CN1753694A - 含有白介素6拮抗剂的脊髓损伤治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种以白介素6拮抗剂为有效成分的脊髓损伤治疗剂、神经干细胞的分化调节剂和向神经胶质细胞分化的分化抑制剂。

Description

含有白介素6拮抗剂的脊髓损伤治疗剂
技术领域
本发明涉及含有以白介素6(interleukin-6，IL-6)拮抗剂为有效成分的脊髓损伤治疗剂。
背景技术
在现代社会，交通事故、跌落·摔倒、运动中的事故等，脊髓受损伤的机会很多，据说在日本，每年受伤者达到了5000人，累积患者数达到10万人。脊髓损伤的症状是永久性的，如四肢运动知觉麻痹、膀胱·直肠障碍、呼吸障碍等非常严重，作为日常性护理要进行恢复护理、呼吸管理、褥疮预防、排便·排尿护理等。
根本不存在脊髓损伤治疗方法，只有包括手术在内的局部稳定等处置性疗法。以预防症状恶化为目的，大量给予甾体，不能得到对恢复麻痹有效的效果。多数脊髓损伤是由外部的机械性作用造成的损伤(一次损伤)开始，经过体内的反应路径发展到进一步的组织破坏(二次损伤)。用于抑制这种两次损伤发展所使用的唯一药物是甲基脱氢强的松，需要大量投入近10000mg该药物。但是，据报道这种方法具有糖尿病急性恶化或肺炎等副作用。
在19世纪之初，自从神经解剖学的巨匠Ramony Cajal在所著书中论述指出“如果成体哺乳类的中枢神经系统(脑和脊髓)一旦受到损伤，将不能再生”以来，这种说法受到长期的信奉。可是，进入19世纪80年代，报告指出针对脊髓损伤的末梢神经(A.Aguayo等人，J.Exp.Bilo.95：231-240，1981)、胎儿脊髓移植(Bregman B.S.，Dev.Brain Res.，34：265-279，1987)，即使在脊髓损伤后，如果能够在损伤部位导入适当的环境，能看到损伤轴索的再生。而且还有神经营养因子促进损伤轴索的再生(Cai，D.等人，Neuron，22：89-101，1999)或确认脊索生长阻断因子(Chen，D.等人，Nature，403：434-439，2000)等多个于脊髓再生相关的报道，使损伤脊髓的再生成为可能。可是，因为胎儿脊髓移植存在损献者不足和伦理等问题，临床应用极其困难。
还有，神经干细胞(Neural stem cell)是能够反复增殖传代(自我复制能力)的同时，还能生成神经元、星形胶质细胞和寡突胶质细胞这3种构成中枢神经系统的细胞(多分化能力)的未分化的神经细胞，因为也存在于成体脊髓中，所以假想能够修复损伤后的组织。可是，实际上，在损伤后它们并未分化成神经元，而是全部分化成胶质细胞，最终形成瘢痕。
时常可以看到关于神经干细胞的分化诱导的细胞因子的报道。Weiss等人报道指出用BDNF(brain-derived neurotrophic factor)能促进来自胎儿小鼠线粒体的神经干细胞向神经元分化(Ahmed，S.等人，J.Neurosci.，150：5765-57781995)。还有，据报道，Ghosh等人用NT-3(Neurotrophin-3)促进了来自胎儿大鼠大脑皮肤的神经干细胞向神经元分化(Ghosh，A.等人，Neuron 15：89-1031995)。Mckay等人有创见性地(instructive)将来自胎儿大鼠海马层的神经干细胞用PDNF(Platelet-derived neurotrophic factor)诱导向神经元分化，用CNTF(Ciliary neutrophic factor)诱导向星形胶质细胞分化，用甲状腺激素(T3)诱导向寡突胶质细胞分化(J one，K.等人，Gene&Dev.10：3129-3140 1996)。
还有，近年，据多贺等人报告，用LIF(Leukemia inhibitoryfactor)和BMP-2(Bone morphogenic protein-2)能促进来自胎儿小鼠神经上皮细胞的神经干细胞向星形胶质细胞分化(Nakashima，K.等人，Science，284：479-482，1999)。这些报告的共同点是CNTF、LIF等都属于IL-6亚家族。即，认为是通过细胞因子受体亚单位gp130的信号将神经干细胞向星形胶质细胞进行分化诱导。
不过，未见有证明通过细胞因子分化诱导神经干细胞可以恢复脊髓损伤的文献。
IL-6是B细胞刺激因子2(BSF2)或又称之为β2干扰素的细胞因子。IL-6是作为和B淋巴细胞的激活相关的分化因子被人发现的(Hirano，T.等人，Nature(1986)324，73-76)。之后又被证明是对多种细胞功能产生影响的有功能性细胞因子(Akira，S.等人，Adv.in Immunology(1993)54，1-78)。据报道IL-6能够诱导T淋巴细胞的成熟(Lotz，M.等人，J.Exp.Med.(1988)167，1253-1258)。
IL-6在细胞上通过两种蛋白质传递其生物学活性。一种是IL-6结合的分子量大约80kD的配体结合性蛋白质的IL-6受体(Taga，T.等人，J.Exp.Med.(1987)166，967-981，Yamasaki，K.等人，Science(1987)241，825-828)。IL-6受体除了贯通细胞膜，表达在细胞膜上以膜结合型存在之外，主要以由细胞外区域构成的可溶性IL-6受体的形式存在。
另外一种是非配体结合性的信号传导中的分子量约130kD的膜蛋白质gp130。IL-6和IL-6受体形成IL-6/IL-6受体复合物，然后通过和gp130结合，将IL-6的生物学活性传递到细胞内(Taga，T.等人，Cell(1989)58，573-581)。
IL-6拮抗剂是能够阻碍IL-6的生物学活性传递的物质。至今已知有：针对IL-6的抗体(抗IL-6抗体)、针对IL-6受体的抗体(抗IL-6受体抗体)、针对gp130的抗体(抗gp130抗体)、IL-6突变体、IL-6或IL-6受体的部分肽等。
关于抗IL-6受体抗体有几篇报道(Novick，D.等人，Hybridoma(1991)10，137-146、Huang Y.W.等人，Hybridoma(1993)12，621-630，国际专利申请公开号WO 95/09873、法国专利申请公开号FR 2694767、美国专利号US 521628)。已知通过向其中之一的小鼠抗体PM-1(Hirata，Y.等人，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)的互补性决定区域(CDR，complementarity determining region)移植人抗体得到的人源化的PM-1抗体(国际专利申请公开号WO 92/19759)。
专利文献1：WO 95/09873
专利文献2：FR 2694767
专利文献3：USP 0521628
非专利文献1：A.Aguayo等人，J.Exp.Bilo.95：231-240，1981
非专利文献2：Bregman B.S.，Dev.Brain Res.，34：265-279，1987
非专利文献3：Cai，D.等人，Neuron，22：89-101，1999
非专利文献4：Chen，D.等人，Nature，403：434-439，2000
非专利文献5：Ahmed，S.等人，J.Neurosci.，150：5765-5778，1995
非专利文献6：Ghosh，A.等人，Neuron 15：89-103，1995
非专利文献7：Jone，K等人，Gene&Dev.10：3129-3140，1996
非专利文献8：Nakashima，K.等人，Science，284：479-482，1999
非专利文献9：Hirano，T.等人，Nature(1986)324，73-76
非专利文献10：Akira，S.等人，Adv.in Immunology(1993)54，1-78
非专利文献11：Lotz，M.等人，J.Exp.Med.(1988)167，1253-1258
非专利文献12：Taga，T.等人，Cell(1989)58，573-581
非专利文献13：Yamasaki，K.等人，Science(1987)241，825-828
非专利文献14：Novick，D.等人，Hybridoma(1991)10，137-146
非专利文献15：Huang，Y.等人，Hybridoma(1993)12，621-630
非专利文献16：Hirata，Y.等人，J.Immunol(1989)143，2900-2906
发明内容
本发明不仅预防脊髓损伤其症状的恶化，还希望获得使之恢复的治疗手段，本发明提供有用的药物组成物作为该手段。
本发明人等为了解决上述课题，进行了各种研究，结果发现针对IL-6的拮抗剂，例如：针对IL-6受体的抗体具有恢复脊髓损伤的作用。所以，本发明提供了含有以白介素6(IL-6)拮抗剂为有效成分的脊髓损伤治疗剂。
本发明还提供了含有以白介素6(IL-6)拮抗剂为有效成分的神经干细胞分化调节剂。
本发明另外提供了含有以白介素6(IL-6)拮抗剂为有效成分的抑制向神经胶质细胞分化的分化抑制剂。
作为上述的IL-6拮抗剂，优选针对IL-6受体的抗体，特别优选单克隆抗体。该单克隆抗体，可列举：针对人IL-6受体的单克隆抗体以及针对小鼠IL-6受体的单克隆抗体。上述针对人IL-6受体的单克隆抗体的具体例子，可列举PM-1抗体，作为针对小鼠IL-6受体的单克隆抗体，可列举MR16-1抗体。作为针对IL-6受体的抗体，还可以列举：从产生单克隆抗体的杂交瘤中克隆的基因人为地操作得到的重组型抗体，例如：嵌和抗体、人源化抗体等。
附图说明
图1表示在下肢运动功能评价中，与未给予抗IL-6受体抗体(MR16)的脊髓损伤的小鼠(对照)相比，在给予上述抗体的脊髓损伤的小鼠中，脊髓损伤后运动的恢复很大。
图2表示在转棒仪旋转试验中，与未给予抗IL-6受体抗体(MR16)的脊髓损伤的小鼠(对照)相比，在给予上述抗体的脊髓损伤的小鼠中，脊髓损伤后运动强度的恢复很大。
图3表示与未给予抗IL-6受体抗体(MR16)的脊髓损伤的小鼠(对照)相比，给予上述抗体的脊髓损伤的小鼠脊髓损伤部位的神经胶质细胞的形成受到抑制。
图4表示与脊髓未损伤(シヤム)的小鼠相比，在脊髓受到损伤的小鼠的脊髓损伤部位，IL-6受体进行表达。
图5表示通过给予抗IL-6受体抗体(MRA)，实际上使脊髓损伤部位的IL-6信号级联受到抑制的磷酸化STAT3的western blot图。
具体实施方式
在本发明中使用的IL-6拮抗剂不论其来源、种类和形状，只要能表现出脊髓损伤的治疗效果即可。
IL-6拮抗剂是通过阻断经由IL-6的信号传递，阻碍IL-6的生物学活性的物质。IL-6拮抗剂优选对IL-6、IL-6受体以及gp130中任何一个的结合具有阻碍作用的物质。作为IL-6拮抗剂，可列举：抗IL-6抗体、抗IL-6受体抗体、抗gp130抗体、IL-6突变体、可溶性IL-6受体突变体或IL-6或IL-6受体的部分肽以及具有和这些物质同样活性的低分子物质。
可以用公知的手段作为多克隆抗体或单克隆抗体得到本发明中使用的抗IL-6抗体。本发明所使用的抗IL-6抗体特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。来自哺乳动物的单克隆抗体包括杂交瘤产生的抗体以及用基因工程方法将含抗体基因的表达载体转化到宿主中产生的抗体。这种抗体通过和IL-6结合，阻碍IL-6向IL-6受体结合，阻断IL-6的生物学活性向细胞内传递。
作为这种抗体，可列举：MH166(Matsuda，T.等人，Eur.J.Immunol.(1988)18，951-956)或SK2抗体(Sato，K.等人，第21次日本免疫学会总会、学术记录(1991)21，166)等。
基本上可以使用公知技术，按照下述方法制备产生抗IL-6抗体的杂交瘤。即，用IL-6作为致敏原，将其按照通常的免疫方法进行免疫，将得到的免疫细胞通过常规的细胞融合方法和公知的亲本细胞融合，按照通常的筛选方法，通过筛选制备产生单克隆抗体的细胞。
具体而言，可按照下面方法制备抗IL-6抗体。例如：可以用Eur.J.Biochem(1987)168，543-550，J.Immunol(1998)140，1534-1541或Agi.Biol.Chem.(1990)54，2685-2688中公开的IL-6基因/氨基酸序列得到作为获得抗体的致敏原而使用的人的IL-6。
将IL-6基因序列插入到公知的表达载体系统中，转化到适当的宿主细胞中后，用公知的方法纯化该宿主细胞中的或培养上清中的IL-6蛋白质，可将该纯化的IL-6蛋白质作为致敏原使用。还有，也可以将IL-6蛋白质和其它蛋白质的融合蛋白作为致敏原使用。
可以用公知的手段得到作为多克隆抗体或单克隆抗体的在本发明中使用的抗IL-6受体抗体。本发明中使用的抗IL-6受体抗体特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。来自哺乳动物的单克隆抗体是由杂交瘤产生的，以及用基因工程方法将含有抗体基因的载体转化到宿主中产生的。该抗体通过和IL-6受体结合，阻碍IL-6向IL-6受体结合，阻断IL-6的生物学活性向细胞内传递。
作为这种抗体，可列举MR16-1抗体(Tamura，T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90，11924-11928)、PM-1抗体(Hirata，Y.等人，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)、AUK12-20抗体、AUK64-7抗体或AUK146-15抗体(国际专利申请公开号WO92/19759)等。这些抗体中，特别优选用PM-1作为抗体。
还有，产生PM-1抗体的杂交瘤细胞株作为PM-1，按照布达佩斯条约在1989年7月12日，作为FERM BP-2998向独立行政法人产业技术综合研究所专利生物寄存中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)进行国际寄存。Rat-mouse hybridoma MR16-1，按照布达佩斯条约在1997年3月13日，作为FERM BP-5875向独立行政法人产业技术综合研究所专利生物寄存中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)进行国际寄存。
基本上使用公知的技术按照下述方法制备产生抗IL-6受体单克隆抗体的杂交瘤。即，用IL-6受体作为致敏原，将其按照通常的免疫方法进行免疫，将得到的免疫细胞按照常规的细胞融合方法和公知的亲本细胞融合，用通常的筛选方法，通过筛选制备得到产生单克隆抗体的细胞。
具体而言，可以按照下述方法制备抗IL-6受体抗体。例如用欧洲专利申请公开号EP 325474中公布的IL-6受体基因/氨基酸序列可以得到作为获得抗体的致敏原使用的人IL-6受体抗体，用日本专利申请公开号特开平3-155795中公布的IL-6受体基因/氨基酸序列可以得到小鼠抗IL-6受体抗体。
IL-6受体蛋白质有在细胞膜上表达的和从膜上脱落的(可溶性IL-6受体)(Yasukawa，K.等人，J.Biochem.(1990)108，673-676)2种。可溶性IL-6受体实质上是由结合在细胞膜上的IL-6受体的细胞外区域构成的，从缺失细胞膜贯通区域或缺失细胞膜贯通区域和细胞内区域这点出发，它和膜结合型IL-6受体不同。IL-6受体蛋白质，在本发明中只要能作为制备抗IL-6受体抗体的致敏原使用，可以使用任何一种IL-6受体。
将IL-6受体的基因序列插入到公知的表达载体系统中，转化到适当的宿主细胞中后，用公知的方法纯化该宿主细胞中的或培养上清中的IL-6受体蛋白质，可将该纯化的IL-6蛋白质作为致敏原使用。还有，也可将IL-6受体蛋白质和其它蛋白质的融合蛋白作为致敏原使用。
在平成元年(1989年)1月9日，将含有包含编码人IL-6受体的cDNA的质粒pIBIBSF2R的大肠杆菌(E.coli)按照布达佩斯条约作为HB101-pIBIBSF2R，寄存编号FERM BP-2232向独立行政法人产业技术综合研究所专利生物寄存中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)进行国际寄存。
可以用公知的手段作为多克隆抗体或单克隆抗体得到本发明中使用的gp130抗体。本发明中使用的抗gp130抗体特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。来自哺乳动物的单克隆抗体是由杂交瘤产生的，以及通过基因工程方法将含有抗体基因的载体转化到宿主中产生的。该抗体通过和gp130结合，阻碍IL-6/IL-6受体复合物向gp130的结合，阻断IL-6的生物学活性向细胞内传递。
作为这种抗体，可列举：AM64抗体(特开平3-219894)、4B11抗体以及2H4抗体(US 5571513)、B-S12抗体以及B-P8(特开平8-291199)等。
基本上使用公知的技术按照下述方法制备产生抗gp130单克隆抗体的杂交瘤。即，用gp130作为致敏原，将其按照通常的免疫方法进行免疫，将得到的免疫细胞用常规的细胞融合方法和公知的亲本细胞融合，根据通常的筛选方法，通过筛选制备产生单克隆抗体的细胞。
具体而言，可以按照下述方法制备单克隆抗体。例如用欧洲专利申请公开号EP 411946中公布的gp130基因/氨基酸序列可以得到作为获得抗体的致敏原使用的gp130。
将gp130的基因序列插入到公知的表达载体系统中，转化到适当的宿主细胞中后，用公知的方法纯化该宿主细胞中的或培养上清中的gp130蛋白质，可以将该纯化的gp130蛋白质作为致敏原使用。还有，也可以将表达gp130的细胞或者gp130蛋白质和其它蛋白质的融合蛋白作为致敏原使用。
作为用致敏原免疫的哺乳动物，没有特定的限制，优选选择考虑到和细胞融合中使用的亲本细胞的适合性，一般使用啮齿类动物，例如：小鼠、大鼠、仓鼠等。
可以按照公知的方法用致敏原免疫动物。例如：可以用将致敏原注射到哺乳动物的腹腔中或皮下的一般性方法。具体而言，用PBS(Phosphate-Buffered Saline)或者生理盐水等将致敏原稀释到适当量，按照希望优选将悬浊物和通常的佐剂，例如：弗氏完全佐剂适量混合，乳化后，每4-12天对哺乳动物数次给药，还有，可以在致敏原免役时，使用适当的载体。
经过如此免疫，确认血清中希望的抗体水平上升后，从哺乳动物中取出免疫细胞，进行细胞融合。进行细胞融合的特别优选的免疫细胞是脾细胞。
和上述免疫细胞融合的另外的亲本细胞是哺乳动物的骨髓瘤细胞，已有公知的多种细胞株，例如适于使用：P3X63Ag8.653(Kearney，J.F.等人，J.Immnol.(1979)123，1548-1550)、P3X63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology andImmunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler.G.and Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.等人，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.等人，Nature(1978)276，269-270)、F0(de St.Groth，S.F.等人，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.等人，Nature(1979)277，131-133)等。
可以基本上按照公知的方法，如：按照Milstein等人的方法(Kohler.G.and Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)等进行上述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合。
更具体而言，例如，可以在细胞融合促进剂存在的情况下，在常规的营养培养液中进行上述细胞融合。作为融合促进剂，例如使用：聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，如果希望提高融合效率可以添加使用二甲亚砜等辅助剂。
免疫细胞和骨髓瘤细胞的使用比例，例如：相对骨髓瘤细胞，优选免疫细胞达到1～10倍。作为上述细胞融合所用的培养液，例如：适合上述骨髓瘤的增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液，此外，可以使用培养这种细胞培养的常规培养液，还有，还可以并用胎牛血清(FCS)等血清添加剂。
细胞融合可将特定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液混合，将预先加热到37℃的PEG溶液，例如：通常为平均分子量1000～6000左右的PEG溶液，按照30～60％(w/v)的浓度添加、混合，形成目的的融合细胞(杂交瘤)。然后，依次添加适当的培养液、重复离心、去除上清操作，去除对杂交瘤生长不利的细胞融合剂等。
该杂交瘤用通常的选择培养液，例如：用HAT培养液(含有次黄嘌、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷)培养进行选择。在该HAT培养液中培养为了达到使杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的目的，持续进行充分长的时间，通常为数天～数周。然后，实施常规的极限稀释法，筛选和克隆产生目的的抗体的杂交瘤。
还有，除了用抗原免疫人以外的动物得到上述杂交瘤之外，在体外用目的的抗原蛋白质或抗原表达细胞致敏人淋巴细胞，将致敏的B淋巴细胞和人骨髓瘤细胞如：U266融合，得到对目的的抗原或抗原表达细胞具有结合活性的目的的人抗体(参见特公平1-59878)。还有，将抗原或抗原表达细胞给予具有人抗体基因文库(レパ一トリ一)的转基因动物，按照上述的方法也可以得到目的的人抗体(参见国际专利申请号WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735)。
这样制备得到的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在常规的培养液中传代培养，或在液氮中长期保存。
为了从该杂交瘤得到单克隆抗体，按照常规方法培养该杂交瘤，采用得到其上清的方法，或将该杂交瘤给予到与之相适应的哺乳动物中，使之增殖，得到其腹水的方法等。前种方法适于得到高纯度的抗体，另外后面的方法适合于抗体的大量生产。
例如：可以按照特开平3-139293所公开的方法制备产生抗IL-6受体抗体的杂交瘤。
可以用下述方法制备抗体，将在平成元年(1989年)7月12日按照布达佩斯条约作为FERM BP-2998国际寄存在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物寄存中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)的PM-1产生抗体杂交瘤注入到BALB/c小鼠腹腔内，得到腹水，从该腹水中纯化PM-1的方法，或者用下述方法，将该杂交瘤在适当的培养基，例如：含有10％胎牛血清、5％BM-Condimed H1(BoehringerMannheim制造)的RPMI1640培养基、杂交瘤SFM培养基(GIBCO-BRL制造)、PFHM-II培养基(GIBCO-BRL制造)等中培养，从其上清中纯化PM-1抗体。
在本发明中，作为单克隆抗体，可以使用从杂交瘤中克隆抗体基因，重组到适当的载体中，将其导入到宿主中，用基因重组技术产生的重组型抗体(例如：参见Borrebaeck C.A.K.and LarrickJ.W.THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，Published in the UnitedKingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。
具体而言，从产生目的的抗体的细胞，例如：杂交瘤细胞中分离编码抗体可变(V)区域的mRNA。用公知的方法分离mRNA，如：用胍超速离心法(Chirgwin，J.M等人，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC 法(Chomczynski.P.等人，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等制备总RNA，使用mRNAPurification Kit(Pharmacia制造)等制备mRNA。还有，可以用QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia制造)直接制备mRNA。
用逆转录酶从得到的mRNA合成抗体V区域的cDNA。可以用AMVReverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等合成cDNA。还有，可以使用5’-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech制造)以及采用PCR的5’-RACE法(Frohman，M.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.等人，Nucleic AcidsRes.(1989)17，2929-2932)进行cDNA的合成和扩增。从得到的PCR产物中纯化目的的DNA片断，与载体DNA连接。还有，由此制备重组载体，导入到大肠杆菌等中，选择克隆，制备目的的重组载体。用公知的方法如：双脱氧法确认目的的DNA的碱基序列。
如果得到编码目的的抗体V区域的DNA，将其与编码目的抗体恒定区域(C区域)的DNA连接，重组到表达载体中。另外也可以将编码抗体V区域的DNA和含有抗体C区域的表达载体重组。
在本发明中使用的抗体制造中，为了表达后述的抗体基因，将表达控制区域，例如：启动子、增强子的控制元件重组到表达载体中。然后，将该表达载体转化到宿主细胞中，使抗体表达。
在本发明中，可以使用以降低其对人的异种抗原性为目的的人为地改变的基因重组型抗体，例如：嵌和(Chimeric)抗体、人源化(Humanized)抗体、人抗体。可以用已知的方法制造这些改型抗体。
将如前述所示得到的编码抗体V区域的DNA和编码人抗体C区域的DNA连接，将其重组到表达载体中，导入到宿主中，使之产生得到嵌和抗体(参见欧洲专利申请公开号EP 125023、国际专利申请公开号WO 92/19759)。用该已知的方法，可以得到本发明中有用的嵌和抗体。
例如：含有编码嵌和抗体PM-1抗体的L链以及H链的V区载的DNA的质粒，分别命名为pPM-k3和pPM-h1，将具有该质粒的大肠杆菌在1991年2月12日根据布达佩斯条约分别作为NCIMB40366和NCIMB40362在国立工业和海洋微生物保藏有限公司(大不列颠和北爱尔兰联合王国Scotland Aberdeen AB2 1RY Macher Drive大街23)进行国际寄存。
人源化抗体又称为重构(reshaped)人抗体，是将人以外的哺乳动物，例如：小鼠抗体的互补决定区域(CDR)移植到人抗体的互补决定区域中。其常规的基因重组方法也是已知的(参见欧洲专利申请公开号EP 125023、国际专利申请公开号WO 92/19759)。
具体而言，为了使小鼠抗体的CDR和人抗体的框架区域(FR：Framework region)连接，使所设计的DNA序列的末端部分含有交叠(overlap)，以PCR法用制备成这样的多个寡核苷酸进行合成，将得到的DNA和编码人抗体C区域的DNA连接，然后，重组到表达载体中，将其导入到宿主中使之产生目的的抗体(参见欧洲专利申请公开号EP239400，国际专利申请公开号WO 92/19759)。
需要选择互补决定区域能形成良好的抗原结合部位的通过CDR连接的人抗体的FR。根据需要，为了使重构人抗体的互补决定区域形成适合的抗原结合部位，也可以置换抗体可变区域的框架区域的氨基酸(Sato，K.等人，Cancer Res.(1993)53，851-856)。
嵌和抗体、人源化抗体使用人抗体C区域。作为人抗体C区域，举例如Cγ，可以使用如：Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4。还有，为了改善抗体或其产生的稳定性，也可以修饰人抗体C区域。
嵌和抗体由来自人以外的哺乳动物的抗体可变区域和来自人抗体的C区域构成，人源化抗体由来自人以外哺乳动物的抗体的互补决定区域和来自人抗体的框架区域以及C区域构成，因为在人体中抗原性低，所以作为本发明中使用的抗体。
作为在本发明中使用的人源化抗体的优选例，可举人源化PM-1抗体(参见国际专利申请公开号WO 92/19759)。
还有，作为人抗体的的取得方法，除了前面所述的方法之外，已知有用人抗体库，通过筛选得到人抗体的技术。例如：人抗体的可变区域作为单链抗体(scFv)，通过噬菌体展示法，使之表达在噬菌体的表面，选择和抗原结合的噬菌体。解析选择得到的噬菌体的基因，确定编码与抗原结合的人抗体的可变区域的DNA序列。如果明确了与抗原结合的scFv的DNA序列，将该序列制备成适当的表达载体，可以得到人抗体。这种方法是公知的方法，可以参见WO 92/01047、WO92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438、WO 95/15388。
如上所述构建的抗体基因，可以通过公知的方法使之表达，得到抗体。当是哺乳类细胞时，可以用功能性地结合了常用的有用的启动子、要表达的抗体基因、其3’侧下游的polyA信号的DNA或含有上述序列的载体进行表达。例如：作为启动子/增强子，可以列举：人巨细胞病毒近早期启动子/增强子(human cytomegalovirus immediateearly promoter/enhancer)。
此外，在本发明中使用的其它抗体表达中能够使用的启动子/增强子可以是反转录病毒、多面体病毒、腺病毒、猴空泡病毒40(SV40)等病毒启动子/增强子或人延长因子1α(HEF1α)等来自哺乳类动物的启动子/增强子。
例如：使用SV40启动子/增强子时，按照Mulligan等人的方法(Mulligan.R.C.等人，Nature(1979)277，108-114)，还有，在使用HEF1α启动子/增强子时，按照Mizushima等人的方法(Mizushima，S.and Nagata，S.Nucleic Acids Res.(1990)18，5322容易实施。
大肠杆菌时，可将常用的有用的启动子、使抗体分泌的信号序列、所表达的抗体基因功能性地结合，并使之表达。例如：作为启动子，可以使用LacZ启动子、araB启动子。使用lacZ启动子时，按照Ward等人的方法(Ward，E.S。等人，Nature(1989)341，544-546；Ward，E.S.等人，FASEB J.(1992)6，2422-2427)，使用araB启动子时，按照Better等人的方法(Better，M.等人，Science(1988)240，1041-1043)。
作为用于抗体分泌的信号序列，在大肠杆菌的周质腔中产生时，可以使用pelB信号序列(Lei，S.P.等人，J.Bacterilol.(1987)169，4379-4383)。分离在周质腔中产生的抗体后，可以适当地使抗体的结构折叠(refold)(例如：参见WO96/30394)。
作为复制起点，可以使用SV40、多面体病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等来源的物质。还有，为了使在宿主细胞系中的基因拷贝数扩增，表达载体可以含有磷酸转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择性标记。
为了制造在本发明中使用的抗体，可以使用任意的生产系统。用于抗体制造的生产系统有体外(in vitro)和体内(in vivo)生产系统。作为体外的生产系统，可以使用真核细胞的生产系统或使用原核细胞的生产系统。
使用真核细胞时，可用动物细胞、植物细胞或真菌细胞作为生产系统。作为动物细胞已知有(1)哺乳类细胞，例如：CHO、COS、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Vero等，(2)两栖类细胞，例如：非洲爪蟾卵母细胞或(3)昆虫细胞，例如：sf9、sf21、Tn5等。作为植物细胞已知有来自烟草(Nicotiana tabacum)来源的细胞，可以将其カルス培养。作为真菌细胞，酵母，已知啤酒酵母(Saccharomyces)属，例如：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、丝状菌，例如：曲霉(Aspergillus)属、例如：黑曲霉(Aspergillusniger)等。
使用原核细胞时，有细菌细胞的生产系统。作为细菌细胞，已知有大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌。
将目的的抗体基因通过转化导入到这些细胞中，通过在体外培养转化的细胞得到抗体。按照公知的方法进行培养。例如：可以用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM作为培养液，也可以并用胎牛血清(FCS)等血清添加液。还有，也可以通过将导入抗体基因的细胞转移到动物的腹腔中，在体内生产抗体。
一方面，作为体内生产系统，例如：使用动物细胞的生产系统或使用植物的生产系统。使用动物时，可使用哺乳类动物、昆虫的生产系统等。
作为哺乳类动物，可以使用山羊、猪、羊、小鼠、牛等(VickiGlaser，SPECTRUM Biotechnology Applications，1993)。还有，作为昆虫，可以使用蚕。使用植物时，例如可以使用烟草。
将抗体基因导入到这些动物或植物中，使之在动物或植物的体内产生抗体，回收。例如：将抗体基因插入到编码如山羊β酪蛋白这种在乳汁中固有性产生的蛋白质中，作为融合基因进行制备。将含有插入的抗体基因的融合基因DNA片断注入到山羊的胚中，将该胚导入到雌性山羊体内。从接受胚的山羊生出的转基因山羊或其后代所产生的乳汁得到目的的抗体。为了增加转基因山羊所产生的含抗体的乳汁量，也可以对转基因山羊使用适当的激素(Ebert，K.M.等人，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
此外，使用蚕时，将插入目的的抗体基因的核型多角体病毒来感染蚕，从该蚕的体液中得到希望的抗体(Maeda，S.等人，Nature(1985)315，592-594)。还有，使用烟草时，将目的的抗体基因插入到用于植物表达的载体如：pMON 530中，将该载体导入如Agrobacteriumtumefaciens的农杆菌中。用该农杆菌感染烟草，如：Nicotianatabacum，从该烟草的叶子得到希望的抗体(Julian，K.-C.Ma等人，Eur.J.Immunol.(1994)24，131-138)。
在如上所述的体外或体内的生产系统中生产抗体时，也可以将编码抗体重链(H链)或轻链(L链)的DNA分别重组到表达载体中，使之同时转化到宿主中，或将编码H链和L链的DNA重组到单独的表达载体中，使之转化到宿主中(参见国际专利申请公开号WO 94/11523)。
在本发明中使用的抗体，只要适合本发明，也可以是抗体的片断或其修饰物。例如：作为抗体片断，可列举Fab、F(ab’)2、Fv或H链和L链的Fv用适当的连接链(linker)连接的单链Fv(scFv)。
具体而言，将抗体用酶，例如：木瓜蛋白酶、胃蛋白酶处理产生抗体片断，或构建编码这些抗体片断的基因，将其导入的到表达载体后，在适当的宿主中表达(参见例如：Co，M.S.等人，J.Immunol.(1994)152，2968-2976、Better，M.&Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476-496、Pluekthun，A.&Skerra，A.Methods inEnzymology (1989)178，476-496、Lamoyi，E.，Methods inenzymology(1989)121，652-663、Rousseaux，J.等人，Methods inEnzymology(1989)121，663-66、Bird，R.E.等人，TIBTECH(1991)9，132-137)。
可以通过连接抗体的H链的V区域和L链的V区域得到scFv。在该scFv中，H链V区域和L链V区域的连接链优选通过连接肽链连接(Huston，J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。scFv中的H链V区域和L链V区域可以使用任何来源的上述记载的抗体。作为V区域的连接肽，例如：用有12-19个氨基酸残基组成的任意的单链肽。
以编码上述抗体的H链、或H链V区域的DNA以及编码L链或L链V区域的DNA为模板，用特定的两端的引物对通过PCR法扩增这些序列中编码希望的氨基酸序列的DNA部分，然后，组合特定的能将编码连接肽部分的DNA和其两端的H链、L链连接的引物对，通过扩增得到编码scFv的DNA。
还有，一旦制备编码scFv的DNA，可以按照常规方法制备含有该DNA的表达载体以及转化该表达载体的宿主，按照常规方法用该宿主得到scFv。
可以用和上述同样的方法得到这些抗体片断的基因，并使之表达，在宿主中生产。本发明中所说的“抗体”包括这些抗体的片断。
作为抗体的修饰物，可以使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。本发明中所说的“抗体”中包括这些抗体修饰物。可以对得到的抗体实施化学性修饰，由此得到这种抗体修饰物。这些方法是在该领域内已经建立的方法。
可以从细胞内外、宿主中分离直至纯化到均匀为止上述产生、表达的抗体。本发明中所用的抗体的分离、纯化可以用亲和层析。在亲和层析中所用的柱，例如：蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱所用的载体，例如：HyperD、POROS、Sepharose F.F.等。此外，也可使用常规蛋白质中使用的分离、纯化方法，没有任何限定。
例如：也可以适当选择、组合上述亲和层析以外的层析、过滤、超滤、盐析、透析等，分离、纯化本发明中所使用的抗体。作为层析，例如：离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤等。这些层析还适用HPLC(High performance liquid chromatography)。此外还可以使用逆相HPLC(reverse phase HPLC)。
可以通过吸光度的测定或ELISA等对上述得到的抗体的浓度进行测定。即，用吸光度进行测定时，用PBS(-)适当稀释后，测定280nm的吸光度，按照1mg/ml为1.35OD进行计算。用ELISA时，可如下测定。即，将以0.1M重碳酸缓冲液(pH9.6)稀释到1μg/ml的山羊抗人IgG(TAG制造)按照100μl加入96孔板(Nunc制造)中，4℃温育1夜，固定抗体。封闭后，添加100μl适当稀释的本发明中使用的抗体或含抗体样本或标准品的人IgG(CAPPEL制造)，室温温育1小时。
洗涤后，加入5000倍稀释后的碱性磷酸酶标记的抗人IgG(BIOSOURCE制造)100μl，在室温温育1小时。洗涤后，添加基质溶液温育后，用MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad制造)测定405nm处的吸光度，计算目的的抗体的浓度。
在本发明中使用的IL-6突变体是具有和IL-6受体的结合活性，并且不能传递IL-6的生物学活性的物质。即，IL-6突变体和IL-6竞争性地结合IL-6受体，因为不传递IL-6的生物学活性，所以阻断了IL-6造成的信号传递。
通过置换IL-6的氨基酸序列中的氨基酸残基，导入变异，制备IL-6突变体。不考虑作为IL-6突变体的最初的IL-6的来源，如果考虑到抗原性等，优选人IL-6。
具体而言，IL-6的突变体是用公知的分子建模程序例如：WHATIF(Vriend等人，J.Mol.Graphices(1990)8，52-56)对IL-6氨基酸序列的二级结构进行预测，然后评价所置换氨基酸对整体产生的影响，确定适当的置换氨基酸残基后，以含有编码人IL-6基因的碱基序列的载体为模板，由常规的PCR法导入可实现氨基酸的置换的突变，得到编码IL-6突变体的基因。根据需要，将其重组到适当的表达载体中，按照上述重组抗体的表达、生产以及纯化方法，得到IL-6突变体。
IL-6突变体的具体例已经公布于Brakenhoff等人，J.Biol.Chem.(1994)269，86-93、以及Savino等人，EMBOJ.(1994)13，1357-1367、WO 96/18648、WO 96/17869。
在本发明中使用的IL-6部分肽或IL-6受体部分肽是分别具有和IL-6受体或IL-6的结合活性，并且不传递IL-6的生物学活性的物质。即，IL-6部分肽或IL-6受体部分肽可以结合IL-6受体或IL-6，通过捕捉这些物质特异性地阻碍IL-6向IL-6受体的结合。其结果，因为不传递IL-6的生物学活性，阻断了IL-6的信号传递。
IL-6部分肽或IL-6受体部分肽，是由IL-6或IL-6受体的氨基酸序列中的IL-6和IL-6受体结合区域的一部分或全部氨基酸序列所组成的肽。这种肽通常由10～80、优选20～50、更优选30～40个氨基酸残基所组成。
IL-6部分肽或IL-6受体部分肽特定在IL-6或IL-6受体氨基酸序列上的IL-6和IL-6受体结合的区域，按照通常所知的方法例如：基因工程学方法或肽合成法制备该区域的部分或全部氨基酸序列。
在用基因工程方法制备IL-6部分肽或IL-6受体部分肽时，可以将编码所望的肽的DNA序列重组到表达载体中，按照表达、生产、纯化上述重组抗体的的方法得到。
在用肽合成方法制造IL-6部分肽或IL-6受体部分肽时，可以在肽合成中，用例如：固相合成法或液相合成法。
具体而言，可以按照“续药品开发”第14卷肽合成、监修矢岛治明，广川书店1991年记载的方法进行。作为固相合成法，例如：在有机溶剂不溶性载体上结合希望合成的肽的C末端所对应的氨基酸，将用适当的保护基团保护α-氨基酸基团以及侧链官能基团的氨基酸按照从C末端到N末端的方向依次和每一个基酸进行缩合反应，该反应和使在树脂上结合的氨基酸或肽的α-氨基酸基团的该保护基团脱离的反应交替反复进行，使肽链延长。固相肽合成法所用的保护基团的种类在Boc法和Fmoc法中有很大不同。
这样合成目的的肽后，进行脱保护反应以及肽链从载体上的切断反应。在与肽链的切断反应中，通常可以使用Boc法中氟化氢或三氟甲磺酸或Fmoc法中的TFA。在Boc法中，例如：在氟化氢中，在甲氧基苯存在的情况下处理上述保护肽树脂。然后，回收脱去保护基团的并从载体上的切断的肽。通过将其冻干，得到粗品肽。另一方面，在Fmoc法中，例如：在TFA中，用和上述同样的操作进行脱保护反应以及肽链与载体的切断反应。
所得到的粗品肽可以通过HPLC进行分离、纯化。可以在洗脱时，使用蛋白质纯化中通常使用的水-乙腈类溶剂，在最适条件下进行该操作。分别收取相应的得到的层析流出峰对应的组分，将其冻干。通过质谱分析对这样得到纯化的肽组分进行分子量解析、氨基酸组成分析或氨基酸序列分析等。
IL-6部分肽和IL-6受体部分肽的具体例子已经公布于特开平2-188600、特开平7-324097、特开平8-311098以及美国专利公报US5210075。
可以用通常采用的方法评价在本发明中使用的IL-6拮抗剂的IL-6信号传导阻断活性。具体而言，培养IL-6依赖性人骨髓瘤株(S6B45，KPMM2)、人T细胞淋巴瘤细胞株KT3或IL-6依赖性细胞MH60.BSF2，向其中加入IL-6，同时使之与IL-6拮抗剂共存，由此测定IL-6依赖性细胞对3H-胸腺嘧啶的摄取。还有，培养IL-6受体表达细胞U266，添加125I标记的IL-6，同时添加IL-6拮抗剂，由此测定IL-6受体表达细胞上结合的125I标记IL-6。在上述的分析体系中，在存在IL-6拮抗剂的组中加入不含IL-6拮抗剂的阴性对照组，比较二者得到的结果，评价IL-6拮抗剂的IL-6阻断活性。
如后述的实施例所示，通过给予抗IL-6受体抗体，在脊髓损伤患者中确认了治疗效果。在本发明中的治疗对象是哺乳动物。治疗对象的哺乳动物优选是人。
本发明的脊髓损伤治疗剂，可以经口或非经口、全身或局部给药。例如：可以选择点滴等静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、栓、肠内注射、经口性肠溶剂等。可以根据患者的年龄、症状来选择适当的给药方法。
每一次对应于每1kg体重，从0.01mg～100mg的范围内选择有效给药量。或每个患者1～1000mg，优选5～50mg的给药量。优选的给药量、给药方法，例如：用抗IL-6受体抗体时，血中完全存在抗体的程度的量为有效给药量，作为具体例，每1kg体重1个月(4周)从0.5mg～40mg，优选将1mg～20mg分为1次～数次给药。例如：按照2次/周、1次/周、1次/2周、1次/4周等给药方案，用静脉内注射、皮下注射等方法作为给药方法。给药方案可以边观察病情以及观察血液检查值的动向，边将给药间隔从2次/周或1次/周延长到1次/2周、1次/3周、1次/4周等加以调整。
本发明的脊髓损伤治疗剂，按照给药途径可含有医药上许可的载体或添加物。作为这种载体和添加物的例子，可列举水、药物可容许的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯共聚物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性糊精、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、明胶、琼脂、双甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂酰醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、作为医药添加物所允许的表面活性剂等。所使用的添加物，相应于剂型，可以从上述中适当选择或组合。添加物不限定于这些物质。
实施例
下面用实施例和参考例对本发明进行具体说明，本发明不限于这些。
实施例1
材料和方法
动物：
所有实验组中都使用成体(18～22g)雌性C57BL/6J小鼠。
脊髓损伤：
用氯胺酮(100mg/kg)和二甲代苯胺(キシラジン)(10mg/kg)通过腹腔内注射，麻醉雌性小鼠。剃除背部的毛，切开20mm的中线皮肤，然后露出脊柱。使背面肌肉向侧面分离，将脊柱胸部区域露出后，露出T7-T13椎骨的棘突起。在第9胸椎水平切除锥弓，注意不损伤硬膜，同时使脊索露出。在T7和T11棘突起以及韧带上用钳子和夹子固定脊柱，然后使沉在底座上的身体挺起来后，用NYU Impactor造成脊髓损伤(SCI)。将3g的重量(直径1.2mm的端部)从25mm的高度落向T9水平的脊髓。层状闭合肌肉和切开部分，并且将动物放在温度调节室内直至使动物再次建立热调节。由手动膀胱压出使之排尿直至建立自然排尿为止，每天进行2次。
实验计划和大鼠抗小鼠IL-6受体mAb(MR16-1)的注入：
损伤后，按照每1kg体重100μg的MR16-1剂量进行单次腹腔内注入(MR16-1组，n＝15)，对照组腹腔内注入等量的大鼠Ig-G(对照组，n＝15)。从为了标记分裂细胞而进行BrdU(50mg/kg体重)腹腔内注入手术之日起进行2周关于两组的组织学以及免疫学的分析。
运动功能评价：
本发明人用3种不同的实验，对受到损伤后的运动功能的恢复性进行评价。功能评价持续到损伤后的第6周。
下肢运动功能评价：为了评价SCI的功能效果，本发明人用通常广泛使用的Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)分值进行了运动功能评价。3个不同的检查员经过4分钟对每个动物进行双盲评价，对于每个动物的下肢功能给予确定的评分(0～21)。所有实验记录到录像带上。
SCANET：SCANET是由配备有红外线传感装置的笼子组成的自动动物移动分析系统，用该系统监视小的(M1)和大的(M2)水平移动和垂直移动(RG)，即起立的次数，对一定时间内动物自发进行的运动量进行定量。特别是据说RG评分和BBB尺度评分间存在统计学的正的相关关系。
转棒仪旋转(Rota rod tredmill)：将小鼠置于有塑料棒组成的旋转棒装置上，通过强制步行对四肢协调运动进行评价。在5、10以及15rpm的速度的旋转棒上放置小鼠，在120秒内监视直至落下的潜伏时间。分别从平均值和最大值对协调运动功能进行评价。
免疫组织化学：
为了组织学的研究，通过吸入二乙醚麻醉小鼠，经心脏循环流动4％的仲甲醛，固定。摘出脊髓，在室温下，用4％的仲甲醛进行固定数小时。将组织样本在10％蔗糖中于4℃下浸泡24小时，置于30％的蔗糖中48小时，在OTC复合物中进行包埋。将包埋组织在液氮中冷冻，在-80℃下保存。冷冻切片在切片机按照纵向切断、横向切断制成20微米的厚度，用HE染色或免疫荧光进行双重染色。
在免疫荧光双重标记实验中，将脊髓切片在0.01M的PBS(pH7.4)中、0.03％Triton X-100以及10％正常山羊血清封闭30分钟。用兔抗-GFAP抗体、大鼠抗-Brd-U抗体以及人抗Hu抗体(作为神经元标记物)作为一抗，在4℃温育一晚。使用FITC-conjugated的兔IgG抗体以及Texas Red-conjugated大鼠抗体作为二抗进行双重染色。洗涤载片，浸润-固定，在荧光显微镜下分析。
Western blot分析：
自造成损伤12小时后(每组n＝4)，切除8mm的脊髓片断(从外伤中心开始，向吻侧4mm，向尾侧4mm)，在含有蛋白酶抑制剂的MAPK溶菌缓冲液中均化，并且用超声波处理后，在15000rpm下离心分离，用SDS-PAGE分离每个样本上清液的蛋白质，然后通过电泳印记到聚偏二氟乙烯膜上。将膜在含有5％脱脂奶粉、150mM的NaCl以及0.05％Tween 20(pH7.5)的TBST缓冲液中在室温下封端(blocking)1小时后，用多克隆兔抗stat3抗体或兔抗磷酸化stat3抗体或兔抗IL-6Rα抗体中的任何一个抗体作为一抗，然后用HRP-conjugated抗兔IgG抗体作为二抗，共同温育。通过自动成像仪，制成像片，用α-imager定量。
结果：
(1)下肢运动功能评价
给予抗IL-6受体抗体(MR16)的脊髓损伤的15只小鼠和未给予上述抗体的脊髓损伤的15只小鼠(对照)相比，在图1中以图表示BBB分值的平均值。可以确定脊髓损伤后，给予MR16抗体的小鼠组在7天后运动的恢复良好，在5周以及6周时具有有意义的差。
(2)SCANET
对于给予抗IL-6受体抗体(MR16)的脊髓损伤的15只小鼠和未给予上述抗体的脊髓损伤的15只小鼠(对照)，水平运动和起立的次数的比较结果是水平运动没有有意义的差，在给予抗IL-6受体抗体(MR16)的脊髓损伤的15只小鼠中有12只有起立运动，另一方面，在未给予抗体的脊髓损伤的15只小鼠(对照)中只有3只。该差在Fisher’s exact probability test中p＜0.05，是有意义的。
(3)转棒仪旋转
对于给予抗IL-6受体抗体(MR16)的脊髓损伤的15只小鼠和未给予上述抗体的脊髓损伤的15只小鼠(对照)，用上述方法进行实验时，在棒的旋转数为10rpm(每1分钟旋转数为10转)和15rpm时未看到有意义的差，在5rpm时，如图2所示，脊髓损伤后35天以后，给予抗IL-6受体抗体(MR16)的脊髓损伤的小鼠的恢复和未给予上述抗体的脊髓损伤的小鼠(对照)相比，有意义地(p＜0.05)高。
(4)免疫组织化学观察
即使在成体脊髓内存在内源性的神经干细胞，也不会产生该细胞分化所形成的骨髓修复。认为其理由是在损伤脊髓内，内源性神经干细胞分化成胶质细胞，进一步分化成星形胶质细胞，所以不能向神经元类细胞分化。通过上述的方法，对于给予抗IL-6受体抗体(MR16)的脊髓损伤的4只小鼠的损伤部分的脊髓和未给予上述抗体(MR16)的脊髓损伤的4只小鼠(对照)的损伤部分的脊髓，用抗GFAP抗体和抗BrDU抗体通过免疫荧光法计算反应性星形胶质细胞的形成，如图3所示，通过给予上述抗体，反应性星形胶质细胞的形成有意义地(p＜0.01)减少了。
(5)Western blot分析
对于脊髓损伤的4只小鼠和脊髓损伤的4只小鼠(对照)在脊髓损伤后第12小时，通过Western blot法调查IL-6受体的表达。结果如图4所示。只有在脊髓损伤的小鼠中，确定IL-6受体的表达。还有，如图5所示，通过给予MR16抑制了磷酸化STAT3的量，显示出腹腔内给予的MR16在脊髓发挥了作用。
综上所述，可以确认IL-6受体的拮抗剂能促进脊髓损伤的修复。
参考例1.人可溶性IL-6受体的制备
用按照Yamasaki等人的方法(Yamasaki，K.等人，Science(1988)241，825-828)得到的含有编码IL-6受体的cDNA的质粒pBSF2R.236，通过PCR法制备可溶性IL-6受体。用限制性酶SphI消化质粒pBSF2R.236，得到IL-6受体cDNA，将其插入到mp18(Amersham制造)。为了向IL-6受体cDNA中导入终止密码子，用设计合成的寡聚引物，通过突变引入系统(Amersham制造)用PCR向IL-6受体cDNA中导入突变。通过该操作在氨基酸345的位置上导入终止密码子，得到编码可溶性IL-6受体的cDNA。
为了在CHO细胞中表达可溶性IL-6受体cDNA，使之和质粒pSV(Pharmacia制造)连接，得到质粒pSVL344。向含有dfhr的cDNA的质粒pECEdhfr中插入用Hind III-Sal I切断的可溶性IL-6受体cDNA，得到CHO细胞表达质粒pECEdhfr344。
将10μg质粒pECEdhfr344通过磷酸钙沉淀法(Chen，C.等人，Mol.Cell.Biol.(1987)7，2745-2751)转染到dhfr-CHO细胞mol.Cell.Biol.(1987)7，2745-2751)使细胞株DXB-11(Urlaub，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，4216-4220)转染。将转染的CHO细胞在含有1mM谷胺酰氨、10％透析FCS、100U/ml的青霉素和100μg/ml链霉素的不含核苷的αMEM的选择培养液中培养3周。
用极限稀释法筛选选择的CHO细胞，得到单一的CHO细胞克隆。在甲基蝶呤浓度20nM～200nM的条件下扩增该CHO细胞克隆，得到人可溶性IL-6受体产生CHO细胞株5E27。将CHO细胞株5E27在含有FBS的イシコ一ブ改性ダルベコ培养液(IMDM，Gibco制造)中进行培养。回收培养上清，用ELISA测定培养上清中的可溶性IL-6受体的浓度。其结果，确认在培养上清中存在可溶性IL-6受体。
参考例2.抗人IL-6抗体的制备
用10μg的重组型IL-6(Hirano，T.等人，Immunol.Lett.(1988)17，41)和完全弗氏佐剂一起，免疫BALB/c小鼠，直到能在血清中检测到抗IL-6抗体为止，持续每周进行一次免疫。从局部淋巴节摘出免疫细胞，用聚乙二醇1500使之和骨髓瘤细胞株P3U1融合。用HAT培养液按照Oi等人的方法(Selective Methods in Cellular Immunology，W.H.freeman and Co.San Francisco，351，1980)选择杂交瘤，建立产生抗人IL-6抗体的杂交瘤。
产生抗人IL-6抗体的杂交瘤按照下述方法进行IL-6结合分析。即，向柔软的聚乙烯制成的96孔微孔板(Dynatech Laboratories公司制造，Alexandria，VA)加入100μl的在0.1M的carbonate-hydrogencarbonate缓冲液(pH9.6)中的山羊抗小鼠Ig(10μl/ml，CooperBiomedical公司制造，Malvern，PA)，4℃包被一晚。然后用100μl含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS在室温下处理平板2小时。
将其用PBS洗涤后，每孔中加入100μl杂交瘤培养上清，在4℃温育1晚。洗涤平板，向各孔中添加125I标记的重组IL-6，使之达到2000cpm/0.5ng/well。洗涤后，用γ计数器(Beckman Gamma 9000，Beckman Instruments，Fullerton，CA)测定各孔的放射活性。通过IL-6结合分析确定在216个杂交瘤克隆中有32个杂交瘤克隆是阳性的。在这些克隆中，最后得到了稳定的MH166.BSF2。该杂交瘤产生的抗IL-6抗体MH166具有IgG1κ的亚型。
然后，用IL-6依赖性的小鼠杂交瘤克隆MH60.BSF2，对MH166抗体造成的和杂交瘤的增殖相关的中和活性进行调查。按照1×104/200μl/孔分别注入MH60.BSF2细胞，向其中加入含MH166抗体的样本，培养48小时，添加0.5μCi/孔的3H-胸腺嘧啶(New EnglandNuclear，Boston，MA)后，再继续培养6小时。将细胞置于感光胶片上，用自动曝光(Labo Mash Sciene Co.Tokyo，Japan)处理，用兔抗IL-6抗体作为对照。
其结果，MH166抗体以剂量性依赖地阻断了IL-6所诱导的MH60.BSF2细胞的3H-胸腺嘧啶的摄取。由此，证明MH166抗体能够中和IL-6的活性。
参考例3.抗人IL-6受体抗体的制备
将按照Hirata等人的方法(Hirata，Y.等人，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)制成的抗IL-6受体抗体MT18和CNBr活化的琼脂糖4B(Pharmacia Fine Chemicals制造)按照添加配方使之结合，纯化IL-6受体(Yamasaki，K.等人，Science(1988)241，825-828)。用1％毛地黄皂苷(ジギトニン)(Wako Chemicals制造)溶化人骨髓瘤细胞株U266，用含有1mMp-パラアミノフエニルメタンスルフオニルオライドハイドロクロリド(Wako Chemicals制)(毛地黄皂苷缓冲液)溶化10mM三乙醇胺(pH7.8)以及0.15M NaCl。使之与和琼脂糖4B珠结合的MT18抗体混合，之后，用毛地黄皂苷缓冲液洗涤珠6次，作为用于免疫的部分纯化的IL-6受体。
用从3×109个的U266细胞中得到的上述部分纯化的IL-6受体每隔10天免疫BALB/c小鼠，共4次，然后按照常规方法制成杂交瘤。按照下述的方法对成长阳性孔中的杂交瘤培养上清和IL-6受体的结合活性进行调查。用35S甲硫氨酸(2.5mCi)标记5×107个的U266细胞，用上述毛地黄皂苷缓冲液溶化。将溶化的U266细胞和与0.04ml容量的琼脂糖4B珠结合的MT18抗体混合，然后，用毛地黄皂苷缓冲液洗涤6次，用0.25ml的毛地黄皂苷缓冲液(pH3.4)洗脱35S甲硫氨酸标记的IL-6受体，用0.025ml的1M Tris(pH7.4)中和。
将0.05ml的杂交瘤培养上清和0.01ml的Protein G 琼脂糖(Pharmacia制造)混合。洗涤后，和用琼脂糖制备的0.005ml的35S标记的IL-6受体溶液一起温育。用SDS-PAGE分析免疫沉淀物质，对和IL-6受体反应的杂交瘤上清进行调查。其结果，建立反应阳性的杂交瘤PM-1(FERM BP-2998)。由杂交瘤PM-1产生的抗体为IgG1κ亚型。
用人骨髓瘤细胞株U266调查杂交瘤PM-1产生抗体的对人IL-6受体的IL-6的结合阻断活性。用大肠杆菌制备人重组型IL-6(Hirano，T.等人，Immunol.Lett.(1988)17，41-45)、用ボルトン一ハンタ一试剂(New England Nuclear，Boston，MA)进行125I标记(Taga，T.等人，J.Exp.Med.(1987)166，967-981)。
将4×105个的U266细胞和70％(v/v)杂交瘤PM-1的培养上清以及14000cpm的125I标记的IL-6一起培养1小时。将70μl的样本置于400μl的マイクロフュ一ジ聚乙烯管的300μl的FCS上、离心后测定细胞上的放射活性。
其结果，明确了杂交瘤PM-1产生的抗体阻断了IL-6的IL-6受体的结合。
参考例4.抗小鼠IL-6受体抗体的制备
按照Saito，T.等人，J.Immunol.(1991)147，168-173所记载的方法制备针对小鼠IL-6受体的单克隆抗体。
将产生小鼠可溶性IL-6受体的CHO细胞在含10％FCS的IMDM培养液中培养，从该上清中用固定在Affigel 10凝胶(Biorad制造)上的抗小鼠IL-6受体抗体RS12(参见上述Saito，T.等人)的亲和柱，纯化小鼠可溶性IL-6受体。
将50μg得到的小鼠可溶性IL-6受体和弗氏完全佐剂混合，注入到Winstar大鼠的腹部中，2周后用弗氏不完全佐剂追加免疫。在第45天摘取大鼠的脾脏细胞，将2×108个细胞和1×107个的小鼠骨髓瘤细胞P3U1、50％的PEG1500(Boehringer Mannheim制造)按照常规方法使细胞融合，在HTA培养基中筛选杂交瘤。
向包被了兔抗大鼠IgG抗体(Cappel制造)的平板上添加杂交瘤培养上清后，使之和小鼠可溶性IL-6受体反应。然后，用兔抗大鼠IL-6受体抗体和碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG通过ELISA法筛选产生针对可溶性IL-6受体的抗体的杂交瘤。对确认的产生抗体的杂交瘤进行2次亚克隆，得到单一的杂交瘤，将此克隆命名为MR16-1。
用MH60.BSF2细胞(Matsuda，T等人，J.Immunol.(1988)18，951-956)的3H-胸腺嘧啶摄取调查该杂交瘤产生的抗体的在小鼠IL-6信号传递中的中和活性。向96孔板中按照1×104个/200μl/孔加入MH60.BSF2细胞。向该平板中加入10pg/ml的小鼠IL-6和12.3～1000ng/ml的MR16-1抗体或RS12抗体，在37℃，5％CO2中培养44小时后，按照1μCi/孔加入3H-胸腺嘧啶。4小时后，测定3H-胸腺嘧啶的摄取。其结果MR16-1抗体抑制了MH60.BSF2细胞的3H-胸腺嘧啶摄取。
所以，确认了杂交瘤MR16-1(FERM BP-5875)产生的抗体阻断了IL-6的IL-6受体的结合。

Claims (36)

1.一种脊髓损伤治疗剂，含有以白介素6(IL-6)拮抗剂为有效成分而构成。
2.权利要求1记载的脊髓损伤治疗剂，其中上述的IL-6拮抗剂是针对IL-6受体的抗体。
3.权利要求2记载的脊髓损伤治疗剂，其中上述抗体是单克隆抗体。
4.权利要求2或3记载的脊髓损伤治疗剂，其中上述抗体是针对人IL-6受体的单克隆抗体。
5.权利要求2或3记载的脊髓损伤治疗剂，其中上述抗体是针对小鼠IL-6受体的单克隆抗体。
6.权利要求1～4任何一项记载的脊髓损伤治疗剂，其中上述抗体是重组型抗体。
7.权利要求1～6任何一项记载的脊髓损伤治疗剂，其中上述针对人IL-6受体的单克隆抗体是PM-1抗体。
8.权利要求5中记载的脊髓损伤治疗剂，其中上述针对小鼠IL-6受体的单克隆抗体是MR16-1抗体。
9.权利要求1～8任何一项记载的脊髓损伤治疗剂，其中上述抗体是针对IL-6受体的嵌和抗体、人源化抗体或人抗体。
10.权利要求9中记载的脊髓损伤治疗剂，其中上述人源化抗体是人源化PM-1抗体。
11.一种神经干细胞的分化调节剂，含有以白介素6(IL-6)拮抗剂为有效成分而构成。
12.一种向神经胶质细胞分化的分化抑制剂，含有以白介素6(IL-6)拮抗剂为有效成分而构成。
13.一种白介素6(IL-6)拮抗剂在制造脊髓损伤治疗剂中的应用。
14.权利要求13记载的应用，上述IL-6拮抗剂是针对IL-6受体的抗体。
15.权利要求14记载的应用，上述抗体是单克隆抗体。
16.权利要求13或14所记载的应用，上述抗体是针对人IL-6受体的单克隆抗体。
17.权利要求14或15所记载的应用，上述抗体是针对小鼠IL-6受体的单克隆抗体。
18.权利要求13～16任何一项记载的应用，其中上述抗体是重组型抗体。
19.权利要求13～18任何一项记载的应用，其中针对上述IL-6受体的单克隆抗体是PM-1抗体。
20.权利要求17记载的应用，其中针对上述小鼠IL-6受体的单克隆抗体是MR16-1抗体。
21.权利要求13～20任何一项记载的应用，其中上述抗体是针对IL-6受体的嵌和抗体、人源化抗体或人抗体。
22.权利要求21中记载的应用，其中上述人源化抗体是人源化PM-1抗体。
23.一种白介素6(IL-6)拮抗剂在制造神经干细胞的分化调节剂中的应用。
24.一种白介素6(IL-6)拮抗剂在制造向神经胶质细胞分化的分化抑制剂中的应用。
25.一种脊髓损伤治疗方法，包括向对象给以白介素6(IL-6)拮抗剂。
26.权利要求25记载的方法，上述IL-6拮抗剂是针对IL-6受体的抗体。
27.权利要求26记载的方法，上述抗体是单克隆抗体。
28.权利要求26或27所记载的方法，上述抗体是针对人IL-6受体的单克隆抗体。
29.权利要求26或27所记载的方法，上述抗体是针对小鼠IL-6受体的单克隆抗体。
30.权利要求25～28任何一项记载的方法，其中上述抗体是重组型抗体。
31.权利要求25～30任何一项记载的方法，其中针对上述IL-6受体的单克隆抗体是PM-1抗体。
32.权利要求29记载的方法，其中针对上述小鼠IL-6受体的单克隆抗体是MR16-1抗体。
33.权利要求25～32任何一项记载的方法，其中上述抗体是针对IL-6受体的嵌和抗体、人源化抗体或人抗体。
34.权利要求33中记载的方法，其中上述人源化抗体是人源化PM-1抗体。
35.一种神经干细胞的分化调节方法，包括向对象给予白介素6(IL-6)拮抗剂。
36.一种向神经胶质细胞分化的分化抑制方法，包括向对象给予白介素6(IL-6)拮抗剂。
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