전 보강제를 적당량 혼합하고, 유화시킨 후, 포유동물에 4 ~ 21일 마다 수 차례 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 감작항원 면역시에 적당한 담체를 사용할 수 있다.

이와 같이 면역하여 혈청 중에 소망하는 항체레벨이 상승하는 것을 확인 한 후, 포유동물로부터 면역세포를 꺼내어 세포융합을 실시한다. 세포융합이 실시되는 바람직한 면역세포로는, 특히 비장세포(脾臟細胞) 들 수 있다.

상기 면역세포와 융합되는 다른 모세포로서의 포유동물의 골수종(myeloma) 세포는 이미 공지된 여러 가지 세포주, 예를 들면 P3X63Ag8.653(Kearney, J. F. et al. J. lmmnol.(1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and lmmunology(1978) 81, 1-7), NS-1(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. lmmunol.(1976) 6, 511-519), MPC-11(Margulies. D. H. et a1., Cell(1976) 8, 405-415), SP2/0(Shulman, M. et a1., Nature(1978) 276, 269-270), FO(de St. Groth, S. F. et a1., J. Immuno1. Methods(1980) 35, 1-21), S194(Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210(Galfre, G. et a1., Nature(1979) 277, 131-133) 등이 적절하게 사용된다.

상기 면역세포와 골수종 세포의 세포융합은 기본적으로는 공지의 방법인 예컨대 밀스타인 등의 방법(Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymo1.(1981) 73, 3-46) 등에 준해서 실행될 수 있다.

보다 구체적으로는, 상기 세포융합은 예컨대 세포융합 촉진제 존재 하의 통상의 영양배양액 중에서 실시된다. 융합촉진제로는 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 센다이바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 또 소망에 따라 융합효율을 높이기 위해 디메틸술폭시드 등의 보조제를 첨가해서 사용할 수도 있다.

면역세포와 골수종 세포의 사용비율은, 예컨대, 골수종 세포에 대해 면역세포를 1 ~ 10 배가 되도록 하는 것이 바람직하다. 상기 세포융합에 이용되는 배양액으로는, 예컨대 상기 골수종 세포주의 증식에 매우 적합한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 기타 이런 종류의 세포배양에 이용되는 통상의 배양액이 사용될 수 있고, 또 소 태아 혈청(FCS) 같은 혈청보액을 병용할 수도 있다.

세포융합은 상기 면역세포와 골수종 세포의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하되, 미리 37℃ 정도로 가온된 PEG 용액, 예를 들면 평균분자량 1000 ~ 6000 정도의 PEG 용액을 통상 30 ~ 60%(w/v)의 농도로 첨가하여 혼합함으로써, 목적으로 하는 융합세포(하이브리도마)가 형성된다. 계속하여, 적당한 배양액을 순차적으로 첨가하고 원심분리로 상청을 제거하는 조작을 반복함으로써, 하이브리도마의 생육 에 바람직하지 않은 세포융합제 등을 제거할 수 있다.

이 하이브리도마는 통상의 선택배양액, 예컨대 HAT 배양액(하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함한 배양액)에서 배양함으로써 선택된다. 상기 HAT 배양액에서의 배양은 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸하기에 충분한 시간인 통상 수일 ~ 수주간 지속된다. 그 다음, 통상의 한계희석법을 실시해서 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 클리닝이 행해진다.

또한, 인간 이외의 동물에 항원을 면역시켜 상기 하이브리도마를 얻는 외에, 인간 임파구를 인 비트로(in vitro)에서 소망하는 항원단백질 또는 항원발현세포로 감작시켜, 감작 B 임파구를 인간 골수종 세포인 예컨대 U266와 융합시켜, 소망하는 항원 또는 항원발현세포에 대한 결합활성을 갖는 소망하는 인간항체를 얻을 수도 있다(일본 특공평 1-59878호 참조). 그리고, 인간 항체유전자의 레퍼터리를 가진 트랜스제닉(transgenic) 동물에 항원 또는 항원발현세포를 투여하고, 앞에서 설명한 방법에 따라 소망하는 인간항체를 얻어도 좋다(국제특허 출원공개 WO 93/12227호, WO 92/03918호, WO 94/02602호, WO 94/25585호, WO 96/34096호, WO 96/33735호 참조).

이와 같이 해서 만들어진 모노크로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대배양될 수 있고, 또한 액체질소 중에서 장기간 보존될 수도 있다.

이 하이브리도마로부터 모노크로날 항체를 얻는 데에는, 당해 하이브리도마 를 통상의 방법에 따라 배양하여 그 배양상청으로서 얻는 방법, 또는 하이브리도마를 이와 적합성을 갖는 포유동물에 투여하여 증식시켜 그의 복수(腹水)로서 얻는 방법 등을 채용할 수 있다. 전자의 방법은 고순도의 항체를 얻기에 적합하고, 후자의 방법은 항체의 대량생산에 적합하다.

예컨대, 항IL-6 수용체 항체생산 하이브리도마의 제조는 일본 특개평 3-139293호에 개시된 방법으로 실행될 수 있다. 일본 독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물기탁센터(일본국 이바라키현 츠쿠바시 히가시1죠메 1번지 1 중앙 제6)에 일본 평성 원년 7월 12일에 FERM BP-2998로서 부다페스트 조약에 기해 국제기탁된 PM-l 항체생산 하이브리도마를 BALB/c 마우스의 복강 내에 주입하여 복수를 얻고, 이 복수로부터 PM-l 항체를 정제하는 방법이나, 본 하이브리도마를 적당한 배지, 예컨대 10% 소 태아 혈청, 5% BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim 제) 함유 RPMI1640 배지, 하이브리도마 SFM 배지(GIBCO-BRL 제), PFHM-II 배지(GIBCO-BRL 제) 등에서 배양하여, 그 배양상청으로부터 PM-l 항체를 정제하는 방법으로 실행할 수 있다.

본 발명에서는 모노크로날 항체로서 항체유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하여 적당한 벡터로 조립하고, 이를 숙주에 도입하여 유전자 조환 기술을 이용하여 생산한 조환형 항체를 이용할 수 있다(예를 들면, Borrebaeck C. A. K. and Larric k J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 참조).

구체적으로는, 목적으로 하는 항체를 생산하는 세포, 예컨대 하이브리도마로 부터 항체의 가변(V)영역을 코드하는 mRNA를 단리(單離)한다. mRNA의 단리는 공지의 방법, 예컨대 구아니딘 초원심법(超遠心法; Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry(1979) 18, 5294-5299), AGPC법(Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem.(1987) 162, 156-159) 등으로 전(全) RNA를 제조하고, mRNA Purification Kit(Pharmacia 제) 등을 사용해서 mRNA를 제조한다. 또, QuickPrep mRNA 정제 키트(Pharmacia 제)를 이용함으로써 mRNA를 직접 제조할 수 있다.

얻어진 mRNA로부터 역전사 효소를 이용하여 항체 V영역의 cDNA를 합성한다. cDNA의 합성은 AMV 연전사 효소 제1-사슬 cDNA 합성 키트(AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit) 등을 이용해서 실시할 수 있다. 또한, cDNA의 합성 및 증폭을 실행하려면 5'-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech 제) 및 PCR를 이용한 5'-RACE 법(Frohman, M. A. et al., Proc Nat1. Acad. Sci. USA(1988) 85, 8998-9002; Be1yavsky, A. et al., Nucleic Acids Res.(1989) 17, 2919-2932)을 사용할 수가 있다. 얻어진 PCR 산물로부터 목적하는 DNA 단편을 정제하여 벡터 DNA와 연결한다. 그리고, 이에 의해 조환벡터를 작성하고, 대장균 등에 도입하여 콜로니를 선택하여 소망하는 조환벡터를 제조한다. 목적으로 하는 DNA의 염기서열을 공지의 방법인 예컨대 데옥시법으로 확인한다.

목적으로 하는 항체의 V영역을 코드하는 DNA가 얻어지면, 이를 소망하는 항체정상영역(抗體定常領域; C영역)을 코드하는 DNA와 연결시켜, 이를 발현벡터와 조립한다. 또는, 항체의 V영역을 코드하는 DNA를 항체 C영역의 DNA를 포함한 발현벡터에 조립하여도 좋다.

본 발명에서 사용되는 항체를 제조하기 위하여, 하기에 설명하는 바와 같이 항체유전자를 발현제어영역, 예를 들어 인핸서(enhancer), 프로모터의 제어 하에서 발현되도록 발현벡터에 조립한다. 그 다음, 이 발현벡터에 의해 숙주세포를 형질전환시켜 항체를 발현시킬 수 있다

본 발명에서, 인간에 대한 이종항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 인위적으로 개변(改變)시킨 유전자 조환형 항체, 예컨대 키메라(Chimeric) 항체, 인간화(Humanized) 항체, 인간(human) 항체를 사용할 수 있다. 이들 개변항체는 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다.

키메라 항체는 상기한 바와 같이 얻은 항체 V영역을 코드하는 DNA를 인간항체 C영역을 코드하는 DNA와 연결시켜 이를 발현벡터에 조립하고 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 얻어지게 된다(유럽특허출원공개 EP 125023호, 국제특허 출원공개 WO 92-19759호 참조). 이 기존의 방법을 써서, 본 발명에 유용한 키메라 항체를 얻을 수 있다.

예컨대, 키메라 PM-1 항체의 L쇄 및 H쇄의 V영역을 코드하는 DNA를 포함한 플라스미드는 각각 pPM-k3 및 pPM-h1로 명명되고, 이 플라스미드를 갖는 대장균은 National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(영국 및 북아일랜드 연합왕국 스코틀랜드 에버딘 AB2 1RY 맥하드라이브가 23)에 1991년 2월 12일 각각 NCIMB40366 및 NCIMB40362로 부다페스트조약에 기해 국제기탁되어 있다.

인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간항체로도 불려지는데, 이는 인간 이외의 포유동물, 예컨대 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR)을 인간항체의 상보성 결 정영역에 이식한 것으로, 그 일반적인 유전자 조환수법도 알려져 있다(유럽특허출원공개 EP 125023호, 국제특허출원공개 WO 92-19759호 참조).

구체적으로는, 마우스항체의 CDR과 인간항체의 프레임워크 영역(FR; framework region)을 연결하도록 설계한 DNA 배열을 말단부에 오버랩하는 부분을 갖도록 만든 몇 개의 올리고 뉴클레오타이드(oligo nucleotide)로부터 PCR법으로 합성한다. 얻어진 DNA를 인간항체 C영역을 코드하는 DNA와 연결한 다음, 발현벡터에 조립하고, 이를 숙주에 도입하여 생산함으로써 얻어진다(유럽특허 출원공개 EP 239400호, 국제특허출원공개 WO 92-19759호 참조).

CDR를 매개로 연결되는 인간항체의 FR은 상보성 결정영역이 양호한 항원 결합부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라, 재구성 인간항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원결합부위를 형성하도록, 항체 가변영역의 프레임워크 영역의 아미노산을 치환하여도 좋다(Sato, K. et a1., Cancer Res.(1993) 53, 851-856).

키메라 항체, 인간화 항체에는 인간항체 C영역이 사용된다. 인간항체 C영역으로는 Cγ를 들 수 있는데, 예컨대, Cγ1, Cγ2, Cγ3 또는 Cγ4를 사용할 수 있다. 또한, 항체 또는 그 생산의 안정성을 개선하기 위해, 인간항체 C영역을 수식(修飾)하여도 좋다.

키메라 항체는 인간 이외의 포유동물에서 유래한 항체의 가변영역과 인간항체에서 유래한 C영역으로 이루어지되, 인간화 항체는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 상보성 결정영역과 인간항체 유래의 프레임워크 영역 및 C영역으로 이루어져 있는데, 이는 인간 체내에서의 항원성이 저하되어 있기 때문에 본 발명에 사용 되는 항체로서 유용하다.

본 발명에 사용되는 인간화 항체의 바람직한 구체적인 예로는, 인간화 PM-1 항체를 들 수 있다(국제특허 출원공개 WO 92-19759호 참조).

또, 인간항체의 취득방법으로는 앞에서 설명한 방법 외에, 인간항체 라이브러리를 이용하여 패닝에 의해 인간항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예컨대, 인간항체의 가변영역을 1줄 사슬 항체(scFv)로 해서 파지 디스플레이법으로 파지의 표면에 발현시켜 항원에 결합하는 파지를 선택할 수도 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석하면, 항원에 결합되는 인간항체의 가변영역을 코드하는 DNA 배열을 결정할 수 있게 된다. 항원에 결합된 scFv의 DNA 배열이 밝혀지면, 당해 배열을 적당한 발현벡터를 제조하여 인간항체를 얻을 수 있다. 이들 방법은 이미 널리 알려져 있는 것으로, WO 92/01047호, WO 92/20791호, WO 93/06213호, WO 93/11236호, WO 93/19172호, WO 95/01438호, WO 95/15388호를 참조할 수 있다.

상기와 같이 구축된 항체유전자는 공지의 방법으로 발현시켜 얻을 수 있다. 포유류 세포의 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 발현되는 항체유전자, 그 3' 측 하류에 폴리 A 시그널을 기능적으로 결합시킨 DNA 또는 이를 함유하는 벡터에 의해 발현시킬 수 있다. 예컨대 프로모터/인핸서로는 인간 사이토메갈로 바이러스 전기 프로모터/인핸서(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)를 들 수 있다.

또한, 기타 본 발명에서 사용되는 항체발현에 사용될 수 있는 프로모터/인핸서로서, 레트로 바이러스, 폴리오머 바이러스, 아데노 바이러스, 시미안 바이러스 40(SV 40) 등의 바이러스 프로모터/인핸서나 인간 연장인자 1α(HEF1α) 등의 포유류 세포 유래의 프로모터/인핸서를 사용하면 좋다.

예컨대, SV 40 프로모터/인핸서를 사용하는 경우, Mu1ligan 등의 방법(Mulligan, R. C. et al., Nature(1979) 277, 108-114), 또는 HEF1α 프로모터/인핸서를 사용하는 경우, Mizushima 등의 방법(Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res.(1990) 18, 5322)에 따르면 쉽게 실시할 수 있다.

대장균의 경우, 통상적으로 사용되는 유용한 프로모터, 항체분비를 위한 시그널 배열, 발현되는 항체유전자를 기능적으로 결합시켜 발현시킬 수 있다. 예컨대 프로모터로는 lacZ 프로모터, araB 프로모터를 들 수 있다. lacZ 프로모터를 사용하는 경우에는 Ward 등의 방법(Ward, E. S. et al., Nature(1989) 341, 544-546; Ward, E. S. et al. FASEB J.(1992) 6, 2422-2427), araB 프로모터를 사용하는 경우에는 Better 등의 방법(Better, M. et al. Science(1988) 240, 1041-1043)에 따르면 된다.

항체분비를 위한 시그널 배열로는, 대장균의 페리프라즘에서 생산되는 경우 pel B 시그널배열(Lei, S. P. et al J. Bacteriol.(1987) 169, 4379-4383)을 사용하는 것이 좋다. 페리프라즘에서 생산된 항체를 분리한 후, 항체의 구조를 적절히 리폴드(refold)하여 사용한다(예를 들면, W096/30394호 참조).

복제기원으로는 SV 40, 폴리오머 바이러스, 아데노 바이러스, 소 파피로머 바이러스(BPV) 등에서 유래한 것을 사용할 수 있고, 또한 숙주세포계에서 유전자 카피의 수를 증폭시키기 위해, 발현벡터는 선택 마커로서 아미노글리코시드 포스포 트란스퍼라제(APR) 유전자, 티미딘 키나제(TK) 유전자, 대장균 크산틴 구아닌 포스포리보실 트란스페라제(Ecogpt) 유전자, 디히드로 엽산 환원효소(dhfr) 유전자 등이 포함될 수 있다

본 발명에서 사용되는 항체의 제조를 위해, 임의의 생산계를 사용할 수 있다. 항체제조를 위한 생산계는 인 비트로 및 인 비보(in vivo)의 생산계가 있다. 인 비트로의 생산계로는 진핵세포를 사용하는 생산계나 원핵세포를 사용하는 생산계를 들 수 있다.

진핵세포를 사용하는 경우, 동물세포, 식물세포, 또는 진균류 세포를 이용하는 생산계가 있다. 동물세포로는, (1) 포유류 세포, 예컨대 CHO, COS, 골수종, BHK(baby hamster kidney), HeLa, Vero 등, (2) 양서류 세포, 예컨대 아프리카 트메가엘 난모세포, 또는 (3) 곤충 세포, 예컨대 sf9, sf21, Tn5 등이 알려져 있다. 식물세포로는, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 유래의 세포가 알려져 있는데, 이를 칼루스 배양하면 좋다. 진균류 세포로는, 효모, 예컨대 사카로마이시스(Saccharomyces) 속, 예컨대 사카로마이시스·세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 사상균, 예컨대 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 예컨대 아스퍼질러스 나이가(Aspergillus niger) 등이 알려져 있다.

원핵세포를 사용하는 경우, 세균세포를 이용하는 생산계가 있다. 상기 세균세포로는 대장균(E. coli)과 고초균(古草菌)이 알려져 있다.

이들 세포에 목적으로 하는 항체유전자를 형질전환으로 도입하여, 형질전환된 세포를 인 비트로에서 배양함으로써 항체가 얻어진다. 배양은 공지의 방법에 따 라 실행한다. 예컨대, 배양액으로는 DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM을 사용할 수가 있고, 소 태아 혈청(FCS) 등의 혈청보액을 병용할 수도 있다. 또한, 항체유전자를 도입한 세포를 동물의 복강 등에 옮겨, 인 비보에서 항체를 생산하여도 좋다.

한편, 인 비보의 생산계로는 동물을 사용하는 생산계나 식물을 사용하는 생산계를 들 수 있다. 동물을 사용하는 경우, 포유류 동물, 곤충을 이용하는 생산계 등이 있다.

포유류 동물로는, 염소, 돼지, 양, 마우스, 소 등을 이용할 수 있다(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). 또한, 곤충으로는 누에를 이용할 수 있다. 식물을 사용하는 경우, 예컨대 담배를 이용할 수 있다.

이들 동물 또는 식물에 항체유전자를 도입하여, 이들 동물 또는 식물의 체내에서 항체를 생산하여 회수한다. 예컨대, 항체유전자를 염소 β카제인과 같은 유즙 중에서 고유하게 생산되는 단백질을 코드하는 유전자 중에 삽입하여 융합유전자로 제조한다. 항체유전자가 삽입된 융합유전자를 포함한 DNA 단편을 염소의 배아에 주입하고, 이 배아를 암컷 염소에다 도입한다. 배아가 도입된 염소에서 태어나는 트란스제닉 염소 또는 그 자손이 생산하는 유즙으로부터 소망하는 항체를 얻는다. 트란스제닉 염소로부터 생산되는 소망하는 항체를 포함한 유즙량을 증가시키기 위해, 적절한 호르몬을 트란스제닉 염소에 사용하여도 좋다(Ebert, K. M. et al., Bio/Technology(1994) 12, 699-702).

또한 누에를 이용하는 경우, 목적하는 항체유전자를 삽입한 배큘로 바이러스를 누에에 감염시키고, 이 누에의 체액에서 소망하는 항체를 얻는다(Maeda, S. et al., Nature(1985) 315, 592-594). 그리고, 담배를 이용하는 경우, 목적하는 항체유전자를 식물발현용 벡터, 예컨대 pMON 530에 삽입하고, 이 벡터를 애그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 박테리아에 도입한다. 이 박테리아를 담배, 예컨대 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)에 감염시켜, 이 담배의 잎에서 소망하는 항체를 얻는다(Julian, K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol.(1994) 24, 131-138).

앞에서 설명한 바와 같이 인 비트로 또는 인 비보의 생산계에서 항체를 생산하는 경우, 항체 중쇄(重鎖; H쇄) 또는 경쇄(輕鎖; L쇄)를 코드하는 DNA를 별개로 발현벡터에 조립해서 숙주를 동시형질전환시켜도 좋고, 또는 H쇄 및 L쇄를 코드하는 DNA를 단일의 발현벡터에 조립해서 숙주를 형질전환시켜도 좋다(국제특허 출원공개 WO94-11523호 참조).

본 발명에서 사용되는 항체는 본 발명에서 적절하게 사용될 수 있는 한, 항체의 단편이나 그 수식물이어도 좋다. 예컨대, 항체의 단편으로는 Fab, F(ab')2, Fv 또는 H쇄와 L쇄의 Fv를 적당한 링커(linker)로 연결시킨 단일사슬인 Fv(scFv)을 들 수 있다.

구체적으로는, 항체를 효소, 예컨대 파파인, 펩신으로 처리해서 항체 단편을 생성시키거나, 또는 이들 항체 단편을 코드하는 유전자를 구축하여 이를 발현벡터에 도입한 후 적당한 숙주세포에서 발현시킨다(예컨대, Co, M. S. et al., J. lmmunol.(1994) 152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology(1989) 178, 476-496, Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology(1989) 178, 476-496, Lamoyi, E., Methods in E nzymology(1989) 121, 652-663, Rousseaux, J. et a1., Methods in Enzymology(1989) 121, 663-66, Bird, R. E. et a1., TIBT ECH(1991) 9, 132-137 참조).

scFv는, 항체의 H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 연결함으로써 얻어진다. 이 scFv에서, H쇄 V영역와 L쇄 V영역은 링커, 바람직하기로는 펩티드 링커를 매개로 연결된다.(Huston, J. S. et al., Proc. Nat1. Acad. Sci. U.S.A.(1988) 85, 5879-5883). scFv에서의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은 상기 항체로 기재되어 있는 것 중 어떤 것에서 유래한 것이라도 좋다. V영역을 연결하는 펩티드 링커로는 예컨대 아미노산 12-19 잔기로 이루어진 임의의 1본쇄 펩티드가 사용된다.

scFv를 코드하는 DNA는 상기 항체의 H쇄 또는 H쇄 V영역을 코드하는 DNA 및, L쇄 또는 L쇄 V영역을 코드하는 DNA를 주형으로 하여, 그들의 배열 중 소망하는 아미노산 배열을 코드하는 DNA 부분을 그 양단을 규정하는 프라이머 한쌍을 이용하여 PCR 법으로 증폭한 다음, 다시 펩티드 링커 일부분을 코드하는 DNA 및 그 양 말단을 각각 H쇄, L쇄와 연결되도록 규정하는 프라이머 한쌍을 조합하여 증폭함으로써 얻어지게 된다.

또한, 일단 scFv를 코드하는 DNA가 만들어지면, 그들을 함유하는 발현벡터 및 당해 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주를 통상적인 방법에 따라 얻을 수가 있고, 또 그 숙주를 이용하여 통상적인 방법에 따라 scFv를 얻을 수 있다.

이들 항체의 단편은 상기한 바와 같이 그 유전자를 취득하고 발현시켜, 숙주에 의해 생산될 수 있다. 본 발명에서 말하는 「항체」에는 이들 항체의 단편도 포 함된다.

항체의 수식물로서 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 사용할 수도 있다. 본 발명에서 말하는 「항체」에는 이들 항체 수식물도 포함된다. 이와 같은 항체 수식물을 얻는데에는, 얻어진 항체에 화학적인 수식을 실시함으로써 얻을 수 있다. 이들 방법은 이 분야에서 이미 확립되어 있다.

상기와 같이 생산되고 발현된 항체는, 세포의 내외, 숙주로부터 분리되어 균질화될 때까지 정제될 수가 있다. 본 발명에서 사용되는 항체의 분리, 정제는 어피니티 크로마토그래피로 실행할 수가 있다. 어피니티 크로마토그래피에 쓰이는 칼럼으로는, 예컨대, 단백질 A 칼럼, 단백질 G 칼럼을 들 수 있다. 단백질 A 칼럼에 쓰이는 담체로는 예컨대 Hyper D, POROS, Sepharose F.F. 등을 들 수 있다. 기타, 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하는 것이 바람직하지만, 특별히 어떤 것으로 한정되는 것은 아니다.

예컨대, 상기 어피니티 크로마토그래피 이외의 크로마토그래피, 필터, 한외여과(限外濾過), 염석(鹽析), 투석(透析) 등을 적절히 선택해서 조합하면, 본 발명에서 사용되는 항체를 분리, 정제할 수 있다. 크로마토그래피로는 예컨대 이온교환 크로마토그래피, 소수(疎水) 크로마토그래피, 겔 여과 등을 들 수 있다. 이들 크로마토그래피는 HPLC(High performance liquid chromatography)에 적용할 수 있다. 또, 역상 HPLC(reverse phase HPLC)를 이용하여도 좋다.

위와 같이 얻어진 항체의 농도측정은 흡광도의 측정 또는 ELISA 등으로 실행할 수 있다. 즉, 흡광도의 측정에 의한 경우에는, PBS(-)로 적당히 희석한 후, 280nm의 흡광도를 측정하여, 1mg/ml를 1.35 OD로 해서 산출한다. 또, ELISA에 의한 경우는 다음과 같이 측정할 수가 있다. 즉, O.1M 중탄산완충액(pH9.6)에 1μg/ml로 희석시킨 염소 항인간 IgG(TAG 제) 100μl를 96 웰 플레이트(Nunc 제)에 넣고, 4℃에서 하룻밤 배양하여 항체를 고상화(古相化)한다. 블로킹 후, 적절히 희석시킨 본 발명에서 사용되는 항체 또는 항체를 함유한 샘플, 또는 표본 제품으로서 인간 IgG(CAPPEL 제) 100μl를 첨가하여, 실온에서 1시간 배양 한다.

세정 후, 5000배 희석한 알칼리 포스파타제 표지 항인간 IgG(BIO SOURCE 제) 100μl를 가해, 실온에서 1시간 배양한다. 세정 후, 기질용액을 가해 배양한 후, MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad 제)을 이용하여 405nm에서의 흡광도를 측정하여, 목적으로 하는 항체의 농도를 산출한다.

본 발명에서 사용되는 IL-6 개변체는 IL-6 수용체와의 결합활성을 갖고, 또 IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않는 물질이다. 즉, IL-6 개변체는 IL-6 수용체에 대해 IL-6과 경합적으로 결합하지만, IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않기 때문에 IL-6에 의한 시그널 전달을 차단한다.

IL-6 개변체는 IL-6의 아미노산 배열의 아미노산 잔기를 치환함으로써 변이를 도입하여 만들어진다. IL-6 개변체의 기본이 되는 IL-6은 그 유래는 문제되지 않지만, 항원성 등을 고려하면 바람직하기는 인간 IL-6이다.

구체적으로는, IL-6의 아미노산 배열을 공지의 분자 모델링 프로그램, 예컨대, WHATIF(Vriend et al., J. Mol. Graphics(1990) 8, 52-56)를 써서 그 2차 구조를 예측하고, 또 치환되는 아미노산 잔기 전체에 미치는 영향을 평가함으로써 실행 된다. 적절한 치환 아미노산 잔기를 결정한 후, 인간 IL-6 유전자를 코드하는 염기배열을 포함한 벡터를 주형으로 하여, 통상 행해지는 PCR 법으로 아미노산이 치환되도록 변이를 도입함으로써, IL-6 개변체를 코드하는 유전자가 얻어진다. 이를 필요에 따라 적당한 발현벡터에 조립하여, 상기 조환형 항체의 발현, 생산 및 정제방법에 준하여 IL-6 개변체를 얻을 수 있다.

IL-6 개변체의 구체적인 예는 Brakenhoff et aI., J. BioI. Chem.(1994) 269, 86-93 및 Savino et aI., EMBO J.(1994) 13, 1357-1367, WO 96-18648, WO96-17869호에 개시되어 있다.

본 발명에서 사용되는 IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드는 각각 IL-6 수용체 또는 IL-6과의 결합활성을 갖고, 또 IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않는 물질이다. 즉, IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드는 IL-6 수용체 또는 IL-6에 결합되어 이들을 포착함으로써, IL-6의 IL-6 수용체에 결합되는 것을 특이적으로 저해한다. 그 결과, IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않기 때문에, IL-6에 의한 시그널 전달을 차단한다.

IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드는 IL-6 또는 IL-6 수용체의 아미노산 배열에서 IL-6과 IL-6 수용체의 결합과 관계되는 영역의 일부 또는 전부의 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드이다. 이와 같은 펩티드는 통상적으로 10 ~ 80, 바람직하기로는 20 ~ 50, 보다 바람직하기로는 20 ~ 40 개의 아미노산 잔기로 이루어진다.

IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드는 IL-6 또는 IL-6 수용체의 아미노산 배열에서 IL-6과 IL-6 수용체의 결합과 관계되는 영역을 특정하고, 그 일부 또는 전부의 아미노산 배열을 통상 알려진 방법인 예컨대 유전공학적 수법 또는 펩티드합성법으로 만들 수 있다.

IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드를 유전공학적 수법으로 만드는 데에는 소망하는 펩티드를 코드하는 DNA 배열을 발현벡터에 조립하여, 상기 조환형 항체의 발현, 생산 및 정제방법에 준해 얻을 수 있다.

IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드를 펩티드 합성법으로 만드는 데에는, 펩티드 합성에서 통상 쓰이고 있는 방법, 예컨대 고상합성법 또는 액상합성법을 이용할 수 있다.

구체적으로, 일본 히로가와 서점에서 1991년에 출판한 야지마 오사무(矢島治明) 감수의, "속(續) 의약품의 개발" 제14권 "펩티드 합성"에 기재된 방법에 준하여 실시하면 좋다. 고상합성법으로는 예컨대 유기용매에 불용성인 지지체에 합성하려고 하는 펩티드의 C말단에 대응하는 아미노산을 결합시켜, α-아미노기 및 측쇄관능기를 적절한 보호기로 보호한 아미노산을 C말단으로부터 N말단방향의 순서로 1 아미노산씩 축합시키는 반응과 수지 상에 결합된 아미노산 또는 펩티드의 α-아미노기의 당해 보호기를 이탈시키는 반응을 교대로 반복함으로써, 펩티드 사슬을 신장시키는 방법이 이용되고 있다. 고상 펩티드 합성법은 사용되는 보호기의 종류에 따라 Boc 법과 Fmoc 법으로 대별된다.

이와 같이 해서 목적으로 하는 펩티드를 합성한 후, 탈보호반응 및 펩티드 사슬의 지지체로부터의 절단반응을 한다. 펩티드 사슬과의 절단반응에는 Boc 법에 서는 불화수소 또는 트리플루오로 메탄술폰산을, 그리고 Fmoc 법에서는 TFA를 통상적으로 이용할 수 있다. Boc 법에서는, 예컨대 불화수소 중에서 상기 보호펩티드 수지를 아니솔 존재 하에서 처리한다. 다음, 보호기의 이탈과 지지체로부터의 절단을 통하여 펩티드를 회수한다. 이를 동결건조함으로써 조 펩티드가 얻어진다. 한편, Fmoc 법으로는, 예컨대 TFA 중에서 상기와 같은 조작으로 탈보호반응 및 펩티드 사슬의 지지체로부터의 절단반응을 실행할 수 있다.

얻어진 조 펩티드는 HPLC에 적용함으로써 분리, 정제할 수 있다. 그의 용출에 있어서는, 단백질의 정제에 통상적으로 사용되는 물-아세토니트릴계 용매를 사용하여 최적조건 하에서 실시하면 좋다. 얻어진 크로마토그래피의 프로파일 피크에 해당하는 분획을 분취(分取)하여 이를 동결건조한다. 이와 같이 해서 정제된 펩티드 분획은 매스 스펙트럼 분석에 의하여 분자량 해석, 아미노산 조성 분석, 또는 아미노산배열 해석 등으로 동정한다.

IL-6 부분 펩티드 및 IL-6 수용체 부분 펩티드의 구체예는, 일본 특개평 2-188600호, 일본 특개평 7-324097호, 일본 특개평 8-311098호 및 미국특허공보 US 5210075호에 개시되어 있다.

본 발명에서 사용되는 IL-6 길항제의 IL-6 시그널 전달 저해활성은 통상적으로 사용되는 방법으로 평가할 수 있다. 구체적으로, IL-6 의존성 인간 골수종주(骨髓種株; S6B45, KPMM2), 인간 레널트 T 임파종 세포주 KT3, 또는 IL-6 의존성 세포 MH60.BSF2를 배양하고, 여기에 IL-6을 첨가하는 동시에 IL-6 길항제를 공존시켜줌 으로써 IL-6 의존성 세포의 ³H-티미딘 수확을 측정하면 된다. 또한, IL-6 수용체 발현세포인 U266를 배양하고, ¹²⁵I 표지 IL-6을 첨가하는 동시에 IL-6 길항제를 가함으로써, IL-6 수용체 발현세포에 결합된 ¹²⁵I 표지 IL-6을 측정한다. 상기 측정계에서 IL-6 길항제를 존재시키는 군에 더해 IL-6 길항제를 함유하지 않은 음성 대조군을 두고, 이들 양자로부터 얻어진 결과를 비교하면 IL-6 길항제의 IL-6 저해활성을 평가할 수 있다.

하기한 실시예에 나타난 바와 같이, 항IL-6 수용체 항체의 투여에 의해, 척수손상 환자에게 치료효과가 인정되었다. 본 발명에서 치료대상은 포유동물이다. 치료대상인 포유동물은 바람직하기는 인간이다.

본 발명에 따른 척수손상 치료제는 경구적 또는 비경구적으로 전신 또는 국소적으로 투여할 수가 있다. 예컨대, 링거 등의 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하 주사, 좌약, 주장(注腸), 경구성 장용제(腸溶劑) 등을 선택할 수 있는바, 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 투여방법을 선택할 수 있다.

유효투여량은 1회에 체중 1kg 당 0.01mg ~ 100mg의 범위에서 선택된다. 또는, 환자당 1 ~ 1000mg, 바람직하기는 5 ~ 50mg의 투여량을 선택할 수 있다. 바람직한 투여량, 투여방법은 예컨대 항 IL-6 수용체 항체의 경우에는 혈중에 유리된 항체가 존재하는 정도의 양이 유효투여량이고, 구체적인 예로는 체중 1kg 당 1개월(4주간)에 O.5mg ~ 40mg, 바람직하기는 1mg ~ 20mg를 1회 ~ 수회로 나누어, 예컨대 2회/주, 1회/주, 1회/2주, 1회/4주 등의 투여스케줄로 링거 등의 정맥주사, 피하주 사 등의 방법으로 투여하는 방법 등이다. 투여스케줄은 병상의 관찰 및 혈액검사치의 동향을 관찰하면서 2회/주 또는 1회/주로부터 1회/2 주, 1회/3주, 1회/4주와 같이 투여간격을 늘려 가는 것과 같이 조정할 수도 있다.

본 발명의 척수손상 치료제는 투여경로대로 의약적으로 허용되는 담체나 첨가물을 함께 함유한 것이어도 좋다. 이와 같은 담체 및 첨가물의 예로는, 물, 의약적으로 허용되는 유기용매, 콜라겐, 폴리비닐알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 카르복시 비닐폴리머, 카르복시 메틸셀룰로스나트륨, 폴리아크릴산나트륨, 알긴산나트륨, 수용성 덱스트란, 카르복시메틸스타치나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 크산탄검, 아리비아검, 카제인, 젤라틴, 한천, 디글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴알코올, 스테아린산, 인간 혈청알부민(HSA), 만니톨, 솔비톨, 락토스, 의약첨가물로서 허용된 계면활성제 등을 들 수 있다. 사용되는 첨가물은, 제형(劑型)에 따라 상기한 것 중에서 선택 또는 조합하여 선택되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

이하, 구체적인 실시예 및 참고예에 따라 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

재료 및 방법

동물:

성체(18 ~ 22g) 암컷 C57BL/6J 마우스를 모든 실험군에 사용하였다.

척수손상:

암컷 마우스를 케타민(IOOmg/kg) 및 키시라진(lOmg/kg)의 복강 내 주사로 마취시켰다. 등쪽의 털을 깎고, 20mm의 중선피부절개를 한 다음, 척주(脊柱)를 노출시켰다. 척주흉부영역을 배면근육의 측면 분리로 노출시킨 후, T7-T13 추골의 가시돌기(棘突起)를 노출시켰다. 추궁절제(椎弓切除)를 제9흉추 레벨에서 실시하고, 경막을 해치지 않도록 주의하면서 척수를 노출시켰다. 척주를 T7 및 T10 가시돌기 및 인대 상에 겸자 및 클램프로 안정화시키고, 대좌(臺座) 내림체를 위로 띄운 후 NYU 임팩터(impactor)로 척수손상(SCI)을 유발하였다. 3g 중량(직경으로 1.2mm의 선단)을 T9 레벨의 척수에 25mm의 높이에서 낙하시켰다. 근육 및 절개부를 층상으로 닫고, 동물을 열조절이 재확립될 때까지 온도조절된 챔버에 두었다. 수동 방광압출에 의한 배뇨를 자연배뇨가 확립될 때까지, 하루 2번씩 실시하였다.

실험계획 및 래트 항 -마우스 IL - 6 수용체 mAb ( MR16 -1)의 주입:

손상 직후에 마우스 체중 1g 당 100μg의 MR16-1을 1회 복강내 주입하고(MR16-1 군, n=15), 대조군에는 동량의 래트 Ig-G를 복강내 주입하였다(대조군, n=15). 양 군에서의 조직학적 및 면역조직학적 분석에 관해서는, 분열하는 세포를 표지하기 위해 BrdU(50mg/kg 체중)의 복강내 주입을 수술한 날로부터 2주간 실시하였다.

운동기능 평가:

본 발명자는 3가지의 다른 시험을 이용하여, 손상을 받은 후의 운동기능의 회복성을 평가하였다. 기능평가는 손상 후 6주일까지 계속하였다.

하지(下肢) 운동 기능평가: SCI의 기능적 효과를 평가하기 위해, 본 발명자는 일반적으로 넓게 쓰이고 있는 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB) 스코어로 운동기능평가를 실시하였다. 3명의 다른 검사자가 4분간에 걸쳐 개개의 동물을 이중 맹검으로 평가하고, 개개의 하지기능에 대해 정의된 평점(0 ~ 21)을 부여하였다. 모든 시험은 비디오테이프에 기록하였다.

SCANET: SCANET은 적외선 센서 프레임을 가진 게이지로 이루어진 자동동물이동분석시스템으로서, 이에 의해 작은(Ml) 및 큰(M2) 수평이동 및 수직이동(RG), 즉 기립회수가 관찰되어, 일정시간 내에 동물이 자발적으로 실행한 운동량이 정량된다. 특히, RG 평점과 BBB 척도평점 사이에 통계학적으로 정(正)의 상호관계가 존재한다고 할 수 있다.

로타로드 트레드밀(Rota rod tredmill): 플라스틱 로드로 이루어진 회전로드장치 상에 마우스를 올려놓고 강제로 보행시킴으로써 사지협조운동을 평가하였다. 5, 10 및 15rpm의 속도로 회전하는 로드 상에 마우스를 배치하여, 낙하하기까지의 잠복시간을 120초간 관찰하였다. 각각의 평균치와 최대치로부터 협조운동기능을 평가하였다.

면역조직화학:

조직학적 검토를 위해, 마우스에 디에틸에테르를 흡입시켜 마취하고, 4%의 파라포름알데히드를 심장 경유(經心臟的)로 환류시켜 고정시켰다. 척수를 적출하여, 실온에서 수시간 4% 파라포름알데히드로 후고정(後固定)시켰다. 조직 샘플을 10% 슈크로스에 4℃에서 24시간 함침하고, 30% 슈크로스에 48시간 배치하여 OTC 콤 파운드로 밀봉하였다. 밀봉조직을 액체질소로 동결시켜 -80℃에서 보존하였다. 동결절편은 크리오스타트에서 시상단(矢狀斷), 축단(軸斷)에 20㎛의 두께로 작성하여, HE 염색 또는 면역형광 이중염색을 실시하였다.

면역형광 이중 표지화 실험에 관하여는, 척수절편을 O.01M의 PBS(pH 7.4) 중 0.03% 트리톤(Triton) X-IOO 및 10% 정상염소 혈청으로 30분간 블로킹하였다. 1차 항체로는, 토끼 항-GFAP 항체, 래트 항-Brd-U 항체 및, 인간 항Hu 항체(뉴런 마커로서)를 이용하여, 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 2차 항체로는 FITC-컨쥬게이트된 토끼 IgG 항체 및 텍사스 레드 커쥬게이트된(Texas Red-conjugated)-래트 항체를 사용하여 2중염색을 실시하였다. 슬라이드를 세정하고, 침윤-고정시켜 형광 현미경 하에서 해석하였다.

웨스턴 블롯 분석:

손상작성으로부터 12시간 후(개별 그룹당 n=4) 8mm의 척수 세그먼트(외상의 중심으로부터 4mm 머리 쪽 및 4mm 꼬리 쪽)를 절제하고, 단백질 분해효소 억제제를 함유한 MAPK 용균완충액에서 균질화하고 음파처리(音波處理)한 후, 15,000rpm으로 원심분리하였다. 개별 샘플 상청액으로부터의 단백질을 SDS- PAGE로 분리하고, 전기영동으로 폴리 이불화비닐리덴막에 블롯하였다. 막을 5% 탈지유, 150mM의 NaCl 및 0.05%의 Tween 20(pH 7.5)를 함유한 TBST 완충액에서 실온 하에 1시간 블로킹한 후, 1차 항체로서 폴리크로날 토끼 항-stat3 항체 또는 토끼 항-인산화 stat3 항체, 또는 토끼 항 IL-6Rα 항체 중 어느 하나를 이용하고, 이어 2차 항체로서 HRP-컨쥬게이트된 항-토끼 IgG 항체와 함께 배양하였다. 자동현상기로 필름에 인화한 후에 α-이미저(Imager)로 정량화하였다.

결과:

(1) 하지 운동기능 평가

항IL-6 수용체 항체(MR16)를 투여한 척수손상 마우스 15마리와 상기 항체를 투여하지 않은 척수손상 마우스 15마리(대조)에 대해, BBB 스코어의 평균치를 그래프화한 것을 도 1에 나타내었다. 척수손상 후 7일 이후의 운동 회복은 MR16 항체를 투여한 마우스 군에서는 양호하여, 5주 및 6주에 유의차가 인정되었다.

(2) SCANET

항IL-6 수용체 항체(MRI6)를 투여한 척수손상 마우스 15마리와 상기 항체를 투여하지 않은 척수손상 마우스 15마리(대조)에 대해, 수평이동 및 기립운동의 회수를 비교한 결과, 수평이동에는 유의적인 차이가 없었지만, 기립운동은 항IL-6 수용체 항체(MRI6)를 투여한 척수손상 마우스 15마리 중 12마리에서 관찰되는 한편, 항체를 투여하지 않은 척수손상 마우스 15마리(대조) 중에서는 3마리만 관찰되었다. 이러한 차이는, 피셔의 정확 확률 검정(Fisher's exact probability test)으로 p ＜ 0.05에서 유의적이었다.

(3) 로타로드 트레드밀

항IL-6 수용체 항체(MRI6)를 투여한 척수손상 마우스 15마리와 상기 항체를 투여하지 않은 척수손상 마우스 15마리(대조)에 대해, 상기 방법으로 실험한 결과, 로드의 회전수가 10rpm(1분간 회전수 10회전) 및 15rpm의 경우에는 유의적인 차이를 볼 수 없었으나, 5rpm에서는 도 2에 도시된 바와 같이 척수손상 후 358일 이후 항IL-6 수용체 항체(MRI6)를 투여한 척수손상 마우스의 회복이 상기 항체를 투여하지 않은 척수손상 마우스(대조)에 비하여 유의적으로(p ＜ 0.05) 높았다.

(4) 면역조직화학 관찰

성체 척수에는 내재성(內在性) 신경간세포가 존재함에도 불구하고, 이 세포의 분화에 의하여 척수가 회복되지는 않았다. 그 이유로는, 손상된 척수 내에서는 내재성 신경간세포가 전구 신경교세포로, 또 성상세포로 분화되어 뉴런계의 세포로 분화되지 않기 때문이라고 예상된다. 상기 방법에 의해, 항IL-6 수용체 항체(MR16)를 투여한 척수손상 마우스 4마리의 손상부분의 척수와 상기 항체를 투여하지 않은 척수손상 마우스 4마리(대조)의 손상부분의 척수에 대하여, 항 GFAP 항체와 항 BrDU 항체를 이용한 면역형광법으로 반응성 성상세포의 형성을 계수한 결과 도 3에 도시된 바와 같이 상기 항체를 투여함으로써 반응성 성상세포의 형성이 유의적으로(p ＜ 0.01) 감소하였다.

(5) 웨스턴 블롯 분석

척수손상 마우스 4마리와, 척수손상되지 않은 마우스 4마리(대조)에 대해, 척수손상 후 12시간째에 IL-6 수용체의 발현을 웨스턴 블롯법으로 조사하였다. 결과를 도 4에 나타내었다. 척수손상 마우스에서만 IL-6 수용체의 발현이 있었다. 또한, 도 5에 도시된 바와 같이, MR16 투여에서는 인산화 STAT3의 양이 억제되어 있는바, 복강 내에 투여한 MR16이 척수에 작용한 것으로 나타난다.

이상과 같은 사실로부터, IL-6 수용체의 길항제가 척수손상의 회복을 촉진한다는 것이 확인되었다.

참고예 1. 인간 가용성 IL -6 수용체의 제조

야마자키 등의 방법(Yamasaki, K. et al., Science(1988) 241, 825-828)에 따라 얻어진 IL-6 수용체를 코드하는 cDNA를 함유한 플라스미드 pBSF2R.236을 이용하여 PCR법으로 가용성 IL-6 수용체를 제조하였다. 플라스미드 pBSF2R.236을 제한 효소 Sph I으로 소화시켜 IL-6 수용체 cDNA를 얻고, 이를 mp18(Amersham 제)에 삽입하였다. IL-6 수용체 cDNA에 정지 코돈을 도입하도록 디자인된 합성 올리고프라이머를 이용하여 인 비트로 돌연변이 유도 시스템(Amersham 제)에 의해 PCR법으로 IL-6 수용체 cDNA에 변이를 도입하였다. 이 조작에 의해 정지 코돈이 아미노산 345의 위치에 도입되어, 가용성 IL-6 수용체를 코드하는 cDNA가 얻어졌다.

가용성 IL-6 수용체 cDNA를 CHO 세포에서 발현시키기 위해, 플라스미드(plasmidd) pSV(Pharmacia 제)와 연결시켜 플라스미드 pSVL344를 얻었다. dhfr의 cDNA를 함유한 플라스미드 pECEdhfr에 Hind III-Sal I으로 절단한 가용성 IL-6 수용체 cDNA를 삽입하여 CHO 세포발현 플라스미드 pECEdhfr344를 얻었다.

10μg의 플라스미드 pECEdhfr344를 dhfr-CHO 세포주 DXB-ll(Urlaub, G. et al., Proc Nat1. Acad. Sci. USA(1980) 77, 4216-4220)에 칼슘포스페이트 침강법(Chen, C. et al., Mol. Cell. BioI.(1987) 7, 2745-2751)으로 트랜스펙트하였다. 이 트랜스펙트된 CHO 세포를 lmM 글루타민, 10% 투석 FCS, 100U/ml의 페니실린 및 100μg/ml의 스트렙토마이신을 함유한 뉴클레오시드를 함유하지 않은 αMEM 선택배양액에서 3주간 배양하였다.

선택된 CHO 세포를 한계희석법으로 스크리닝하여 단일의 CHO 세포 클론을 얻 었다. 이 CHO 세포 클론을 20nM ~ 200nM 농도의 메트트레키세이트에서 증폭시켜, 인간 가용성 IL-6 수용체 생산 CHO 세포주 5E27를 얻었다. 이 CHO 세포주 5E27를 5% FBS 함유 이스코브 변성 둘베코 배양액(IMDM, Gibco 제)에서 배양하였다. 배양상청을 회수하여, 배양상청 중의 가용성 IL-6 수용체의 농도를 ELISA에서 측정하였다. 그 결과, 배양상청 중에는 가용성 IL-6 수용체가 존재하는 것이 확인되었다.

참고예 2. 항인간 IL -6 항체의 제조

10μg의 조환형 IL-6(Hirano, T. et al., Immunol. Lett.(1988) 17, 41)을 프로인트 완전 보강제와 함께 BALB/c 마우스를 면역하여, 혈청 중에 항 IL-6 항체가 검출될 수 있을 때까지 일주일 마다 이를 계속하였다. 국부 림프절에서 면역세포를 적출하여, 폴리에틸렌 글리콜 1500을 써서 골수종 세포주 P3U1과 융합시켰다. 하이브리도마를 HAT 배양액를 이용하는 Oi 등의 방법(Selective Methods in Cellular Immunology, W.H.Freeman and Co., San Francisco, 351, 1980)에 따라 선택하여, 항인간 IL-6 항체를 생산하는 하이브리도마를 수립하였다.

항인간 IL-6 항체를 생산하는 하이브리도마는 다음과 같이 하여 IL-6 결합을 측정하였다. 즉, 유연한 폴리비닐제 96 웰 마이크로 플레이트(Dynatech Laboratories, Inc. 제, Alexandria, VA)를 O.1M의 탄산-탄산수소 완충액(pH 9.6) 중에서 100μl의 염소 항마우스 Ig(10μl/m1, Cooper Biomedical Inc 제 Malvern, PA)로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 다음, 플레이트를 100μ1의 1% 소혈청 알부민(BSA)을 함유한 PBS로 실온에서 2시간 처리하였다.

이를 PBS로 세정한 후, 100μl의 하이브리도마 배양상청을 각 웰에 가하여, 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 플레이트를 세정하고 2000 cpm/0.5ng/웰이 되도록 ¹²⁵I 표지조환형 IL-6을 각 웰마다 첨가하고 세정한 후 각 웰의 방사능 활성을 감마카운터(Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA)로 측정하였다. 216 하이브리도마 클론 중 32의 하이브리도마 클론이 IL-6 결합 측정에서 더 양성이었다, 이들 클론 중에서 최종적으로 안정된 MH166.BSF2가 얻어졌다. 당해 하이브리도마가 생산하는 항 IL-6 항체 MH166은 IgG1κ의 서브타입을 갖는다.

그 다음, IL-6 의존성 마우스 하이브리도마 클론 MH60.BSF2를 써서 MH166 항체에 의한 하이브리도마의 증식에 관한 중화활성을 조사하였다. MH60.BSF2 세포를 1 x 10⁴/200μl/웰이 되도록 나누어 넣고, 여기에 MH166 항체를 함유한 샘플을 가하여 48시간 배양하고, 0.5μCi/웰의 ³H 티미딘(New England Nuclear, Boston, MA)을 가한 후, 다시 6시간 배양을 계속하였다. 세포를 유리 필터 페이퍼 상에 올려놓고 자동 수확기(Labo Mash Science Co., Tokyo, Japan)로 처리하였다. 대조로는 토끼 항 IL-6 항체를 이용하였다.

그 결과, MH166 항체는 IL-6에 의해 유도되는 MH60.BSF2 세포의 ³H 티미딘의 수확을 용량의존적으로 저해하였다. 이에 의해, MH166 항체가 IL-6의 활성을 중화한다는 것이 분명해졌다.

참고예 3. 항인간 IL -6 수용체 항체의 제조

히라타 등의 방법(Hirata, Y. et a1. J. 1mmuno1.(1989) 143, 2900-2906)으 로 제조된 항IL-6 수용체 항체 MT18을 CNBr로 활성화시킨 세파로스 4B(Pharmacia Fine Chemicals 제, Piscataway, NJ)와 첨부된 처방에 따라 결합시켜 IL-6 수용체(Yamasaki, K. et a1., Science(1988) 241, 825-828)를 정제하였다. 인간 골수종 세포주 U266을 1% 디기토닌(Wako Chemicals 제), 10mM 트리에탄올 아민(pH 7.8) 및 0.15M NaCl을 함유한 1mM p-파라아미노페닐메탄술포닐플루오라이드하이드로클로라이드(Wako Chemicals 제)(디기토닌 완충액)에 가용화시켜 세파로스 4B 비드와 결합시킨 MT18 항체와 혼합하였다. 그 후, 비드를 디기토닌 완충액으로 6회 세정하여, 면역하기 위한 부분정제 IL-6 수용체로 하였다.

BALB/c 마우스를 3 x l0⁹ 개의 U266 세포로부터 얻은 상기 부분정제 IL-6 수용체로 10일 간격으로 4회 면역하고, 그 후 통상적인 방법으로 하이브리도마를 작성하였다. 성장 양성 웰로부터의 하이브리도마 배양상청은 아래의 방법으로 IL-6 수용체로의 결합활성을 조사하였다. 5 x 10⁷ 개의 U266 세포를 ³⁵S -메티오닌(2.5mCi)으로 표지하고, 상기 디기토닌 완충액으로 가용화하였다. 가용화된 U266 세포를 O.04ml 용량의 세파로스 4B 비드와 결합시킨 MT18 항체와 혼합한 후, 디기토닌 완충액으로 6회 세정하고, 0.25ml의 디기토닌 완충액(pH3.4)으로 ³⁵S -메티오닌 표지 IL-6 수용체를 유출시켜, 0.025ml의 1M Tris(pH 7.4)에서 중화시켰다.

0.05ml의 하이브리도마 배양상청을 O.Olml의 프로테인 G 세파로스(Phramacia 제)와 혼합하였다. 세정한 후, 세파로스를 위에서 조제한 0.005ml의 ³⁵S 표지 IL-6 수용체 용액과 함께 배양하였다. 면역침강물질을 SDS-PAGE로 분석해서 IL-6 수용체와 반응하는 하이브리도마 배양상청을 조사하였다. 그 결과, 반응 양성 하이브리도마 클론 PM-l(FERM BP-2998)를 수립하였다. 하이브리도마 PM-l로부터 생산되는 항체는 IgGlκ의 서브타입을 갖게 된다.

하이브리도마 PM-l이 생산하는 항체의 인간 IL-6 수용체에 대한 IL-6의 결합저해활성을 인간 골수종 세포주 U266을 써서 조사하였다. 인간 조환형 IL-6을 대장균으로부터 조제하고(Hirano, T. et al., 1mmunol. Lett.(1988) 17, 41-45), 볼튼한타 시약(New England Nuclear, Boston, MA)으로 ¹²⁵I 표지를 하였다(Taga, T. et al., J. Exp. Med.(1987) 166, 967-981).

4 x l0⁵개의 U266 세포를 1시간동안 70%(v/v)의 하이브리도마 PM-1의 배양상청 및 14000cpm의 ¹²⁵I 표지 IL-6과 함께 배양하였다. 70μl의 샘플을 400μl의 마이크로퓨지폴리에틸렌 튜브에 300μl의 FCS 상에 중층(重層)하고 원심분리한 후 세포 상의 방사능 활성을 측정하였다.

그 결과, 하이브리도마 PM-1이 생산하는 항체는 IL-6의 IL-6 수용체에 대한 결합을 저해한다는 것이 분명해졌다.

참고예 4. 항마우스 IL -6 수용체 항체의 제조

Saito, T. et a1., J. Immuno1.(1991) 147, 168-173에 기재된 방법으로 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로날 항체를 제조하였다.

마우스 가용성 IL-6 수용체를 생산하는 CHO 세포를 10% FCS를 포함한 IMDM 배양액에서 배양하여, 그 배양상청에서 항마우스 IL-6 수용체 항체 RS12(상기 Saito, T. et a1 참조)를 Affige1 10 겔(Biorad 제)에 고정시킨 어피니티 컬럼을 사용하여 마우스 가용성 IL-6 수용체를 정제하였다.

얻어진 마우스 가용성 IL-6 수용체 50μg을 프로인트 완전 보강제와 혼합하여 위스타 래트의 복부에 주사하였다. 2주일 후부터는 프로인트 불완전 보강제로 추가면역하였다. 45일째에 래트 비장세포를 채취하여, 2 x l0⁸ 개를 1 x 10⁷ 개의 마우스 골수종세포 P3U1과 50%의 PEG1500(Boehringer Mannheim 제)를 가지고 통상적인 방법으로 세포융합시킨 후, HAT 배지에서 하이브리도마를 스크리닝하였다.

토끼 항래트 IgG 항체(Cappel 제)를 코팅한 플레이트에 하이브리도마 배양상청을 가한 후, 마우스 가용성 IL-6 수용체를 반응시켰다. 다음, 토끼 항마우스 IL-6 수용체 항체 및 알칼리 포스파타제 표지 양 항토끼 IgG에 의한 ELISA법으로 마우스 가용성 IL-6 수용체에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마를 스크리닝하였다. 항체의 생산이 확인된 하이브리도마 클론은 2회의 서브 스크리닝을 실행하여, 단일의 하이브리도마 클론을 얻었다. 클론을 MR16-1이라고 명명하였다.

이 하이브리도마가 생산하는 항체의 마우스 IL-6의 정보전달에 있어서의 중화활성을 MH60.BSF2 세포(Matsuda, T. et a1., J. Immunol(1988) 18, 951-956)를 사용한 ³H 티미딘을 수확하여 조사하였다. 96 웰 프레이트에 MH60.BSF2 세포를 1 x 10⁴ 개/200μ1/웰이 되도록 조제하였다. 이 플레이트에 10pg/ml의 마우스 IL-6과 MR16-1 항체 또는 RS12 항체를 12.3 ~ 1000ng/ml 가하여 37℃, 5%CO₂에서 44시간 배양한 후, 1μCi/웰의 ³H 티미딘을 가하였다. 4시간 후에 ³H 티미딘의 수확을 측정하였다. 그 결과, MR16-1 항체는 MH60.BSF2 세포의 ³H 티미딘의 수확을 억제하였다.

따라서, 하이브리도마 MR16-1(FERM BP-5875)이 생산하는 항체는 IL-6의 IL-6 수용체에 대한 결합을 저해하는 것이 분명해졌다.

Claims

인터루킨-6(IL-6) 길항제를 유효성분으로 함유하여 이루어지는 척수손상 치료제.
제1항에 있어서, 상기 IL-6 길항제가 IL-6 수용체에 대한 항체인 척수손상 치료제.
제2항에 있어서, 상기 항체가 모노크로날 항체인 척수손상 치료제.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 항체가 인간 IL-6 수용체에 대한 모노크로날 항체인 척수손상 치료제.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 항체가 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로날 항체인 척수손상 치료제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 조환형 항체인 척수손상 치료제.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 IL-6 수용체에 대한 모노크로날 항체가 PM-1 항체인 척수손상 치료제.
제5항에 있어서, 상기 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로날 항체가 MR16-1항체인 척수손상 치료제.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IL-6 수용체에 대한 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간항체인 척수손상 치료제.
제9항에 있어서, 상기 인간화 항체가 인간화 PM-1 항체인 척수손상 치료제.
인터루킨-6(IL-6) 길항제를 유효성분으로 함유하여 이루어지는 신경간세포의 분화조절제.
인터루킨-6(IL-6) 길항제를 유효성분으로 함유하여 이루어지는 신경교세포로의 분화억제제.
척수손상 치료제를 제조하기 위한 인터루킨-6(IL-6) 길항제의 용도.
제13항에 있어서, 상기 IL-6 길항제가 IL-6 수용체에 대한 항체인 IL-6 길항제의 용도.
제14항에 있어서, 상기 항체가 모노크로날 항체인 IL-6 길항제의 용도.
제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 항체가 인간 IL-6 수용체에 대한 모노크로날 항체인 IL-6 길항제의 용도.
제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 항체가 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로날 항체인 IL-6 길항제의 용도.
제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 조환형 항체인 IL-6 길항제의 용도.
제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 IL-6 수용체에 대한 모노크로날 항체가 PM-1 항체인 IL-6 길항제의 용도.
제17항에 있어서, 상기 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로날 항체가 MR16-1 항체인 IL-6 길항제의 용도.
제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IL-6 수용체에 대한 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간항체인 IL-6 길항제의 용도.
제21항에 있어서, 상기 인간화 항체가 인간화 PM-1 항체인 IL-6 길항제의 용도.
신경간세포의 분화조절제를 제조하기 위한 인터루킨-6(IL-6) 길항제의 인터루킨-6(IL-6) 길항제의 용도.
신경교세포로의 분화억제제를 제조하기 위한 인터루킨-6(IL-6) 길항제의 용도.
인터루킨-6(IL-6) 길항제를 대상으로 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 척수손상 치료방법.
제25항에 있어서, 상기 IL-6 길항제가 IL-6 수용체에 대한 항체인 척수손상 치료방법.
제26항에 있어서, 상기 항체가 모노크로날 항체인 척수손상 치료방법.
제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 항체가 인간 IL-6 수용체에 대한 모노크로날 항체인 척수손상 치료방법.
제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 항체가 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로날 항체인 척수손상 치료방법.
제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 조환형 항체인 척수손상 치료방법.
제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 IL-6 수용체에 대한 모노크로날 항체가 PM-1 항체인 척수손상 치료방법.
제29항에 있어서, 상기 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노크로날 항체가 MR16-1 항체인 척수손상 치료방법.
제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IL-6 수용체에 대한 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간항체인 척수손상 치료방법.
제33항에 있어서, 상기 인간화 항체가 인간화 PM-l 항체인 척수손상 치료방법.
인터루킨-6(IL-6) 길항제를 대상으로 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 신 경간세포의 분화조절방법.
인터루킨-6(IL-6) 길항제를 대상으로 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 신경교세포로의 분화억제방법.