RU2253903C2

RU2253903C2 - Method for stopping carcinoma cells division in a biological object

Info

Publication number: RU2253903C2
Application number: RU2003101287/14A
Authority: RU
Inventors: Ю.М. Штерн (RU); Ю.М. Штерн; А.Я. Грабовщинер (RU); А.Я. Грабовщинер; Н.В. Христофорова (RU); Н.В. Христофорова
Original assignee: Зао "Милта-Пкп Гит"
Priority date: 2003-01-20
Filing date: 2003-01-20
Publication date: 2005-06-10

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: method involves exposing cell or cell group to external power source. At least two electrodes are introduced before treating the cells. One of electrodes is set on cytoplasmatic external cell membrane surface and the other one cell membrane and membrane potential value is measured. External electric voltage source is connected to the introduced electrodes oppositely in polarity with cell membrane potential difference value being not less than cell membrane potential.

EFFECT: enhanced effectiveness in building cell damage model by means of energy burst and death.

Description

Изобретение относится к области микробиологии и клинической медицины, в частности онкологии, и может быть использовано для исследования процессов разрушения раковых клеток, находящихся в питательной среде, в организме и вне организма.The invention relates to the field of microbiology and clinical medicine, in particular oncology, and can be used to study the destruction of cancer cells in a nutrient medium, in the body and outside the body.

Исследование причин возникновения злокачественных опухолей и лечение онкологических заболеваний в последние годы перешли на молекулярный уровень.The study of the causes of malignant tumors and the treatment of cancer in recent years have moved to the molecular level.

Доказано, что для превращения нормальной клетки в раковую необходима активация не менее двух онкогенов, а для сохранения ее в этом качестве необходимо постоянное поступление онкобелков (Л. Киселев. Новое о молекулярной природе рака. Вестник АН СССР №1, 1987 г.).It has been proved that the transformation of a normal cell into a cancer cell requires the activation of at least two oncogenes, and to maintain it in this quality, a constant supply of oncoproteins is necessary (L. Kiselev. New about the molecular nature of cancer. Vestnik AN SSSR No. 1, 1987).

В связи с этим блокирование деления раковых клеток проводится в следующих направлениях. Так, например, известен способ деструкции раковых клеток, основанный на использовании иммунохимиотерапии, в основу которого положен прием химических препаратов совместно с цитокинами, позволяющими блокировать деление раковых клеток (Л.А.Грачева. Цитокины в онкогематологии, М., “Алтус”, 1996 г., с.168.) Однако наличие токсического действия цитостатиков обуславливает возникновение рецидива заболевания. Для снижения токсических действий цитостатиков используется способ доставки цитостатика в комплексе с ДНК-антрациклином к опухоли. В этом случае раковые клетки активно поглощают ДНК, и благодаря этому внутрь клетки попадает цитостатик, что и приводит к гибели клетки (Tronet A., Depredate Campeneeve D., Smedt-Malengreaux M., de Aassi G. Experimental leukemia Chemotherapy with a lysosmotropic Adriamycin - DNA complex.// Eur. J. Cancer. - 1974, 10, 405). Однако селективная доставка химического препарата вызывает необходимость постоянного контроля антрациклина в крови.In this regard, the blocking of cancer cell division is carried out in the following directions. For example, a method for the destruction of cancer cells is known, based on the use of immunochemotherapy, which is based on the use of chemicals along with cytokines that block cancer cell division (L. A. Gracheva. Cytokines in oncohematology, M., Altus, 1996 G., s.168.) However, the presence of the toxic effect of cytostatics causes the onset of relapse. To reduce the toxic effects of cytostatics, a method for delivering a cytostatic agent in combination with DNA anthracycline to the tumor is used. In this case, cancer cells actively absorb DNA, and due to this, a cytostatic agent enters the cell, which leads to cell death (Tronet A., Depredate Campeneeve D., Smedt-Malengreaux M., de Aassi G. Experimental leukemia Chemotherapy with a lysosmotropic Adriamycin - DNA complex.// Eur. J. Cancer. - 1974, 10, 405). However, the selective delivery of a chemical preparation necessitates continuous monitoring of anthracycline in the blood.

Известен способ блокировки деления раковых клеток, основанный на введении в раковые клетки так называемого гена-протектора (ген РБ), который позволяет восстановить нарушенный “баланс сил” и тем самым остановить неудержимый рост раковых клеток (Г.Абелев. Научный поиск в онкологии. Наука и жизнь, №12, 1989 г., стр.16 -20). Однако, как показала практика, ген РБ эффективен в относительной мере только к редким формам рака - ретинобластоме и остеосаркоме.A known method of blocking cancer cell division, based on the introduction of a so-called protector gene (RB gene) into cancer cells, which allows you to restore the disturbed "balance of power" and thereby stop the unstoppable growth of cancer cells (G. Abelev. Scientific search in oncology. Science and life, No. 12, 1989, pp. 16-20). However, as practice has shown, the RB gene is relatively effective only to rare forms of cancer - retinoblastoma and osteosarcoma.

В настоящее время в микробиологии наметилась тенденция блокирования и уничтожения раковых клеток посредством прямого энергетического воздействия на них. Это относится к методам воздействия электромагнитной энергией, преимущественно высокочастотной и световой с использованием лазеров. Колебательные процессы, инициированные излучением лазера, принципиально отличаются своей высокой упорядоченностью, что делает лазер уникальным инструментом для воздействия на биологические объекты с их сложной и совершенной системой электромагнитных энергетических взаимоотношений. Так, известен способ блокирования деления раковых клеток с использованием локальной лазерной гипертермии, основанный на воздействии света (А.Г.Коноплянников, Л.В.Штейн. Использование гипертермии для подавления репаративных процессов в опухолевых клетках и для повышения эффективности лучевой терапии. Медицинская радиология, 1977, №2, с.23-27). При анализе локальной лазерной гипертермии было обнаружено, что для эффективного объемного воздействия на раковые клетки необходимо использование инфракрасного диапазона излучения лазера с мощностью более 3-5 Вт. В этом случае глубина проникновения фотонов в ткани измеряется сантиметрами. При всех положительных сторонах этого способа было обнаружено, что для достижения требуемого эффекта необходимо соблюдать особый режим светового воздействия. Кроме того, необходимы особые светорассеивающие инструменты для внутритканевой световой гипертермии.Currently, in microbiology, there has been a tendency to block and destroy cancer cells through direct energy exposure to them. This applies to methods of exposure to electromagnetic energy, mainly high-frequency and light using lasers. Oscillatory processes initiated by laser radiation are fundamentally distinguished by their high orderliness, which makes the laser a unique tool for influencing biological objects with their complex and perfect system of electromagnetic energy relationships. So, there is a method of blocking cancer cell division using local laser hyperthermia, based on exposure to light (A.G. Konoplyannikov, L.V. Stein. Using hyperthermia to suppress reparative processes in tumor cells and to increase the effectiveness of radiation therapy. Medical radiology, 1977, No. 2, pp. 23-27). When analyzing local laser hyperthermia, it was found that for effective volumetric exposure to cancer cells, it is necessary to use the infrared range of laser radiation with a power of more than 3-5 watts. In this case, the depth of penetration of photons into the tissue is measured in centimeters. With all the positive aspects of this method, it was found that to achieve the desired effect, it is necessary to observe a special regime of light exposure. In addition, special light-scattering tools for interstitial light hyperthermia are needed.

Наиболее близким техническим решением по совокупности существенных признаков является способ блокирования деления раковых клеток в биологическом объекте, включающий воздействие на клетку или группу клеток внешним источником энергии с последующим преобразованием энергии клетки (Ardenne M. Von Theoretische und Experimentalle Grundlagen der Kreber-Mehrshrift-Therapie. Berlin, 1967, 365 s.). В основе предложенного способа лежит идея создания в клетке условий для некоего “энергетического взрыва”, в инициировании начального “запального” процесса в энергетически перенасыщенной среде. В этом случае избыток выделившейся локально энергии будет лавинообразно распространяться до полного использования “реактогенного” материала клетки. Состояние готовности к “энергетическому взрыву” клетки автор данного способа обеспечивает с помощью такого инструмента форсирования клеточной энергопродукции, как гипертермия. Для того чтобы максимально стимулировать процесс развития такой цепной реакции, автор дополнил гипертермию гипергликемией. Это оправдано тем, что раковые клетки возмещают энергетические потери за счет гликолиза. В то же время такая шоковая терапия рака является сложной, многоэтапной.The closest technical solution for the totality of essential features is a method for blocking cancer cell division in a biological object, including exposure to a cell or group of cells with an external energy source, followed by cell energy conversion (Ardenne M. Von Theoretische und Experimentalle Grundlagen der Kreber-Mehrshrift-Therapie. Berlin , 1967, 365 s.). The basis of the proposed method is the idea of creating conditions for a certain “energy explosion” in the cell, in initiating the initial “firing” process in an energy-saturated environment. In this case, the excess of locally released energy will spread like an avalanche until the “reactogenic” material of the cell is fully used. The author of this method provides a state of readiness for an “energy explosion” of a cell with the help of a tool for forcing cell energy products such as hyperthermia. In order to maximally stimulate the development of such a chain reaction, the author supplemented hyperthermia with hyperglycemia. This is justified by the fact that cancer cells compensate for energy losses due to glycolysis. At the same time, such a shock therapy for cancer is complex, multi-stage.

Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, заключается в повышении эффективности блокирования и разрушения раковых клеток.The problem to which the claimed invention is directed, is to increase the efficiency of blocking and destruction of cancer cells.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе блокирования деления раковых клеток в биологическом объекте, включающем воздействие на клетку или группу клеток внешним источником электродвижущей силы (ЭДС), вначале в клетку или в группу клеток вводят электроды, одни из которых вводят на цитоплазматическую поверхность мембраны клетки, а другие - на наружную поверхность мембраны клетки, затем используют внешний источник ЭДС, полюса которого соединяют с противоположными по полярности электродами. Способ осуществляется следующим образом. Вводят электроды, представляющие собой потенциалочувствительные зонды АНС или микроэлектроды, в клетку или группу клеток. Затем предварительно измеряют значение мембранного потенциала в клетке. Число электродов должно быть не менее двух, один из которых вводится на цитоплазматическую поверхность мембраны клетки, а другой - на наружную поверхность мембраны клетки. На следующем этапе внешний источник ЭДС с разностью потенциалов не меньше значения мембранного потенциала клетки подключают к электродам таким образом, что его полюса соединяются с противоположными по полярности электродами.The problem is solved due to the fact that in the method of blocking the division of cancer cells in a biological object, including exposure to a cell or group of cells by an external source of electromotive force (EMF), first electrodes are introduced into the cell or group of cells, some of which are introduced onto the cytoplasmic surface cell membranes, and others on the outer surface of the cell membrane, then use an external source of EMF, the poles of which are connected to electrodes of opposite polarity. The method is as follows. Electrodes, which are potential-sensitive probes of ANS or microelectrodes, are introduced into a cell or group of cells. Then pre-measure the value of the membrane potential in the cell. The number of electrodes must be at least two, one of which is introduced onto the cytoplasmic surface of the cell membrane, and the other onto the outer surface of the cell membrane. At the next stage, an external source of EMF with a potential difference not less than the value of the membrane potential of the cell is connected to the electrodes in such a way that its poles are connected to electrodes of opposite polarity.

В основе предложенного способа блокирования деления раковых клеток в биологическом объекте лежит стимулирование начала процесса блокирования деления в энергетически перенасыщенной среде раковой клетки при помощи электрического воздействия на нее. Причина заключена в особенностях структуры раковых клеток. Они имеют иной характер трансмембранного переноса материалов, необходимых для клеточной интеграции, иные размеры мембранных пор и значение потенциала действия клеточных мембран, что в конечном итоге делает их энергетически перенасыщенными объектами. Известно, например, что раковые клетки излучают в оптическом диапазоне частот в ~ 100 раз интенсивнее нормальных клеток (Гурвич А.Г. Введение в учение о митогенезе. M., “Наука”, 1948 г.).The proposed method for blocking the division of cancer cells in a biological object is based on stimulating the onset of the process of blocking division in an energetically supersaturated environment of a cancer cell by means of an electric effect on it. The reason lies in the structural features of cancer cells. They have a different character of transmembrane transfer of materials necessary for cell integration, different sizes of membrane pores and the value of the action potential of cell membranes, which ultimately makes them energetically saturated. It is known, for example, that cancer cells emit in the optical frequency range ~ 100 times more intense than normal cells (Gurvich AG Introduction to the doctrine of mitogenesis. M., “Science”, 1948).

Действие электрического тока от внешнего источника, направление которого противоположно направлению тока в электродах, искусственно введенных в клетку или группу клеток, вызывает повышение пористости мембран, изменение размеров липидных пор, что ведет к изменению энергетики и высоты энергетического барьера последних. На начальном этапе взаимодействия двух энергетических объектов - клетки и внешнего источника ЭДС - действие электрического тока клетки направлено на повышение стабильности липидной бислойной мембраны, сохранение мембранного потенциала за счет расходования клеточной энергии.The action of an electric current from an external source, the direction of which is opposite to the direction of the current in the electrodes artificially introduced into the cell or group of cells, causes an increase in the porosity of the membranes, a change in the size of lipid pores, which leads to a change in the energy and height of the energy barrier of the latter. At the initial stage of the interaction of two energy objects - the cell and the external source of EMF - the action of the electric current of the cell is aimed at increasing the stability of the lipid bilayer membrane, preserving the membrane potential due to the expenditure of cellular energy.

При дальнейшем взаимодействии двух энергетических объектов в клетке появляются структурные дефекты в виде сквозных липидных пор (электропорация). Это приводит к резкой интенсификации процессов преобразования энергии в клетке, что в свою очередь создает условия для инициирования в ней “энергетического взрыва” и, как следствие, ее гибели. Описанная модель соответствует теории механизма гибели как нормальных, так и раковых клеток (В.Афанасьев, Б.Король и др. Две формы клеточной гибели: цитометрический и биохимический анализ. Доклады АН СССР, т.285, №2, 1985 г.).With the further interaction of two energy objects in the cell, structural defects appear in the form of through lipid pores (electroporation). This leads to a sharp intensification of the processes of energy conversion in the cell, which in turn creates the conditions for the initiation of an “energy explosion” in it and, as a consequence, its death. The described model corresponds to the theory of the mechanism of death of both normal and cancer cells (V. Afanasyev, B. Korol and others. Two forms of cell death: cytometric and biochemical analysis. Reports of the USSR Academy of Sciences, vol. 285, No. 2, 1985).

Таким образом, введение внешнего источника ЭДС, значение потенциала которого не меньше значения мембранного потенциала клетки, обуславливает наличие описанных выше процессов в клетке. Эти процессы ведут на начальном этапе взаимодействия двух энергетических объектов к сохранению целостности клеточной мембраны посредством расхода дополнительной энергии раковой клеткой и, следовательно, к замедлению деления и ослаблению агрессивности раковой клетки. В дальнейшем они приводят к разрушению самой раковой клетки за счет полного расхода клеточной энергии: происходит переход необходимых внутриклеточных видов энергии в виды, которые безвозвратно рассеиваются во внешней среде.Thus, the introduction of an external source of EMF, whose potential value is not less than the membrane potential of the cell, determines the presence of the above processes in the cell. These processes lead at the initial stage of the interaction of two energy objects to preserve the integrity of the cell membrane by spending additional energy on the cancer cell and, therefore, to slow down the division and weaken the aggressiveness of the cancer cell. In the future, they lead to the destruction of the cancer cell itself due to the complete consumption of cellular energy: the necessary intracellular types of energy are transformed into species that are irrevocably dispersed in the external environment.

Методом проточной цитометрии удается контролировать размер клеток после применения способа блокирования деления клеток, а также определить цитоплазматические и мембранные особенности клетки.Using flow cytometry, it is possible to control cell size after applying the method of blocking cell division, as well as to determine the cytoplasmic and membrane features of the cell.

В проведенных исследованиях в качестве клеточного материала использовались быстро делящиеся бактерии Gluconobacter oxydans (около 5 мг в мл). Клетки вместе с ростовым субстратом размещались в измерительной кювете электрохимической ячейки с объемом ~3 мл. В клеточную среду вводили электроды, которые соединяли посредством медных проводов с прибором, измеряли значение мембранного потенциала, 60 mV, после чего к введенным электродам подключали противоположно по полярности внешний источник ЭДС со значением разности потенциалов 60 mV, не меньшим значения мембранного потенциала клетки, и его поддерживали в течение 15 мин. По истечении 15 мин источник внешнего потенциала был отключен. Опыт показал, что в следующие полчаса система развила потенциал, значение которого ~30 мV. Это значительно меньше, чем первоначальная величина 60 мV. В свою очередь было показано, что уменьшение значения мембранного потенциала приводит к замедлению деления клеток. В результате клеточная масса испытуемой среды оказывалась на ~20% меньше контрольной, где воздействие внешнего источника отсутствовало.In the studies performed, the rapidly dividing bacteria Gluconobacter oxydans (about 5 mg per ml) were used as cellular material. The cells, along with the growth substrate, were placed in a measuring cell of an electrochemical cell with a volume of ~ 3 ml. Electrodes were introduced into the cell medium, which were connected via copper wires to the device, the membrane potential was measured, 60 mV, after which an external EMF source with a potential difference of 60 mV not less than the membrane potential of the cell was connected to the introduced electrodes with the opposite polarity, and its maintained for 15 minutes After 15 minutes, the source of external potential was turned off. Experience has shown that in the next half hour, the system developed a potential whose value is ~ 30 mV. This is significantly less than the initial value of 60 mV. In turn, it was shown that a decrease in the membrane potential leads to a slowdown in cell division. As a result, the cell mass of the test medium was ~ 20% less than the control, where there was no external source.

Данный способ позволяет подойти к решению задачи блокирования деления раковых клеток совершенно с другой стороны по отношению к известным способам: он позволяет исключить использование химических токсических препаратов, сократить время наступления лечебного эффекта, что в конечном итоге является важным шагом к решению проблем лечения раковых заболеваний.This method allows you to approach the problem of blocking the division of cancer cells from a completely different perspective with respect to the known methods: it eliminates the use of chemical toxic drugs, reduces the onset of the therapeutic effect, which is ultimately an important step in solving the problems of treating cancer.

Claims

A method of blocking cancer cell division, comprising exposing an external energy source to a cell or group of cells, characterized in that at least two electrodes are introduced before exposure, one of which is on the cytoplasmic surface of the cell membrane and the other on the outer surface of the cell membrane and measure the value of the membrane potential, after which an external EMF source with a potential difference not less than the value of the membrane potential is connected to the introduced electrodes opposite in polarity notch.